Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

16.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52533

⸱

21 kwietnia 2015

 ,  , 
1Center for Gastrointestinal Biology and Disease, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Genetics, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Streszczenie

Istnieje wiele różnych modeli zwierzęcych do badania patogenezy ludzkich chorób zapalnych jelit (IBD), z których każdy ma swoje zalety i wady. Opisujemy tutaj eksperymentalny model zapalenia jelita grubego, który jest inicjowany przez adoptywny transfer syngenicznych komórek T CD4 + CD45RB z syngeniczną śledzioną do myszy biorców z niedoborem limfocytów T i B. Populacja limfocytów T owysokiej zawartości CD4 + CD45RB, która w dużej mierze składa się z naiwnych komórek efektorowych, jest zdolna do wywoływania przewlekłego zapalenia jelit, bardzo przypominającego kluczowe aspekty ludzkiego IBD. Metodą tą można manipulować w celu zbadania aspektów początku i progresji choroby. Dodatkowo może być wykorzystany do badania funkcji wrodzonych, adaptacyjnych i regulacyjnych populacji komórek odpornościowych oraz roli ekspozycji środowiskowych, tj. mikrobioty, w zapaleniu jelit. W tym artykule ilustrujemy metodologię wywoływania zapalenia jelita grubego za pomocą protokołu krok po kroku. Obejmuje to demonstrację wideo kluczowych aspektów technicznych wymaganych do pomyślnego opracowania tego mysiego modelu eksperymentalnego zapalenia jelita grubego do celów badawczych.

Wprowadzenie

Choroby zapalne jelit (IBD) Choroba Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego wynikają z nie do końca zdefiniowanej i złożonej interakcji między odpowiedziami immunologicznymi gospodarza, podatnością genetyczną, czynnikami środowiskowymi i zawartością światła jelitowego1. Ostatnie badania asocjacyjne całego genomu donoszą o powiązaniach między genami regulatorowymi komórek odpornościowych a podatnością na IBD2,3. W badaniach tych reprezentowane są zarówno wrodzone, jak i nabyte geny wewnętrzne komórek odpornościowych, co wskazuje na kluczową rolę tych populacji komórek w patogenezie IBD.

Obecnie istnieje ponad 50 zwierzęcych modeli ludzkiego IBD. Chociaż żaden model nie jest idealnie fenokopią ludzkiego IBD, wiele z nich jest przydatnych do badania różnych aspektów chorób u ludzi, w tym początku i progresji choroby oraz reakcji na gojenie się ran. W opisanej tutaj metodzie zapalenie jelit rozpoczyna się od syngenicznego transferu adopcyjnego komórek T CD4 + CD45RB do myszy biorców z niedoborem limfocytów Ti B 4. Populacja limfocytów To wysokiej zawartości CD4 + CD45RB zawiera głównie naiwne limfocyty T przygotowane do aktywacji, które są zdolne do wywoływania przewlekłego zapalenia jelita cienkiego i okrężnicy. Metoda ta pozwala badaczowi modyfikować kluczowe zmienne eksperymentalne, w tym zarówno wrodzone, jak i adaptacyjne populacje komórek odpornościowych, aby odpowiedzieć na biologicznie istotne pytania związane z patogenezą choroby. Dodatkowo metoda ta zapewnia precyzyjną inicjację początku choroby i dobrze scharakteryzowany przebieg eksperymentu w czasie. Pozwala to na badanie kinetyczne klinicznych cech progresji choroby u myszy. Zapalenie jelit wywołane tą metodą ma wiele cech wspólnych z ludzkim IBD, w tym przewlekłe zapalenie poprzeczne jelita grubego i cienkiego, patogenezę napędzaną przez cytokiny, takie jak TNF i IL-12, oraz objawy ogólnoustrojowe, takie jak wyniszczenie5. Jest to więc idealny system modelowy do badania patogenezy ludzkiego NZJ.

