Artykuł metodologiczny

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

DOI:

10.3791/52510

⸱

11 kwietnia 2015

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Neurosciences, Faculty of Medicine, Université Laval, 2Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodysekcja laserowa (LCM) pozwala na izolację określonych komórek z cienkich skrawków tkanek z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Skuteczny LCM wymaga precyzyjnej identyfikacji subpopulacji komórek z niejednorodnej tkanki. Identyfikacja komórek będących przedmiotem zainteresowania dla LCM jest zwykle oparta na kryteriach morfologicznych lub na fluorescencyjnych reporterach białkowych. Połączenie LCM i szybkiego znakowania immunologicznego stanowi alternatywny i skuteczny sposób wizualizacji określonych typów komórek i izolowania ich od otaczających tkanek. Wysokiej jakości RNA można następnie wyekstrahować z czystej populacji komórek i dalej przetwarzać do dalszych zastosowań, w tym sekwencjonowania RNA, mikromacierzy lub qRT-PCR. Podejście to było już wcześniej stosowane i pokrótce opisane w kilku publikacjach. Celem tego artykułu jest zilustrowanie, w jaki sposób przeprowadzić szybkie znakowanie immunologiczne populacji komórek przy zachowaniu integralności RNA oraz jak wyizolować te specyficzne komórki za pomocą LCM. W tym artykule zilustrowaliśmy tę wieloetapową procedurę poprzez znakowanie immunologiczne i wychwytywanie komórek dopaminergicznych w tkance mózgowej jednodniowych myszy. Zwracamy uwagę na kluczowe, krytyczne kroki, które zasługują na szczególną uwagę. Protokół ten można dostosować do różnych tkanek i komórek będących przedmiotem zainteresowania. Naukowcy z różnych dziedzin prawdopodobnie skorzystają na demonstracji tego podejścia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózg składa się z wielu różnych typów neuronów tworzących złożone sieci. Neurony te są zorganizowane w odrębne grupy i podgrupy zgodnie z ich morfologią, połączeniem i wzorcem ekspresji genów1. Opracowanie mikromacierzy, sekwencjonowania nowej generacji i qRT-PCR umożliwiło porównanie profili ekspresji genów w populacjach neuronów w różnych kontekstach biologicznych1,2. Te czułe analizy wymagają precyzyjnej identyfikacji i izolacji typów komórek będących przedmiotem zainteresowania przy zachowaniu integralności RNA2-4. Technika sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) jest szeroko stosowana do izolowania określonych typów komórek na podstawie markerów powierzchniowych komórek i/lub morfologii. FACS wymaga etapu dysocjacji komórek przed sortowaniem, co powoduje całkowitą utratę rozdzielczości przestrzennej5. Wiele subpopulacji neuronalnych różni się od siebie ze względu na ich anatomiczne rozmieszczenie w mózgu. Mikrodysekcja laserowa stosowana na cienkich skrawkach mózgu zapewnia odpowiednią opcję do specyficznej izolacji komórek o wysokiej rozdzielczościprzestrzennej 6-8. Głównym ograniczeniem LCM była potrzeba identyfikacji komórek będących przedmiotem zainteresowania na podstawie kryteriów morfologicznych lub fluorescencyjnych reporterów białkowych genetycznie modyfikowanych w modelach zwierzęcych. Opracowanie nowych technik wykonywania szybkich metod znakowania immunologicznego, które zachowały integralność RNA, w połączeniu z LCM, pozwala obecnie na izolację subpopulacji komórek w celu przeprowadzenia eksperymentów profilowania genów.

To podejście zostało już wcześniej przeprowadzone i krótko opisane w kilku publikacjach1,9-13. Tutaj demonstrujemy szczegółową procedurę uzyskiwania wysokiej jakości RNA z określonego podzbioru komórek w złożonej strukturze tkankowej poprzez połączenie szybkiego znakowania immunologicznego z LCM. Pokazujemy, jak wykonać kluczowe kluczowe kroki, aby uzyskać maksymalny odzysk RNA i uniknąć degradacji RNA, ponieważ może to znacząco wpłynąć na profilowanie ekspresji genów.

