Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie kontrastowe w zarodkach myszy za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52520

⸱

4 marca 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Sunnybrook Research Institute, 3Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania ultradźwiękowych mikropęcherzykowych środków kontrastowych do żywych, izolowanych mysich zarodków w późnym stadium ciąży. Metoda ta umożliwia badanie parametrów perfuzji i naczyniowych markerów molekularnych w obrębie zarodka za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości ze wzmocnieniem kontrastowym.

Streszczenie

Obrazowanie ultradźwiękowe ze wzmocnionym kontrastem może dostarczyć istotnych informacji ilościowych dotyczących unaczynienia tkanek i perfuzji, a w docelowych zastosowaniach ułatwić wykrywanie i pomiar biomarkerów naczyniowych na poziomie molekularnym. W obrębie zarodka myszy ta nieinwazyjna technika może być wykorzystana do odkrycia podstawowych mechanizmów leżących u podstaw rozwoju naczyń krwionośnych we wczesnym układzie krążenia myszy oraz w genetycznych modelach chorób sercowo-naczyniowych. Zarodek myszy stanowi również doskonały model do badania adhezji mikropęcherzyków do celów angiogennych (w tym receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 2 (VEGFR2) lub αw porównaniu zβ3) oraz do oceny ilościowego charakteru ultradźwięków molekularnych. W związku z tym opracowaliśmy metodę wprowadzania ultrasonograficznych środków kontrastowych do naczyń krwionośnych żywych, izolowanych zarodków. Pozwala to na swobodę w zakresie kontroli wtrysku i pozycjonowania, odtwarzalność płaszczyzny obrazowania bez przeszkód i ruchu oraz uproszczoną analizę obrazu i kwantyfikację. W późnym stadium ciąży (dzień embrionalny (E)16,6 i E17,5) mysie zarodki wyizolowano z macicy, delikatnie wyeksterioryzowano z woreczka żółtkowego, a do żył dostępnych na powierzchni kosmówki krążka łożyskowego wstrzyknięto mikropęcherzykowe środki kontrastowe. Nieliniowe obrazowanie ultrasonograficzne z kontrastem zostało następnie wykorzystane do zebrania szeregu podstawowych parametrów perfuzji (wzmocnienie piku, szybkość wymywania i czas do szczytu) oraz ilościowego określenia docelowego wiązania mikropęcherzyków w mysim modelu endoglinu. Pokazujemy udaną cyrkulację mikropęcherzyków w żywych zarodkach i użyteczność tego podejścia w charakterystyce unaczynienia embrionalnego i zachowania mikropęcherzyków.

Wprowadzenie

Obrazowanie ultrasonograficzne z kontrastem wykorzystuje środki kontrastowe z mikropęcherzykami do wizualizacji i charakterystyki środowiska naczyniowego. Środki te umożliwiają nieinwazyjną ocenę mikrokrążenia, unaczynienia i funkcji układu krążenia. Ponadto modyfikacja powierzchni pęcherzyka może prowadzić do celowego wiązania mikropęcherzyków z biomarkerami śródbłonka, jak wykazano w przedklinicznych zastosowaniach angiogenezy, miażdżycy i stanu zapalnego 1,2, umożliwiając molekularne obrazowanie ultrasonograficzne zdarzeń naczyniowych. Ultrasonografia wzmocniona kontrastem może być zatem wykorzystana do identyfikacji złożonych i zróżnicowanych środowisk, które wpływają na zdrowe i chore stany naczyniowe3-5.

W ciągu ostatnich kilku lat zainteresowanie użytecznością obrazowania mikropęcherzyków rozszerzyło się na wszechstronny model embrionu myszy. Jako model rozwoju ssaków, wprowadzenie mikropęcherzyków do naczyń krwionośnych zarodka usprawnia fizjologiczne badanie rozwijającego się układu krążenia (np. przepływu krwi, pojemności minutowej serca), a w przypadku transgenicznych i celowanych zmutowanych mysich modeli choroby serca 6,7 może dostarczyć informacji na temat tego, jak czynniki genetyczne zmieniają funkcję układu krążenia. W rzeczywistości przeprowadzono już ilościowe i jakościowe analizy 2D unaczynienia mózgu embrionalnego8. Co więcej, zarodek myszy stanowi doskonały model do badania wiązania docelowych mikropęcherzyków z markerami naczyniowymi in vivo. Bartelle i wsp.9, na przykład, wprowadzili mikropęcherzyki awidyny do komór serca zarodka, aby ocenić celowe wiązanie w transgenicznych zarodkach Biotag-BirA i zbadać anatomię naczyń krwionośnych. Generowanie heterozygotycznych i homozygotycznych modeli myszy może być również wykorzystywane jako substytut badań nad modelami nowotworowymi mających na celu określenie ilościowego charakteru ultrasonografii molekularnej - ważnego punktu odniesienia w tłumaczeniu tej techniki na praktykę kliniczną.

