Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celowanie genowe jest kluczowym podejściem do charakteryzowania funkcji genów we współczesnych badaniach biomedycznych. Jednak skuteczność celowania genów w komórkach ludzkich jest niska, co uniemożliwia generowanie ludzkich linii komórkowych w pożądanym tempie. W ciągu ostatnich dwóch lat byliśmy świadkami szybkiego postępu w zakresie poprawy efektywności manipulacji genetycznych za pomocą narzędzi do edycji genomu, takich jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania reporterów ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) specyficznych dla danej linii przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas. Opisano procedury uzyskiwania niezbędnych komponentów do tworzenia linii reporterowych linii linii neuronalnych z wykorzystaniem systemu CRISPR/Cas, koncentrując się na budowie wektorów docelowych i pojedynczych przewodnikowych RNA. Protokół ten można rozszerzyć na tworzenie platformy i korekcję mutacji w hiPSC.
Wprowadzenie
System CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), wraz z innymi narzędziami do edycji genomu, zrewolucjonizował manipulację ludzkim genomem w ostatnich latach1-7. Głównymi składnikami systemu CRISPR/Cas9 są RNA z pojedynczym przewodnikiem (sgRNA) i Cas9. Cas9 jest endonukleazą DNA typu II kierowaną przez RNA. Ma dwie domeny nukleazy, HNH i RuvC, które są odpowiedzialne za tworzenie dwuniciowych pęknięć DNA (DSB) w określonym regionie genomu obok motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM)7-10. sgRNA pełni połączoną funkcję crRNA i tracrRNA, dwóch cząsteczek RNA odporności nabytej zidentyfikowanych w bakteriach (takich jak Streptococcus pyogenes) i archeonach w celu walki z inwazją DNA źródeł egzogennych9-11. Po odpowiednim zaprojektowaniu i jednoczesnym wprowadzeniu do komórek ssaków, sgRNA rozpoznaje sekwencję PAM, pary zasad z komplementarną nicią docelowego DNA oraz prowadzi i transaktywuje Cas9 do rozszczepienia obu nici DNA bezpośrednio przed PAM7. Następnie nastąpi homologiczna rekombinacja ukierunkowana (HDR, w obecności wektora docelowego) lub niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) w celu naprawy DSB. Transgeny, takie jak cDNA, kasety reporterowe lub fragmenty oporne na antybiotyki, mogą być integrowane, a linie transgeniczne lub knockin.
Chociaż system CRISPR/Cas9 jest wysoce wydajny i stosunkowo specyficzny, zgłoszono niepożądane działania niezgodne z celem12-15. Aby zminimalizować zdarzenia niezgodne z celem, nickasy Cas9 (Cas9n) zostały również zaprojektowane9,10,14,16,17. Cas9n (Cas9 D10A lub Cas9 H840A) to enzym Cas9 z mutacjami w jednej z dwóch domen nukleazy, który wywołuje nacięcie tylko na jednej nici DNA. Aby osiągnąć rozszczepienie na obu niciach, dwa sgRNA są zaprojektowane tak, aby prowadzić parę nickaz, które przecinają się oddzielnie w pobliskich loci dwóch różnych nici DNA. Strategia "podwójnego nacinania" wymaga bardziej rygorystycznego projektu niż konwencjonalna platforma Cas9 i oferuje zarówno wysoką wydajność, jak i wysoką specyficzność dla eksperymentów z edycją genów.
