Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Ukierunkowanych na TALEN z genem GFP do AAVS1 Safe Harbor

Podsumowanie

Edycja genów za pośrednictwem TALEN-TALEN w locus AAVS1 umożliwia wysoce efektywną addycję transgenów w ludzkich iPSC. Protokół ten opisuje procedury przygotowania iPSC do dostarczania TALEN i wektora dawcy, transfekcji iPSC oraz selekcji i izolacji klonów iPSC w celu osiągnięcia ukierunkowanej integracji genu GFP w celu wygenerowania linii reporterowych.

Streszczenie

Ukierunkowana addycja transgenu może zapewnić trwałą ekspresję genów, jednocześnie omijając mutagenezę genów i mutagenezę insercyjną spowodowaną losową integracją za pośrednictwem wektora wirusowego. Protokół ten opisuje uniwersalną i wydajną platformę ukierunkowanej addycji transgenów w ludzkich iPSC, opartą na wykorzystaniu zwalidowanych TALEN-ów typu open source i dawcy przypominającego pułapkę genową w celu dostarczenia transgenów do locus bezpiecznej przystani. Co ważne, efektywna edycja genów jest ograniczona przez wydajność dostarczania wektorów edycji genów. W związku z tym protokół ten koncentruje się w pierwszej kolejności na przygotowaniu iPSC do transfekcji w celu osiągnięcia wysokiej wydajności dostarczania jądrowego. Kiedy iPSC są dysocjowane na pojedyncze komórki za pomocą delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek i transfekowane za pomocą zoptymalizowanego programu, można skłonić >50% komórek do przejęcia dużych wektorów edycji genów. Ponieważ locus AAVS1 znajduje się w intronie aktywnego genu (PPP1R12C), do selekcji docelowych komórek iPS użyto genu opornego na puromycynę (PAC) sprzężonego z akceptorem splicingu (SA), wykluczając komórki tylko z losową integracją i nietransfekowane. Strategia ta znacznie zwiększa szansę na uzyskanie docelowych klonów i może być również wykorzystana w innych eksperymentach z aktywnym celowaniem genowym. Dwa tygodnie po selekcji puromycyny w dawce dostosowanej do specyficznej linii iPSC, klony są gotowe do pobrania poprzez ręczne rozwarstwienie dużych, izolowanych kolonii na mniejsze kawałki, które są przenoszone na świeże podłoże w mniejszym dołku w celu dalszej ekspansji oraz badań genetycznych i funkcjonalnych. Można postępować zgodnie z tym protokołem, aby łatwo uzyskać wiele linii reporterowych iPSC GFP, które są przydatne do obrazowania in vivo i in vitro oraz izolacji komórek.

Wprowadzenie

Zdolność do przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w embrionalne indukowane komórki macierzyste (iPSC) została po raz pierwszy odkryta przez Takahashi et al. w 2007 roku¹. Wykazano, że ludzkie fibroblasty skóry transdukowane retrowirusami wyrażającymi cztery czynniki transkrypcyjne (tak zwane czynniki Yamanaka Oct3/4, Sox2, c-Myc i Klf4) okazały się bardzo podobne do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w oparciu o morfologię, proliferację, ekspresję genów i status epigenetyczny; Co najważniejsze, iPSC są również zdolne do różnicowania się w komórki wszystkich trzech listków rozrodczych¹. Potencjał proliferacyjny i zdolność różnicowania iPSC sprawiają, że są one bardzo atrakcyjnymi narzędziami; Dzięki przeprogramowaniu komórek pochodzących od pacjentów cierpiących na określone choroby, komórki iPS mogą być wykorzystywane zarówno jako systemy modelowe chorób in vitro, jak i jako potencjalne środki terapeutyczne.