Metoda tutaj szczegółowo opisuje protokół indukowania eksperymentalnego zapalenia jelita grubego poprzez adoptywny transfer limfocytów To wysokiej zawartości CD4+CD45RB do myszy Rag1-/-. Omawiamy kluczowe kroki techniczne, oczekiwane wyniki, optymalizację i rozwiązywanie problemów. Do celów badawczych zajmiemy się elementami wymaganymi do pomyślnego opracowania tego mysiego modelu zapalenia jelit

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Należy upewnić się, że wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i są z nimi zgodne, a także z wytycznymi National Research Council w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Myszy dawcy mogą być samcami lub samicami, ale myszy biorcy powinny być samcami. W przypadku użycia samic jako biorców, myszy dawcy również muszą być samicami5. Kolonie należy utrzymywać, stosując zwykłą, niesterylną ściółkę oraz wodę niezakwaszoną, ponieważ czynniki te mogą wpływać na mikrobiotę jelitową, a w konsekwencji na fenotyp zapalenia jelita grubego u myszy5,6.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Użyć schłodzonych w lodzie pożywek i buforów. Przez cały czas trwania eksperymentu komórki należy przechowywać w lodzie.
  2. Eksperyment należy przeprowadzić w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując technikę sterylną.

2. Izolacja limfocytów T z śledziony

  1. Uśmiercić mysz/myszy dawców w komorze z CO2, a następnie zastosować zwichnięcie szyi. Spryskać brzuch 70% etanolem.
  2. Wyonać poziome cięcie w obrębi brzucha i odsunąć skórę, aby odsłonić otrzewną. Odsunąć otrzewną od organów wewnętrznych za pomocą pęsety i wykonać nacięcie w lewej części otrzewnej brzusznej, aby odsłonić i wyciąć śledzionę.
  3. Umieścić śledzionę w 10 ml pożywki kompletnej (Complete Media) w płytce Petriego. Usunąć i odrzucić nadmiar tkanki ze śledziony.
  4. Używając dwóch sterylizowanych szkiełek przedmiotowych, rozgnieść i rozdzielić śledzionę do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sito o oczkach 70 μm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml i przepłukać sito 5 ml pożywki kompletnej. Do jednej probówki stożkowej 50 ml można umieścić do 5 śledzion.
  5. Wirować komórki przy 450 x g przez 7 min. Usunąć supernatant poprzez odlanie lub odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.
  6. Delikatnie resuspendować komórki w buforze do lizy (Lysis Buffer) w ilości 5 ml na każdą śledzionę, aby zlizować erytrocyty; inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Do probówki dodać równą objętość pożywki kompletnej (5 ml na śledzionę).
  7. Wirować komórki przy 450 x g przez 7 min. Usunąć supernatant poprzez odlanie lub odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.
  8. Delikatnie resuspendować komórki w 10 ml buforu do znakowania (Labeling Buffer).
  9. Policzyć komórki metodą wykluczania błękitu trypanowego.
    1. Pobrać 20 μl zawiesiny komórkowej, dodać do 180 μl błękitu trypanowego w probówce do mikrowirowania i dokładnie wymieszać. Po 5 min nanieść 10 μl oznakowanych komórek do hemocytometru i policzyć komórki niezafarbowane na niebiesko pod mikroskopem. Określić całkowitą liczbę żywych komórek. Wyrzucić mieszaninę komórek z błękitem trypanowym.
  10. Wirować komórki w 10 ml buforu do znakowania przy 450 x g przez 7 min. Usunąć supernatant poprzez odlanie lub odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.

