Opisano protokół ekstrakcji pierwotnych komórek ludzkich z chirurgicznego guza jelita grubego i normalnych tkanek. Wyizolowane komórki są następnie hodowane na miękkich elastycznych podłożach (hydrożele poliakrylamidowe) funkcjonalizowanych przez białko macierzy zewnątrzkomórkowej i osadzonych w fluorescencyjnych mikrogranulkach. Cytometria trakcyjna jest wykonywana w celu oceny komórkowych naprężeń skurczowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki nowotworowe reagują na mechaniczną sztywność matrycy w złożony sposób, używając skoordynowanego, hierarchicznego systemu mechanochemicznego składającego się z receptorów adhezyjnych i związanych z nimi białek błonowych transdukcji sygnału, architektury cytoszkieletu i silników molekularnych1, 2. Mechanowrażliwość różnych komórek nowotworowych in vitro jest badana głównie na unieśmiertelnionych liniach komórkowych lub komórkach pierwotnych pochodzących od myszy, a nie na pierwotnych ludzkich komórkach rakowych. W związku z tym niewiele wiadomo na temat mechanowrażliwości pierwotnych komórek ludzkiego raka jelita grubego in vitro. W tym miejscu opracowano zoptymalizowany protokół, który opisuje izolację pierwotnych ludzkich komórek jelita grubego ze zdrowych i nowotworowych próbek tkanek ludzkich chirurgicznych. Wyizolowane komórki jelita grubego są następnie z powodzeniem hodowane na miękkich (sztywność 2 kPa) i sztywnych (sztywność 10 kPa) hydrożelach poliakrylamidowych oraz sztywnych podłożach polistyrenowych (sztywność ~3,6 GPa) funkcjonalizowanych macierzą zewnątrzkomórkową (w tym przypadku fibronektyną). Mikrogranulki fluorescencyjne są zatopione w miękkich żelach w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej, a test trakcyjny jest wykonywany w celu oceny naprężeń kurczliwości komórkowej za pomocą bezpłatnego oprogramowania o otwartym dostępie. Ponadto mikroskopia immunofluorescencyjna na podłożach o różnej sztywności dostarcza użytecznych informacji na temat pierwotnej morfologii komórek, organizacji cytoszkieletu i zrostów ogniskowych zawierających winkulinę w funkcji sztywności substratu.
Wprowadzenie
W ostatnich latach stało się coraz bardziej oczywiste, że mikrośrodowisko mechaniczne, oprócz czynników biochemicznych, odgrywa ważną rolę w regulacji funkcjonalności komórek. Komórki mogą wyczuwać i reagować na sztywność podłoża, do którego są przylegają (jak w hodowli 2D) lub są otoczone (jak w hodowli 3D) 3-7. W ten sposób komórki mogą modulować swoje różnicowanie3, morfologię4, migrację/ruchliwość5, właściwości biofizyczne6, wzrost7 i inne procesy.
Komórki nowotworowe również reagują na sztywność matrycy 2D i 3D za pomocą skoordynowanej, hierarchicznej mechanochemicznej k....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opisany poniżej protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach UIUC.
1. Pobieranie i trawienie próbki tkanki chirurgicznej
- Pobrać próbkę tkanki nowotworowej zaraz po resekcji jelita grubego (ryc. 1A i 1B). Zbierz również tkankę z sąsiedniego zdrowego miejsca.
- Natychmiast przenieść tkankę do fiolki o pojemności 15 ml zawierającej 12 ml roztworu HBSS. Przechowywać fiolkę na lodzie w izolowanym pudełku piankowym.
- W ciągu 45 minut należy przetransportować fiolkę zawierającą tkankę do kaptura do hodowli tkankowej w celu dalszego przetwarzania. Fiolkę należy przechowywać na bl....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany powyżej protokół został z powodzeniem zastosowany dla wielu próbek tkanek (n=12) pobranych od czterech różnych pacjentów zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej komisji etyki. Rysunek 1A przedstawia reprezentatywny guz jelita grubego bezpośrednio po operacji, z którego pobrano przekroje tkankowe do hodowli komórkowych. Typowy przekrój tkanki w roztworze HBSS po przeniesieniu do dygestorium laminarnego w celu dalszego przetwarzania pokazano na Rysunku 1B. Schemat trawienia i enzymat.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Stres trakcyjny komórkowy pojawił się ostatnio jako potencjalny biofizyczny wskaźnik stanu przerzutowego13. Jednak do tej pory w literaturze nie ma eksperymentalnych danych trakcyjnych z pierwotnymi komórkami nowotworowymi. Nie zgłoszono również jeszcze bezpośredniego hodowania izolowanych pierwotnych komórek jelita grubego na żelach poliakrylamidowych o różnej sztywności. W związku z tym ustalamy zoptymalizowane warunki hodowli pierwotnych komórek okrężnicy na żelach i polistyrenie (ryc. 2). .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt został sfinansowany przez National Science Foundation ECCS grant 10-02165, oraz Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y.A. został sfinansowany na UIUC przez NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer 'Midwest Cancer Nanotechnology Training Center' Grant R25 CA154015A. Immnunostaining i obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej przeprowadzono w Instytucie Biologii Genomowej (IGB), UIUC. M.Y.A. potwierdza rozmowy z B. J. Williamsem z UIUC na temat eksperymentów izolacyjnych. M.Y.A. dziękuje C. Nemehowi i Abdulowi Bhuiya z UIUC za pomoc w przygotowaniu schematów i listy materiałów.<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Reodczynniki | |||
| HBSS | Technologie życia | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Trypsyna | Worthington | LS003736 | |
| Kolagen | Worthington | LS004176 | |
| 3- Aminopropylotrymetoksysilan (ATS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Aldehyd glutarowy | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| Akrylamid | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N-metylenobisakryloamid (bis) | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| Roztwór buforowy HEPES | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| Nadsiarczan amonu | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Ludzka fibronektyna | BD | biologia 354008 | |
| Hydrat hydrazyny | Sigma-Aldrich | 18412 | Niebezpieczny |
| kwas octowy | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Paraformaldehyd | Mikroskopia elektronowa Nauki | RT15710 | |
| Wzmacniacz sygnału | Technologie życia | I36933 | |
| Monoklonalne przeciwciało anty winkulinowe | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgG | Life technologie | A11001 | |
| TRITC koniugaty falloidyny | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0,1 i mikro; m koraliki fluroscent | Life technologies | F8801 | |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Technologie życia | 25200-056 | |
| Materiały | |||
| 12 mm2 szklane szkiełka nakrywkowe | Corning | 2865-12 |
Bibliografia
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Pierwotne ludzkie kom rki jelita grubegoenzymatyczna dysocjacja tkankitest cytometrii trakcyjnejmikroskopia immunofluorescencyjnahydro ele poliakrylamidoweanaliza sztywno ci pod o apomiar kurczliwo ci kom rekwizualizacja adhezji ogniskowejbadanie organizacji cytoszkieletuchirurgiczna izolacja tkanki
