Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej

15.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52532

⸱

4 czerwca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2College of Medicine, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Provena Covenant Medical Centre, 4Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokół ekstrakcji pierwotnych komórek ludzkich z chirurgicznego guza jelita grubego i normalnych tkanek. Wyizolowane komórki są następnie hodowane na miękkich elastycznych podłożach (hydrożele poliakrylamidowe) funkcjonalizowanych przez białko macierzy zewnątrzkomórkowej i osadzonych w fluorescencyjnych mikrogranulkach. Cytometria trakcyjna jest wykonywana w celu oceny komórkowych naprężeń skurczowych.

Streszczenie

Komórki nowotworowe reagują na mechaniczną sztywność matrycy w złożony sposób, używając skoordynowanego, hierarchicznego systemu mechanochemicznego składającego się z receptorów adhezyjnych i związanych z nimi białek błonowych transdukcji sygnału, architektury cytoszkieletu i silników molekularnych1, 2. Mechanowrażliwość różnych komórek nowotworowych in vitro jest badana głównie na unieśmiertelnionych liniach komórkowych lub komórkach pierwotnych pochodzących od myszy, a nie na pierwotnych ludzkich komórkach rakowych. W związku z tym niewiele wiadomo na temat mechanowrażliwości pierwotnych komórek ludzkiego raka jelita grubego in vitro. W tym miejscu opracowano zoptymalizowany protokół, który opisuje izolację pierwotnych ludzkich komórek jelita grubego ze zdrowych i nowotworowych próbek tkanek ludzkich chirurgicznych. Wyizolowane komórki jelita grubego są następnie z powodzeniem hodowane na miękkich (sztywność 2 kPa) i sztywnych (sztywność 10 kPa) hydrożelach poliakrylamidowych oraz sztywnych podłożach polistyrenowych (sztywność ~3,6 GPa) funkcjonalizowanych macierzą zewnątrzkomórkową (w tym przypadku fibronektyną). Mikrogranulki fluorescencyjne są zatopione w miękkich żelach w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej, a test trakcyjny jest wykonywany w celu oceny naprężeń kurczliwości komórkowej za pomocą bezpłatnego oprogramowania o otwartym dostępie. Ponadto mikroskopia immunofluorescencyjna na podłożach o różnej sztywności dostarcza użytecznych informacji na temat pierwotnej morfologii komórek, organizacji cytoszkieletu i zrostów ogniskowych zawierających winkulinę w funkcji sztywności substratu.

Wprowadzenie

W ostatnich latach stało się coraz bardziej oczywiste, że mikrośrodowisko mechaniczne, oprócz czynników biochemicznych, odgrywa ważną rolę w regulacji funkcjonalności komórek. Komórki mogą wyczuwać i reagować na sztywność podłoża, do którego są przylegają (jak w hodowli 2D) lub są otoczone (jak w hodowli 3D) 3-7. W ten sposób komórki mogą modulować swoje różnicowanie3, morfologię4, migrację/ruchliwość5, właściwości biofizyczne6, wzrost7 i inne procesy.

Komórki nowotworowe również reagują na sztywność matrycy 2D i 3D za pomocą skoordynowanej, hierarchicznej mechanochemicznej kombinacji receptorów adhezyjnych i związanych z nimi białek błonowych transdukcji sygnału, architektury cytoszkieletu i silników molekularnych1, 2. Na przykład komórki nabłonka sutka (MEC) tworzą normalną miąższ groniasty, gdy są hodowane na substratach 150 Pa, co jest podobne do sztywności zdrowej tkanki sutka. Co ciekawe, wykazują one cechy rozwijającego się guza, zarówno strukturalne, jak i transkrypcyjne, gdy są hodowane na sztywniejszych podłożach (> 5000 Pa), które naśladują sztywność zrębu guza8. Ponadto inny eksperyment pokazuje, że nowotworowi piersi towarzyszy sieciowanie kolagenu i usztywnienie ECM9. Ostatnie eksperymenty pokazują, że ludzkie komórki raka jelita grubego (HCT-8) wykazują przerzuty, takie jak fenotyp (MLP), gdy są hodowane na substratach 2D o fizjologicznie istotnej sztywności (20-47 kPa), ale nie na bardzo sztywnych (3,6 GPa) substratach10-12. Komórki te najpierw tworzą skupiska komórek przypominające nowotwór, a następnie dysocjują od siebie, zaczynając od peryferii. Gdy zachodzi ta zmiana morfologiczna nabłonkowa do zaokrąglonej (przejście E do R), proliferują się, zmniejszają adhezję komórka-komórka i komórka-ECM i stają się migrujące. Komórki HCT-8 hodowane na bardzo twardych podłożach polistyrenowych nie wykazują tych złośliwych cech. W związku z tym wysunięto hipotezę, że komórki HCT-8 stają się przerzutowe pod wpływem odpowiedniego mikrośrodowiska. Warto zauważyć, że eksperymenty te są przeprowadzane na unieśmiertelnionych liniach komórek rakowych lub komórkach pierwotnych pochodzących z myszy, a nie na pierwotnych ludzkich komórkach rakowych.

