Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Podsumowanie

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Streszczenie

Mikroskopia konfokalna jest metodą z wyboru do analizy lokalizacji wielu typów komórek w złożonych tkankach, takich jak szpik kostny. Jednak analiza i kwantyfikacja lokalizacji komórkowej jest trudna, ponieważ w wielu przypadkach opiera się na ręcznym liczeniu, co wiąże się z ryzykiem wprowadzenia błędu systematycznego zależnego od oceniającego i zmniejszenia wiarygodności między oceniającymi. Co więcej, często trudno jest ocenić, czy kolokalizacja między dwiema komórkami wynika z losowego pozycjonowania, zwłaszcza gdy typy komórek różnią się znacznie częstotliwością ich występowania. W tym miejscu przedstawiono metodę bezstronnej kwantyfikacji kolokalizacji komórkowej w szpiku kostnym. Protokół opisuje przygotowanie próbki stosowanej w celu uzyskania wycinków histologicznych całych mysich kości długich, w tym szpiku kostnego, a także protokół barwienia i pozyskiwanie obrazów o wysokiej rozdzielczości. Przedstawiono przebieg analizy obejmujący proces od rozpoznawania typów komórek krwiotwórczych i niekrwiotwórczych w dwuwymiarowych (2D) obrazach szpiku kostnego do kwantyfikacji bezpośrednich kontaktów między tymi komórkami. Obejmuje to również analizę sąsiedztwa w celu uzyskania informacji o mikrośrodowisku komórkowym otaczającym określony typ komórki. Aby ocenić, czy kolokalizacja dwóch typów komórek jest jedynie wynikiem losowego rozmieszczenia komórek, czy też odzwierciedla preferencyjne powiązania między komórkami, stosuje się narzędzie symulacyjne, które jest odpowiednie do testowania tej hipotezy w przypadku komórek krwiotwórczych i zrębowych. Podejście to nie ogranicza się do szpiku kostnego i może zostać rozszerzone na inne tkanki, aby umożliwić odtwarzalną, ilościową analizę danych histologicznych.

Wprowadzenie

Ze względu na niedawny szybki rozwój technologiczny w mikroskopii, w tym obrazowanie optyczne, analiza komórek w kontekście całej tkanki staje się coraz bardziej dostępna dla immunologów. Charakterystyka pojedynczych komórek w zawiesinie stanowi cenną i niezbędną metodę zrozumienia funkcji komórkowych i molekularnych. Jednak analiza komórek w ich (mikro)anatomicznym środowisku jest niezbędna do zrozumienia interakcji między różnymi typami komórek, które współpracują w złożonych procesach, takich jak rozwój odpowiedzi immunologicznej.

Chociaż stosunkowo łatwo jest uzyskać informacje jakościowe z obrazów, ilościowe określenie tych danych pozostaje wyzwaniem, częściowo ze względu na fakt, że metody analizy w tej dziedzinie są opóźnione w porównaniu do tego, co jest możliwe w pozyskiwaniu obrazów. Wielu badaczy nadal polega na czasochłonnym ręcznym zliczaniu komórek w swoich obrazach histologicznych, wprowadzając w ten sposób stronniczość między różnymi oceniającymi i utrudniając replikację przez inne grupy. Często wybiera się jeden reprezentatywny obraz, aby podkreślić stwierdzenie dotyczące pozycji sieci komórkowej lub kolokalizacji w publikacji, co utrudnia czytelnikowi ocenę statystycznego znaczenia takiego zdarzenia.

Razem z faktem, że pełna zawartość informacji zawartych w danych obrazowych jest rzadko wykorzystywana, podkreśla to potrzebę bardziej bezstronnego, szybszego i wszechstronnego podejścia do analizy obrazów histologicznych.

Szpik kostny to złożona tkanka, która pełni ważne funkcje życiowe jako organ hematopoezy u dorosłych kręgowców. Oprócz^{tego, że} jest miejscem narodzin komórek krwiotwórczych^1,2 i odgrywa ważną rolę w rozwoju limfocytów B3, działa również jako miejsce, w którym inicjowane są reakcje immunologiczne⁴ i wspiera dojrzałe, recyrkulacyjne limfocyty B⁵. Ponadto jego rola w utrzymaniu pamięci immunologicznej stała się coraz bardziej doceniana w ostatniej dekadzie, ponieważ stwierdzono, że rezyduje tam kilka typów komórek składających się na pamięć immunologiczną^6-9.

