Artykuł metodologiczny

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

DOI:

10.3791/52533

⸱

21 kwietnia 2015

 ,  , 
1Center for Gastrointestinal Biology and Disease, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Genetics, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele różnych modeli zwierzęcych do badania patogenezy ludzkich chorób zapalnych jelit (IBD), z których każdy ma swoje zalety i wady. Opisujemy tutaj eksperymentalny model zapalenia jelita grubego, który jest inicjowany przez adoptywny transfer syngenicznych komórek T CD4 + CD45RB z syngeniczną śledzioną do myszy biorców z niedoborem limfocytów T i B. Populacja limfocytów T owysokiej zawartości CD4 + CD45RB, która w dużej mierze składa się z naiwnych komórek efektorowych, jest zdolna do wywoływania przewlekłego zapalenia jelit, bardzo przypominającego kluczowe aspekty ludzkiego IBD. Metodą tą można manipulować w celu zbadania aspektów początku i progresji choroby. Dodatkowo może być wykorzystany do badania funkcji wrodzonych, adaptacyjnych i regulacyjnych populacji komórek odpornościowych oraz roli ekspozycji środowiskowych, tj. mikrobioty, w zapaleniu jelit. W tym artykule ilustrujemy metodologię wywoływania zapalenia jelita grubego za pomocą protokołu krok po kroku. Obejmuje to demonstrację wideo kluczowych aspektów technicznych wymaganych do pomyślnego opracowania tego mysiego modelu eksperymentalnego zapalenia jelita grubego do celów badawczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby zapalne jelit (IBD) Choroba Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego wynikają z nie do końca zdefiniowanej i złożonej interakcji między odpowiedziami immunologicznymi gospodarza, podatnością genetyczną, czynnikami środowiskowymi i zawartością światła jelitowego1. Ostatnie badania asocjacyjne całego genomu donoszą o powiązaniach między genami regulatorowymi komórek odpornościowych a podatnością na IBD2,3. W badaniach tych reprezentowane są zarówno wrodzone, jak i nabyte geny wewnętrzne komórek odpornościowych, co wskazuje na kluczową rolę tych populacji komórek w patogenezie IBD.

Obecnie istnieje ponad 50 zwierzęcych modeli ludzkiego IBD. Chociaż żaden model nie jest idealnie fenokopią ludzkiego IBD, wiele z nich jest przydatnych do badania różnych aspektów chorób u ludzi, w tym początku i progresji choroby oraz reakcji na gojenie się ran. W opisanej tutaj metodzie zapalenie jelit rozpoczyna się od syngenicznego transferu adopcyjnego komórek T CD4 + CD45RB do myszy biorców z niedoborem limfocytów Ti B 4. Populacja limfocytów To wysokiej zawartości CD4 + CD45RB zawiera głównie naiwne limfocyty T przygotowane do aktywacji, które są zdolne do wywoływania przewlekłego zapalenia jelita cienkiego i okrężnicy. Metoda ta pozwala badaczowi modyfikować kluczowe zmienne eksperymentalne, w tym zarówno wrodzone, jak i adaptacyjne populacje komórek odpornościowych, aby odpowiedzieć na biologicznie istotne pytania związane z patogenezą choroby. Dodatkowo metoda ta zapewnia precyzyjną inicjację początku choroby i dobrze scharakteryzowany przebieg eksperymentu w czasie. Pozwala to na badanie kinetyczne klinicznych cech progresji choroby u myszy. Zapalenie jelit wywołane tą metodą ma wiele cech wspólnych z ludzkim IBD, w tym przewlekłe zapalenie poprzeczne jelita grubego i cienkiego, patogenezę napędzaną przez cytokiny, takie jak TNF i IL-12, oraz objawy ogólnoustrojowe, takie jak wyniszczenie5. Jest to więc idealny system modelowy do badania patogenezy ludzkiego NZJ.