Dla tego ostatniego celu, kilka kwestii musi zostać poruszonych, zanim pełny potencjał iPSC w warunkach klinicznych będzie mógł zostać zrealizowany; potencjał rakotwórczy hodowanych in vitro hESC i iPSC, użycie pochodnych ksenogennych podczas przeprogramowania i utrzymania komórek oraz potrzeba śledzenia przeszczepionych komórek in vivo są kluczowymi przeszkodami w klinicznym zastosowaniu pluripotencjalnych komórek macierzystych (Sprawdzone przez Hentze et at.²). Idealnym rozwiązaniem potrzeby śledzenia zróżnicowanych komórek po przeszczepie byłby wizualnie wykrywalny marker, który jest odporny na wyciszanie i różnorodność niezależnie od zastosowania. Silna i trwała ekspresja zintegrowanych transgenów jest najłatwiejsza do osiągnięcia, gdy egzogenne DNA jest wprowadzane do loci "bezpiecznej przystani"; Oznacza to, że miejsca genomowe umożliwiają wystarczającą transkrypcję zintegrowanego wektora, jednocześnie łagodząc zaburzenia ekspresji w sąsiednich genach³. Jednym z takich miejsc, które zostało bardzo dobrze scharakteryzowane od czasu jego odkrycia, jest miejsce integracji wirusa związanego z adenowirusem 1 (AAVS1), w pierwszym intronie genu podjednostki regulatorowej 12C (PPP1R12C) fosfatazy białkowej 1. Wykazano, że locus ten nie tylko umożliwia trwałą i solidną ekspresję zintegrowanych transgenów poprzez wydłużony czas w hodowli i różnicowaniu in vitro ³, ale także chroni otaczające geny przed zaburzeniami transkrypcji⁴; Uważa się, że obie cechy wynikają z obecności endogennych elementów izolatora chromatyny otaczających miejsce^{AAVS1 5}.

Postępy w narzędziach inżynierii genomu w ciągu ostatniej dekady znacznie ułatwiły łatwość i efektywność, z jaką można osiągnąć manipulacje genetyczne w dowolnym typie komórki. Podczas gdy wczesne udane eksperymenty opierały się na niezwykle niskich poziomach endogennej rekombinacji homologicznej (HR) z wprowadzonym dawcą w celu osiągnięcia celowania genów w ESC^6,7, zastosowanie nukleaz specyficznych dla miejsca, takich jak nukleazy palca cynkowego (ZFN), które znacząco indukują rekombinację homologiczną poprzez generowanie dwuniciowego pęknięcia DNA, znacznie zwiększyło skuteczność takich eksperymentów^8,9. Ponowne wykorzystanie zarówno efektorów podobnych do aktywatorów transkrypcji (TALE) patogennych dla roślin rodzajów Xanthomonas, jak i prokariotycznego systemu zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/Cas9 w wydajne, specyficzne dla miejsca nukleazy zaprojektowane sprawiły, że celowanie genów w pluripotencjalne komórki macierzyste stało się dostępną i praktyczną metodologią^10-13.

Niedawny artykuł opisywał skuteczną metodę stabilnej integracji zielonej kasety reporterowej fluorescencyjnej z locus bezpiecznej przystani AAVS1 w ludzkich iPSC przy użyciu nukleaz TALE (TALENs)¹⁴. Te ukierunkowane iPSC zachowały swoją fluorescencję nawet po skierowanym różnicowaniu do kardiomiocytów i przeszczepieniu do mysiego modelu zawału mięśnia sercowego (MI), dostarczając mocnych dowodów na użyteczność takich stabilnie fluorescencyjnych pluripotencjalnych komórek macierzystych¹⁴. Aby uzyskać docelowe kolonie, zastosowano metodę pułapki genowej, w której sekwencja peptydu samorozszczepiającego 2A za pomocą syplingu-akceptora (SA) umieszcza gen N-acetylotransferazy puromycyny (PAC) pod kontrolą endogennego promotora PPP1R12C; w związku z tym tylko iPSC, które włączyły dawcę DNA w locus AAVS1, wyrażają PAC, co czyni je wybieralnymi na podstawie oporności na puromycynę; (Rysunek ^1,15). Protokół ten szczegółowo opisuje procedury generowania iPSC AAVS1-GFP opisane w niedawnym artykule¹⁴, w tym proces transfekcji iPSC za pomocą TALEN-ów i dawcy 9,8 kb w celu integracji fragmentu DNA o wielkości 4,2 kb z locus bezpiecznej przystani AAVS1, selekcji iPSC na podstawie oporności na puromycynę i wybierania kolonii do ekspansji klonalnej. Techniki opisane w niniejszym dokumencie mogą być stosowane do wielu eksperymentów inżynierii genomu.