Ten manuskrypt opisuje protokół generowania reportera ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) specyficznych dla linii przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas. Opisano etapy uzyskiwania składników niezbędnych do tworzenia linii reporterowych linii neuronalnych za pomocą edycji genomu za pośrednictwem systemu CRISPR/Cas, ze szczególnym uwzględnieniem budowy wektorów docelowych i sgRNA. Protokół ten został z powodzeniem powtórzony w wielu liniach hiPSC, w tym pochodzących od osób zdrowych i od pacjentów z chorobami OUN. Geny celowane w naszym laboratorium to OLIG2, HB9 (MNX1), NEUROG2, SOX1, ALDH1L1 i SOD1. Skuteczność celowania w rekombinację homologiczną za pośrednictwem systemu CRISPR/Cas w hiPSC waha się od 20 do 40%, co jest zgodne z poprzednimi raportami1,18,19. W porównaniu z typową skutecznością 1-2% w konwencjonalnych eksperymentach z celowaniem genowym, skuteczność celowania jest znacznie lepsza.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Projektowanie i konstruowanie wektorów dla wektorów docelowych
- Po określeniu markera specyficznego dla linii, zlokalizuj sekwencję genomową genu i odpowiednio zaprojektuj ramiona homologii. Długość ramienia homologii 5' wynosi ~1 kb, a ramienia homologii 3' ~1,5 kb (rysunek 1).
- Oznacz kasetę reportera sekwencyjnie za sekwencją genomową tuż przed kodonem stop, poprzez subklonowanie, tak aby endogenna ekspresja nie została zmieniona ani zakłócona. Połącz kasetę reporterową lub kasetę (kasety) z samorozszczepiającymi sekwencjami peptydowymi 2A (F2A, E2A lub T2A) 20,21 lub wewnętrznym miejscem wejścia rybosomu (IRES).
Uwaga: Zgłaszacze mogą zawierać białka fluorescencyjne, takie jak GFP, tdTomato, tagRFP, YFP, lucyferaza lub kaseta oporności na antybiotyki, połączenie białka fluorescencyjnego i kasety oporności na antybiotyki. Przykład pokazano na rysunku 1 w celu skonstruowania wektora docelowego dla ludzkiego genu ALDH1L1, oznaczonego przez EGFP i kasetę oporności na neomycynę. - Dodaj kasetę pozytywnej selekcji za reporterem. Selekcja pozytywna to floksowana kaseta oporna na antybiotyki, która zostanie wycięta z docelowych iPSC po wybraniu i wyizolowaniu pozytywnych klonów.
- Dołącz kasetę selekcji negatywnej na zewnątrz ramienia homologii 3'. Typowymi kasetami selekcji negatywnej są kinaza tymidynowa, TK i toksyna błonicza A (DTA) 22.
- Uzyskać ludzki klon BAC zawierający sekwencję markera linii i zweryfikować klon przez amplifikację PCR. Skonstruuj wektor celowania w pKD46 zawierający-DH5α za pomocą rekombinacji, aby ściągnąć miejsce docelowe 23. W razie potrzeby zastosuj multisite gateway, strategie Golden gate23,24.
2. Projektowanie i wektorowa budowa sgRNA dla systemu CRISPR/Cas9.
- Określ znacznik specyficzny dla linii, który będzie ukierunkowany na reportera. Skopiuj sekwencję cDNA z bazy danych NCBI. Przejdź do wyszukiwania BLAT u człowieka, aby uzyskać wyrównanie genomowego DNA.
- Kliknij zakładkę "przeglądarka", aby wyświetlić montaż genu. W zakładce "Widok" kliknij "DNA", aby uzyskać pełną sekwencję genomowego DNA w formacie FASTA.
- Zlokalizuj kodon stop w sekwencji DNA, gdzie sekwencja 2A i kaseta reporterowa zostaną oznaczone.
- Szukaj motywu przylegającego do protospaceru (PAM, tj. NGG) w obrębie winiczności (obszar flankowania ~100 pz) kodonu stop. Zeskanuj obie nici, aby zlokalizować odpowiednią sekwencję NGG. Weź pod uwagę specyfikę sekwencji poprzedzających, aby uniknąć potencjalnych zdarzeń niedocelowych. Korzystaj z narzędzi typu open source, takich jak BLAST i CasOT (szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 5).
- Skopiuj sekwencję 20 zasad bezpośrednio przed NGG i wklej ją do narzędzia do projektowania stron internetowych ZiFit, aby zaprojektować oligonukleotydy z nawisami kompatybilnymi z wektorem ekspresji ludzko-gRNA (z promotorem U6) MLM3636.
- Syntetyzuj oligonukleotydy do przodu i do tyłu 7.