W celu zademonstrowania tego protokołu, na celowniku znalazły się neurony dopaminergiczne z jednodniowego śródmózgowia myszy. Neurony dopaminergiczne mogą być znakowane immunologicznie za pomocą przeciwciała skierowanego przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH), enzymowi ograniczającemu szybkość syntezy dopaminy. Po barwieniu immunologicznym TH pojedyncze lub grupy neuronów dopaminergicznych można następnie wyizolować za pomocą LCM. Mikrowypreparowane komórki są zbierane w buforze do lizy, a RNA jest ekstrahowane za pomocą zestawu do izolacji RNA. Jakość i ilość wyekstrahowanego RNA mierzy się za pomocą bioanalizatora5. Następnie można przeprowadzić dalszą analizę ekspresji genów za pomocą: sekwencjonowania RNA, mikromacierzy lub qRT-PCR2,4,6. Na przykład zademonstrowano dwuetapowy qRT-PCR na wychwyconych laserowo izolowanych domenach dopaminergicznych. Względna kwantyfikacja poziomów ekspresji dwóch genów markerów neuronów dopaminergicznych ilustruje selektywność tego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Kanadyjskim Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet Ochrony Zwierząt Université Laval.

1. Przygotowanie próbki

UWAGA: W tym przykładzie użyliśmy mózgów myszy w 1. dniu po urodzeniu.

  1. Użyj znieczulenia hipotermicznego w kruszonym lodzie przez 3 do 4 minut dla szczeniąt, a następnie jak najszybciej wypreparuj mózgi w lodowatym podłożu L15. Wykonaj ten krok w ciągu 2 minut.
  2. Przenieś wypreparowane mózgi do formy do zatapiania (por. wykaz materiałów) i wypełnij zamrożonymi pożywkami do zatapiania tkanek, zwracając uwagę na orientację próbki w pożądanej pozycji. Próbki należy natychmiast zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wykonać ten krok w ciągu 30 sek.
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy bez uszczerbku dla jakości RNA.

2. Podział na sekcje

  1. Szkiełka szklane powlekane membraną (por. wykaz materiałów) należy potraktować powierzchniowym roztworem do odkażania RNAzy, aby wyeliminować wszelkie ślady RNAz. Umyj szkiełka w wodzie DEPC i pozostaw do wyschnięcia. Alternatywnie piecz szkiełka przez noc w temperaturze 200 °C.
  2. Zamrożone próbki należy przenieść do kriostatu uprzednio oczyszczonego powierzchniowym roztworem do odkażania RNAzą. Ustawić temperaturę komory kriostatu na -20 °C i pokroić próbki w plastry o grubości 10 μm. Zbierz skrawki tkanek na szkiełkach pokrytych membraną i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut przed barwieniem. Alternatywnie szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu zabarwienia.