Mikropęcherzyki są najczęściej wprowadzane do krążenia embrionalnego poprzez iniekcje dosercowe do pojedynczych zarodków narażonych na laparotomię8-10. Zastrzyki in utero wiążą się jednak z wieloma wyzwaniami. Obejmują one wskazówki dotyczące iniekcji, konieczność przeciwdziałania ruchom w zarodku matki i zarodka zezewnętrznego, utrzymanie żywotności hemodynamicznej u matki i zarodków zewnętrznych, zajęcie się długoterminowymi skutkami znieczulenia i powikłaniami spowodowanymi krwawieniem11. W związku z tym celem badań było opracowanie techniki wstrzykiwania mikropęcherzyków do izolowanych żywych zarodków w późnym stadiumrozwoju 12. Ta opcja zapewnia większą swobodę w zakresie kontroli wtrysku i pozycjonowania, odtwarzalność płaszczyzny obrazowania bez przeszkód oraz uproszczoną analizę obrazu i kwantyfikację.

W obecnym badaniu przedstawiamy nowatorską procedurę wstrzykiwania mikropęcherzyków do żywych embrionów myszy w celu zbadania kinetycznego zachowania mikropęcherzyków i zbadania celowego wiązania mikropęcherzyków z endogennymi markerami powierzchni śródbłonka. Nieliniowe obrazowanie ultrasonograficzne z określonym kontrastem służy do pomiaru szeregu podstawowych parametrów perfuzji, w tym wzmocnienia piku (PE), szybkości wymywania i czasu do szczytu (TTP) w izolowanych zarodkach E17,5. Wykazujemy również przydatność modelu zarodkowego do oceny ilościowego charakteru ultradźwięków molekularnych w transgenicznym modelu myszy z utratą funkcji endoglinu embrionalnego, w którym endoglin jest klinicznie istotnym celem ze względu na jego wysoką ekspresję w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych w miejscach aktywnej angiogenezy13. W heterozygotycznych endoglinach (Eng+/-) i homozygotycznych endoglinach (Eng+/+) ocenia się adhezję mikropęcherzyków ukierunkowanych na endoglin (MBE), kontrolnych izotypu IgG2 szczurów (MBC) i niecelowanych (MBU). Analiza docelowego wiązania ujawnia, że ultradźwięki molekularne są zdolne do różnicowania genotypów endoglinu i odnoszenia gęstości receptorów do mierzalnych poziomów ultradźwięków molekularnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Procedury eksperymentalne przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w Instytucie Badawczym Sunnybrook (Toronto, Ontario, Kanada). Procedury humanitarnego traktowania zwierząt muszą być zawsze przestrzegane. Zakłada się, że badacz jest przeszkolony w zakresie podstawowej obsługi systemu obrazowania ultrasonograficznego. Ten protokół działa najlepiej w przypadku dwóch osób.

1. Modele zwierząt

  1. Kryj CD-1 samca i samicę Mus musculus w celu uzyskania zarodków typu dzikiego do badań perfuzji.
  2. W przypadku badań obrazowania molekularnego wygeneruj myszy Eng + / - przez rekombinację homologiczną przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych pochodzenia 129 / Ola, jak opisano przez Bourdeau i wsp.Rozdział 14.
    1. Myszy Backcross B6- Eng +/-, uprzejmie nabyte od dr Michelle Letarte, do tła CD-1. Użyj zarodków skrzyżowanych wstecznie Eng+/- CD-1, a także ich kontroli z miotu Eng+/+. Połącz myszy, aby wyprodukować zarodki w stadium.

2. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Zainicjuj kojarzenie myszy i codziennie sprawdzaj wtyczki. Dzień embrionalny 0,5 definiuje się jako południe w dniu, w którym obserwuje się czop pochwowy.
  2. Przygotować pożywkę dla zarodków, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej, 5 ml 1 M HEPES i 5 ml penicyliny-streptomycyny (10 000 jednostek penicyliny, 10 000 μg streptomycyny) do 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Sole (DMEM) firmy Dulbecco o wysokim stężeniu glukozy (4 500 mg/l). Zawinąć butelkę w folię i przechowywać w stanie schłodzonym w temperaturze 4 °C.
  3. Odwirować przezroczysty żel ultradźwiękowy w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml o pojemności 140 x g przez 20 min. Pobrać żel do strzykawek o pojemności 30 ml. Napełnić dodatkowe (oznaczone) strzykawki o pojemności 30 ml solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i odstawić na bok. Jeden miot zarodków będzie zazwyczaj wymagał od 2 do 3 strzykawek żelu do ultradźwięków i 4 strzykawek PBS.
  4. Wyciągnij około 30 szklanych igieł i delikatnie przymocuj do paska plasteliny w naczyniu do hodowli komórkowej o wymiarach 100 x 20 mm. Gwarantuje to, że igły są oddzielone i zabezpieczone podczas przenoszenia. Za pomocą ściągacza do szkła użyj następujących ustawień na szklanych kapilarnach 1 x 90 mm z żarnikiem: Grzałka 77, Magnes podrzędny 55, Magnes główny 70.
  5. Przygotuj od dziesięciu do dwunastu płytek separacyjnych (wystarczająco dużo, aby zapewnić, że każdy zarodek w miocie otrzyma własne naczynie), używając stosunku objętości utwardzacza do podstawy 1:8. Wlać 40 ml bazy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 5-6 ml utwardzacza i wymieszaj drewnianym patyczkiem.
    1. Wlać do naczyń hodowlanych o wymiarach 60 x 15 mm, wypełniając każdą do około połowy. Pozostaw O/N do ustawienia.
  6. Przymocuj żeńskie luery do kawałków rurki z polichlorku winylu (PVC) o długości 400 mm (średnica wewnętrzna: 0,79 mm). Rurka musi wygodnie sięgać od pompy strzykawkowej do stopnia ultrasonograficznego.

3. Konfiguracja eksperymentalna

  1. Ułóż platformę obrazowania pod mikroskopem operacyjnym z silnikiem 3D i przetwornikiem liniowym 21 MHz.
    1. Ustaw platformę tak, aby uchwyt szynowy znajdował się po lewej stronie, a stolik znajdował się bezpośrednio pod mikroskopem.
    2. Przymocuj silnik 3D do przegubu kulowego ramienia przedłużającego platformy. Przykręć szybkozłączkę przetwornika clamp do szybkozłączki na silniku, skierowanej do przodu, i umieść głowicę przetwornika w zacisku, mocując zatrzask.
    3. Zamocuj złącze przetwornika w aktywnym porcie na przednim panelu wózka. Włącz urządzenie.
  2. Zainicjuj działanie głowicy ultradźwiękowej 21 MHz, wybierając ustawienie "kardiologiczne" dla badań obrazowania molekularnego i "ogólne" dla badań perfuzji. Przesuń wszystkie suwaki kompensacji przyrostu czasu dokładnie do środkowej pozycji. Dla "Trybu kontrastu" ustaw następujące parametry: Częstotliwość: 18 MHz, moc nadawania: 4%, (0,39 MPa), Wzmocnienie kontrastu: 30 dB, Ogniska: 6 i 10 mm, Tryb kontrastu: nieliniowy, Czas serii: 100% przy 0,1 s, Szerokość wiązki: Szeroka.
  3. Podwielokrotność 40 ml pożywki dla zarodków w czterech stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Ułóż na lodzie.
  4. Podgrzej 1 l wody w zlewce o pojemności 2 l na gorącej płycie. Przechowywać w temperaturze 45 °C. Dodać jedną strzykawkę z żelem do ultradźwięków i PBS do zlewki w celu podgrzania. Utrzymuj tę temperaturę, monitorując ją przez cały czas za pomocą termometru.
  5. Odłożyć na bok dziesięć do dwunastu strzykawek o pojemności 1 ml i dziesięć do dwunastu igieł 21 G do wstrzykiwania mikropęcherzyków.

4. Zabieg chirurgiczny

UWAGA: Niech asystent przygotuje bąbelki (etap 5), podczas gdy chirurg rozpocznie zabieg chirurgiczny. Opisany tutaj protokół został zaadaptowany z Whiteley et al.15