Niedawne badanie sugeruje, że zwiększony stres trakcyjny komórkowy może być wykorzystany jako potencjalna biofizyczna sygnatura dla komórek przerzutowych13. Badanie polega na pomiarze siły pociągowej dla różnych linii komórek nowotworowych u ludzi na żelach poliakrylamidowych. Stwierdzono, że przerzutowe komórki rakowe mogą wywierać znacznie większy stres trakcyjny w porównaniu z komórkami bez przerzutów we wszystkich przypadkach13. Jednak wyniki te są bezpośrednio sprzeczne z wcześniej opublikowanymi odkryciami dotyczącymi linii komórkowych raka piersi pochodzących z myszy14. Ponadto niedawne badanie podkreśla niezwykłe różnice między unieśmiertelnionymi i pierwotnymi komórkami ludzkimi w ich profilowaniu białek przebudowy cytoszkieletu i ekspresji białek przetrwania komórek15. Dlatego ważne jest, aby ponownie przyjrzeć się wielu testom biofizycznym, w tym trakcji dla pierwotnych ludzkich komórek rakowych. To odpowie na pytanie, czy komórki pierwotne podsumowują unieśmiertelniony trend trakcji linii komórek rakowych.

Opisany tutaj protokół jest zoptymalizowany do izolacji pierwotnych komórek ludzkiego jelita grubego (zarówno zdrowych, jak i nowotworowych) oraz do hodowli ich na miękkich podłożach (hydrożele poliakrylamidowe), jak również na szalkach Petriego. Protokół opiera się na trawieniu, a następnie enzymatycznej dysocjacji próbki tkanki chirurgicznej na zawiesinę pojedynczej komórki16. Według naszej wiedzy jest to pierwsza demonstracja hodowli izolowanego pierwotnego guza jelita grubego i normalnych komórek bezpośrednio na miękkich podłożach hydrożelowych z osadzonymi mikrogranulkami fluorescencyjnymi do cytometrii trakcyjnej. Przezroczyste podłoża żelowe umożliwiają również barwienie immunologiczne. Test ten ujawnił różnice w organizacji F-aktyny i ogniskowych adhezjach w pierwotnych ludzkich komórkach okrężnicy w miarę zmian sztywności substratu. Ta platforma hodowli komórkowych otwiera możliwość zbadania różnych właściwości biofizycznych pierwotnych komórek ludzkich, takich jak sztywność komórek i trakcja, jako parametrów prognostyki raka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisany poniżej protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach UIUC.

1. Pobieranie i trawienie próbki tkanki chirurgicznej

  1. Pobrać próbkę tkanki nowotworowej zaraz po resekcji jelita grubego (ryc. 1A i 1B). Zbierz również tkankę z sąsiedniego zdrowego miejsca.
  2. Natychmiast przenieść tkankę do fiolki o pojemności 15 ml zawierającej 12 ml roztworu HBSS. Przechowywać fiolkę na lodzie w izolowanym pudełku piankowym.
  3. W ciągu 45 minut należy przetransportować fiolkę zawierającą tkankę do kaptura do hodowli tkankowej w celu dalszego przetwarzania. Fiolkę należy przechowywać na bloku lodu wewnątrz kaptura.
  4. Wlać dostarczoną chusteczkę do 6-dołkowej płytki zawierającej 6-7 ml roztworu HBSS za pomocą pipety.
    Uwaga: Ilość tkanki w studzience nie jest krytyczna na tym etapie płukania.
  5. Trzymaj płytkę z 6 dołkami na bloku lodu. Opłucz tkankę w roztworze HBSS dwukrotnie.
  6. Pokrój tkankę czysto na oddzielone sekcje sterylnymi nożyczkami. Zmiel tkankę na mniejsze odcinki nie większe niż 1-2 mm3 cala za pomocą sterylnego ostrza skalpela.
  7. Zważyć oznakowaną fiolkę z 0,1% trypsyną (zawierającą 1 ml 0,1% roztworu trypsyny) przed przeniesieniem tkanki. Przenieś tkankę ~ 20 mg do każdej z fiolek z 0,1% trypsyną za pomocą pipety.
  8. Staraj się zminimalizować przenoszenie HBSS do fiolki z trypsyną, aby uniknąć dalszego rozcieńczania trypsyny.
  9. Zważyć fiolki z trypsyną po przeniesieniu tkanki; udokumentować różnicę jako masę tkanki.
  10. Wlej ~ 20 mg tkanki i 1 ml trypsyny do każdego dołka 24-dołkowej płytki.
  11. Umieść 24-dołkową płytkę na shakerze w lodówce w temperaturze 4 °C na 16-20 godzin. W tym okresie oczekiwania lub wcześniej należy przygotować podłoża w żelu poliakrylamidowym i funkcjonalizować je białkami ECM, jak opisano w punkcie 3.

