Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

Podsumowanie

W tym protokole wideo krok po kroku wyjaśniamy transdukcję lentiwirusową w organoidach pierwotnego nabłonka jelitowego oraz przetwarzanie i dalszą analizę tych kultur za pomocą ilościowego RT-PCR, RNA-mikromacierzy i immunohistochemii.

Streszczenie

Struktury kosmków jelitowych zwane organoidami, mogą być utrzymywane w długotrwałej hodowli trójwymiarowo, jeśli są uzupełnione odpowiednimi czynnikami wzrostu. Ponieważ organoidy są bardzo podobne do oryginalnej tkanki pod względem homeostatycznego różnicowania komórek macierzystych, polaryzacji komórek i obecności wszystkich terminalnie zróżnicowanych typów komórek znanych z nabłonka jelita dorosłego, służą one jako niezbędny zasób w badaniach eksperymentalnych nad nabłonkiem. Możliwość ekspresji transgenów lub interferującego RNA za pomocą wektorów lentiwirusowych lub retrowirusowych w organoidach zwiększyła możliwości analizy funkcjonalnej nabłonka jelitowego i jelitowych komórek macierzystych, przewyższając tradycyjne transgeniczne myszy pod względem szybkości i kosztów. W obecnym protokole wideo pokazujemy, jak wykorzystać transdukcję organoidów jelita cienkiego za pomocą wektorów lentiwirusowych, zilustrowanych za pomocą transgenów indukowanych doksycyliną lub indukowanego przez IPTG krótkiego RNA spinki do włosów w celu nadekspresji lub knockdownu genu. Ponadto, biorąc pod uwagę, że hodowla organoidów daje niewielką liczbę komórek, która może być nawet zmniejszona przez eksperymentalne traktowanie, wyjaśniamy, jak przetwarzać organoidy do dalszej analizy mającej na celu ilościowe RT-PCR, RNA-mikromacierz i immunohistochemię. Techniki, które umożliwiają ekspresję transgenów i knock down genów w organoidach jelitowych, przyczyniają się do zwiększenia potencjału badawczego, jaki posiadają te struktury nabłonka jelitowego, ustanawiając hodowlę organoidów jako nowy standard w hodowli komórkowej.

Wprowadzenie

Nabłonek jelitowy jest jedną z najszybciej rozprzestrzeniających się tkanek ciała, co spowodowało, że wzbudził szerokie zainteresowanie wśród badań nad rakiem i komórkami macierzystymi. W 2009 r. opublikowano technikę generowania długotrwałych kultur krypt jelita cienkiego w matrigelu, zachowując trójwymiarową strukturę¹. Struktury te, zwane organoidami jelitowymi, mogą być hodowane przy użyciu standardowych technik, z otaczającym podłożem uzupełnionym wieloma zdefiniowanymi czynnikami wzrostu, w tym noggin inhibitora szlaku sygnałowego Bmp (Nog), wzmacniaczem szlaku sygnałowego Wnt rspondyną 1 (Rspo1) i naskórkowym czynnikiem wzrostu (Egf), które zwiększają proliferację jelit^2-4.

Organoidy przewyższają tradycyjne linie komórek rakowych pod tym względem, że nie są zmutowane, zachowały hierarchię komórek macierzystych, wykazują nienaruszoną polaryzację komórkową i wykazują różnicowanie do wszystkich linii komórkowych znajdujących się w powstającym nabłonku jelita cienkiego. Ponieważ mogą być transdukowane w celu przenoszenia transgenów lub konstruktów interferencyjnych RNA⁵, są one wykorzystywane do badania określonych elementów genetycznych, przewyższając eksperymenty z wykorzystaniem myszy transgenicznych pod względem kosztów i szybkości. Ekspresję transgeniczną w organoidach można przeprowadzić przy użyciu mysich wektorów retrowirusowych lub lentiwirusowych^6,7. Ze względu na ograniczenia mysich retrowirusów, zdolnych do transdukcji wyłącznie komórek mitotycznych⁸, transdukcja lentiwirusowa jest częściej stosowana w przypadku komórek trudnych do zakażenia, takich jak organoidy.

