Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

DOI:

10.3791/52544

⸱

8 kwietnia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Immunodynamics, German Rheumatism Research Center, a Leibniz Institute, 2Biophysical Analytics, German Rheumatism Research Center, a Leibniz Institute, 3Max-Delbrück Center for Molecular Medicine, 4Wimasis GmbH, 5Immunodynamics and Intravital Imaging, Charité - University of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia konfokalna jest metodą z wyboru do analizy lokalizacji wielu typów komórek w złożonych tkankach, takich jak szpik kostny. Jednak analiza i kwantyfikacja lokalizacji komórkowej jest trudna, ponieważ w wielu przypadkach opiera się na ręcznym liczeniu, co wiąże się z ryzykiem wprowadzenia błędu systematycznego zależnego od oceniającego i zmniejszenia wiarygodności między oceniającymi. Co więcej, często trudno jest ocenić, czy kolokalizacja między dwiema komórkami wynika z losowego pozycjonowania, zwłaszcza gdy typy komórek różnią się znacznie częstotliwością ich występowania. W tym miejscu przedstawiono metodę bezstronnej kwantyfikacji kolokalizacji komórkowej w szpiku kostnym. Protokół opisuje przygotowanie próbki stosowanej w celu uzyskania wycinków histologicznych całych mysich kości długich, w tym szpiku kostnego, a także protokół barwienia i pozyskiwanie obrazów o wysokiej rozdzielczości. Przedstawiono przebieg analizy obejmujący proces od rozpoznawania typów komórek krwiotwórczych i niekrwiotwórczych w dwuwymiarowych (2D) obrazach szpiku kostnego do kwantyfikacji bezpośrednich kontaktów między tymi komórkami. Obejmuje to również analizę sąsiedztwa w celu uzyskania informacji o mikrośrodowisku komórkowym otaczającym określony typ komórki. Aby ocenić, czy kolokalizacja dwóch typów komórek jest jedynie wynikiem losowego rozmieszczenia komórek, czy też odzwierciedla preferencyjne powiązania między komórkami, stosuje się narzędzie symulacyjne, które jest odpowiednie do testowania tej hipotezy w przypadku komórek krwiotwórczych i zrębowych. Podejście to nie ogranicza się do szpiku kostnego i może zostać rozszerzone na inne tkanki, aby umożliwić odtwarzalną, ilościową analizę danych histologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na niedawny szybki rozwój technologiczny w mikroskopii, w tym obrazowanie optyczne, analiza komórek w kontekście całej tkanki staje się coraz bardziej dostępna dla immunologów. Charakterystyka pojedynczych komórek w zawiesinie stanowi cenną i niezbędną metodę zrozumienia funkcji komórkowych i molekularnych. Jednak analiza komórek w ich (mikro)anatomicznym środowisku jest niezbędna do zrozumienia interakcji między różnymi typami komórek, które współpracują w złożonych procesach, takich jak rozwój odpowiedzi immunologicznej.

Chociaż stosunkowo łatwo jest uzyskać informacje jakościowe z obrazów, ilościowe określenie tych danych pozo....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez odpowiednie komitety państwowe ds. dobrostanu zwierząt (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) i zostały przeprowadzone zgodnie z aktualnymi wytycznymi i przepisami (licencja na eksperymenty na zwierzętach G0194/11).

1. Generacja fluorescencyjnych myszy chimerycznych w szpiku kostnym

UWAGA: Generowanie fluorescencyjnych chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu wizualizacji komórek zrębu szpiku kostnego odbywa się zgodnie z opisem poprzednio9.

  1. Rozpocznij leczenie myszy Del-Cre x ROSA-tdRFP (myszy eksprymujące tandemowe białko ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wycinanie kriosekcji nieodwapnionej kości metodą taśmy Kawamoto pozwala na przecięcie całej kości jako nienaruszonego przekroju, z szpikiem kostnym obszaru śródkostnego nadal przyczepionym do zmineralizowanej kości, zarówno w trzonie, jak i w obszarach nasadowych o dużej gęstości kości beleczkowej (Rysunek 1). Barwienie jądrowe skrawków ujawnia, że chociaż nie można w pełni uniknąć małych pęknięć w preparacie, struktura sinusoid i tętnic oraz siatkowata sieć miąższu pozostają nienaruszone.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo postępu w nowoczesnych metodach obrazowania optycznego, analiza danych histologicznych jest nadal często utrudniona przez brak odpowiednich narzędzi i metod kwantyfikacji lub przez tendencyjne analizy, które koncentrują się na niewielkim obszarze zainteresowania. Przedstawione tutaj podejście synergiczne łączy analizę obrazu obejmującą cały obszar szpiku kostnego, automatyczną segmentację i rozpoznawanie obiektów różnych typów komórek krwiotwórczych i zrębowych, analizę kolokalizacji i wreszcie narzędzie do walida.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Juan Escribano Navarro jest powiązany z Wimasis GmbH, Monachium, Niemcy. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Andreasowi Radbruchowi za cenne dyskusje. Jesteśmy wdzięczni Sabine Gruczek, Patrickowi Thiemannowi i Manueli Ohde za pomoc w opiece nad zwierzętami oraz Robertowi Güntherowi za doskonałą pomoc techniczną. Dziękujemy naszym przeszkolonym oceniającym: Laurze Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florence Pache i Katharinie Horn za ocenę próbek histologicznych oraz Randy'emu Lindquistowi za korektę manuskryptu. Dziękujemy J. i N. Lee z Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, USA za przeciwciała specyficzne dla MBP.