- Aby wytworzyć dwuniciowe sgRNA, należy denaturować oba oligonukleotyde w temperaturze 70 °C przez 15 minut i stopniowo schładzać do RT. W przypadku reakcji 50 μl należy dodać odpowiednio 22,5 μl oligonukleotydów do przodu i do tyłu (stężenie wyjściowe wynosi 0,1 mM) oraz 5 μl buforu do wyżarzania (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1,5 M NaCl, pH 8,0).
- Wymieszaj i podwiąż oligonukleotydy otrzymane w kroku 2.7 z trawionym przez BsmBI wektorem ekspresji ludzkiego gRNA (z promotorem U6) MLM3636. W przypadku reakcji o objętości 20 μl dodać 1 μl oligonukleotydów z kroku 2.7, 100 ng MLM3636 i 1 μl (400 U) ligazy T4. Inkubować w temperaturze RT O/N.
- Przekształć komórki DH5α za pomocą produktu ligacji przez szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 30 sekund. Hoduj bakterie na płytce LB agar Ampicillin (100 μg / ml) w temperaturze 37 ° C O / N. Wybierz 3 ~ 5 kolonii do miniprzygotowania plazmidu zgodnie z protokołem producenta. Sekwencjonuj plazmidowe DNA, aby potwierdzić za pomocą komercyjnych dostawców. Maxiprep odpowiedni plazmid zgodnie z protokołem producenta.
- Oceń sgRNA za pomocą testu endonukleazy T7 1 (T7E1) (szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 4). Transfekcyjna hiPSC z plazmidem i sgRNA będzie ulegać ekspresji pod wbudowanym promotorem U6 w MLM3636 szkielecie (szczegóły w kroku 6).
3. Projekt i budowa Cas9n Double Nickase sgRNA
- Uzyskaj wektor podwójnej nickazy Cas9n D10A pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A).
- Zaprojektuj parę oligonukleotydów do przodu i do tyłu dla każdego miejsca docelowego. Skopiuj sekwencję 20 baz bezpośrednio przed NGG, jak opisano w kroku 2 i wklej ją do narzędzia do projektowania stron internetowych ZiFit
- Aby uzyskać oligonukleotydy z nawisami zgodnymi z pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A), należy usunąć pierwszą i ostatnią podstawę oligonukleotydów zarówno do przodu, jak i do tyłu, które są pokazane przez narzędzie do projektowania ZiFit.
- Synteza oligonukleotydów do przodu i do tyłu7. Nazwij te oligonukleotydy jako f(n)-F, f(n)-R dla PAM po jednej stronie miejsca docelowego, r(n)-F, r(n)-R dla PAM po drugiej stronie miejsca docelowego. Spośród nich n jest liczbą oznaczającą różne PAM, małe litery f i r reprezentują położenie PAM na nici sensu (f) lub antysensownej (r), F i R reprezentują oligonukleotydy do przodu i do tyłu.
- Przetestuj wiele par (np. r5 i f2) za pomocą testu T7E1 (szczegółowo opisanego w kroku 4), aby zidentyfikować zoptymalizowaną parę sgRNA, która ma być użyta dla Cas9n.
- Aby wytworzyć dwuniciowe sgRNA, należy denaturować oba oligonukleotyde w temperaturze 70 °C przez 15 minut i stopniowo schładzać do RT. W przypadku reakcji o objętości 50 μl należy dodać odpowiednio 22,5 μl oligonukleotydów do przodu i do tyłu (stężenie wyjściowe wynosi 0,1 mM) oraz 5 μl buforu do wyżarzania (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1,5 M NaCl, pH 8,0).
- Wymieszać i podwiązać oligonukleotydy otrzymane z kroku 3.5 z pX335-U6-Chimeric_BB-hSpCas9n (D10A) trawionymi przez BbsI. Aby uzyskać reakcję 20 μl, dodaj 1 μl sgRNA z kroku 3.5, 100 ng Cas9n (D10A), 1 μl (400 U) ligazy T4. Inkubować w temperaturze RT O/N.