3. Przygotowanie roztworów barwiących

  1. Przygotuj wszystkie roztwory tuż przed rozpoczęciem eksperymentu i użyj inhibitora RNAzy we wszystkich roztworach barwiących (z wyjątkiem roztworów do mycia), aby zapobiec degradacji RNA.
  2. Przygotować roztwór buforowy. Stosować ten sam bufor we wszystkich roztworach (składających się z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez RNAz, uzupełnionej 1% BSA, 0,2% trytonu i 2% inhibitora RNAzy). Na każde szkiełko należy przygotować 400 μl roztworu buforowego (200 μl dla przeciwciał pierwszorzędowych i 200 μl dla przeciwciał drugorzędowych).
  3. Przygotować roztwór utrwalający: użyć 70% etanolu przechowywanego w temperaturze -20 °C. Procedurę utrwalania tkanek należy ograniczyć do minimum, aby uniknąć drastycznego zmniejszenia wydajności ekstrakcji RNA.
    UWAGA: Alternatywnie należy użyć 95% roztworu etanolu uzupełnionego 5% kwasem octowym przechowywanym w temperaturze -20 °C.
  4. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze buforowym. Do znakowania neuronów dopaminergicznych należy użyć przeciwciała skierowanego przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH, enzym ograniczający szybkość produkcji dopaminy). Użyj wysokiego stężenia przeciwciał, aby skompensować szybki czas inkubacji. Stosować przeciwciało TH w rozcieńczeniu 1:25,
    UWAGA: W normalnym protokole immunofluorescencji przeciwciało to daje silny sygnał podczas inkubacji przez noc w rozcieńczeniu 1:1,000. W tym protokole jest stosowany 40 razy bardziej skoncentrowany ze względu na krótki czas inkubacji. Ze względu na wysokie stężenie przeciwciał stosowanych w tej metodzie, należy równolegle przeprowadzić standardowe barwienie immunologiczne w celu sprawdzenia ewentualnego wzrostu znakowania nieswoistego.
  5. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając przeciwciało drugorzędowe w roztworze buforowym. Stosować biotynylowane przeciwciało drugorzędowe w stężeniu 1:100,
    UWAGA: W tym przykładzie użyliśmy biotynylowanego przeciwciała anty-króliczego.
  6. Przygotować roztwór kompleksu awidyna-biotyna (ABC) do wykrywania biotynylowanych przeciwciał drugorzędowych. Przygotować roztwór ABC, dodając związek A i związek B w stężeniu 1:100 rozcieńczony w PBS DEPC uzupełnionym 2% inhibitorem RNAzy. Przygotuj kompleks Avidin-Biotin 30 minut przed dodaniem go do szkiełek.

4. Barwienie

  1. Rozmrażaj jedną lub dwie szkiełka jednorazowo od -80 °C, szybko wyrzucając je w powietrze (lub użyj dmuchawy). Otocz sekcje hydrofobowym pisakiem barierowym i pozostaw do wyschnięcia na kilka sekund.
    1. Umieścić szkiełka w zimnym roztworze utrwalającym nie dłużej niż 5 minut w temperaturze -20 °C. Wstrząsnąć raz na powietrzu, aby usunąć nadmiar roztworu utrwalającego, a następnie szybko zanurzyć szkiełka w DEPC PBS 6-8 razy w celu umycia.
    2. Przesuwaj slajdy, aby usunąć nadmiar PBS DEPC. Upewnij się, że etap rozmrażania szkiełek nie przekracza 5 minut.
  2. Umieścić szkiełka na czystej tacy (wstępnie potraktowanej powierzchniowym roztworem do odkażania RNAzy w celu wyeliminowania wszelkich śladów RNAz) i umieścić 200 μl pierwszorzędowego roztworu przeciwciała na każdym szkiełku (króliczym anty-TH) na 10 minut w temperaturze pokojowej. Zanurz szybko szkiełka w DEPC PBS 3 razy w celu umycia i przesuń szkiełka raz, aby usunąć nadmiar DEPC PBS.
  3. Umieścić 200 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych na każdym szkiełku przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Zanurz szybko szkiełka 3 razy w DEPC PBS w celu umycia i przesuń szkiełka, aby usunąć nadmiar DEPC PBS.
  4. Umieścić 200 μl roztworu ABC na każdym szkiełku przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Zanurz szybko szkiełka w DEPC PBS 3 razy w celu umycia i przesuń slajdy, aby usunąć nadmiar DEPC PBS.
  5. Przygotować roztwór DAB (3,3' diaminozydyny) podczas 4 minut inkubacji w roztworze ABC. Użyj odczynników dostarczonych w zestawie (DAB Peroxidase Substrate Kit). Wymieszaj 1 kroplę dostarczonego buforu, 1 kroplę roztworu DAB i 1 kroplę 30% H2O2 w 2,5 ml wody DEPC. Wymieszaj roztwór, odwracając go.
  6. Weź 196 μl roztworu DAB i dodaj 4 μl (2%) roztworu inhibitora RNAzy tuż przed rozprowadzeniem na szkiełkach. Umieść szkiełka na czystej tacy (wstępnie potraktowanej powierzchniowym roztworem do odkażania RNAzą) i umieść 200 μl roztworu DAB na szkiełkach.
    UWAGA: Roztwór DAB powinien zareagować w ciągu 1 lub 2 minut.
  7. Zanurz szybko szkiełka w DEPC PBS 3 razy w celu umycia i umieść szkiełka na kilka sekund w absolutnym etanolu. Wysuszyć szkiełka, wyrzucając je w powietrze (lub użyj dmuchawy).
    UWAGA: Preparaty mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości lub przetwarzane na LCM.