  1. Pobrać zarodki E16,5 lub E17,5 od ciężarnej samicy myszy po zwichnięciu szyjki macicy.
    UWAGA: Wpływ znieczulenia na zarodki nie został jeszcze szczegółowo przebadany16. Dodatkowe metody, w tym dekapitacja, mogą być odpowiednimi opcjami dla złożenia ciężarnych myszy.
    1. Rozetnij brzuch, aby odsłonić macicę i zarodki. Ostrożnie i szybko usuń macicę, przecinając końce rogów macicy (przecinając naczynia jajnikowe i maciczne) oraz przecinając pochwę i pęcherz
      2. moczowy.
    2. Za pomocą kleszczy do odłamków przenieś macicę do probówki zawierającej 40 ml lodowatej pożywki dla zarodków tak szybko, jak to możliwe, nie uszkadzając zarodków. Wyrzuć tuszę myszy.
  2. Przenieś do mikroskopu i sceny. Umieść macicę w naczyniu do hodowli komórkowej o wymiarach 100 x 20 mm. Przenieś macicę do nowego naczynia wypełnionego 50 ml świeżej pożywki dla zarodków.
  3. Za pomocą wysterylizowanych (70% etanolu w sprayu) drobnych kleszczyków delikatnie rozerwij i odciągnij zewnętrzne błony macicy, zaczynając od jednego końca. Odsłonić łożysko liściaste, woreczek żółtkowy ciemieniowy i błonę Reicherta w celu oddzielenia i usunięcia z leżącego poniżej woreczka żółtkowego trzewnego.
  4. Wypreparuj zarodki jeden po drugim, pozostawiając trzewne woreczki żółtkowe w stanie nienaruszonym i dotykając łożyska tak delikatnie, jak to możliwe17. Uważaj, aby nie dopuścić do pęknięcia woreczka żółtkowego, ponieważ zarodki natychmiast wyskakują.
    1. Za pomocą perforowanej łyżki przenieś zarodki do innego naczynia trzymanego na lodzie ze świeżą pożywką dla zarodków. Trzymaj zarodki w chłodzie, aż będą potrzebne. Zmieniaj pożywkę w naczyniu z zarodkami co 1-1,5 godziny. W tych warunkach zarodki są zdolne do życia do 4 godzin po sekcji.

5. Przygotowanie mikropęcherzyków

UWAGA: Wykonaj obrazowanie molekularne za pomocą ultradźwięków, używając zarówno docelowych, jak i niedocelowych mikropęcherzyków. Pojedynczy eksperyment może wymagać aż 3 oddzielnych fiolek z mikropęcherzykami: i) mikropęcherzyki ukierunkowane na przeciwciała, ii) mikropęcherzyki ukierunkowane na przeciwciała izotypowe kontrolne i iii) mikropęcherzyki nieukierunkowane. Środek kontrastowy występuje w postaci proszku do zamrażania na sucho i przed wstrzyknięciem należy go rozpuścić w roztworze soli fizjologicznej. W każdej niedocelowej fiolce z mikropęcherzykami znajduje się ~2 x 109 mikropęcherzyków, a w fiolkach gotowych do użycia ~8,8 x 108 mikropęcherzyków. Mikropęcherzyki są stabilne do 3 godzin po rozpuszczeniu.