Związek między złożoną architekturą tkankową szpiku kostnego a jego funkcjami nadal pozostaje nieuchwytny. W przeciwieństwie do wtórnych narządów limfatycznych, które są zorganizowane w makroprzedziały, takie jak strefy komórek T i B, szpik kostny nie ma wyraźnego podziału na makroprzedziały. Do tej pory odrębne przedziały w szpiku kostnym są definiowane przez ich bliskość do kory kostnej lub do układu naczyniowego. Znaczenie różnych rezydujących populacji komórek zrębowych w szpiku kostnym dla wielu procesów, takich jak wspieranie komórek macierzystych, rozwój komórek B lub utrzymanie populacji komórek pamięci immunologicznej (takich jak długowieczne komórki plazmatyczne (PC), limfocyty T pamięci CD4 ⁺ i CD8 ⁺) wyraźnie wskazuje, że w szpiku kostnym istnieje pewien stopień mikrokompartmentalizacji.

Te obserwacje doprowadziły do koncepcji odrębnych nisz mikroanatomicznych, które specjalizują się w określonych funkcjach (utrzymanie komórek macierzystych, rozwój komórek B na różnych etapach i utrzymanie pamięci immunologicznej) w szpiku kostnym. Chociaż wydaje się, że istnieje pewien stopień niejednorodności wśród nisz, które pełnią różne funkcje, niektóre czynniki wytwarzane przez komórki zrębu, takie jak ligand 12 chemokiny CXC (CXCL12) lub interleukina 7 (IL-7), są kluczowymi składnikami kilku z tych nisz¹⁰. Wizualizacja i charakterystyka komórek zrębu w szpiku kostnym jest trudna ze względu na ich cechy morfologiczne z długimi, cienkimi wypustkami dendrytycznymi tworzącymi sieć w całym szpiku kostnym oraz brak odpowiednich markerów do rozróżniania subpopulacji zrębu.

Nie jest jeszcze jasne, w jakim stopniu te nisze mają wspólne cechy w odniesieniu do ich składu komórkowego i molekularnego, oraz które elementy sprawiają, że dana nisza jest wyjątkowa. Oprócz komórek zrębu wykazano, że typy komórek krwiotwórczych odgrywają kluczową rolę, dostarczając pewnych sygnałów przynajmniej dla niektórych nisz. Nie ulega wątpliwości, że złożoność składu niszy wymaga ich analizy in situ, a dla immunologów i hematologów coraz ważniejsze staje się przybliżanie mikroarchitektury szpiku kostnego, np. poprzez analizę relacji przestrzennych między jego składnikami komórkowymi.

Tutaj przedstawiono strategię ilościowego określania kolokalizacji komórkowej i relacji sąsiedztwa w szpiku kostnym w sposób zautomatyzowany i bezstronny. Zapewniony jest szczegółowy przepływ pracy, w tym generowanie chimerycznych myszy, zawierających fluorescencyjne komórki zrębu i niefluorescencyjne komórki krwiotwórcze, przygotowanie wycinków histologicznych z nieodwapnionych kości, akwizycję obrazów konfokalnych obejmujących całą kość, a także zautomatyzowaną analizę obrazu kolokalizacji komórkowej i jej walidację/dyskryminację na podstawie losowego pozycjonowania za pomocą narzędzia symulacyjnego (ryc. 8).

Protokół

Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez odpowiednie komitety państwowe ds. dobrostanu zwierząt (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) i zostały przeprowadzone zgodnie z aktualnymi wytycznymi i przepisami (licencja na eksperymenty na zwierzętach G0194/11).

1. Generacja fluorescencyjnych myszy chimerycznych w szpiku kostnym

UWAGA: Generowanie fluorescencyjnych chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu wizualizacji komórek zrębu szpiku kostnego odbywa się zgodnie z opisem poprzednio⁹.