2. Enzymatyczna dysocjacja próbki tkanki na zawiesinę pojedynczej komórki i hodowla izolowanych komórek na funkcjonalnych elastycznych podłożach ECM i sztywnych naczyniach polistyrenowych

  1. Po 16-20 godzinach inkubacji w studzience trypsyny w temperaturze 4 °C na wytrząsarce, przenieść tkankę z trypsyny o temperaturze 4 °C do fiolki z kompletną pożywką wzrostową o temperaturze 4 °C (zawierającej 2-3 ml kompletnej pożywki wzrostowej) za pomocą pipety. Zapewnić minimalny transfer trypsyny do pożywki wzrostowej.
    Uwaga: Kompletny preparat pożywki wzrostowej jest następujący: pożywka bazowa RPMI 1640 uzupełniona surowicą końską do końcowego stężenia 10% i penicyliną-streptomycyną do 1% całkowitego roztworu.
  2. Umieścić fiolkę z tkanką zawierającą pożywkę w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 12-15 minut.
  3. Przenieść tkankę do 15 ml fiolki zawierającej roztwór HBSS za pomocą pipety, delikatnie wstrząsnąć.
  4. Powtórz czynności 2.3.
  5. Usunąć tkankę z roztworu HBSS i przenieść do 0,1% roztworu kolagenazy (w HBSS) fiolki zawierającej 1 ml roztworu. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C i 5% środowisku CO2 w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych. W okresie oczekiwania należy rozgrzać pożywkę wzrostową w fiolce o pojemności 15 ml w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
  6. Wyciągnij wszystkie fragmenty tkanek do pipety, minimalizując przenoszenie kolagenazy. Wyrzuć tylko fragmenty tkanek do wstępnie podgrzanych fiolek z pożywką hodowlaną.
  7. Umieść filtr studzienkowy o wielkości 40 μm w każdym dołku płytki 6-dołkowej. Zwilżyć filtr 1 ml pożywki do hodowli komórkowych.
  8. Rozcierać tkankę w pożywce za pomocą szklanej pipety o pojemności 10 ml kilka razy, aż do całkowitego rozdzielenia tkanki.
  9. Końcówkę pipety należy trzymać jak najbliżej dna fiolki.
  10. Umieść roztwór na filtrze, aby usunąć zanieczyszczenia i niezdysocjowane części.
  11. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórek w pożywce o sile 150 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Następnie usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić osad komórkowy z 2 ml świeżej pożywki hodowlanej.
  13. Policz komórki za pomocą hemocytometru (jeśli jest to wymagane). Wysiewaj izolowane komórki pierwotne na żelach funkcjonalizowanych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) i naczyniach polistyrenowych o pożądanym stężeniu.

3. Przygotowanie i funkcjonalizacja żeli poliakrylamidowych (PA) o różnej sztywności i podłoży polistyrenowych

Uwaga: W celu wizualnej demonstracji Sekcji 3, widzowie/czytelnicy są odsyłani do niedawnego artykułu17 Journal of Visualized Experiments (JoVE).