  1. Rekonstytucja fiolek gotowych do użycia w
    UWAGA: Przykłady preparatów gotowych do użycia w celu: mikropęcherzyki ukierunkowane na endoglin (MBE, z biotynylowanym szczurzym przeciwciałem MJ 7/18 przeciwko endoglinowi myszy; w domowym zakładzie hybrydoma); mikropęcherzyki ukierunkowane na receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 2 (VEGFR2) (MBV, z anty-mysią biotyną CD309); przeciwciało kontrolne szczura IgG2 ukierunkowane na mikropęcherzyki (MBC, biotyna szczura izotyp IgG2 kontrola ukierunkowana na mysz IgG2a).
    1. Rozcieńczyć roztwór przeciwciał (20 μg) w 1 ml (końcowa objętość) soli fizjologicznej. Trzymaj na lodzie.
    2. Napełnić strzykawkę 1 ml soli fizjologicznej, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza. Podłączając igłę 21 G, powoli wstrzyknąć roztwór do fiolki z mikropęcherzykami.
    3. Powoli wyjąć tłok, usuwając 1 ml powietrza i wyjąć igłę. Delikatnie poruszyć. Odstawić na 5 minut na lód.
      UWAGA: Mikropęcherzyki ultradźwiękowe mogą ulec zniszczeniu w środowisku o wysokim ciśnieniu.
    4. Po upływie tego czasu napełnić nową strzykawkę rozcieńczeniem przeciwciał i dodać do odpowiedniej fiolki. Delikatnie poruszyć. Odstawić mieszaninę (teraz 2 ml) na 10 minut. Trzymaj na lodzie. Zakładając pełną koniugację powierzchniową, średnia liczba związanych ligandów dla mikropęcherzyków wynosi około18 7 600 ligandów/μm2.
  2. Rekonstytucja niedocelowych fiolek
    1. Napełnić strzykawkę 1 ml soli fizjologicznej, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza. Podłączając igłę 21 G, powoli wstrzyknąć roztwór do fiolki z mikropęcherzykami.
    2. Powoli wyjąć tłok, usuwając 1 ml powietrza i wyjąć igłę. Delikatnie poruszyć. Odstawić na 5 minut. Dodaj dodatkowo 1 ml soli fizjologicznej, jak opisano powyżej. Delikatnie wymieszaj i odstaw na 10 minut na lód.
  3. Liczenie redlic
    1. Delikatnie wymieszać żądaną fiolkę z mikropęcherzykami i pobrać ~50 μl roztworu do strzykawki o pojemności 1 ml za pomocą igły 21 G. Wstrzyknąć mikropęcherzyki do pustej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.
    2. Odpipetować 10 μl próbki roztworu podstawowego mikropęcherzyków do 10 ml rozcieńczalnika.
    3. Po delikatnym wymieszaniu ocenić stężenie i rozkład wielkości populacji mikropęcherzyków, stosując liczenie redlic (patrz Wykaz materiałów). Wykonać co najmniej trzy pomiary po 50 μl (na próbkę z fiolki) przy użyciu apertury 30 μm.
  4. Przygotowanie mikropęcherzyków do wstrzykiwań
    UWAGA: Asystent wykonuje ten krok, gdy rozpoczyna się "Wstrzykiwanie mikropęcherzyków do zarodków" (krok 6). Każdy zarodek jest wstrzykiwany jednokrotnie, przy czym rodzaj mikropęcherzyków wybrany do każdego wstrzyknięcia jest losowo wybierany przez asystenta, tak aby wszystkie rodzaje mikropęcherzyków były równomiernie rozmieszczone podczas całej procedury, ale podawane w losowej kolejności. Upewnij się, że chirurg jest ślepy na rodzaj wstrzykiwanego pęcherzyka.
    1. Oznaczyć objętość podstawowego roztworu pęcherzykowego potrzebną do wytworzenia końcowego stężenia 1 x 108 MB/ml w objętości 400 μl (obliczyć objętość na podstawie stężeń podstawowych zmierzonych w ppkt 5.3.3). Porcję odpowiedniej objętości soli fizjologicznej przelać do pustej probówki do mikrowirówki.
    2. Delikatnie wymieszać wybraną fiolkę z mikropęcherzykami i za pomocą igły 21 G pobrać nadmiar objętości (~50 μl więcej niż obliczona powyżej) roztworu do strzykawki o pojemności 1 ml. Wstrzyknąć mikropęcherzyki do pustej probówki do mikrowirówki.
    3. Odmierzyć pipetą odpowiednią objętość roztworu podstawowego mikropęcherzyków i dodać do porcji soli fizjologicznej. Wymieszać, delikatnie mieszając końcówką pipety.
    4. Pobrać rozcieńczony roztwór mikropęcherzyków do czystej strzykawki za pomocą igły 21 G. Wyjmując igłę, usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki i założyć luer oraz rurkę. Powoli wepchnij roztwór do końca rurki, uważając, aby nie wytworzyć żadnych pęcherzyków powietrza.
    5. Włożyć strzykawkę do pompy infuzyjnej strzykawki w celu dozowania mikropęcherzyków z szybkością 20 μl/min, co daje całkowitą objętość 20 μl. Przymocować wyciągniętą szklaną igłę do końca rurki. Przesunąć pompę w pobliże etapu wtrysku.