3. Wzbogacanie limfocytów T CD4+

UWAGA: W przypadku konkretnych produktów użytych w tej sekcji należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Delikatnie resuspenduj komórki do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek o stężeniu 20 x 106 cell/ml w zimnym Labeling Buffer.
  2. Dodaj 5 μl biotynylowanych przeciwciał do wzbogacania limfocytów T CD4 na 1 x 106 komórek. Inkubuj komórki w lodzie przez 15 min.
  3. Dodaj 10-krotność objętości Labeling Buffer. Centryfuguj komórki przy 450 × g przez 7 min. Ostrożnie odessij cały supernat { supernatant} za pomocą odkurzacza do pojemnika na odpady.
  4. Dokładnie wymieszaj na wirówce (vortex) magnetyczne cząsteczki sprzężone ze streptawidyną. Dodaj 5 μl cząsteczek na 1 x 106 komórek.
  5. Wymieszaj dokładnie, lecz delikatnie. Przechowuj mieszaninę w temperaturze 6-12 °C przez 30 min.
  6. Dodaj Labeling Buffer do uzyskania stężenia 20-80 x 106 cells/ml. Przenieś do 1,0 ml oznakowanych komórek do każdej okrągłodennej probówki 12 x 75 mm (określanej jako „probówka z frakcją pozytywną”).
  7. Umieść każdą probówkę z frakcją pozytywną na magnesie na 6-8 min.
  8. Gdy probówki z frakcją pozytywną wciąż znajdują się na magnesie, ostrożnie przenieś supernat z probówki z frakcją pozytywną za pomocą szklanej pipety Pasteura do nowej sterylnej probówki stożkowej 50 ml (określanej jako „frakcja wzbogacona”). Ta frakcja wzbogacona zawiera limfocyty T CD4+. Należy uważać, aby nie zakłócić osadzenia oznakowanych komórek przyciągniętych przez magnes.
  9. Resuspenduj komórki pozostałe w probówkach z frakcją pozytywną w tej samej objętości Labeling Buffer, co w kroku 3.6, energicznie pipetując w górę i w dół. Ponownie umieść probówkę z frakcją pozytywną na magnesie na 6-8 min.
  10. Gdy probówki z frakcją pozytywną wciąż znajdują się na magnesie, ostrożnie przenieś supernat (frakcja wzbogacona, CD4+) z probówki z frakcją pozytywną za pomocą szklanej pipety Pasteura do sterylnej probówki stożkowej 50 ml z kroku 3.8, nie zakłócając komórek przytwierdzonych do magnesu.
  11. Powtórz kroki 3.9-3.10, aby zwiększyć uzysk uzyskanych limfocytów T CD4+. Kontynuuj protokół, używając frakcji wzbogaconej (komórek CD4+).

4. znakowanie i sortowanie komórek7

  1. Odwiruj wzbogacone komórki z prędkością 450 x g przez 7 min. Usuń nadsącz przez odlanie lub odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.
  2. Resuspender komórki w 1 ml buforu do znakowania (Labeling Buffer). Pobierz aliquot komórek w celu ich policzenia i oceny żywotności za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego, zgodnie z krokiem 2.9.
  3. Dodaj objętość buforu do znakowania (Labeling Buffer), aby uzyskać stężenie 10 x 106 komórek/ml; jeśli liczba komórek jest już <10 x 106, odwiruj przy 450 x g przez 7 min, usuń nadsącz przez odlanie lub odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady i dodaj objętość buforu do znakowania (Labeling Buffer) do 10 x 106 komórek/ml.
    1. Przygotuj oddzielne aliquoty po około 5-10 × 105 komórek każda dla komórek niezbarwionych, barwionych izotypem oraz kontroli pojedynczo barwionych w probówkach do mikrocentryfugi.
  4. Dodaj do komórek 5 μg/ml CD4-FITC oraz 1 μg/ml CD45RB-PE. Dodaj barwniki kontrolne izotypowe i barwniki pojedyncze w tym samym stężeniu do odpowiednich aliquotów w probówkach do mikrocentryfugi. Wymieszaj dokładnie, lecz delikatnie, i inkubuj na lodzie, chroniąc przed światłem, przez 30 min.
  5. Dodaj 10-krotną objętość buforu do znakowania (Labeling Buffer) do komórek i kontroli. Odwiruj przy 450 x g przez 7 min. Usuń nadsącz przez odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.
  6. Resuspender w buforze do znakowania (Labeling Buffer) do objętości opisanej w kroku 4.5. Odwiruj przy 450 x g przez 7 min. Usuń nadsącz przez odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.
  7. Resuspender w buforze do znakowania (Labeling Buffer) do stężenia 10 x 106 komórek/ml. Przepuść komórki przez sito 70 μm do probówki do FACS. Przechowuj na lodzie, chroniąc przed światłem, aż do rozpoczęcia analizy FACS.
  8. Skonfiguruj i wyznacz odpowiednią kompensację w sorterze komórek, korzystając z komórek niezbarwionych i kontroli pojedynczo barwionych.
  9. Wyklucz martwe komórki za pomocą bramkowania rozproszenia przedniego i bocznego (forward- and side-scatter gating) (Rycina 1A). Skonfiguruj bramkowanie dla komórek CD4+ i CD45RB+ przy użyciu kontroli barwionych izotypem. Wyznacz bramkę dla populacji CD4+.
  10. Posortuj komórki CD4+ na populacje CD45RBhigh i CD45RBlow, stosując prosty histogram dla komórek barwionych PE, do probówek zawierających 2 ml pożywki kompletnej (Complete Media). Populacja CD45RBhigh stanowi najwyższe 40% komórek CD4+CD45RB+ (CD45RBhigh), a populacja CD45RBlow stanowi najniższe 20% komórek CD4+CD45RB+ (CD45RBlow; Rycina 1B).