Metoda tutaj szczegółowo opisuje protokół indukowania eksperymentalnego zapalenia jelita grubego poprzez adoptywny transfer limfocytów To wysokiej zawartości CD4+CD45RB do myszy Rag1-/-. Omawiamy kluczowe kroki techniczne, oczekiwane wyniki, optymalizację i rozwiązywanie problemów. Do celów badawczych zajmiemy się elementami wymaganymi do pomyślnego opracowania tego mysiego modelu zapalenia jelit

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie protokoły dotyczące zwierząt są zatwierdzone i zgodne z przepisami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) oraz Przewodnikiem Narodowej Rady ds. Badań Naukowych dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Myszy dawcy mogą być samcami lub samicami, ale myszy biorcy powinny być samcami. Jeśli mają być wykorzystane samice biorców, myszy dawcy muszą być samicami5. Utrzymuj kolonie przy użyciu zwykłej, niesterylnej ściółki i niezakwaszonej wody, ponieważ mogą one wpływać na mikrobiotę jelitową, a tym samym na fenotyp zapalenia jelita grubegomyszy 5,6.

1. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Używaj lodowatych pożywek i. Utrzymuj komórki na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu.
  2. Przeprowadź eksperyment w sterylnym kapturze zagrożenia biologicznego przy użyciu sterylnej techniki.

2. Izolacja limfocytów T śledziony

  1. Eutanazja myszy/myszy dawcy w komorze CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Spryskaj brzuch 70% etanolem.
  2. Wykonaj poziome nacięcie w jamie brzusznej i oderwij skórę, aby odsłonić otrzewną. Przytrzymaj otrzewną z dala od narządów wewnętrznych za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie w lewej otrzewnej brzusznej, aby odsłonić i wyciąć śledzionę.
  3. Umieścić śledzionę w 10 ml kompletnej pożywki na szalce Petriego. Usuń i wyrzuć nadmiar tkanki ze śledziony.
  4. Użyj 2 wysterylizowanych szkiełek szkiełkowych, aby zmiażdżyć i rozdzielić śledzionę na jednokomórkową zawiesinę. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przepłukać sitko 5 ml Complete Media. Umieść do 5 śledzion w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  5. Odwirować komórki przy 450 x g przez 7 min. Odlać supernatant przez wylanie lub odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.
  6. Delikatnie zawiesić komórki w 5 ml na śledzionę buforu Lysis Buffer, aby lizować czerwone krwinki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodać równą objętość pożywki Complete (5 ml na śledzionę) do probówki.
  7. Odwirować komórki przy 450 x g przez 7 min. Odlać supernatant przez wylanie lub odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.
  8. Delikatnie zawieś ponownie komórki w 10 ml buforu do etykietowania.
  9. Policz komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego.
    1. Usunąć 20 μl zawiesiny komórkowej i dodać do 180 μl błękitu trypanowego do probówki do mikrofuge i dokładnie wymieszać. Po 5 minutach dodać 10 μl znakowanych komórek do hemocytometru i policzyć inne niż niebieskie komórki pod mikroskopem. Określ całkowitą liczbę żywotnych komórek. Wyrzuć mieszankę komórkowo-trypanową błękitu.
  10. Odwirować komórki w 10 ml buforu do etykietowania przy 450 x g przez 7 minut. Odlać supernatant przez wylanie lub odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.

3. Wzbogacanie limfocytów T CD4+

UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dla konkretnych produktów używanych w tej sekcji.