- Przekształć kompetentne komórki DH5α za pomocą produktu ligacji przez szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 30 sekund. Hoduj bakterie na płytce LB agar Ampicillin (100 μg / ml) w temperaturze 37 °C O / N. Wybierz 3 ~ 5 kolonii do miniprepu plazmidu zgodnie z protokołem producenta. Sekwencjonuj plazmidowe DNA, aby potwierdzić za pomocą komercyjnych dostawców. Maxiprep odpowiedni plazmid zgodnie z protokołem producenta.
- Oceń sgRNA za pomocą testu T7E1 (szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 4). Transfekcyjna hiPSC z plazmidem i sgRNA będzie ulegać ekspresji pod wbudowanym promotorem U6 w szkielecie Cas9n (D10A) (szczegóły w kroku 6).
4. Ocena sgRNA za pomocą testu endonukleazy T7 (T7E1)
- W przypadku jednej płytki 24-dołkowej, płytka 2 x 105 komórek 293FT na basenik dzień wcześniej (dzień -1).
- W dniu transfekcji (dzień 0) współtransfekują komórki 293FT z plazmidem sgRNA i wektorem ekspresyjnym Cas9. Dodać 0,5 μg wektora sgRNA, 0,5 μg wektora ekspresyjnego Cas9 JDS246 (Cas9-003) i 1,5 μl Lipofectamine 2000.
- W celu kontroli ujemnej dodaj 0,5 μg wektora ekspresji GFP (np. GFP sterowanego promotorem CMV w szkielecie pcDNA3) zamiast wektorów sgRNA.
- Po 72 godzinach (dzień 3) zbierz komórki, dodając 100 μl buforu do szybkiej ekstrakcji DNA i energicznie rozcierając.
- Inkubować mieszaninę w temperaturze 68 °C przez 15 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 8 minut. Jest to matryca dla kolejnych eksperymentów PCR.
- Zaprojektuj zarówno startery PCR do przodu, jak i do tyłu, aby wzmocnić sekwencję flankującą PAM. Zwykle celujący produkt PCR ma około 400-500 pz długości. Synteza oligonukleotydów7.
- W przypadku 50 μl reakcji PCR dodaj 1 μl matrycy z kroku 4.5, 0,5 μl Herculase II, 0,5 μl DMSO, 10 μl 5x buforu, 0,5 μl mieszanki dNTP i 1 μl mieszanki starterów do przodu i do tyłu.
- Stosować następujące parametry PCR: 98 °C przez 2 min, 35 cykli po 98 °C przez 20 sekund, 59 °C przez 20 sekund, 72 °C przez 1 min, z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 5 min.
Uwaga: Opisane tutaj parametry PCR dają specyficzne produkty dla kilku badanych genów. Jednak warunki te są zależne od wybranych przez użytkownika genów, które są przedmiotem zainteresowania. PCR wykorzystujące genomowe DNA jako matrycę często wymagają optymalizacji, aby upewnić się, że nie pojawią się żadne dodatkowe prążki. Te dodatkowe pasma można pomylić z produktami rozszczepienia po teście T7E1. - Zmierzyć stężenie DNA w produktach PCR za pomocą spektrometru przy A260.
- Dodać 400 ng produktów PCR do 2 μl buforu wytrawiającego 2. Dodać ddH2O do końcowej objętości reakcyjnej wynoszącej 19 μl. Inkubować we wrzącej wodzie przez 5 minut. Pozwól reakcji usiąść na ławce i naturalnie ostygnąć do RT (45-60 min).
- Dodać 1 μl (10 jednostek/μl) T7E1, inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 min. Zatrzymać reakcję przez dodanie 2 μl 0,25 M EDTA zmieszanego z 6x barwnikiem ładującym DNA.
- Rozpuścić 2,5 g proszku agarozy w 100 ml 1xTAE. Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej i wlej żel do pudełka z żelem. Po utworzeniu żelu załaduj całe 20 μl reakcji do 2,5% żelu agarozowego. Uruchom żel pod napięciem 100-150 V przez 30 minut.