Transdukowane wirusowo i stabilnie wyrażające organoidy transgeniczne mogą być używane do wielu dalszych analiz, w tym ilościowych analiz RNA i immunohistochemii. Podsumowując, hodowla organoidów z pierwotnych komórek nabłonka jelitowego przekształciła się w rutynową technikę, którą można łatwo wdrożyć bez szczególnych wymagań laboratoryjnych i stała się nowym standardem w hodowli komórkowej w badaniach nad nabłonkiem jelitowym.

Techniki transdukcji wirusa i późniejszej analizy w organoidach są żmudne do wykonania i aby wspomóc eksperymenty organoidowe, stworzyliśmy ten protokół wideo, pokazujący metody transdukcji lentiwirusowej hodowanych organoidów. Dodatkowo pokazujemy, w jaki sposób prawidłowe przetwarzanie organoidów może zwiększyć wydajność, a tym samym poprawić wydajność dalszej analizy przy użyciu technik RNA lub immunohistochemii. W protokole wykorzystano wyłącznie organoidy pochodzące z krypt jelita cienkiego, chociaż opisane techniki mogą być również stosowane do organoidów okrężnicy.

Protokół

1. Przygotowanie polietylenininy (PEI) jako odczynnika do transfekcji

1. Rozpuścić około 150 mg PEI w 100 ml_H2O.
2. Dostosuj roztwór do pH 7,4, dodając HCl, aż roztwór stanie się klarowny i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Może to trwać od 10 do 60 minut i dodać wodę do końcowego stężenia 1 mg/ml.
3. Po złożeniu klarownym przefiltrować roztwór PEI przez sterylny filtr 0,22 μm i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C w porcjach 5 ml.

2. Produkcja cząsteczek lentiwirusowych

Dzień 1:

1. Podziel HEK293T komórki do 60%-80% zbiegu w kolbie o średnicy 162^cm2 lub dużej szalce Petriego w pożywce do hodowli linii komórkowych (DMEM uzupełniony 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny i 2 mM suplementu glutaminy).

Dzień 2:

2. Przygotować roztwór do transfekcji DNA zawierający 45 μg całkowitego plazmidowego DNA, dodając do siebie lentiwirusowe wektory pakujące (7 μg pVSVg; 5 μg pRSV rev; 13 μg pMDL) i 20 μg plazmidu lentiwirusowego kodującego interesujący nas gen lub shRNA. Dostosować do objętości 1 ml za pomocą DMEM.
3. Przygotować roztwór do transfekcji PEI, dodając 90 μl 1 mg/ml PEI do 930 μl DMEM i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Dodaj roztwór do transfekcji DNA do roztworu PEI. Wirować lub odwracać kilka razy i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania roztworu do transfekcji DNA.
5. Wlać 2 ml roztworu do transfekcji DNA na HEK293T komórki i inkubować przez 4 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
6. Po 4 godzinach odśwież pożywkę hodowlaną, aby usunąć PEI. Nie ma potrzeby mycia komórek przed dodaniem nowego podłoża.
   UWAGA: PEI jest cytotoksyczny, a czas inkubacji dłuższy niż 4 godziny może spowodować uszkodzenie komórek HEK293T.

Dzień 4:

7. Zastąp supernatant nową pożywką hodowlaną. Przechowywać supernatant (zawierający wirusa); Zostanie to użyte w kroku 2.10.
8. Umieścić supernatant w kolbie o pojemności 15 ml. Aby usunąć martwe komórki, wirować przez 5 minut przy 500 x g.
9. Przepchnąć supernatant przez filtr 0,45 μm za pomocą dużej strzykawki o pojemności 60 ml. Przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.

