Ten artykuł opisuje technikę używaną do wykonywania dwukanałowego mapowania optycznego w monowarstwach hodowlanych komórek przedsionkowych HL-1. Ten unikalny protokół umożliwia jednoczesną wizualizację zarówno aktywności wapnia (Ca), jak i napięcia (Vm) w tym samym obszarze w celu szczegółowego wykrywania i analizy właściwości elektrofizjologicznych monowarstw kultur.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dwukanałowe mapowanie optyczne napięcia i wapnia w monowarstwie miocytów przedsionkowych HL-1 z hodowlą
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mapowanie optyczne okazało się cenną techniką wykrywania aktywności elektrycznej serca zarówno na nienaruszonych sercach ex vivo, jak i w monowarstwach hodowlanych miocytów. Komórki HL-1 są szeroko stosowane jako dwuwymiarowy model komórkowy do badania różnych aspektów fizjologii serca. Dużym wyzwaniem było jednak optyczne mapowanie stanów przejściowych wapnia (Ca) i potencjałów czynnościowych jednocześnie z tego samego pola widzenia w hodowlanej monowarstwie komórek przedsionkowych HL-1. Dzieje się tak, ponieważ wymagana jest specjalna obsługa i ostrożność, aby przygotować zdrowe komórki, które można wychwycić elektrycznie i zmapować optycznie. W związku z tym opracowaliśmy optymalny protokół pracy dla dwukanałowego mapowania optycznego. W tym manuskrypcie opisaliśmy szczegółowo, jak przeprowadzić eksperyment z dwukanałowym mapowaniem optycznym. Protokół ten jest użytecznym narzędziem do lepszego zrozumienia propagacji potencjału czynnościowego i kinetyki Ca w rozwoju arytmii.
Wprowadzenie
Unikalna technika dwukanałowego mapowania optycznego wapnia (Ca) i napięcia (Vm)1-5 staje się skutecznym narzędziem do jednoczesnego rejestrowania sygnałów V, m i Ca zarówno w nienaruszonych sercach, jak i w monowarstwach hodowanych komórek. Technika ta umożliwia uzyskanie istotnych informacji na temat związku między stanami przejściowymi wapnia a potencjałami czynnościowymi, aby lepiej zrozumieć mechanizmy elektrofizjologiczne leżące u podstaw arytmii serca.
Monowarstwy hodowlane okazały się użytecznym modelem komórkowym do badania elektrofizjologii serca i mechanizmu leżącego u podstaw arytmii. 4,6-8<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie roztworów
- Roztwór norepinefryny (NP)
- Rozpuścić 40 mg NP w 25 ml 30 mM kwasu askorbinowego (0,1475 g kwasu askorbinowego w 25 ml oczyszczonej wody Milli-Q (MQ). Podczas przygotowywania tego roztworu należy unikać bezpośredniej ekspozycji na światło, ponieważ norepinefryna (NP) jest światłoczuła.
- Przefiltrować roztwór NP za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 µm. Rozdzielić roztwór do sterylnych mikroprobówek o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Po zamrożeniu NP jest stabilna przez jeden miesiąc.
- Uzupełnione pożywki Claycomb do płukania i końcowe
- Do 43,5 ml pożywki C....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Kulturowana warstwa pojedyncza o charakterze konfluentnym wykazuje regularny rytm wewnętrzny, co zaprezentowano w Filmie 1. Następnie przeprowadzono dwukanałowe mapowanie optyczne Vm/Ca w pełni konfluentnej warstwie pojedynczej HL-1. Rysunek 1A przedstawia przykładowe zapisy sygnałów Vm i Ca z zarejestrowanego pojedynczego skurczu. Reprezentatywne mapy izochroniczne jednorodnie propagowanych sygnałów Vm i Ca, uzyskane za pomocą dwukanałowego systemu mapow.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule opisano kluczowe aspekty mapowania optycznego w hodowli monowarstwy miocytów przedsionków HL-1 barwionej barwnikami fluorescencyjnymi wrażliwymi na wapń i napięcie. Obejmuje to hodowlę optymalnej monowarstwy komórek HL-1, konfigurację sprzętu do mapowania, mapowanie monowarstwy hodowlanej i analizę danych.
Aby skutecznie mapować hodowane komórki, kluczem jest przygotowanie równomiernie rozłożonej monowarstwy komórkowej. Podczas wysiewania komórek na szkiełkach nakrywkowych należy pa.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Dr. Claycombowi za dostarczenie komórek HL-1 i szczegółowy protokół konserwacji. Chcielibyśmy również podziękować Pani Elenie Carrillo i dr Sethowi Robii za ich pomoc w wygenerowaniu filmu o komórce oraz Panu Pete'owi Caronowi za pomoc w wykonaniu akcesoriów do naszego dwukanałowego systemu mapowania optycznego.
Ta praca była wspierana przez American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 do XA), National Institutes of Health (HL113640 do XA) oraz Loyola University Research Development Fund (do XA).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rhod2 suchy proszek | AAT Bioquest | 21062 | |
| pluroniczny | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | Sigma 276855 | ||
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPEs | Sigma | H3375 |
Bibliografia
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / e....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