6. Wstrzykiwanie mikropęcherzyków do zarodków

  1. Losowo wybrać i usunąć (za pomocą perforowanej łyżki) jeden zarodek z naczynia ze schłodzoną pożywką. Umieścić w naczyniu separacyjnym znajdującym się na stoliku ultrasonograficznym pod stereoskopem i usunąć woreczek żółtkowy i błony owodniowe za pomocą cienkich kleszczy, nacinając/rozdzierając od strony, która wydaje się najmniej unaczyniona (strona antypatiometryczna). Najłatwiej to osiągnąć, przebijając obszar przylegający do obszaru głowy.
    1. Wytnij wystarczająco dużo, aby usunąć zarodek od wewnątrz, ale nie więcej. Ustabilizuj naczynia preparacyjne za pomocą małych kawałków plasteliny.
  2. Delikatnie manewruj workiem od okolic zarodka. Ułóż zarodek na boku, z łożyskiem i naczyniami pępowinowymi z przodu. Za pomocą szpilek przeciw owadom przypnij woreczek żółtkowy (zalecane 4 szpilki) i krawędzie łożyska, jeśli to konieczne, aby przymocować je na miejscu. Unikaj głównych statków.
  3. Umyć zarodek wstępnie ogrzanym PBS o temperaturze 45 °C, aż zarodek ożyje. Zidentyfikuj żyłę pępowinową i związaną z nią sieć naczyniową. Ustawić naczynie tak, aby można było wygodnie wykonać wstrzyknięcie.
    UWAGA: Po ogrzaniu krew w zarodku zacznie płynąć, widocznie pompując w tętnicy pępowinowej. Kiedy zacznie się przepływ, żyły będą jaskrawoczerwone, a krew w obu naczyniach szybko stanie się identyczna. Gałęzie powstające z żyły pępowinowej zwykle nakładają się na gałęzie z tętnicy pępowinowej na powierzchni łożyska.
  4. Gdy zarodek się ożywi, przykryj go (ale nie łożysko) wstępnie podgrzanym żelem USG, pamiętając o delikatnym usunięciu wszelkich pęcherzyków powietrza (za pomocą cienkich kleszczyków) z okolic zarodka. Uzupełnij naczynie podgrzanym PBS.
    UWAGA: Należy zwracać uwagę na poziom roztworu w strzykawkach PBS i strzykawkach z żelem i w razie potrzeby dodać zapasowe strzykawki do zlewki grzewczej.
  5. Zamontuj szklaną igłę na dużej kuli plasteliny na krawędzi naczynia do wycinki i włóż koniec igły do PBS. Wybierając żyłę na powierzchni kosmówki krążka łożyska, tak daleko od głównej gałęzi, jak to rozsądne, przytnij końcówkę do rozmiaru za pomocą nożyczek. Wstrzyknięcie jest najłatwiejsze, jeśli końcówka jest przycięta pod niewielkim kątem. Usuń wszelkie postrzępione krawędzie szkła za pomocą krawędzi nożyczek sprężynowych.
  6. Za pomocą pompy strzykawkowej powoli wstrzykiwać roztwór mikropęcherzyków w ilości 20 μl/min do szklanej igły, aż całe powietrze zostanie usunięte z końcówki igły i będzie można zauważyć, że mikropęcherzyki mogą swobodnie wpływać do PBS. Zatrzymać pompę i zresetować do objętości wtrysku 20 μl. Nie należy dopuścić do przedostania się powietrza do układu naczyniowego zarodka podczas wstrzyknięcia.
  7. Delikatnie wprowadzić szklaną końcówkę igły do jednej z żył w łożysku i upewnić się, że jest nieruchoma. Odchyl głowicę stereoskopu i umieść głowicę nad zarodkiem. Rozpocznij obrazowanie.

7. Ultrasonograficzne obrazowanie molekularne

UWAGA: Korzystając z wcześniej ustawionych warunków obrazowania nieliniowego z kontrastem, ustaw głowicę tak, aby zarodek znajdował się równomiernie między ogniskami na wysokości 6 i 10 mm. Po ustawieniu należy rozpocząć wstrzykiwanie mikropęcherzyków w bolusie. Po zakończeniu wstrzykiwania należy uruchomić stoper.

  1. Obrazowanie perfuzyjne
    1. Upewnij się, że maksymalna liczba klatek dla trybu kontrastu nieliniowego została wybrana, naciskając przycisk "zarządzanie badaniem" i klikając zakładkę "Preferencje" w górnej części przeglądarki badania. Zaznacz odpowiednie pole w oknie "Preferencje".
    2. Dostosuj ustawienia obrazowania, inicjując obrazowanie nieliniowe. Naciśnij przycisk "tryb kontrastu" na panelu sterowania. Popraw wzmocnienie 2D, ustawiając pokrętło "wzmocnienia" na 30 dB, zmniejsz moc do 4% za pomocą pokrętła "power", zmniejsz częstotliwość do 1 Hz za pomocą pokrętła "frequency" i ustaw szerokość wiązki (lewy dolny róg) na szeroką za pomocą kulki rolkowej/myszy.
      UWAGA: Wszystkie elementy sterujące znajdują się na panelu sterowania systemu ultrasonograficznego.
    3. Uchwyć całe wypłukiwanie i rozpraszanie bolusa mikropęcherzyków, nagrywając 20-minutową pętlę cine z częstotliwością odświeżania 1 Hz. Naciśnij przycisk skanowania/zamrażania, aby rozpocząć akwizycję danych.
    4. Po przechwyceniu pełnej sekwencji obrazów naciśnij przycisk "cine store" znajdujący się na panelu sterowania, aby zapisać sekwencję obrazów w buforze systemowym. System tworzy pętlę cine ze znacznikiem daty na podstawie uzyskanych danych z nieliniowego modelu kontrastu.
  2. Celowane obrazowanie mikropęcherzyków
    1. W sekcji "Preferencje" ustaw czas serii na 0,1 sekundy. Ustaw odpowiednie parametry obrazowania, korzystając z elementów sterujących opisanych powyżej (7.1.2.).
    2. Rozpocznij nieliniowe obrazowanie z kontrastem, naciskając przycisk "tryb kontrastu" na panelu sterowania. Upewnij się, że zarodek jest prawidłowo umieszczony pod głowicą i że przepływ środka kontrastowego z mikropęcherzykami przez zarodek jest widoczny na nieliniowym obrazie w trybie kontrastu.
    3. Aby ocenić celowe wiązanie mikropęcherzyków podczas embrionalnych badań obrazowania molekularnego, należy pozwolić mikropęcherzykom krążyć bez zakłóceń przez 3 minuty i 40 sekund po zakończeniu wstrzyknięcia. Czas ten ma pozwolić na zatrzymanie krążących mikropęcherzyków. Naciśnij "skanuj/zamrażaj", aby zatrzymać obrazowanie w tym czasie.
    4. Po 3 minutach i 40 sekundach wznów obrazowanie, aby potwierdzić, że zarodek jest nadal widoczny, jest odpowiednio pokryty PBS i że mikropęcherzyki nadal krążą. Naciśnij "skanuj/zamrażaj", aby rozpocząć obrazowanie.
    5. Uzyskuj sekwencję zakłóceń/uzupełniania zapasów po 3 minutach i 50 sekundach od wstrzyknięcia, rejestrując sekwencję reakcji akustycznej "przed zniszczeniem" przy 29 Hz. Naciśnij "skanuj/zamrażaj", aby rozpocząć akwizycję danych. W 4 minuty po wstrzyknięciu18,19 zainicjuj impuls akustyczny o wysokiej częstotliwości w ciągu 0,1 sekundy. Naciśnij przycisk "burst", aby wykonać serię.
    6. Kontynuuj nagrywanie klatek przez pozostałą część sekwencji (aż linia bufora zostanie zapełniona) i zapisz pętlę cine, naciskając "cine store".
    7. Zbierz dodatkową pętlę cine z krążącymi mikropęcherzykami. Zakłada się, że ta późniejsza sekwencja obrazowania "po zniszczeniu" zawiera tylko krążące sygnały pęcherzykowe, które uzupełniły wiązkę. Naciśnij "skanuj/zamrażaj", aby rozpocząć obrazowanie i "cine store", aby zebrać obrazy.
    8. Oznacz pętle cine po zobrazowaniu każdego zarodka. Naciśnij "zarządzanie badaniem", zaznacz plik za pomocą kulki rolkowej i przycisku "wybierz", naciśnij "etykieta obrazu" i odpowiednio nazwij.