Protokół

1. Przygotowanie matrycy membrany podstawnej i powlekanie wyrobów z tworzyw sztucznych

1. Zamrożony materiał z matrycą błony podstawnej umieścić w temperaturze od -20 °C do lodu i rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Po rozmrożeniu odpipetować 2 mg podwielokrotności macierzy błony podstawnej do wstępnie schłodzonych probówek Eppendorfa. Przechowuj je w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
3. Aby przygotować płytki pokryte matrycą membrany podstawnej, rozmrozić jedną porcję na lodzie, aż ostatni kawałek lodu w probówce eppendorfa zniknie (zwykle w ciągu ~2 godzin).
4. Po rozmrożeniu dodać matrycę błony podstawnej do 12 ml zimnego (4 °C) DMEM/F12, aby uzyskać roztwór do powlekania matrycy membrany podstawnej.
5. Dodać roztwór macierzy błony podstawnej do odpowiedniego naczynia hodowlanego. W przypadku płytki 6-dołkowej należy dozować 1 ml na dołek. Zakręć płytą, aby upewnić się, że roztwór matrycy membrany podstawnej całkowicie zakrywa każdą studzienkę.
6. Parafilm uszczelnić płytę/naczynie pokryte matrycą membrany podstawnej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przed użyciem. Alternatywnie, płyty/naczynia pokryte membraną podstawną należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 2 tygodni od nałożenia powłoki.
   UWAGA: Dodaj dodatkowy DMEM/F12 do płyty/naczynia pokrytego matrycą membrany podstawnej, aby zapobiec wysuszeniu. Przed użyciem płyty/naczynia pokrytego membraną podstawową o temperaturze 4 °C należy umieścić je w komorze bezpieczeństwa biologicznego i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na co najmniej 30 minut.
7. Całkowicie odessać matrycę błony podstawnej przed dodaniem pożywki i komórek.

2. Przygotowanie podłoża E8

1. Przygotować pożywkę E8, rozmrażając suplement E8 przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Usunąć 10 ml podłoża podstawowego E8 z 500 ml bulionu i wyrzucić.
3. Odpipetować całą 10 ml fiolkę z suplementem E8 bezpośrednio do 490 ml podłoża podstawowego E8. Nie podgrzewać kompletnego podłoża E8 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ponieważ powtarzające się wahania temperatury mogą spowodować degradację bFGF w całym podłożu E8.
4. Zużyć kompletną pożywkę E8 w ciągu 2 tygodni od dodania suplementu.

3. Rozmrażanie iPSC

1. Wyjąć fiolkę z zamrożonymi iPSC z ciekłego azotu i umieścić na suchym lodzie.
2. Szybko rozmrozić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; obracać fiolkę w łaźni wodnej do momentu, aż pozostanie tylko niewielki fragment lodu.
3. Spryskać fiolkę 70% etanolem i przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego.
4. Dodać kroplami 1 ml pożywki E8 o temperaturze pokojowej bezpośrednio do fiolki.
5. Za pomocą pipety o pojemności 2 ml przenieść zawiesinę komórek kroplami do 9 ml pożywki E8 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Często obracaj probówką, aby upewnić się, że komórki i podłoże dobrze się mieszają.
6. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut.
7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości E8 uzupełnionej 10 μM Y-27632.
8. Dodać komórki do odpowiedniej liczby studzienek pokrytych matrycą z membraną podstawną i umieścić na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Zaleca się płytki co najmniej 0,2 x 10⁶ iPSC na dołek płytki 6-dołkowej, aby umożliwić szybkie odzyskanie po rozmrożeniu.

4. Konserwacja i rutynowe przechodzenie iPSC

1. Odświeżaj pożywkę E8 codziennie.
2. Monitoruj morfologię i zbieganie się komórek za pomocą odwróconego mikroskopu. Wysokiej jakości iPSC rosną w płaskich koloniach z wyraźnymi granicami; poszczególne kolonie mają wygląd "podobny do kostki brukowej".
3. Przejście komórek iPSC, gdy osiągną ~70% konfluencji.
4. Przygotować roztwór pasażujący EDTA, dodając 0,9 g NaCl i 500 μl 0,5 M EDTA do 500 ml DPBS. Dobrze wymieszaj, aby rozpuścić NaCl i filtr próżniowy do sterylizacji. Przed pasażowaniem ogrzać porcję roztworu pasażującego w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
5. Aby przejść, odessać zużytą pożywkę hodowlaną i przemyć komórki raz równą objętością ciepłego roztworu pasażowego. Aspirat i odpipetować wystarczającą ilość roztworu pasującego EDTA, aby pokryć komórki (1 ml na dołek płytki 6-dołkowej).
6. Umieść komórki pod odwróconym mikroskopem i obserwuj kolonie iPSC. Pojawienie się w koloniach i podniesionych granicach powinno stać się widoczne w ciągu 2 do 5 minut.
7. Ostrożnie zassać roztwór pasażujący EDTA.
8. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml dozować 4 ml pożywki E8 (w przypadku użycia płytki 6-dołkowej) pod wysokim ciśnieniem bezpośrednio do każdej studzienki, która ma być przepuszczona.
9. Zbierz grudki iPSC i podziel je na odpowiednią liczbę dołków w zależności od proporcji podziału od 1:8 do 1:12. Nie należy pipetować zbyt mocno, ponieważ dezagregacja grudek komórek spowoduje słabą żywotność.
10. Umieść płytkę w inkubatorze i kilkakrotnie kołysz płytką w przód iw tył oraz na boki, aby rozproszyć komórki.