Dzień 5:

10. Zebrać drugą partię supernatantu, odwirować i przefiltrować jak w krokach 2.8-2.9.
11. Zebrać supernatanty z etapów 2.9 i 2.10 w probówkach ultrawirówek i odwirować przy 50 000 x g w ultrawirówce przez 90 minut.
12. Bardzo ostrożnie wyjmij kapsułki zawierające probówki do ultrawirówek i włóż je do okapu z przepływem laminarnym, pamiętając o orientacji rurki wewnątrz wirówki.
13. Ostrożnie otwórz kapsułkę z probówką ultrawirówkową i zdekantuj pożywkę w taki sposób, aby osad znajdował się na górnej stronie probówki. Ponieważ granulki wirusa mogą być trudne do wizualizacji, pamiętaj, po której stronie rurki utworzy się granulka. Weź mikropipetę i usuń ostatnią część pożywki, uważając, aby nie poruszyć nieprzezroczystego brązowego osadu, który jest widoczny z boku dna probówki do ultrawirówki.
14. Zawiesić ten osad w 500 μl organoidowej pożywki hodowlanej uzupełnionej 10 mM nikotynamidu, 10 μM Chir99021, 10 μM Y27632 i 8 μg/ml polibrenu. Ponowne zawieszenie w tej pożywce jest ważne, ponieważ wirus wysokiego miana jest używany do bezpośredniej transdukcji organoidów.
15. Fakultatywnie: zamrozić wirusa w tym podłożu w dwóch partiach po 250 μl w temperaturze -80 °C.

3. Transdukcja organoidów w lentiwirusach

Dzień 0:

1. Na dwa dni przed transdukcją do nowego dołka należy rozłupać pełną studzienkę organoidów o średnicy 0,95 cm2, mając na celu uzyskanie około 50 małych organoidów. Podziel organoidy zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem¹ (ryc. 3A, B).
2. Uzupełnij pożywkę do hodowli organoidów 10 μM Chir99021 i 10 mM nikotynamidu, aby otrzymać torbielowate krypty hiperproliferacyjne (ryc. 3C).
   UWAGA: Krypty torbielowate rozwijają się najlepiej, gdy świeżo rozszczepione organoidy są hodowane w obecności Chir99021.

Dzień 2:

3. Organoidy należy zebrać, pipetując w górę i w dół matrycę i pożywkę, rozbijając w ten sposób mieszaninę za pomocą mikropipety p1000. Umieść mieszaninę w probówce o pojemności 15 ml.
4. Dalsze zakłócenia za pomocą pipety Pasteura, w której dystalny otwór został zmniejszony przez stopienie. Odwirować organoidy do osadzania przez 5 minut w temperaturze 100 x g.
   UWAGA: W zależności od wielkości wirówki należy użyć innej prędkości wirówki. Konieczne jest znalezienie dokładnej prędkości, z jaką uszkodzone organoidy są oddzielane od mieszaniny.
5. Usuń supernatant i dodaj 500 μl wstępnie podgrzanej 1x trypsyny (podobnie jak 0,25% trypsyny). Zawiesić organoidy w trypsynie i inkubować przez 3 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
6. Dezaktywuj trypsynę, dodając 3,5 ml pożywki do hodowli linii komórkowych (DMEM uzupełniony 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny i glutaminy). Wirować przez 5 minut przy 500 x g.
7. Usunąć sklarowany osad i pozostawić osad w około 20 μl pożywki. Przenieść organoidy w tej ostatniej małej ilości pożywki do studzienki na 48-dołkowej płytce.
8. Dodać lentiwirusa o wysokim mianie do pożywki transdukcyjnej, jak opisano w kroku 2.14, zawiesić ponownie i przejść do kroku 3.10. W przypadku niskiej skuteczności transdukcji można dodać krok 3.9.
   UWAGA: Aby zapewnić wydajną transdukcję, zazwyczaj dodaje się jedną porcję 250 μl lentiwirusa o wysokim mianie do jednego dołka organoidów. Stanowi to 50% całego pozyskanego lentiwirusa z jednej produkcji, jak opisano w kroku 2 niniejszego protokołu.
9. Opcjonalnie: w celu zwiększenia skuteczności transdukcji należy przeprowadzić spinokkulację, umieszczając 48-dołkową płytkę zawierającą organoidy we wstępnie ogrzanej wirówce w temperaturze 32 °C i obracając przy 600 x g przez 1 godzinę.
10. Umieścić mieszaninę organoidów i wirusów w inkubatorze hodowlanym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze hodowli, aby umożliwić transdukcję.
11. Opcjonalnie: w celu dalszego zwiększenia skuteczności transdukcji należy inkubować organoidy przez dodatkowe 3 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze hodowli.
12. Dodać 1 ml pożywki do hodowli organoidów i ponownie zawiesić mieszaninę organoidów i wirusów, przenieść do probówki do mikrowirówki i odwirować w mikrowirówce przez 5 minut przy 850 x g w celu osadzenia organoidów.
13. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 μl lodowatego matrygelu. Ponieważ materiał krzepnie, gdy staje się cieplejszy, należy używać końcówek do pipet, które są schładzane przez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół lodowatego PBS.
14. Umieścić kropelkę w środku studzienki na 48-dołkowej płytce i inkubować w inkubatorze kultur w temperaturze 37 °C przez 15 minut do zestalenia.
15. Po 15 minutach ostrożnie dodać 250 μl pożywki do hodowli organoidów uzupełnionej 10 mM nikotynamidu, 10 μM Chir99021 i 10 μM Y27632. Małe uszkodzone fragmenty organoidów przekształcają się w małe organoidy torbielowate w ciągu 24 godzin.