1. Rozpocznij leczenie myszy Del-Cre x ROSA-tdRFP (myszy eksprymujące tandemowe białko czerwonej fluorescencji (tdRFP) wszechobecnie^11-13), aby przygotować je do napromieniania. Alternatywnie, użyj dowolnego innego szczepu z wszechobecną ekspresją białka fluorescencyjnego. Podać 1 mg/ml neomycyny i 1 mg/ml witamin (A, D3, E, C) z wodą do picia na dwa dni przed napromienianiem.
2. Napromieniuj myszy dwukrotnie 3,8 Graya promiennikiem promieniowania gamma cezu-137 w odstępie 3 godzin. W tym celu umieść myszy w klatce do napromieniania odpowiedniej dla danego naświetlacza.
   UWAGA: Do napromieniania myszy nasz Instytut nie wymaga znieczulenia. Należy postępować zgodnie z lokalnymi zasadami instytucjonalnymi dotyczącymi znieczulenia do napromieniania. Zwierzęta należy podawać podskórnie (s.c.) w dawce 5 mg/kg karprofenu dziennie po napromienianiu, jeśli występują oznaki bólu.
3. Następnego dnia należy rozpuścić myszy przez dożylne wstrzyknięcie 3 x 10⁶ komórek szpiku kostnego przygotowanych z kości długich myszy dawców C57BL / 6 w buforze transferowym⁹. Trzymaj myszy na neomycynie i witaminach przez okres do 2 tygodni i monitoruj ich samopoczucie i wagę w tym czasie. Należy odczekać co najmniej 4 tygodnie, aby umożliwić odtworzenie układu odpornościowego przed rozpoczęciem określonych eksperymentalnych metod leczenia (np. immunizacji)⁹.
4. Złóż myszy w ofierze i umieść je na desce rozbiorowej, wysterylizuj nogi 70% etanolem. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z lokalnymi zasadami instytucjonalnymi. Nasz Instytut przeprowadza zwichnięcie szyjki macicy.
5. Użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć skórę z ud. Usuń tkankę mięśniową, aby odsłonić kość udową. Zwichnąć kość udową od stawu biodrowego i kolanowego za pomocą kleszczy i nożyczek. Uważaj, aby nie złamać ani nie przeciąć kości.
6. Ostrożnie usuń pozostałe duże kawałki tkanki mięśniowej i chrząstki z kości za pomocą nożyczek. Usuń pozostałą tkankę mięśniową, pocierając kość bibułą laboratoryjną. Zebrać oczyszczone kości na szalce Petriego z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
7. Utrwalić całe kości udowe w 4% paraformaldehydzie (PFA, klasa mikroskopii elektronowej) przez 4 - 6 godzin.
8. Wyrzuć PFA i inkubuj kości w 10% sacharozie w PBS O/N. Następnego dnia inkubuj kości w 20% sacharozie O/N. Następnego dnia inkubuj kości w 30% sacharozie O/N.

2. Kriosekcja kości

UWAGA: Po 16 - 24 godzinach w 30% sacharozy, zamroź kości i poddaj je kriosekcji zgodnie z metodą taśmy Kawamoto^14,15.

1. Przygotować dużą zlewkę (o objętości 2 000 ml) z suchym lodem i acetonem (stosunek objętościowy około 2:1, np. 400 ml suchego lodu i 200 ml acetonu) pod wyciągiem. Umieścić w nim małą zlewkę (objętość 150 - 250 ml) z heksanem (około 30 - 50 ml). Poczekaj, aż mieszanina ostygnie (około 10 minut, aż na zewnętrznej stronie dużej zlewki pojawi się szron).
2. Napełnij 3/4 oznakowanego kriomoldu pożywką do zatapiania w krioemburgu (SCEM); ostrożnie umieść kości w środku, aż zostaną całkowicie zanurzone, uważając, aby nie dotykały krawędzi formy. Za pomocą dużych kleszczy przytrzymaj kriomold w zlewce tak, aby dno formy dotykało powierzchni heksanu.
   1. Poczekaj, aż zewnętrzne krawędzie SCEM zamarzną (wskazywane przez nieprzezroczystość, zajmuje to około 15 sekund). Następnie całkowicie wrzuć formę do heksanu i pozwól jej zamarznąć na 1-2 minuty. Wyjmij zamrożoną próbkę i zawiń w celofan, a następnie w folię aluminiową (w celu ochrony próbki przed wyschnięciem i uniknięcia ekspozycji na światło). Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu kriosekcji.
3. Do kriosekcji kości udowych należy używać standardowego mikrotomu i ostrzy mikrotomowych do tkanek twardych.
4. Ustawić temperaturę próbki i ostrza mikrotomu na -24 °C. Pozostaw próbkę w mikrotomie na około 15 minut przed cięciem.
   1. Przymocuj blok próbki do metalowego uchwytu próbki za pomocą medium SCEM lub o optymalnej temperaturze skrawania (OCT). W razie potrzeby dostosuj orientację bloku. Przycinaj próbkę, aż kość zostanie całkowicie otwarta i szpik będzie widoczny. Dostosuj grubość przekroju do 7 μm (odrzuć pierwszą sekcję).
   2. Przymocuj kawałek taśmy Kawamoto lepką stroną do górnej części bloku próbki za pomocą drewnianej szpatułki pokrytej skórą jelenia. Następnie odetnij próbkę i obróć taśmę tak, aby sekcja znalazła się na górnej stronie. Przenieś taśmę na szkiełko szkiełkowe za pomocą kleszczy. Przymocuj taśmę do szkła ślizgowego za pomocą taśmy klejącej.
5. Pozostaw sekcje do wyschnięcia na co najmniej 30 minut i przechowuj je w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Niepoplamione i niezamontowane szkiełka należy przechowywać w plastikowych pudełkach na prowadnice z przekładkami między pojedynczymi szkiełkami, aby uniknąć ich sklejania. Poplamione i zamontowane szkiełka można przechowywać do tygodnia w tekturowych teczkach na szkiełka w temperaturze 4 °C.