Wielokolorowa analiza cytometrii przepływowej, wykresy kropkowe i histogram, przedstawiające rozkład danych komórkowych.
Rycina 1: Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej populacji limfocytów T CD4+CD45RB podczas analizy FACS. (A-C) Splenocyty od myszy dawców C57BL/6 barwione FITC CD4 i PE CD45RB zostały posortowane metodą FACS na populacje limfocytów T CD4+CD45RBhigh oraz CD4+CD45RBlow. (A) Zdarzenia dubletów zostały wykluczone na wykresie rozprosiania przedniego. (B) Limfocyty zostały wyznaczone (gating) na wykresie rozprosiania przedniego i bocznego. (C) Wyznaczono bramkę dla limfocytów T CD4+ , a następnie (D) limfocyty T CD4+CD45RB+ przedstawiono na histogramie PE względem liczby zdarzeń. Komórki CD4+CD45RBlow uznano za dolne 20% komórek CD45RB+. Komórki CD4+CD45RBhigh zdefiniowano jako górne 40% komórek CD45RB+.

  1. Przeanalizuj alikwot każdej populacji komórek na urządzeniu FACS, aby ocenić czystość populacji.
  2. Wirować posortowane komórki przy 450 x g przez 7 min. Resuspendować w 1 ml PBS. Pobrać alikwot komórek w celu ich policzenia i oceny żywotności za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego, zgodnie z krokiem 2.9.

5. Wstrzykiwanie komórek do biorców

  1. Resuspendowane posegregowane komórki w PBS powinny osiągnąć stężenie 4 x 106 komórek/ml (CD45RBhigh) lub 2 x 106 komórek/ml (CD45RBlow).
  2. Przenieś 100 μl komórek CD45RBhigh na jednego biorcę do nowej sterylnej probówki. Do probówki dodaj 100 μl PBS na jednego biorcę. W ten sposób całkowita objętość iniekcji na zwierzę wynosi 200 μl, a całkowita liczba komórek na biorcę to 4 x 105 naiwnych limfocytów T CD4+CD45RBhigh.
  3. W przypadku chęci utworzenia grupy eksperymentalnej otrzymującej limfocyty T regulatorowe, przenieś 100 μl komórek CD45RBhigh na jednego biorcę do nowej sterylnej probówki. Do tej samej probówki dodaj 100 μl komórek CD45RBlow na jednego biorcę. Całkowita objętość iniekcji na zwierzę wynosi 200 μl; stosunek komórek CD45RBhigh:CD45RBlow wynosi 2:1.
  4. Wstrzyknij 100 μl komórek CD45RBhigh lub CD45RBhigh/CD45RBlow CD4+ drogą dostrojewną w prawą i lewą stronę jamy brzusznej (łącznie 200 μl) każdego biorcy.

6. Monitorowanie progresji choroby u zwierząt biorców

  1. Aby ocenić stan kliniczny zwierząt biorców, przypisz zagregowane oceny kliniczne dla następujących parametrów8 w dniu iniekcji, następnie co tydzień oraz w momencie uboju:
    1. Określ stopień wyniszczenia poprzez pomiar utraty masy ciała: 0 – brak utraty masy ciała; 1 – utrata 0,1-10% początkowej masy ciała; 2 – utrata więcej niż 10% początkowej masy ciała (Rycina 2A).