Ta praca była wspierana przez DFG HA5354/4-1, przez JIMI-a główny grant sieci ośrodków DFG na mikroskop....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

figure-materials-9 Section-Lab,figure-materials-17 DAKO

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Neomycinfigure-materials-1 SigmaN6386 SIGMAHydrat soli trisiarczanu neomycyny, kod zagrożenia UE: GHS08
Ursovit AD3ECSerumwerke Bernburg1 ml zawiera: 50.000 I.E. palmitynian retinylu, 5.000 I.E. cholekalcyferol, 30 mg octan tokoferylu, 100 mg kwas askorbinowy, 1 mg kwas sorbowy, 200 mg polioksylu 35 olej rycynowy, 0,5 mg galusan propylu
Bufor transferowy (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicyliny/streptomycyny)figure-materials-2 SigmaP4333, H3375
Hapten 4-hydroksy-3-nitrofenyloacetylowy sprzężony z gamma globuliną
Gamma globulina kurczaka (CGG) 100 mgfigure-materials-3 RocklandD602-0100
20% roztwór paraformaldehydu (klasa EM)Science Services15713Kody zagrożeń UE: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sacharozafigure-materials-4 Carl Roth4621.1
Suchy lód
Acetonfigure-materials-5 Sigma-Aldrich179124 Kody zagrożeń SIGMA-ALDRICHEU: GHS02, GHS07
Hexanefigure-materials-6 Sigma-Aldrich 208752 Sigma-AldrichKody zagrożeń UE: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)figure-materials-7 Sakura455725 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.figure-materials-8 Sakura4583
do osadzania SCEM firmy Kawamoto
Kawamoto figure-materials-10 Section-Lab,
Kawamoto typ 2C(9)figure-materials-11 Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profilefigure-materials-12 Thermo Scientific3052835dł. x szer.: 80 x 8 mm (31,5 x 3,13"), grubość: 0,25 mm (0,01")
Poliklonalne królicze przeciwciało anty-RFP, biotynylowanefigure-materials-13 Rockland600-406-379
Alexa Fluor 555 streptawidynafigure-materials-14 Życie TechnologieS-32355
Szczur anty-MBPJ. i N. LeeDostępne w: J. i N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, USA, klon MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647figure-materials-15 Life TechnologiesA-21247
Anty-B220 dla szczurów - Alexa Fluor 594wyprodukowany i sprzężony we własnym zakresie (DRFZ), klon RA3.6B2, Alexa Fluor 594 z Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITCwyprodukowany i sprzężony we własnym zakresie (DRFZ), klon LS136
Rat anti-k light chain - FITCwyprodukowany i sprzężony we własnym zakresie (DRFZ), klon 187.1
DAPI (4′,6-dichlorowodorek dimidino-2-fenyloindolu)figure-materials-16 SigmaD9542 SIGMA
do montażu fluorescencyjnegoS3023
Szkiełka nakrywkowe (24 x 24 x 0,13-0,16 mm)figure-materials-18 Carl RothH875.2
Okulary do slajdów Superfrost (75 x 25 mm)figure-materials-19 VWR48311-703
Laserowy skaningowy mikroskopwyposażony w linie laserowe 405, 488, 561, 594, 633 nm i soczewkę obiektywu powietrznego 20X/0,8 NA. Korzystaliśmy z oprogramowania Zeiss LSM710 oraz Zen 2010 w wersji 6.0.
Zautomatyzowane narzędzia do analizy obrazu szpiku kostnegofigure-materials-20 Wimasis, MonachiumNarzędzie do kontaktu z komórkami i narzędzie do sąsiedztwa komórek zostaną udostępnione przez Wimasis na żądanie.
Środowisko uruchomieniowe VC2012Microsoftbezpłatne pobranie
Narzędzie symulacyjne do losowego pozycjonowaniadostępne u nas, na życzenie
Oprogramowanie do analizy obrazu z funkcjamisegmentacji obrazuUżyliśmy Volocity (Perkin Elmer) do pomiaru rozkładu wielkości komórek typów komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym (Rysunek 5). Alternatywą jest Definiens Image Analysis (Definiens) lub Cell Profiler (do pobrania za darmo)
Oprogramowanie do analizy obrazu Fidżi darmowe pobranie. Fidżi był używany przez przeszkolonych oceniających do ręcznego liczenia komórek (Rysunek 3).
kurczaka Medium zestaw do przygotowania kriosekcji JP kriofilm JP Medium konfokalny komórek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
  2. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bone Marrow AnalysisConfocal MicroscopyHistological SectioningImmunofluorescence StainingImage SegmentationColocalization QuantificationNeighborhood AnalysisSimulation ToolCell Contact MeasurementStromal Cell Interaction

Powiązane artykuły