- Sprawdź żel w świetle UV (rysunek 3). T7E1 tnie w niedopasowanych miejscach. W przypadku sgRNA, które spowodowały niehomologiczne łączenie końców, produkty PCR będą wykazywać dodatkowe szybko migrujące prążki (mniejszy rozmiar) w porównaniu z kontrolą ujemną (opisaną w kroku 4.3).
- Oszacuj i uszereguj skuteczność cięcia sgRNA oraz procent insercji i delecji (indel%), porównując gęstość pasma za pomocą oprogramowania Image J.
- Dla każdej próbki, która występuje na żelu, oznacz pasma żelu jako nieodcięte pasmo, odetnij pasmo 1 i odetnij pasmo 2.
- Zmierz gęstość każdego pasma za pomocą ImageJ zgodnie z instrukcją oprogramowania.
- Obliczcięcie f za pomocą następującego wzoru: fcięcie = (cięcie pasma 1 + cięcie pasma 2) / (nieobcięta taśma + cięta taśma 1 + cięta taśma 2)
- Oblicz Indel% za pomocą następującego wzoru: Indel=1- √(1-f cięcie).
5. Przewidywanie in silico potencjalnych lokalizacji niedocelowych
Uwaga: Potencjalne strony docelowe można przewidzieć za pomocą internetowego narzędzia open source o nazwie CasOT17, które jest programem opartym na Perlu.
- W przypadku systemu Windows pobierz program CasOT i pliki bazy danych genomu ludzkiego na lokalny dysk twardy.
- Przygotuj plik docelowy projektowanego sgRNA w formacie FASTA.
- Otwórz plik o nazwie "casot". Pojawi się okno poleceń. Na razie zostaw to tak, jak jest.
- Otwórz plik o nazwie "opt-generator", aby wygenerować ciąg opcji. Wklej ścieżkę i nazwę pliku docelowego do okna dialogowego opcji "-t" lub "-target".
- Wklej ścieżkę pliku sekwencji genomu do okna dialogowego opcji "-g" lub "-genome".
- Wartości wejściowe –s lub –seed (wartość domyślna to 2) i –n lub -nonseed (wartość domyślna to 255). Ciąg opcji zostanie wygenerowany i pojawi się w polu u góry strony.
- Skopiuj ciąg opcji i wklej go do okna poleceń CasOT opisanego w kroku 5.3.
Uwaga: Uruchomienie programu CasOT może potrwać od 30 do 90 minut, w zależności od opcji i używanego komputera. Po zakończeniu zostanie wygenerowany folder o nazwie "--". W folderze zostaną umieszczone dwa pliki, plik ".stat" opisujący statystyki oraz plik .csv (wartości oddzielone przecinkami) zawierający szczegółowe wyniki wyszukiwania. - Otwórz plik .csv za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. W pliku znajdują się następujące informacje dla każdego miejsca poza miejscem docelowym: lokalizacja chromosomowa i genomowa, sekwencja miejsca, typ niezgodności (Mm), całkowita liczba niedopasowanych zasad oraz informacje eksonowe odnoszące się do miejsca poza miejscem docelowym.
- Zaprojektuj startery PCR dla miejsc, które mają <2 Mm w sekwencji zasiewnej lub niesiewnej.
- Przeprowadzić PCR dla wybranego dodatniego klonu hiPSC w następujących warunkach: 98 °C przez 2 min, 35 cykli po 98 °C przez 20 sekund, 59 °C przez 20 sekund, 72 °C przez 1 min, z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 5 min.
Uwaga: Opisane tutaj parametry PCR dają specyficzne produkty dla kilku genów testowanych w naszym laboratorium. Jednak warunki te są zależne od wybranych przez użytkownika genów, które są przedmiotem zainteresowania. PCR wykorzystujące genomowe DNA jako matrycę często wymagają optymalizacji, aby upewnić się, że nie pojawią się żadne dodatkowe prążki. - Sekwencjonuj produkty PCR, dopasowuj wyniki sekwencjonowania do przewidywanych sekwencji i szukaj mutacji. Jeśli mutacje istnieją, identyfikowane są zdarzenia poza celem.