  1. Delikatnie zawiesić komórki do zawiesiny jednokomórkowej o wymiarach 20 x 106 komórek/ml w zimnym buforze do etykietowania.
  2. Dodać 5 μl na 1 x 106 komórek biotynylowanych przeciwciał wzbogacających limfocyty T CD4. Inkubować komórki na lodzie przez 15 minut.
  3. Dodaj 10-krotną objętość bufora do etykietowania. Odwirować komórki w ilości 450 × g przez 7 minut. Ostrożnie odessać cały supernatant za pomocą odsysania próżniowego do pojemnika na odpady.
  4. Dokładnie wirować cząstki magnetyczne sprzężone ze streptawidyną. Dodać 5 μl cząstek na 1 x 106 komórek.
  5. Wymieszaj dokładnie, ale delikatnie. Mieszać w temperaturze 6-12 °C przez 30 minut.
  6. Dodać bufor do etykietowania o stężeniu 20-80 x 106 komórek/ml. Przenieść do 1,0 ml oznakowanych komórek na probówkę okrągłodenną o wymiarach 12 x 75 mm (określaną jako "probówka z frakcją dodatnią").
  7. Umieść każdą probówkę z frakcją dodatnią na magnesie na 6-8 minut.
  8. Trzymając probówki z frakcją dodatnią nadal na magnesie, ostrożnie przenieś supernatant z probówki frakcji dodatniej ze szklaną pipetą Pasteura do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml (zwanej "frakcją wzbogaconą"). Ta wzbogacona frakcja zawiera limfocyty T CD4 +. Uważaj, aby nie zakłócić oznaczonych komórek przyciąganych do magnesu.
  9. Zawiesić komórki pozostawione w probówkach z frakcją dodatnią w tej samej objętości buforu znakującego, co w kroku 3.6, energicznie pipetując w górę iw dół. Umieść probówkę z frakcją dodatnią z powrotem na magnesie na 6-8 minut.
  10. Trzymając probówki z frakcją dodatnią nadal na magnesie, ostrożnie przenieś supernatant (frakcja wzbogacona, CD4+) z probówki frakcji dodatniej ze szklaną pipetą Pasteura do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml z kroku 3.8 bez naruszania komórek przymocowanych do magnesu.
  11. Powtórz kroki 3.9-3.10, aby zwiększyć wydajność uzyskanych limfocytów T CD4 +. Kontynuuj protokół z użyciem wzbogaconej frakcji (komórki CD4+).

4. Etykietowanie i sortowanie komórek7

  1. Odwirować wzbogacone komórki przy 450 x g przez 7 minut. Odlać supernatant przez odlanie lub odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do etykietowania. Usunąć podwielokrotność komórek do zliczenia i oceny żywotności komórek poprzez wykluczenie błękitu trypanowego, jak w kroku 2.9.
  3. Dodać objętość buforu do etykietowania do 10 x 106 komórek/ml; jeśli komórki są już <10 x 106, odwirować przy 450 x g przez 7 minut, wyrzucić supernatant przez wylanie lub odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady i dodać objętość buforu do etykietowania do 10 x 106 komórek/ml.
    1. Ustaw oddzielne podwielokrotności po około 5-10 × 105 komórek każda dla niebarwionych, barwionych izotypem i pojedynczo barwionych komórek kontrolnych w probówkach do mikrofugów.
  4. Dodać 5 μg/ml CD4-FITC i 1 μg/ml CD45RB-PE do komórek. Dodać barwienia kontrolne izotypu i pojedyncze barwienia w tym samym stężeniu do odpowiednich podwielokrotności w probówkach do mikrofuge. Dobrze wymieszaj, ale delikatnie i inkubuj na lodzie chronionym przed światłem przez 30 minut.
  5. Dodaj 10-krotnie większą objętość bufora etykietowania do komórek i kontrolek. Wirować 450 x g przez 7 min. Wyrzucić supernatant przez odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.
  6. Ponownie zawieś w buforze etykietowania do woluminu w kroku 4.5. Wirować 450 x g przez 7 min. Wyrzucić supernatant przez odsysanie próżniowe do pojemnika na odpady.
  7. Zawiesić w buforze do etykietowania do 10 x 106 komórek/ml. Przepuścić komórki przez sitko 70 μm do probówki FACS. Przechowywać na lodzie chronionym przed światłem, dopóki nie będzie gotowy do FACS.
  8. Ustaw i określ odpowiednią kompensację w sortowniku komórek z niebarwionymi komórkami i pojedynczymi kontrolami.
  9. Wyklucz nieżywotne komórki z bramkowaniem rozproszenia do przodu i bocznie (Rysunek 1A). Skonfiguruj bramkowanie dla komórek CD4 + i CD45RB + z kontrolkami barwionymi izotypem. Komórki bramkowe w populacji CD4+.
  10. Sortuj komórki CD4+ na populacje owysokiej zawartości CD45RB iniskiej CD45RB za pomocą prostego histogramu dla komórek barwionych PE do probówek z 2 ml Complete Media. Wysoka populacja CD45RB reprezentuje najwyższe 40% komórek CD4 + CD45RB + (wysoki CD45RB), aniska populacja CD45RB to najniższe 20% komórek CD4 + CD45RB + (CD45RBniski; Rysunek 1B).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej populacji limfocytów T CD4 + CD45RB podczas analizy FACS. (A-C) Splenocyty barwione CD4 i PE FITC CD45RB od myszy C57BL / 6 dawcy posortowano za pomocą FACS na populacje limfocytów T CD4 + CD45RBo wysokiej i CD4 + CD45RBo niskim poziomie. (A) Zdarzenia dubletowe zostały wykluczone z wykresu punktowego do przodu. (B) Limfocyty bramkowano na wykresie rozproszenia do przodu i z boku. (C) Limfocyty T CD4 + bramkowano, a (D) Limfocyty T CD4 + CD45RB + wykreślono na histogramie PE w porównaniu ze zdarzeniami. Niskie komórki CD4 + CD45RB zostały uznane za najniższe 20% komórek CD45RB +. Wysokie komórki CD4 + CD45RB zdefiniowano jako najwyższe 40% komórek CD45RB +.