3. Kolekcja obrazów

1. Rozmrażanie i barwienie kriosekcji zgodnie z powszechnymi protokołami immunofluorescencji⁹. Dołącz barwnik jądrowy, np. dichlorowodorek 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI), aby uwidocznić integralność tkanki.
   UWAGA: Barwienie, na przykład, dla RFP w celu wizualizacji komórek zrębu (przeciwciało anty-RFP-biotyna i streptawidyna-Alexa Fluor 555), barwienie eozynofili przeciwciałem przeciwko głównemu białku zasadowemu (MBP) szczura i przeciwciałem anty-szczurzemu Alexa Fluor 647, limfocyty B szczurzym przeciwciałem anty-B220-Alexa Fluor 594 i PC z przeciwciałami anty-κ łańcucha lekkiego-fluoresceiny-izo-tiocyjanianu (FITC) i przeciwciałami anty-λ1 łańcucha lekkiego-FITC (szczegóły procedury barwienia opisano w⁹).
2. Zamontuj poplamione sekcje: nałóż jedną kroplę fluoromount na sekcję, a następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym #1, ostrożnie unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Następnie należy wykonać laserową skaningową mikroskopię konfokalną za pomocą przyrządu wyposażonego w linie laserowe odpowiednie do barwienia.
3. W celu zarejestrowania obrazów do automatycznej analizy kolokalizacji komórek krwiotwórczych szpiku kostnego z komórkami zrębu za pomocą narzędzia Wimasis, należy zastosować następujące ustawienia:
   1. Użyj obiektywu 20X i pola widzenia 708.15 x 708.15 μm. W przypadku automatycznej analizy utrzymuj stały rozmiar wszystkich obrazów 2 048 x 2 048 pikseli (px), aby wyniki były porównywalne.
   2. Rejestruj jeden kanał dla struktur zrębowych (np. linia laserowa 561 nm), jeden kanał dla jąder (np. DAPI, 405 nm) i dodatkowe kanały dla komórek krwiotwórczych będących przedmiotem zainteresowania (np. 3 kanały, 488/594/633 nm dla eozynofili, limfocytów B i PC).
   3. Rejestruj obrazy za pomocą uśredniania linii 4 ¹⁶. Najlepiej pokryć cały odcinek udowy, wykonując pojedyncze sąsiednie obrazy. Alternatywnie zrób nieprzylegające zdjęcia z różnych obszarów szpiku kostnego (trzon i nasada).
      UWAGA: Uważaj, aby nie nakładać się na siebie sąsiednich obrazów (aby uniknąć wielokrotnej analizy komórek w nakładających się obszarach).
4. Zapisz obrazy w formacie pliku obrazu mikroskopowego. Sprawdź i, jeśli to konieczne, dostosuj kontrast dla wszystkich kanałów w oprogramowaniu do przeglądania obrazów/analizy.
5. Eksport 3 plików .jpg na plik obrazu: jeden plik .jpg dla kanału DAPI (format czerwony/zielony/niebieski (RGB), jeden plik .jpg dla kanału zrębu (skala szarości) i jeden plik .jpg zawierający kanały dla komórek krwiotwórczych (maksymalnie 3 kanały, format RGB, np. FITC (komputery PC, fałszywy kolor: zielony)/ Alexa Fluor 594 (komórki B, fałszywy kolor: niebieski) / Alexa Fluor 647 (eozynofile, fałszywy kolor: czerwony)).