8. Postępowanie z zarodkami po wstrzyknięciu

  1. Po obrazowaniu przesuń głowicę, odpiąć zarodek i poddać eutanazji (poprzez dekapitację, zwichnięcie szyjki macicy, uduszenie dwutlenkiem węgla lub znieczulenie, a następnie szybkie zamrożenie lub stabilizację) zgodnie z życzeniem.
  2. Do każdego kolejnego wstrzyknięcia zarodka należy użyć świeżego naczynia rozwarstwiającego, igły, strzykawki i segmentu rurki, przy czym przygotowanie następnej partii roztworu do wstrzykiwań mikropęcherzyków odbywa się podczas sekcji i wznowienia.
  3. Zachowaj próbki tkanek (np. ogon, mózg) do dodatkowych analiz (np. genotypowania określonego za pomocą analizy PCR izolowanego DNA ogona, barwienia lacz lub półilościowych pomiarów ekspresji biomarkerów przy użyciu western blot21).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wstrzykiwanie środków kontrastowych do ultrasonografii do embrionów myszy ex utero zależy od pomyślnej izolacji żywych embrionów w późnym stadium rozwoju z macicy oraz utrzymania ich żywotności podczas wstrzykiwania i towarzyszącego mu obrazowania ultradźwiękowego. Po wyjęciu embrionu na zewnątrz i jego odpowiednim ustawieniu, jak pokazano na Rysunku 1, możliwe jest ostrożne wstrzyknięcie środka kontrastowego do naczyń krwionośnych embrionu. Typowy obraz ultradźwiękowy w trybie B embrionu myszy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ultradźwiękowe środki kontrastowe wstrzyknięto do zarodków myszy w późnym stadium ciąży i uzyskano nieliniowe obrazy kontrastowe w celu pomiaru parametrów perfuzji i celowego wiązania mikropęcherzyków. Pomyślne zobrazowanie mikropęcherzyków w obrębie zarodka naczyniowego zależało od wielu czynników, z których pierwszym była żywotność zarodka. Cały sprzęt i aparatura zostały przygotowane z wyprzedzeniem w celu zminimalizowania czasu potrzebnego na izolację zarodków z macicy do rozpoczęcia iniekcji. Ponieważ wpływ jednoraz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