  1. Uruchom podwielokrotność każdej populacji komórek na maszynie FACS, aby ocenić czystość populacji.
  2. Odwirować posortowane komórki w dawce 450 x g przez 7 minut. Zawiesić w 1 ml PBS. Usunąć podwielokrotność komórek do zliczenia i oceny żywotności komórek poprzez wykluczenie błękitu trypanowego, jak w kroku 2.9.

5. Wstrzykiwanie komórek do odbiorców

  1. Ponownie zawieś posortowane komórki do 4 x 106 komórek/ml (CD45RBwysoki) lub 2 x 106 komórek/ml (CD45RBniski) w PBS.
  2. Przenieś 100 μlkomórek o wysokiej zawartości CD45RB na biorcę do nowej sterylnej probówki. Dodaj 100 μl PBS na odbiorcę do tej probówki. Zatem całkowita objętość wstrzyknięcia na zwierzę wynosi 200 μl, a całkowita ilość komórek na biorcę to 4 x 105 naiwnych limfocytów T CD4 + CD45RB.
  3. Jeśli pożądana jest grupa eksperymentalna otrzymująca komórki regulatorowe T, przenieś 100 μlkomórek o wysokiej zawartości CD45RB na biorcę do nowej sterylnej probówki. Dodać 100 μlniskich komórek CD45RB na odbiorcę do tej samej probówki. Całkowita objętość iniekcji na zwierzę wynosi 200 μl; stosunekwysokich komórek CD45RB doniskich komórek CD45RB wynosi 2: 1.
  4. Wstrzyknąć 100 μl komórek CD45RBo wysokim poziomie lub CD45RBwysokim/CD45RBo niskim poziomie CD4+ dootrzewnowo po prawej i lewej stronie brzucha (łącznie 200 μl) każdego biorcy.

6. Monitorowanie postępu choroby u zwierząt biorców

  1. Aby ocenić stan kliniczny zwierząt biorców, należy przypisać łączne wyniki kliniczne dla następujących parametrów8 w dniu wstrzyknięcia, co tydzień po wstrzyknięciu i w momencie uśmiercenia:
    1. Określ marnotrawstwo, mierząc utratę wagi: 0 – brak utraty wagi; 1 – 0,1-10% utraty początkowej masy ciała; 2 – ponad 10% utrata początkowej masy ciała (ryc. 2A).