6. Elektroporacja hiPSC w celu stworzenia raportów o rodowodzie neuronalnym
- Hodowla hiPSC w pożywce TeSR-E8 na szalkach pokrytych Geltrexem. Zmień pożywkę na pożywkę MEF-CM (pożywka kondycjonowana przez mysie fibroblasty embrionalne) na dwa dni przed elektroporacją. Inkubować w 2 ml Accutase przez 5 minut i zbierać komórki.
- Elektroporować hiPSC za pomocą linearyzowanego wektora docelowego, wektora ekspresji Cas9-003 i wektora sgRNA w następujących warunkach: 1 x 107 hiPSC, kotransfekcja 2,5 μg sgRNA, 2,5 μg Cas9 i 50 μg wektora docelowego. W przypadku strategii podwójnej nickazy dodaj 50 μg wektora celowania, 2,5 μg każdego sgRNA (z Cas9n współwyrażonym przez wektor).
- Wybierz klony przez selekcje pozytywne i negatywne, jak opisano24,25.
- Zidentyfikuj dodatnie klony za pomocą analizy Southern blot lub genomowego PCR dalekiego zasięgu24,25.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Konstruuje się wektory celujące zawierające wszystkie niezbędne komponenty, w tym ramiona homologii, kasetę reporterową oraz kasety selekcji pozytywnej i negatywnej (Rysunek 1). Na podstawie endogennego locus genomowego projektuje się i konstruuje w wektorach ekspresyjnych dla ludzkich gRNA MLM3636 lub pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) kilka (od 2 do 3) sgRNA (w przypadku systemu Cas9) lub par sgRNA (w przypadku strategii z podwójną nickazą Cas9n) (Rysunek 2). Przed transfekcją hi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celowanie genowe jest podstawowym narzędziem w charakterystyce funkcji genów. Jednak stosunkowo niska wydajność wymaga pracochłonnej i czasochłonnej pracy. Niedawne prace nad narzędziami do edycji genomu, takimi jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania reportera indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) specyficznego dla danej linii przy użyciu rekombinac...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Departament Neurochirurgii, Memorial Hermann Foundation Staman Ogilvie Fund, Bentsen Stroke Center przy University of Texas Health Science Center w Houston oraz Mission Connect TIRR Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| pStart-K | Addgene | 20346 | |
| pWS-TK6 | Addgene | 20350 | |
| pKD3 | Addgene | 45604 | |
| pKD46 | Centrum Genetyczne Coli, CGSC | 7634 | |
| Sekwencja PGK-neo-bpA | Addgene | 13442 | |
| Ludzkie klony BAC docelowych genów | |||
| JDS246 (Cas9-003), Streptococcus pyogenes zoptymalizowany pod kątem kodonów ssaków Cas9-3X Flag | Addgene | 43861 | |
| MLM3636, wektor ekspresji human-gRNA z promotorem U6 | Addgene | 43860 | |
| pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) | Projekt sgRNA Addgene | 42335 | |
| narzędzie do przewidywania celu | |||
| Perl | http://www.perl.org/get.html | ||
| NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | ||
| BLAT | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start | ||
| synteza starterów sgRNA | Sigma | ||
| One shot Top10 Electrocomp E. Coli Kompetentne komórki | Life Technologies | C4040-50 | |
| AccuPrime Pfx SupperMix | Life Technologies | 12344-040 | |
| Enzymy restrykcyjne | NEB i Life Technologies | ||
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Researech | D4007 | |
| Bufor do szybkiej ekstrakcji DNA | Epicentrum | QE0905T | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerases | Agilent Technologies | 600675 | |
| Bufor trawienny 2 | New England Biolab | ||
| 6X Barwnik ładujący DNA | Thermo Scientific | R0611 | |
| TeSR-E8 Zestaw do konserwacji hESC/hiPSC | Technologie komórek macierzystych | 05940 | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| 50xTAE | Life Technologies | B49 | |
| Essential 8 średni | Technologie życia | A1517001 | |
| Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i magnezu | Life Technologies | A12856-01 | |
| D-MEM/F12 z Glutamax | Life Technologies | 10565018 | |
| D-MEM z Glutamax | Life Technologies | 10566040 | |