Badanie odpowiedzi immunologicznej; wykres wagi; mysz jako obiekt badań; porównanie przewodu pokarmowego; wpływ limfocytów T.
Rycina 2: Objawy kliniczne i makroskopowe zmiany patologiczne stanu zapalnego występujące po transferze limfocytów T CD4+CD45RBhigh typu dzikiego do myszy biorców Rag1-/- oraz NRDKO11. (A) Biorcy NRDKO stracili średnio 10% początkowej masy ciała do 5 tygodnia po transferze, podczas gdy biorcy Rag1-/- nie wykazywali w tym czasie klinicznych objawów choroby. Każdy punkt reprezentuje średnią wartość procentową początkowej masy ciała dla danej kohorty ± SEM. **, p <0.005. (B) U niektórych myszy rozwinął się ciężki stan zapalny jelit, co potwierdzono wystąpieniem wypadku odbytnicy. Jest to reprezentatywne zdjęcie wypadku odbytnicy u myszy biorcy NRDKO. (C) Makroskopowo jelita grubie z myszy biorców Rag1-/- oraz NRDKO są pogrubione i skrócone w porównaniu do jelit grubych myszy Rag1-/- oraz NRDKO bez adopcyjnego transferu limfocytów T. Jelita grubie myszy biorców NRDKO wykazują ciężki stan zapalny i zwiększoną masę (dane nie pokazano). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