5. Przygotowanie MEFów i iPSC do Tansfection

1. 48 godzin przed transfekcją należy przepuścić iPSC w temperaturze ~ 1:6 do czterech lub więcej studzienek 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą membrany podstawnej, tak aby za dwa dni były one w 70% zlewane.
2. Następnego dnia rozmrozić DR4 MEF do pożywki MEF składającej się z DMEM (wysoki poziom glukozy) uzupełnionego 10% FBS i 1x MEM-NEAA.
3. Umieścić DR4 MEF na dwóch 10-centymetrowych szalkach w temperaturze ~ 2 x 10⁴ komórki/^cm2 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
4. W dniu transfekcji należy zmienić pożywkę MEF na E8 uzupełnioną 10 μM Y-27632 30 minut przed wykonaniem transfekcji na iPSC.
5. Opcjonalnie: Jeśli pożądana jest analiza cytometryczna przepływowa iPSC po transfekcji, należy usunąć płytkę pokrytą membraną podstawną z 4 °C i umieścić w temperaturze pokojowej.
6. Opcjonalnie: 4 godziny przed transfekcją uzupełnij hodowlę iPSC przed transfekcją Y-27632 w końcowym stężeniu 10 μM.

6. Leczenie odczynnikiem dysocjacji komórek delikatnych i transfekcja iPSC za pomocą systemu elektroporacji

1. Usunąć roztwór do transfekcji komórek pierwotnych P3 z 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na ~30 minut. Przed użyciem dodać cały 100 μl suplementu do roztworu do transfekcji.
2. Ciepły odczynnik do dysocjacji delikatnych komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Uzyskać TALENY AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 i pZT-AAVS1-R1) oraz dawcę AAVS1-CAG-EGFP od -20 °C.
4. Wyjąć iPSC z inkubatora i przemyć je raz za pomocą DPBS.
5. Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji delikatnych komórek do dołka i inkubować iPSC w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy więcej niż 50% komórek oddzieli się od naczynia hodowlanego.
6. Odpipetuj komórki kilka razy w górę i w dół za pomocą pipety p1000, aby oddzielić wszelkie pozostałe komórki od naczynia hodowlanego i rozbić grudki iPSC.
7. Dodać 2 ml pożywki E8 do każdego dołka i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aby dalej dezagregować grudki komórek na pojedyncze komórki
   UWAGA: Wydajność transfekcji znacznie spada, jeśli grudki komórek nie są wystarczająco zdezagregowane.
8. Zebrać iPSC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 100 x g przez 3 minuty.
9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w minimalnej ilości pożywki E8.
10. Policz komórki za pomocą hemocytometru po nałożeniu ważnego barwnika, takiego jak 0,4% błękitu trypanowego. Upewnij się, że komórki są wystarczająco zdysocjowane podczas liczenia (1-3 komórki na "kępę").
11. Dozować 3 x 10⁶ komórek do każdej z dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml i ponownie odwirowywać w temperaturze 100 x g przez 3 minuty
    UWAGA: Wirowanie z niską prędkością zmniejsza obciążenie komórek i umożliwia łatwe ponowne zawieszenie iPSC przed elektroporacją.
12. Ustawić system elektroporacji na program specyficzny dla typu komórki dla linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H9 (Program CB-150).
13. Po odwirowaniu odessać supernatant z osadów komórkowych. Do jednej osadki dodać 10 μg dawcy HR jako próbkę kontrolną. Do drugiego osadu dodać 10 μg dawcy HR wraz z 5 μg każdego TALEN-a (pZT-AAVS1-L1 i pZT-AAVS1-R1) jako próbkę doświadczalną.
14. Zawiesić każdą osadkę komórkową w 100 μl roztworu do transfekcji komórek pierwotnych P3 i przenieść do kuwety.
15. Wykonaj transfekcję i natychmiast dodaj 500 μl pożywki E8 o temperaturze pokojowej do każdej kuwety.
16. Przenieść transfekowane iPSC kroplami do jednej 10-centymetrowej płytki zawierającej MEF DR4 przygotowane w kroku 5.4.
17. Opcjonalnie: Dodaj kilka kropli z każdego eksperymentu do jednej studzienki 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą membrany podstawnej, jeśli pożądana jest analiza cytometrii przepływowej wydajności transfekcji.
18. Powtórz kroki 6.15-6.17, aby zakończyć obie próbki. Następnego dnia należy dwukrotnie przemyć komórki DPBS i zmienić pożywkę hodowlaną na NutriStem, który wydaje się wspierać hodowlę iPSC na karmnikach lepiej niż E8.
19. Przejściowa ekspresja EGFP osiąga szczyt w 48 do 72 godzinach po transfekcji; oceń skuteczność transfekcji zgodnie z potrzebami.