| Kwalifikowana płodowa surowica bydlęca-ES komórka | Life Technologies | 10439 | |
| Wymiana surowicy nokautującej | Life Technologies | 10828010 | |
| 2-merkaptoetanol 1000X | Technologie życiowe | 21985023 | |
| Aminokwasy endogenne | Technologie życia | 11140050 | |
| Stempro Accutase | Technologie życiowe | A1110501 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| 0,25% roztwór trypsyny-EDTA | Technologie życia | 25200-056 | |
| Geltrex | Technologie życiowe | 12760-013 | |
| Inhibitor ROCK Y-27632 | Milipore | Odczynnik SCM075 | |
| SMC4 | BD | 354357 | |
| Oporny na neomycynę MEF | Millipore | PMEF-NL | |
| Odporny na higromycynę MEF | Millipore | PMEF-HL | |
| G418 (Geneticin) | LifeTechnologies | 11811 | |
| Hygromycyna B | Life Technologies | 10687010 | |
| FIAU (Fialurydyna, 1-2-deoksy-2-fluoro-ß-D-arabinofuranozylo-5-jodouracyl | Moravek Biochemikalia i Radiochemikalia& | nbsp; Elektroporator M251 | |
| : Gene Pulser Xcell | Kuweta do elektroporacji Bio-Rad | ||
| 0,4 cm | Bio-Rad | 165-2088 | |
| DIG-High prime zestaw startowy do znakowania i wykrywania DNA II | Roche | 11585614910 | |
| Hybrydyzacja rozwiązania denaturacyjnego | VWR | 82021-478 | |
| PCR DIG | Zestaw | Roche 11636090910 | |
| DIG | Roche | 11585762001 | |
| Anty-Digoxigenina (DIG-AP) | System | ||
| CSPD firmy Roche | Zestaw | ||
| DIG | Bufor Roche | 11585762001 | |
| 50X TAE | Life Technologies | 24710030 | |
| Bufor do bikingu (25 mM Tris pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween20) | |||
| Środek sieciujący w ultrafiolecie Hoefer | Fisher Scientific | 03-500-308 | |
| Spermidyna | Fisher | AC13274-0010 | |
| Tris HCl 2M (pH 7,5) | VWR& | nbsp; 200064-506 | |
| Denville Scientific niebieska folia biograficzna 8x10 | Fisher | nc9550782 | |
| Marker masy cząsteczkowej DNA II (znakowany DIG) | Roche | 11218590910 | |
| Membrana Amersham Blotting Hybond-N+ | Roche | 95038-400 | |
| Taca do suszenia szkła Pyrex | Ręczniki | papierowe Fisher 15-242A | |
| C | Fisher | 06-666-32B | |
| Papier Whatman 3MM (26X41) | Fisher | 05-713-336 | |
| Torba do hybrydyzacji | Roche | 11666649001 | |
| Rurki do hybrydyzacji | Fisher | 13-247-300 | |
| Rożen w piekarniku hybrydowym Shake 'n' Stack | Fisher | HBMSOV14110 |
Bibliografia
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 227-229 (2013).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. , (2013).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., Jinek, M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 513, 569-573 (2014).
- Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471, 602-607 (2011).
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471(2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31, 822-826 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31, 827-832 (2013).
- Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 31, 833-838 (2013).
- Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology. 31, 839-843 (2013).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11, 399-402 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9, 1956-1968 (2014).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nature Biotechnology. 22, 589-594 (2004).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
- Yagi, T., et al. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Analytical Biochemistry. 214, 77-86 (1993).
- Wu, S., Ying, G., Wu, Q., Capecchi, M. R. A protocol for constructing gene targeting vectors: generating knockout mice for the cadherin family and beyond. Nature Protocols. 3, 1056-1076 (2008).
- Xue, H., et al. A targeted neuroglial reporter line generated by homologous recombination in human embryonic stem cells. Stem Cells. 27, 1836-1846 (2009).
- Liu, Y., Jiang, P., Deng, W. OLIG gene targeting in human pluripotent stem cells for motor neuron and oligodendrocyte differentiation. Nature Protocols. 6, 640-655 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