figure-protocol-2
Rycina 2: Kliniczne i poważne patologiczne objawy zapalenia występują po przeniesieniu dzikich komórek T o wysokiej zawartości CD4 + CD45RB do myszy biorców Rag1-/- i NRDKO11. (A) Biorcy NRDKO stracili średnio 10% początkowej masy ciała w ciągu 5 tygodni po transferze, podczas gdy biorcy Rag1-/- nie wykazywali w tym czasie klinicznych objawów choroby. Każdy punkt reprezentuje średni procent początkowej masy ciała dla kohorty ± SEM. **, p <0,005. (B) U niektórych myszy rozwinęło się ciężkie zapalenie jelit, o czym świadczy obecność wypadania odbytnicy. Jest to reprezentatywny obraz wypadania odbytnicy u myszy biorcy NRDKO. (C) Rażąco, okrężnice zarówno od myszy biorców Rag1-/-, jak i NRDKO są pogrubione i skrócone w porównaniu z okrężnicami myszy Rag1-/- i NRDKO bez transferu adoptywnego limfocytów T. Okrężnice od myszy biorców NRDKO wykazują ciężki stan zapalny i zwiększoną masę okrężnicy (dane nie pokazane). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

    1. Określ jakość stolca, umieszczając zwierzę w czystym pojemniku, aż odda stolec: 0 – brak; 1 – miękki stolec; 2 – wodnisty i/lub krwawy stolec.
    2. Określ ogólny stan zdrowia zwierzęcia na podstawie obecności następujących objawów choroby: 0 – brak zgarbionej postawy, szczeciniasta sierść lub zmiany skórne; 1 – występowanie któregokolwiek z poniższych: zgarbiona postawa, szczeciniasta sierść lub zmiany skórne.
    3. Określ obecność wypadania odbytnicy: 0 – brak; 1 – występuje (ryc. 2B).
  2. Uśmiercać zwierzęta poprzez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy, gdy stracą 20% wyjściowej masy ciała lub w pożądanym punkcie czasowym, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Choroba kliniczna jest zwykle widoczna od 5 tygodnia po wypełnieniu.
  3. Ocenić nasilenie choroby, jak opisano wcześniej5,7.
    1. Przypisz wyniki kliniczne jak w kroku 6.18.
    2. Zmierz długość i wagę okrężnicy (Rysunek 2C).
    3. Wykonaj analizę histologiczną stanu zapalnego5.
    4. Określ spontaniczną ekspresję cytokin w kulturach eksplantatów tkanki jelitowej9, węzłach chłonnych krezkowych10 i / lub surowicy11.
      1. Krótko mówiąc, w przypadku kultur eksplantatów9 usuń okrężnice po uśmierceniu, otwórz wzdłużnie i wyczyść PBS. Inkubować okrężnice na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 250 obr./min w kompletnej pożywce przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Rozdrobnić tkankę na małe kawałki i inkubować w temperaturze 37 °C w kompletnym podłożu przez 24 godziny. Zebrać supernatant i użyć do ilościowego oznaczania cytokin na tkankę 100 mg metodą ELISA.
    5. Przeprowadzić charakterystykę ex vivo fenotypów i/lub funkcji limfocytów T10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Około 10 x 106 limfocytów T CD4+CD45RB owysokiej zawartości z 10 śledzion od dorosłych myszy dawców C57BL/6 jest niezawodnie izolowanych. Liczba ta będzie się różnić w zależności od wieku i szczepu myszy dawcy oraz umiejętności badacza. Gdy 4 x 105 C57BL / 6 CD4 + CD45RBwysokie limfocyty T są przenoszone do myszy biorców C57BL / 6 Rag1-/-, kliniczne objawy choroby pojawiają się około 5 tygodnia po napełnieniu lub wcześniej, jeśli myszy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy krok po kroku protokół indukujący zapalenie okrężnicy u myszy poprzez adoptywny transfer limfocytów T CD4 + CD45RB + do myszy z niedoborem odporności. Użyliśmy śledziony dawcy C57BL/6 i myszy biorców syngenicznych Rag1-/-, chociaż inne szczepy (np. BALB/c, 129S6/SvEv, cukrzyca nieotyła (NOD)) i genetyczne modele niedoboru odporności (np. SCID, Rag2-/-) mogą być również stosowane4,14-16. Powszechnie wiadomo, że szcze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez American Gastroenterological Association (AGA) Research Scholars Award oraz Crohn's and Colitis Foundation of America (CCFA) Career Development Award (dla S.Z.S.), NIH NIDDK F30 DK089692 (dla E.C.S.), oraz University of North Carolina Center for Gastrointestinal Biology and Disease Grant P30 DK34987 (Histology Core). Podstawowy ośrodek cytometrii przepływowej UNC jest częściowo wspierany przez NCI Center Core Support Grant (P30CA016086) dla UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Dziękujemy Luke'owi B. Borstowi z North Carolina State University College of Veterinary Medicine za pomoc w analizie histopatologicznej i immunohistochemii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa firmy zajmującej się odczynnikiem/ sprzętemNumer katalogowyUwagi/Opis