  1. Przyjmując opublikowane protokoły18, 19, aktywuj chemicznie szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm2, aby zapewnić kowalencyjne wiązanie hydrożelu.
    1. Najpierw należy traktować szkiełka nakrywkowe 3-aminopropylotrymetoksysilanem (ATS) przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Całkowicie usunąć ATS za pomocą wody DI, spłukać i potraktować szkiełka nakrywkowe 0,5% roztworem aldehydu glutarowego (rozcieńczonego w PBS z 70% roztworu podstawowego aldehydu glutarowego) przez 30 minut.
  2. Otrzymać roztwory żelu o natężeniu 2 kPa, mieszając 5% m/v roztworu akrylamidu i 0,05% roztworu N,N'-metylenobisakryloamidu (bis) w 10 mM soli fizjologicznejbuforowanej przez HEPES 20. Użyj 8% w/v akrylamidu i 0,13% roztworu N,N'-metylenobisakryloamidu (bis) w 10 mM soli fizjologicznej buforowanej HEPES dla żelu10 kPa 20.
    1. W obu przypadkach należy użyć nadsiarczanu amonu w stosunku 1:200 (10% w/v) i 1:2,000 N,N,N',N'--tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) jako inicjatora i katalizatora procesu polimeryzacji, odpowiednio.
    2. Dodać również 100 μl kulek fluorescencyjnych do roztworu żelu o natężeniu 2 kPa jako markery powiernicze 21, 22.
  3. Umieść kroplę 20 μl prepolimerowego roztworu żelu PA na szkiełku nakrywkowym aktywowanym o średnicy 12mm2. Umieść na kropli kolejne 12 mm2 zwykłe szklane szkiełko nakrywkowe. Upewnij się, że kropla rozprzestrzenia się między szkiełkami nakrywkowymi ze względu na kapilarność. Odwróć kanapkę dla żeli o natężeniu 2 kPa, aby upewnić się, że większość kulek znajdzie się w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej.
  4. Utwardzaj żel PA przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Zdejmij górne szkiełko nakrywkowe za pomocą maszynki do golenia z jedną krawędzią.
    Uwaga: Podczas obierania odklejanie postępuje od jednej krawędzi kanapki. Żel pozostaje przylegający do aktywowanego szkiełka podstawowego.
  6. Przed użyciem należy przechowywać żele w roztworze PBS.
  7. Funkcjonalizować żele PA i szkło cząsteczkami ECM, ludzką fibronektyną w stężeniu 50 μg/ml zgodnie z opublikowanymi metodami 23.
    1. Krótko mówiąc, inkubować podłoża z 2 ml czystego hydratu hydratyny O/N.
    2. Usuń hydrat hydrazyny i dokładnie spłucz podłoża wodą demineralizowaną.
    3. Podłoża myć 5% kwasem octowym przez 30 min.
    4. Usuń kwas octowy i dokładnie spłucz podłoża wodą demineralizowaną.
    5. Podłoża należy przechowywać zanurzone w wodzie DI przez 30 minut.
    6. Inkubować substraty z utlenioną fibronektyną przez 35 minut w stężeniu 50 μg/ml.
    7. Płukać podłoża PBS na wytrząsarce przy niskich obrotach przez 10 minut.
    8. Inkubować wszystkie substraty w temperaturze 37 °C w 2-3 ml pożywki hodowlanej przez 30 minut przed posiewem komórek.
      Uwaga: Komórki płytkowe w sposób słabo zaludniony (1,000-3,000 komórek/cm2). Każde szkiełko pokryte żelem musi być umieszczone na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Pozwól komórkom całkowicie przylegać przed jakąkolwiek mikroskopią (co najmniej O/N).