7. Puromycyna Wybór docelowych iPSC

1. Rozpocznij selekcję puromycyny 72 godziny po transfekcji, gdy iPSC osiągną 70% konfluencji.
2. W przypadku iPSC NCRM5 selekcję puromycyny należy rozpocząć od 0,5 μg/ml puromycyny (1/2 pełnej dawki) rozcieńczonej na pożywce hodowlanej NutriStem. Optymalne stężenie puromycyny może wahać się od 0,25 do 1 μg/mlL dla niektórych linii iPSC.
3. Hodowla iPSC w NutriStem + 0,5 μg/ml puromycyny przez 3 dni, codziennie odświeżając podłoże.
4. Po 3 dniach należy zwiększyć stężenie puromycyny do 1 μg/ml.
5. Hodowla iPSC pod wpływem 1 μg/ml puromycyny przez kolejne 7 do 8 dni lub do momentu, gdy odrębne kolonie pojawią się wystarczająco duże, aby można było je pobrać.

8. Wybieranie kolonii i rozszerzanie docelowych iPSC

1. Użyj macierzy błony podstawnej, aby pokryć 96-dołkową płytkę, dozując 50 μl roztworu do powlekania macierzy błony podstawnej (2 mg matrycy błony podstawnej rozcieńczonej w 12 ml DMEM/F12) do każdej studzienki. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przez noc przed użyciem.
2. Po odczekaniu, aż płyta pokryta matrycą membrany podstawowej osiągnie temperaturę pokojową, odessać matrycę membrany podstawnej i dozować 100 μl E8 uzupełnionego 10 μM Y-27632 do każdej studzienki.
3. Umieść odwrócony mikroskop w komorze bezpieczeństwa biologicznego i lekko spryskaj 70% EtOH w celu sterylizacji.
4. Przeciągnij szklaną pipetę Pasteura na palnik Bunsena, aby uzyskać idealne narzędzie do zbierania kolonii, które ma mały "haczyk" na końcówce. Wysterylizuj 70% EtOH i umieść w kapturze do wyschnięcia.
5. Wyjąć z inkubatora szalkę zawierającą docelowe kolonie iPSC i umieścić w kapturze pod mikroskopem.
6. Wybierz iPSC, rysując okrąg wokół granicy kolonii za pomocą narzędzia do wybierania kolonii.
7. Użyj "haczyka" narzędzia do zbierania kolonii, aby delikatnie zeskrobać i usunąć kolonię iPSC z powierzchni płytki. W przypadku większych kolonii narysowanie znaku X za pomocą narzędzia do zbierania kolonii, aby poćwiartować kolonię, ułatwi wzrost komórek po ponownym posiewaniu.
8. Gdy grudki komórek zostaną odłączone i swobodnie unoszą się na wodzie, użyj pipety p200 ustawionej na ~30 μl, aby zebrać iPSC. Umieść komórki bezpośrednio w płytce 96-dołkowej.
9. Opcjonalnie: za pomocą pipety p20 ustawionej na ~5 μl zebrać iPSC do probówki Eppendorfa, a następnie dodać 50 μl odczynnika do dysocjacji komórek delikatnych do trawienia przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Po roztrawieniu dodać 500 μl pożywki E8 do probówki Eppendorfa, aby rozcieńczyć odczynnik do dysocjacji komórek delikatnych i odwirować komórki przy 200 x g w standardowej mikrowirówce stołowej przez 5 minut. Następnie odessać większość pożywki i pozostawić ~30 μl do ponownego zawieszenia i przeniesienia komórek do płytki 96-dołkowej.
   UWAGA: Takie podejście ułatwi dysocjację skupiska komórek i szybką ekspansję wybranej kolonii.
10. Kontynuuj zbieranie kolonii, aż zostanie zebrana wystarczająca liczba kolonii iPSC (zaleca się około 20-30 kolonii na eksperyment).
11. Po pobraniu kolonii umieść na noc 96-dołkową płytkę w inkubatorze. Odśwież się kompletną pożywką E8 następnego dnia i hoduj do ~70% zlewania się.
12. Przejście komórek z 96-dołka do 24-dołkowego, a następnie do 6-dołkowego, jak opisano w krokach 4.5-4.10.
    UWAGA: objętości roztworu EDTA i pożywki E8 powinny być proporcjonalnie zmniejszone w przypadku stosowania studzienek mniejszych niż płytka 6-dołkowa.
13. Oceń skuteczność celowania za pomocą PCR skrzyżowania i analizy Southern blot w celu potwierdzenia celowanej integracji kasety i braku losowo wstawionych wektorów¹⁶.