4. Automatyczna analiza obrazu

1. Użyj narzędzia do analizy obrazu, aby przeprowadzić segmentację obrazu, kwantyfikację kolokalizacji i analizę sąsiedztwa (patrz Dyskusja).
2. Jeśli korzystasz z narzędzi Wimasis, postępuj w następujący sposób:
   1. Prześlij zestawy 3 .jpg plików na obraz o tej samej nazwie pliku, po której następuje podkreślenie i liczba wskazująca typ obrazu.
   2. Użyj _1 dla pliku .jpg z komórkami krwiotwórczymi, _2 dla pliku .jpg dla kanału DAPI, _3 dla pliku .jpg dla kanału zrębu. Na przykład: Image1_1.jpg (komórki krwiotwórcze), Image1_2.jpg (kanał DAPI) i Image1_3.jpg (kanał zrębu). Prześlij zdjęcia za pośrednictwem konta klienta.
   3. W celu ilościowego określenia kontaktu z komórką należy wybrać narzędzie do kontaktu z komórką, klikając odpowiednie pole. Aby określić ilościowo sąsiedztwo komórek, wybierz narzędzie do określania sąsiedztwa komórek i wprowadź preferowany promień sąsiedztwa w μm (mierzony od krawędzi komórek).
   4. Pobierz wyniki.
      UWAGA: Wyniki są dostarczane jako pliki .jpg przedstawiające komórki krwiotwórcze i kanał zrębu z zaznaczonymi granicami wykrytych obiektów, a także pojedyncze pliki .csv zawierające pomiary dla każdego obrazu, a także plik .csv podsumowujący, który zawiera dane dla wszystkich przesłanych obrazów.
3. Na podstawie pomiarów kontaktowych określ częstotliwość kontaktów komórek krwiotwórczych (krwinek czerwonych, zielonych lub niebieskich) w kontakcie z komórkami zrębu lub częstotliwości kontaktu czerwonych, zielonych lub niebieskich krwinek z innymi typami komórek krwiotwórczych (przykład pokazano w Reprezentatywne wyniki, ryc. 4). Aby określić częstości, podziel podaną liczbę kontaktów na obrazie przez całkowitą liczbę komórek na obrazie.
   1. W przypadku eksperymentów z pojedynczymi myszami zsumuj całkowitą liczbę kontaktów wszystkich obrazów dla pojedynczych myszy i podziel je przez sumę całkowitej liczby komórek wszystkich obrazów.
4. Na podstawie pomiarów w pobliżu określ częstość występowania czerwonych, zielonych lub niebieskich krwinek w wybranej odległości od komórek zrębu i/lub częstość występowania czerwonych, zielonych lub niebieskich krwinek w preferowanej odległości od innych typów komórek krwiotwórczych, jak opisano w kroku 4.3 (patrz również Reprezentatywne wyniki, Rysunek 4).