F.S. Foster potwierdza swoją rolę jako konsultant firmy VisualSonics Inc.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Program Terry'ego Foxa z National Cancer Institute of Canada.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reagenty
Przeciwciała (biotynylowane, eBioscience) — Wybór przeciwciał zależy od eksperymentu
  • szczur izotyp IgG2 kontrola
eBioscience13-4321-85Ta kombinacja przeciwciał/mikropęcherzyków jest często wymagana jako kontrola eksperymentalna 
  • biotyna anty-mysz CD309
eBioscience13-5821-85
Biotynylowane szczur MJ 7/18 przeciwciało przeciwko mysiemu endoglinowiHybrydomaPrzeciwciała zewnętrzne mogą być również odpowiednie: w przeszłości używaliśmy eBioscience (13-1051-85 ) Woda
Pożywka dla zarodków
  • 500 ml Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni z wysokim poziomem glukozy
SigmaD5796
  • 50 ml Płodowa surowica bydlęca
ATCC30-2020lot # 7592456
  • Hepes
Gibco156305 ml, 1 M
  • Penicylina-Streptomycyna
Gibco15140-1225 ml, 10 000 jednostek Pen., 10,000 μ g
Strep Etanol, 70%
Lód
ParaformaldehydSigma762404%
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem [1x] SigmaD85371x, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu
Ciężarna mysz, CD-1Charles River Laboratories Inc. 
0,9% chlorek sodu (sól fizjologiczna)Hospira0409-7984-11
Ultradźwiękowy środek kontrastowy, gotowy do użycia i nieukierunkowanyMicroMarker; VisualSonics Inc.
Żel do ultradźwięków (Aquasonic 100, bezbarwny)CSP Medical133-1009
Equipment
Płytki do hodowli komórkowych (4) :  100  x  20  mmFisher Scientific08-772-22
Płytki do hodowli komórkowych (12) : 60  x  15  mmWirówka SigmaD8054
Wirówka Sorvall Legend RT 
Probówki stożkowe, 50 ml BD FalconVWR21008-938
RozcieńczalnikBeckman CoulterIsoton II, 8448011
Nożyczki preparacyjne (Wagner)Narzędzia do naukiprecyzyjnej Wagner 14068-12
Kleszcze (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm)Narzędzia do nauki o naczyniu11200-33
Kleszcze, drzazgaVWR25601-134
Zlewka szklana, 2 L (zlewka gryfowa)VWR89000-216
Kapilary szklane, 1 x 90  mm GD-1 z żarnikiemNarishigeGD-1
Szklany ściągacz do igiełNarishigePN-30
RękawiceAnsell4002
Sonda anatomiczna bruttoFine Science Tools10088-15
Płyta grzejnaVWR89090-994
Wiadro na lódCole ParmerRK 06274-01
Obrazowanie PlatformaVisualSonics Inc.Zintegrowany system
Źródło światła, światłowódFisher Scientific12-562-36Idealnie ma regulowane ramiona
Luers (12), polipropylenowy kolczasty żeński ¼-28 Gwint UNFCole Parmer45500-30
mikroultradźwiękowy, wysokiej częstotliwościVisualSonics Inc.Igły Vevo2100
, rozmiar 21  (1")VWR305165
Analizator wielkości cząstekBeckman CoulterMultisizer 3 Coulter Counter
Łyżka perforowana (Moria)Fine Science ToolsMC 17 10373-17
Kołki (6), anodowany minutien 0,15 mmFine Science Tools26002-15
Pipetory [2-20 μ l, 20-200 μ l, 100-1,000 μ l]EppendorfResearch Plus  regulowany 3120000038;             3120000054;            
Końcówki do pipet [2-200  μ l, 50-1,000  μ l]EppendorfepT.I.P.S.                                    22491334;                        
Nożyczki
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning
Tubing, laboratorium Tygon 1/32" x 3/32"VWR63010-007
Drewniany aplikator w sztyfcie (wacik, bawełniana główka)VWRCA89031-270
Mikroskop chirurgiczny 5-8x powiększenieFisher ScientificSteromaster
, 1 ml NormjectFisher14-817-25
Strzykawki (10), 30 mlVWRCA64000-041
Strzykawkowa pompa infuzyjna Bio-ryś Termometr NE-1000
, -20-110  ° CVWR89095-598
TimerVWR33501-418
Rury, EppendorfVWR20170-577
Stojaki na rurki (3)VWR82024-462
Przetwornik ultradźwiękowy, 20 MHzVisualSonics Inc.MS250
Vannas-Tubingen, kąt do góryFine Science Tools15005-08
w domu destylowanaszynowy System 3120000062022491351 Strzykawki

Bibliografia

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65(2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581(2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162(2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097(2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4 (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie kontrastowe w ultrad wi kachunaczynienie zarodka myszywstrzykiwanie mikrop cherzyk wparametry perfuzjiwi zanie celowanych mikrop cherzyk wmodel mysi endoglinyo yskowa sie naczyniowanieliniowe ultrad wi ki kontrastowetechnika manipulacji zarodkami
Obrazowanie kontrastowe w zarodkach myszy za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.