    1. Określ konsystencję stolca, umieszczając zwierzę w czystym pojemniku do czasu wydalenia stolca: 0 – brak; 1 – stolec miękki; 2 – stolec wodnisty i/lub z domieszką krwi.
    2. Określ ogólny stan zdrowia zwierzęcia na podstawie obecności następujących objawów choroby: 0 – brak zgarbionej postawy, zjeżyłego futra lub zmian skórnych; 1 – wystąpienie dowolnego z poniższych: zgarbiona postawa, zjeżyłe futro lub zmiany skórne.
    3. Określ obecność wypadnięcia odbytnicy: 0 – brak; 1 – obecne (Rysunek 2B).
  2. Uśmieć zwierzęta poprzez inhalację CO2, a następnie zastosuj zwichnięcie szyi, gdy stracą 20% początkowej masy ciała lub w wybranym punkcie czasowym, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. Objawy kliniczne choroby pojawiają się zazwyczaj począwszy od 5. tygodnia po uzupełnieniu diety.
  3. Oceń stopień nasilenia choroby zgodnie z wcześniejszym opisem5,7.
    1. Przypisz oceny kliniczne zgodnie z krokiem 6.18.
    2. Zmierz długość i masę okrężnicy (Rysunek 2C).
    3. Przeprowadź analizę histologiczną stanu zapalnego5.
    4. Określ spontaniczną ekspresję cytokin w kulturach eksplantów tkanki jelitowej9, węzłach chłonnych krezkowych10 i/lub w surowicy11.
      1. Krótko opisując: w przypadku kultur eksplantów9 usuń okrężnice po uśmierceniu, otwórz je wzdłużnie i oczyść za pomocą PBS. Inkubuj okrężnice na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 250 rpm w Complete Media przez 30 min w temperaturze pokojowej.
      2. Posiekaj tkankę na małe kawałki i inkubuj w temperaturze 37 °C w Complete Media przez 24 hr. Zbierz supernatant i wykorzystaj go do ilościowego oznaczenia cytokin na 100 mg tkanki metodą ELISA.
    5. Przeprowadź charakterystykę fenotypów i/lub funkcji limfocytów T ex vivo10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Z 10 śledzion z dorosłych myszy dawców szczepu C57BL/6 niezawodnie izoluje się około 10 x 106 limfocytów T CD4+CD45RBhigh. Liczba ta będzie się różnić w zależności od wieku i szczepu myszy dawcy oraz doświadczenia badacza. Po przeniesieniu 4 x 105 limfocytów T C57BL/6 CD4+CD45RBhigh do myszy biorców C57BL/6 Rag1-/-, objawy kliniczne choroby pojawiają się około 5 tygodnia po transferze lub wcześniej, jeśli myszy są genetycznie podatne na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj opisujemy krok po kroku protokół indukujący zapalenie okrężnicy u myszy poprzez adoptywny transfer limfocytów T CD4 + CD45RB + do myszy z niedoborem odporności. Użyliśmy śledziony dawcy C57BL/6 i myszy biorców syngenicznych Rag1-/-, chociaż inne szczepy (np. BALB/c, 129S6/SvEv, cukrzyca nieotyła (NOD)) i genetyczne modele niedoboru odporności (np. SCID, Rag2-/-) mogą być również stosowane4,14-16. Powszechnie wiadomo, że szcze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez American Gastroenterological Association (AGA) Research Scholars Award oraz Crohn's and Colitis Foundation of America (CCFA) Career Development Award (dla S.Z.S.), NIH NIDDK F30 DK089692 (dla E.C.S.), oraz University of North Carolina Center for Gastrointestinal Biology and Disease Grant P30 DK34987 (Histology Core). Podstawowy ośrodek cytometrii przepływowej UNC jest częściowo wspierany przez NCI Center Core Support Grant (P30CA016086) dla UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Dziękujemy Luke'owi B. Borstowi z North Carolina State University College of Veterinary Medicine za pomoc w analizie histopatologicznej i immunohistochemii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa firmy zajmującej się odczynnikiem/ sprzętemNumer katalogowyUwagi/Opis
10x PBSGibco14200075
12 mm x 75 mm rurka okrągłodennaFalcon352052
15 ml stożkowaCorning430790
Igła 26 G x 3/8BD Biosciences305110
50 ml stożkowaCorning
70 μ m Sitko do komórekFisherbrand22363548
BD IMagnetBD Biosciences552311
β-merkaptoetanolThermo Scientific35602
CD4-FITC IgG2beBioscience11-0041
CD45RB-PE IgG2aBD Pharminogen553101
Complete MediaRPMI-1640, 1% Długopis/paciorkowiec, 10% FBS, 0,0004% β-ME
Probówka FACS + sitkoBD Falcon352235
Szklane szkiełka mikroskopoweFisherbrand12550A3
Inaktywowany termicznie FBSGemini100-106
Bufor1x PBS, 0,5% BSA, 2 mM
EDTA Bufor0,08% NH4Cl, 0,1% KHCO3, 1 mM EDTA
MoFlo XDPBeckman Coulter
Mouse CD4 T Zestaw do wzbogacania limfocytów - DMBD Biosciences558131
Mysz IgG2a-PEBD Pharminogen553457
Mysz IgG2b-FITCeBioscience11-4732
Pibuła PasteuraFisherbrand13-678-20D
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100XCorning Cellgro30-002-CI
[nagłówek]
Petri DishFisherbrand875713
Czysty etanol 200 ProofDecon Labs2705-HC
RPMI-1640Gibco11-875-093
StrzykawkaBD Biosciences309597
Trypan niebieskiCorning Cellgro25-900-CI
Wash MediaRPMI-1640, 1% pióro/paciorkowiec, 0,0004% β-ME
430828 do etykietowania do lizy

Bibliografia

  1. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  2. Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
  3. Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
  4. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Ma, B. W., et al. Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice. PLoS One. 7 (10), e47416(2012).
  7. Read, S., Powrie, F. Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).
  8. Maillard, M. H., et al. The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells. J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).
  9. Hegazi, R. A., et al. Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway. J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).
  10. Kole, A., et al. Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis. J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).
  11. Kobayashi, T., et al. NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis. J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).
  12. Steinbach, E. C., et al. Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis. J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).
  13. Kobayashi, T., et al. NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity. J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).
  14. Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells. Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).
  15. Powrie, F., et al. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4. T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).
  16. Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).
  17. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437(2014).
  18. Fukata, M., et al. The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease. J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).
  19. Kurtz, C. C., et al. Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).
  20. Naganuma, M., et al. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).
  21. Ranatunga, D. C., et al. A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis. J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).
  22. Srikrishna, G., et al. Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa. B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).
  23. Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

adoptywny transfer limfocyt w Tizolacja kom rek ledzionyfluorescencyjne znakowanie przeciwcia amisortowanie kom rek aktywowane fluorescencjdojambrzuszna iniekcja kom rekeksperymentalny model zapalenia jelita grubegonieswoiste zapalenia jelit
Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.