5. Mikrodysekcja przechwytywania laserowego

  1. Rozmrażanie przesuwa się szybko, przesuwając je w powietrzu (lub używając dmuchawy powietrza). Upewnij się, że etap rozmrażania szkiełek nie przekracza 5 minut.
  2. Przejdź do LCM. Umieść szkiełko pod mikroskopem stroną z próbką skierowaną w stronę nasadki probówki zbiorczej. Wybierz najlepsze powiększenie dla próbki. Dostosuj fokus, aby zobaczyć interesujące Cię komórki.
    1. Zdefiniuj obszar cięcia i rozpocznij cięcie za pomocą lasera. Zebrać wypreparowane komórki lub kawałek tkanki w nasadce probówki wypełnionej 50 μl buforu do lizy (z zestawu do ekstrakcji RNA). Upewnij się, że krok LCM nie przekracza 30 minut.
  3. Wyodrębnij całkowite RNA z izolowanych komórek za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA (por. lista materiałów). Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
    1. Inkubować zebrane komórki przez 30 minut w temperaturze 42 °C w celu lizy komórek. Wstępnie kondycjonować kolumnę oczyszczającą RNA, dodając 250 μl buforu kondycjonującego. Załaduj 50 μl etanolu do zlizowanych komórek. Załadować 100 μl zlizowanych komórek do wstępnie przygotowanej kolumny oczyszczającej.
    2. Odwirować kolumnę przy 16 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Umyć kolumnę dwukrotnie myjącymi. Eluować w minimalnej zalecanej objętości (11 μl) wody wolnej od RNAzów (nie poddawanej działaniu DEPC, ponieważ może to zakłócać działanie bioanalizatora). Zachowaj 2 μl do sprawdzenia jakości.
      UWAGA: Wszystkie roztwory i odczynniki znajdują się w zestawie.