10x PBSGibco14200075
12 mm x 75 mm rurka okrągłodennaFalcon352052
15 ml stożkowaCorning430790
Igła 26 G x 3/8BD Biosciences305110
50 ml stożkowaCorning
70 μ m Sitko do komórekFisherbrand22363548
BD IMagnetBD Biosciences552311
β-merkaptoetanolThermo Scientific35602
CD4-FITC IgG2beBioscience11-0041
CD45RB-PE IgG2aBD Pharminogen553101
Complete MediaRPMI-1640, 1% Długopis/paciorkowiec, 10% FBS, 0,0004% β-ME
Probówka FACS + sitkoBD Falcon352235
Szklane szkiełka mikroskopoweFisherbrand12550A3
Inaktywowany termicznie FBSGemini100-106
Bufor1x PBS, 0,5% BSA, 2 mM
EDTA Bufor0,08% NH4Cl, 0,1% KHCO3, 1 mM EDTA
MoFlo XDPBeckman Coulter
Mouse CD4 T Zestaw do wzbogacania limfocytów - DMBD Biosciences558131
Mysz IgG2a-PEBD Pharminogen553457
Mysz IgG2b-FITCeBioscience11-4732
Pibuła PasteuraFisherbrand13-678-20D
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100XCorning Cellgro30-002-CI
[nagłówek]
Petri DishFisherbrand875713
Czysty etanol 200 ProofDecon Labs2705-HC
RPMI-1640Gibco11-875-093
StrzykawkaBD Biosciences309597
Trypan niebieskiCorning Cellgro25-900-CI
Wash MediaRPMI-1640, 1% pióro/paciorkowiec, 0,0004% β-ME
430828 do etykietowania do lizy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  2. Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
  3. Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
  4. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Ma, B. W., et al. Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice. PLoS One. 7 (10), e47416(2012).
  7. Read, S., Powrie, F. Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).
  8. Maillard, M. H., et al. The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells. J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).
  9. Hegazi, R. A., et al. Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway. J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).
  10. Kole, A., et al. Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis. J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).
  11. Kobayashi, T., et al. NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis. J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).
  12. Steinbach, E. C., et al. Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis. J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).
  13. Kobayashi, T., et al. NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity. J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).
  14. Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells. Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).
  15. Powrie, F., et al. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4. T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).
  16. Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).
  17. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437(2014).
  18. Fukata, M., et al. The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease. J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).
  19. Kurtz, C. C., et al. Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).
  20. Naganuma, M., et al. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).
  21. Ranatunga, D. C., et al. A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis. J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).
  22. Srikrishna, G., et al. Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa. B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).
  23. Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

adoptywny transfer limfocyt w Tizolacja kom rek ledzionyfluorescencyjne znakowanie przeciwcia amisortowanie kom rek aktywowane fluorescencjdojambrzuszna iniekcja kom rekeksperymentalny model zapalenia jelita grubegonieswoiste zapalenia jelit

Powiązane artykuły