Wyniki

Wizualizacja protokołu została przedstawiona na Rysunku 2, gdzie okresy hodowli iPSC w różnych mediach zostały zaznaczone kolorem zielonym dla E8 lub niebieskim dla NutriStem. Ważne jest, aby transfektować jedynie wysokiej jakości iPSC; należy badać naczynia hodowlane podczas rutynowej konserwacji i upewnić się, że hodowle iPSC zawierają głównie wyraźne kolonie o morfologii przypominającej brukowanie (Rysunek 3A); komórki zróżnicowane nie powinny zajmować więcej niż 10% hodowli. Transfek...

Dyskusja

Najważniejszymi etapami pomyślnego wytworzenia ukierunkowanych na AAVS1 ludzkich iPSC w ramach "bezpiecznej przystani" są: (1) skuteczne dostarczanie plazmidów TALEN i dawcy do iPSC poprzez transfekcję; (2) optymalizacja dysocjacji iPSC na pojedyncze komórki przed transfekcją i gęstość posiewu po transfekcji; (3) optymalizacja dawki i czasu doboru leków w oparciu o wzrost linii iPSC; (4) staranne preparowanie i wybieranie docelowych kolonii oraz przenoszenie na nową płytkę/studzienkę. W porównaniu z podobnymi metodami za...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Podstawna membrana membranowa, *bez LDEV, 10 ml	Corning	354230	Przechowywać w temperaturze -20 stopni C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Costar 6 Well Clear Płytki wielodołkowe poddane działaniu TC	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Przechowywać podłoże podstawowe w temperaturze 4 stopni C. Przechowywać suplement w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Y-27632 dichlorowodorek	Tocris	1254	Przechowywać w temperaturze pokojowej Po rozpuszczeniu w H2O, przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Chlorek sodu	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Life Technologies	15575-020
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Life Technologies	14190-250
100 mm Naczynie hodowlane z powłoką TC	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Przechowywać w ciekłym azocie.
DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian	Life Technologies	11995-040	Przechowywać w temperaturze 4 & st. C.
Zdefiniowana płodowa surowica bydlęca,	Hyklon	SH30070.03	Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w temperaturze 4 stopni Celsjusza. C na noc i podwielokrotnie. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 ° C, dopóki nie będzie potrzebny.
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)	Life Technologies	11140-050	Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Jednostka podstawowa 4D-Nucleofector	Lonza	AAF-1001B	część systemu elektroporacji
4D-Nucleofector X	Lonza	AAF-1001X	część systemu elektroporacji
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Po przybyciu wyjmij roztwór ogniw pierwotnych, uzupełnij i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. C i ogrzać podwielokrotność w 37 ° C kąpiel wodna przed użyciem.
NutriStem XF/FF Pożywka	Stemgent	01-0005	Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 i pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 i 52638
[header]
AAVS1-CAG-EGFP Dawca rekombinacji homologicznej	Addgene	22212
Dichlorowodorek puromycyny	Life Technologies	A11138-03	Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Przygotować robocze porcje 1 mg/ml w ddH2O.
Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (chłodnicze), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 & razy; 750 ml Wahadłowy wirnik kubełkowy	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0,4%	Life Technologies	15250-061