6. Synteza cDNA i ilościowy RT-PCR

  1. Odwrotna transkrypcja próbek RNA z laserowo wychwyconych komórek dopaminergicznych na komplementarne DNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy i oligo(dT). Postępuj zgodnie z protokołem producenta (por. lista materiałów).
  2. Użyj 1 μl cDNA do amplifikacji qRT-PCR za pomocą starterów specyficznych dla genu. Ustawić reakcje PCR w objętości 20 μl z jednoskładnikową mieszanką reakcyjną gorącego startu do ilościowej reakcji PCR zgodnie z zaleceniami producenta. Każdą reakcję przeprowadzić w trzech egzemplarzach.
    1. Do opisanych tutaj eksperymentów użyj następujących par starterów: Gapdh-F(5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3')/Gapdh-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3'); Rpl13a-F (5'-ACA GCC ACT CTG GAG AA-3') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3') ; Th-F (5'-CAG, TGG, AGG, ATG, TGT, CTC, -3') / Th-R (5'-GAA, AAT, AC, GGG, CAG, ACA, G-3'); Aadc-F (5'- CAT GAG AGC, TTC, TGC, CCT, TC -3')/Aadc-R (5'- GGA, TGT, GGT, CCC, CAG, AG, -3').
  3. Przeprowadzić ilościową amplifikację RT-PCR przy użyciu następujących parametrów szybkich cykli: 95 °C przez 5 minut, a następnie 45 cykli po 10 sekund 95 °C, 10 sekund w temperaturze 60 °C i 10 sekund w temperaturze 72 °C. Przeprowadzić analizę krzywej topnienia przy użyciu domyślnego ustawienia przyrządu w celu określenia tworzenia jednorodnego produktu.
  4. Analizuj dane za pomocą wbudowanego oprogramowania.
    1. Znormalizuj wartości ekspresji markerów DA genów Th i Aadc z ekspresją dwóch genów referencyjnych Gapdh i Rpl13a, aby uzyskać względne poziomy ekspresji, jak opisano wcześniej14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta szybka procedura immunoznakowania pozwala na wizualizację interesujących komórek przy jednoczesnym zachowaniu integralności RNA. Rysunek 1 ilustruje etapy przygotowania tkanki przed ekstrakcją RNA. Po kriosekcji neurony dopaminergiczne są znakowane za pomocą przeciwciała skierowanego przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (znakowane neurony pojawiają się na brązowo). W zależności od pytania eksperymentalnego, pojedyncze komórki lub większy obszar zainteresowania można wyizolować za pomocą LCM (Fi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej krytycznym punktem tej metody jest znakowanie interesujących komórek przy jednoczesnym zapobieganiu degradacji RNA. Ponieważ RNAzy są aktywne w roztworach wodnych, skrócenie czasu inkubacji poprawia zachowanie RNA11,15. Wszystkie użyte roztwory muszą być traktowane DEPC w celu inaktywacji RNAz. Wszystkie materiały i powierzchnie muszą być poddane działaniu powierzchniowego roztworu do odkażania RNAzy, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNAzy. Wreszcie, w tych warunkach, dodanie inhibitora RNAzy we wszys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez grant z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC otrzymuje stypendium od Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB jest finansowany ze stypendium Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ), a ML jest FRSQ Chercheur-Boursier.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Prowadnice powlekane membraną Leica Biosystems11505158MembranySlides PEN-Membrana 2,0 & mikro; m; 50 sztuk
Powierzchniowy roztwór do dekontaminacji RNAzyTechnologie życioweAM9780RNaseZap
Fixative70% Etanol utrzymywany na poziomie -20 ° C
Anty-TH Pel-ZamrażakP40101  1:25
wolny od RNAzyDEPC PBS + 1% BSA + 0,02% inhibitor
RNAzyPromegaN2615Rnasine Plus Rnazy Inhibitor 40 kU/ml (stock)
Anty-królik biotynylowanyVector LaboratoriesBA-1000
Vectastain Elite ABC zestaw StandardVector LaboratoriesPK-61008µ l/ml
Zestaw substratu peroksydazy DAB Vector LaboratoriesSK-4100
Zestaw do izolacji RNATechnologie życioweKIT0204Zestaw do izolacji RNA Arcturus PicoPure
H2O2 30%SigmaHC4060
Absolutny
System mikropreparacji laserowejMikrosystemyModel AS-LMD
DEPCAlfa AesarB22753-14
BioanalizatorAgilentAgilent 2100 Bioanalizator
Forma do zatapiania Leica Biosystems147022183116x8mm
Hydrofobowe pióro barierowe Vector LaboratoriesH-4000
Podłoża do zatapiania mrożonych tkanekTissue-Tek4583
Aligent Technologies5067-1513RNA 6000 Pico LabChip używany z bioanalizatorem Agilent 2100
Mieszanina reakcyjna gorącego startu do ilościowego PCRRoche6402712001Fast Start Essential DNA Green
Master Odwrotna transkryptazaŻycie technologie11752-050SuperScript III Synteza pierwszej nici SuperMix do qRT-PCR
Bufor trytonu etanol Leica Chip Bioanalyzer

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
  4. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  5. Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
  6. Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
  7. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
  8. Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
  9. Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
  10. Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938(2013).
  11. Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
  12. Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
  13. Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
  14. Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , International University Line (IUL). La Jolla, CA. (2004).
  15. Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
  16. Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
  17. Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
  18. Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
  19. Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cell SubpopulationsBrain TissueRNA IntegrityRNA ExtractionqRT PCRRNA SequencingMicroarray

Powiązane artykuły