Dzień 5:

16. Odświeżyć podłoże i uzupełnić wybranym antybiotykiem (dla puromycyny należy użyć 4 μg/ml).

Dzień 7:

17. Zastąp pożywkę standardową pożywką do hodowli organoidów, uzupełnioną antybiotykiem selekcyjnym.
    UWAGA: Pączkowanie zostanie zakończone 2-3 tygodnie po wycofaniu Chir99021. Po selekcji organoidy mogą być hodowane bez antybiotyku selekcyjnego.

4. Przygotowanie organoidowego RNA do ilościowego RT-PCR lub mikromacierzy

1. Do przygotowania RNA należy użyć zestawu komercyjnego zgodnie z protokołem producenta. Usunąć pożywkę z organoidów i dodać 350 μl buforu RLT, uzupełnionego β-merkaptoetanolem bezpośrednio na kopułę matrycy zawierającej organoidy. Zawiesić materiał w RLT, pipetując za pomocą mikropipety p1000.
2. Wykonaj dalsze przygotowanie RNA zgodnie z protokołem producenta.
3. Opcjonalnie: zwiększenie wydajności RNA poprzez amplifikację za pomocą systemu Ovation Pico WTA, wymagającego początkowego wprowadzenia 50 μg całkowitego RNA zgodnie z protokołem producenta.
4. Opcjonalnie: w celu kontroli jakości przed mikromacierzą RNA, uruchom próbki na bioanalizatorze 2100 przy użyciu nano chipa całkowitego RNA eukariotów, dążąc do uzyskania liczby integralności RNA (RIN) 8,5 lub więcej (rysunek 5) zgodnie z protokołem producenta.