4. Testy mikroskopii sił trakcyjnych i immunofluorescencyjnej

  1. Test mikroskopii sił trakcyjnych
    1. Ogrzej 0,25% roztwór trypsyny-EDTA / 10% SDS w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentów trakcyjnych.
    2. Usuwać po jednym żelu z inkubatora do hodowli komórkowych na raz i umieszczać na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego (powiększenie 32x).
    3. Znajdź pojedynczą komórkę w polu widzenia. Zdejmij pokrywkę szalki Petriego.
    4. Wykonaj obraz komórki z kontrastem fazowym (np. Rysunek 3).
    5. Przełącz tryb obrazowania na fluorescencyjny i wybierz odpowiedni filtr. W tym czasie nie przesuwaj stolika mikroskopu ani próbki.
    6. Zrób zdjęcie kulek fluorescencyjnych przemieszczonych przez trakcję komórkową (Rysunek 4C).
    7. Dodać 1 ml roztworu trypsyny/SDS na szalkę Petriego, aby odłączyć komórkę od żelu. W tym czasie nie przesuwaj stolika mikroskopu ani próbki. Wykonaj również obraz kontrolny komórki, aby zapewnić całkowite usunięcie z żelu.
    8. Wykonaj obraz referencyjny (siła zerowa) koralików po usunięciu komórki.
    9. Powtórzyć kroki 4.1.2-4.1.8 dla wszystkich pozostałych żeli.
    10. Utwórz stos obrazów za pomocą ImageJ z dwóch obrazów uzyskanych w krokach 4.1.6 i 4.1.8 dla każdego przypadku. Aby wygenerować stos obrazów, użyj następującej sekwencji poleceń w ImageJ po otwarciu obrazów: Image → Stacks → Images to stack.
    11. Aby uzyskać pole przemieszczenia i przyczepność, użyj wtyczek ImageJ zgodnie z opublikowanymi metodami 21, 22. Uzyskaj kody i szczegółowe samouczki dla tych wtyczek, korzystając z poniższego linku: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
      1. Wyrównaj obrazy w stosie za pomocą wtyczki "Template Matching". Użyj następującej sekwencji poleceń w ImageJ po otwarciu stosu obrazów wygenerowanego w kroku 4.1.10: Wtyczki → Template Matching → Align Slices in Stack → OK. W konsekwencji zapisz stos obrazów. Użyj tego nowego stosu obrazów w poniższych krokach.
      2. Uzyskaj pole przemieszczenia za pomocą wtyczki PIV (prędkość obrazu cząstek) (rysunek 4D). Użyj następującej sekwencji poleceń po otwarciu stosu obrazów zapisanego w kroku 4.1.11.1: Wtyczki → PIV → Iteracyjny PIV (podstawowy) → OK → Zaakceptuj ten PIV i wyprowadź → Ok. Zapisz dane wyjściowe PIV w tym samym katalogu, co w oryginalnym stosie obrazów. Użyj tego jako danych wejściowych w następnym kroku.
      3. Na koniec użyj wtyczki FTTC (cytometria trakcyjna z transformacją Fouriera), aby uzyskać mapę trakcji (rysunek 4E). Użyj następującej sekwencji poleceń: Wtyczki → FTTC → Wstaw właściwości materiału, tj. moduł Younga i stosunek Poissona żelu PA → OK → Wybierz plik wyjściowy PIV zapisany w kroku 4.1.11.2 → OK. Zapisz wyniki FTTC w tym samym katalogu, co w stosie obrazów i danych wyjściowych PIV.
  2. Testy mikroskopii immunofluorescencyjnej
    1. Przenieś substraty, które mają być wybarwione immunologicznie, do okapu laminarnego i usuń pożywkę hodowlaną.
    2. Przepłukać podłoża PBS i utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj podłoża PBS 3 razy (za każdym razem 5 minut). W związku z tym inkubować podłoża z 500 μl wzmacniacza sygnału przez 30 minut i płukać PBS.
    4. Inkubować komórki z przeciwciałem monoklonalnym anty-winkuliną w rozcieńczeniu 1:250 w PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć podłoża PBS 3 razy (za każdym razem 5 minut).
    5. Inkubować próbki z przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG w rozcieńczeniu 1:200 w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemywać podłoża PBS 3 razy (za każdym razem 5 minut).
    6. Aby uwidocznić strukturę F-aktyny, inkubuj komórki z koniugatami falloidyny TRITC w stężeniu 50 μg/ml przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj podłoża PBS 3 razy (za każdym razem 5 minut).
    7. Zobrazuj próbki za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (rysunek 5A-5D).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany powyżej protokół został z powodzeniem zastosowany dla wielu próbek tkanek (n=12) pobranych od czterech różnych pacjentów zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej komisji etyki. Rysunek 1A przedstawia reprezentatywny guz jelita grubego bezpośrednio po operacji, z którego pobrano przekroje tkankowe do hodowli komórkowych. Typowy przekrój tkanki w roztworze HBSS po przeniesieniu do dygestorium laminarnego w celu dalszego przetwarzania pokazano na Rysunku 1B. Schemat trawienia i enzymat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stres trakcyjny komórkowy pojawił się ostatnio jako potencjalny biofizyczny wskaźnik stanu przerzutowego13. Jednak do tej pory w literaturze nie ma eksperymentalnych danych trakcyjnych z pierwotnymi komórkami nowotworowymi. Nie zgłoszono również jeszcze bezpośredniego hodowania izolowanych pierwotnych komórek jelita grubego na żelach poliakrylamidowych o różnej sztywności. W związku z tym ustalamy zoptymalizowane warunki hodowli pierwotnych komórek okrężnicy na żelach i polistyrenie (ryc. 2). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt został sfinansowany przez National Science Foundation ECCS grant 10-02165, oraz Interdisciplinary Innovation Initiative Program, University of Illinois grant 12035. M.Y.A. został sfinansowany na UIUC przez NIH National Cancer Institute Alliance for Nanotechnology in Cancer 'Midwest Cancer Nanotechnology Training Center' Grant R25 CA154015A. Immnunostaining i obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej przeprowadzono w Instytucie Biologii Genomowej (IGB), UIUC. M.Y.A. potwierdza rozmowy z B. J. Williamsem z UIUC na temat eksperymentów izolacyjnych. M.Y.A. dziękuje C. Nemehowi i Abdulowi Bhuiya z UIUC za pomoc w przygotowaniu schematów i listy materiałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
HBSSTechnologie życia14175-095
PBSLonza17-516F
TrypsynaWorthingtonLS003736
KolagenWorthingtonLS004176
3- Aminopropylotrymetoksysilan (ATS) Sigma-Aldrich281778
Aldehyd glutarowyPolysciences, Inc.01201-5
AkrylamidSigma-AldrichA4058
N-metylenobisakryloamid (bis)Sigma-AldrichM1533
Roztwór buforowy HEPESSigma-Aldrich83264
Nadsiarczan amonuBio-Rad161-0700
Ludzka fibronektynaBDbiologia 354008
Hydrat hydrazynySigma-Aldrich18412Niebezpieczny
kwas octowySigma-AldrichA6283
Paraformaldehyd Mikroskopia elektronowa NaukiRT15710
Wzmacniacz sygnałuTechnologie życiaI36933
Monoklonalne przeciwciało anty winkulinowe Sigma-AldrichV9131
Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgGLife technologieA11001
TRITC koniugaty falloidyny Sigma-AldrichP1951
0,1 i mikro; m koraliki fluroscentLife technologiesF8801
0,25% Trypsin-EDTATechnologie życia25200-056
Materiały
12 mm2 szklane szkiełka nakrywkoweCorning2865-12