5. Przetwarzanie organoidów do zatapiania parafiny i immunohistochemii

1. Przed rozpoczęciem osadzania organoidów należy wstępnie ogrzać aluminiowy blok z otworami pasującymi do szklanych probówek o średnicy 12 mm w inkubatorze w temperaturze 70 °C, aby utrzymać płynną parafinę.
2. Weź pojedynczą studzienkę z w pełni rozwiniętymi organoidami i usuń podłoże, pozostawiając osadzone organoidy nienaruszone.
3. Dodać 1 ml 4% paraformaldehydu z PBS bezpośrednio do studzienki i utrwalić w temperaturze 4 °C w dowolnym miejscu od 1 godziny do nocy.
4. Zastąp paraformaldehyd 1 ml lodowatego PBS.
   Fakultatywnie: po tym etapie organoidy należy przechowywać w PBS do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.
5. Zawiesić utrwalone organoidy w 1 ml PBS i umieścić w szklanej fiolce.
6. Pozwól organoidom opaść na dno na 1 minutę, zdekantuj PBS i zastąp 70% etanolem, w którym rozpuszczono kilka kropelek roztworu eozyny, aby umożliwić wizualizację organoidów podczas całego procesu osadzania.
7. Pozostawić organoidy w 70% etanolu w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach usuń 70% etanolu, ostrożnie dekantując, będąc w stanie uwidocznić organoidy na oko ze względu na lekki różowawy kolor eozyny. Zastąp roztwór do zatapiania 96% etanolem.
8. Powtórz krok 5.7, za każdym razem zastępując roztwór do osadzania następnym. Następnie przepuścić organoidy przez następujące roztwory: 70% etanol, 90% etanol, 96% etanol, 100% etanol, 100% etanol, ksylen, ksylen.
9. Zdekantować ostatnie płukanie ksylenem i wlać parafinę do probówki. Natychmiast umieścić probówkę w podgrzanym bloku aluminiowym w temperaturze 70 °C na 30 minut i zastąpić parafinę nową, czystą parafiną.
10. Odlać parafinę i odpipetować organoidy do formy bloku parafiny za pomocą wstępnie podgrzanej pipety Pasteura z dużym otworem. Utrzymuj pipetę Pasteura w cieple za pomocą palnika Bunsena. Umieść wszystkie organoidy w formie bloku parafiny w małej warstwie płynnej parafiny.
11. O ile to możliwe, staraj się manipulować wszystkimi organoidami w kierunku środka formy bloku parafiny za pomocą rozgrzanej igły preparcyjnej. Utrzymuj igłę preparacyjną w cieple za pomocą palnika Bunsena.
12. Gdy lokalizacja organoidów w formie jest zadowalająca, należy lekko schłodzić pleśń, aby zestalić warstwę parafiny.
13. Zakończ blok, wylewając więcej parafiny na wierzch i dodaj standardową kasetę do zatapiania histologicznego.

Wyniki

Transdukcja lentiwirusowa organoidu

Technika transdukcji organoidów za pomocą cząstek lentiwirusowych zależy od prawidłowego obchodzenia się z organoidami przed i podczas transdukcji. Organoidy (ryc. 3A) hodowano i rozbijano na pojedyncze krypty (ryc. 3B). Jak wcześniej informowano, te pojedyncze krypty, po wyhodowaniu w obecności inhibitora GSK3 Chir99021, stały się kryptami torbielowatymi⁹ (Figura 3C). Następnie organoidy...

Dyskusja

Obecny protokół wideo opisuje transdukcję lentiwirusową organoidów z pierwotnego nabłonka jelitowego i dalszą analizę tych organoidów przy użyciu ilościowych technik RNA i immunohistochemii.

Transdukcja lentiwirusowa jest często wykonywana w przylegających lub pływających komórkach na płytkach hodowlanych. Ponieważ trójwymiarowa struktura organoidów sprawia, że są one trudne do przeniknięcia przez cząsteczki wirusa, stosuje się szereg metod zwiększających skuteczność. Wstępna obróbka organoidó...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polietylenomina	Polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Surowica cielęca płodu	Lonza	DE14-801F
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15140-122
Glutamina	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Zaawansowany DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetylocysteina	Mysz Sigma	A9165-1G
Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polibren	Sigma	107689
nikotynamid	Sigma	N0636
Trypsyna	Lonza	BE02-007E
puromycyna	Sigma	P 7255
Rneasy mini zestaw	Qiagen	74106
β-merkaptoetanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyd	Sigma	252549-1L
szklana fiolka stożkowa 12  mm x 75  mm 5  ml	VWR	LSUKM12
Eozyna Żółtawy	VWR	1 159 350 025