Bibliografia

  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28, 113-127 (2009).
  3. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  4. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil. Cytoskeleton. 60, 24-34 (2005).
  5. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (25), 3661-3665 (1997).
  6. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophys. J. 93, 4453-4461 (2007).
  7. Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 279, 1345-1350 (2000).
  8. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  9. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  10. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophys. J. 99, 2460-2469 (2010).
  11. Ali, M. Y., Saif, M. T. A. Substrate Stiffness Mediated Metastasis Like Phenotype of Colon Cancer Cells is Independent of Cell to Gel Adhesion. Cell. Mol. Bioeng. , (2014).
  12. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. A. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. , (2014).
  13. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572(2012).
  14. Indra, I., Undyala, V., Kandow, C., Thirumurthi, U., Dembo, M., Beningo, K. A. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys. Biol. 8 (1), (2011).
  15. Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. J. Proteome Res. 5 (4), 862-878 (2006).
  16. Oikonomou, E., Kothonidis, K., Zografos, G., Nasioulas, G., Andera, L., Pintzas, A. Newly established tumourigenic primary human colon cancer cell lines are sensitive to TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. Br. J. Cancer. 97 (1), 73-84 (2007).
  17. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J. Vis. Exp. (91), (2014).
  18. Wang, Y. L., Pelham, R. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  19. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8, 3197-3206 (2012).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10-16 (2010).
  21. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  22. Chopra, A., et al. Augmentation of integrin-mediated mechanotransduction by hyaluronic acid. Biomaterials. 35 (1), 71-82 (2014).
  23. Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
  24. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS ONE. 5 (9), e12905(2010).
  25. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
  26. Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pierwotne ludzkie kom rki jelita grubegoenzymatyczna dysocjacja tkankitest cytometrii trakcyjnejmikroskopia immunofluorescencyjnahydro ele poliakrylamidoweanaliza sztywno ci pod o apomiar kurczliwo ci kom rekwizualizacja adhezji ogniskowejbadanie organizacji cytoszkieletuchirurgiczna izolacja tkanki
Izolacja pierwotnych ludzkich komórek nowotworowych jelita grubego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich, elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.