5. Symulacja losowego pozycjonowania szpiku kostnego

1. Przed wykonaniem symulacji losowego rozmieszczenia komórek na analizowanych obrazach histologicznych szpiku kostnego należy wcześniej przygotować następujące pliki: pojedyncze pliki .csv dostarczone przez narzędzie do kontaktu z komórką, oryginalne pliki .jpg dla kanału DAPI oraz oryginalne pliki .jpg dla kanału zrębowego.
2. Aby przeprowadzić symulacje wsadowe na serii obrazów (np. wszystkie obrazy z jednego odcinka kości udowej), zbierz wszystkie oryginalne pliki .jpg (_1, _2 i _3) oraz odpowiadające im pojedyncze pliki .csv w jednym folderze.
   UWAGA: Narzędzie symulacyjne do losowego pozycjonowania komórek szpiku kostnego jest dostępne na żądanie.
3. Uruchom narzędzie symulacyjne, zaznacz pole "Automatycznie ładuj dane obrazu".
   UWAGA: Program automatycznie odczyta liczbę komórek i średni rozmiar komórki z pliku .csv. Wartości te są wyświetlane w polach "Numer komórki" i "Rozmiar komórki AVG" (Rysunek 5A).
4. Wprowadź wspólny znacznik dla .csv plików, tj. wspólny czynnik w ich nazwach. Wprowadź liczbę zestawów obrazów, które mają być używane do symulacji w trybie wsadowym.
5. Załaduj plik .jpg wygenerowany z kanału zrębu (z nazwą pliku kończącą się _3).
6. Wprowadź ustawienia generowania maski z kanału DAPI:
   1. Zaznacz pole "Zastosować maskę?" Ustaw próg konwersji obrazu DAPI na maskę binarną na 10 (zakres 0 - 255).
   2. Zaznacz pole "8-bitowy"? Zaznacz pole "Rozszerzyć?" i ustaw stopień dylatacji na 5 pikseli. Zaznacz pole "z erozją?".
   3. Wprowadź żądaną wartość promienia sąsiedztwa (promień sąsiedztwa) używaną do analizy symulowanych obrazów. Dla obrazu o wymiarach 708,15 x 708,15 μm i rozmiarze 2 048 x 2 048 px (skalowanie pikseli xy: 0,346 μm), 29 px odpowiada 10 μm.
7. Pole wyboru "Używać Otsu?", aby użyć algorytmu¹⁷ Ottu do automatycznego wykrywania struktur zrębowych.
   UWAGA: Jest to ten sam algorytm, który jest używany przez narzędzie do kontaktu i sąsiedztwa. Wykorzystanie tego samego algorytmu segmentacji obrazu w zautomatyzowanej analizie zarejestrowanego obrazu i symulowanego obrazu ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia porównywalności danych.
8. Wprowadź ustawienia komórek krwiotwórczych, które są symulowane jako okrągłe kształty.
   UWAGA: Numery komórek czerwonych, zielonych i niebieskich są ładowane bezpośrednio z pliku .csv (patrz także krok 5.6).
   1. Użyj narzędzia symulacyjnego, aby obliczyć średnią średnicę w px czerwonych, zielonych i niebieskich komórek. Określ średni obszar pojedynczej komórki jako całkowity obszar każdego typu komórki na obrazie w pikselach podzielony przez całkowitą liczbę komórek na obrazie. Użyj średniej powierzchni, aby obliczyć promień dysku za pomocą wzoru. Podwój promień, aby określić średnią średnicę.
9. Zmierz rozkład wielkości analizowanych typów komórek za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy obrazu, które zawiera funkcje segmentacji obiektów. Określ σ dla wszystkich typów komórek krwiotwórczych (¹⁸ i ryc. 5B).
   UWAGA: Ponieważ rozkłady wielkości zarejestrowanych komórek nie są określane przez automatyczną analizę obrazu, należy użyć rozkładu Gaussa jako przybliżenia rozkładów rzeczywistych. Szerokość krzywej rozkładu jest opisana przez σ i może być bardzo różna dla różnych typów komórek. (Szczegółowe informacje znajdują się na rysunku 5B).
   1. Na podstawie tych pomiarów określ "odcięcie rozmiaru komórki": średnicę w pikselach, która opisuje najmniejszy obiekt nadal rozpoznawany jako kompletna komórka przez narzędzie do analizy obrazu.
10. Wprowadź parametry w odpowiednich polach graficznego interfejsu użytkownika (Rysunek 5A).
    1. Wprowadź odcięty rozmiar komórki, tj. minimalny rozmiar komórki dozwolony w symulacji, jako średnicę w px.
    2. Wprowadź σ w px, aby przeprowadzić symulację rozkładu rozmiaru komórek dla komórek czerwonych, zielonych i niebieskich (od kroku 5.9).
    3. Zaznacz pole "Usuń" w podsekcji "Komórki w masce". Przy tym ustawieniu program wybierze nową pozycję dla komórki, jeśli nakłada się ona na co najmniej jeden piksel z obszarem maski bez wyjścia. Zaznacz pole "Unikać nakładania się komórek?" w podsekcji "Wykluczanie komórek".
    4. Wprowadź dozwoloną minimalną odległość między środkami dwóch komórek w px.
       UWAGA: Minimalną odległość należy określić na podstawie zarejestrowanych obrazów. Nieprawidłowo zmierzone odległości minimalne doprowadzą do stronniczych/sztucznych wyników porównania zarejestrowanych i symulowanych obrazów.
    5. Ustaw maksymalny obszar nakładania na 100%, jeśli nakładanie jest definiowane przez minimalną odległość od środka do środka.
    6. Ustaw narzędzie symulacyjne na 1,000 powtórzeń.
    7. Zaznacz pole "Automatycznie zapisywać komórki?", aby zapisać współrzędne symulowanych obiektów dla wszystkich powtórzeń każdego obrazu wsadu jako pliki .rect (format tekstowy). Zaznacz pole "Automatycznie zapisywać obrazy?", aby zapisać plik .tiff dla każdego symulowanego obrazu. Wprowadź wspólny znacznik dla zapisanych plików.
       UWAGA: Opcja "Automatycznie zapisywać komórki?" skraca czas trwania symulacji i ogólny rozmiar danych w porównaniu z zapisywaniem rzeczywistych symulowanych obrazów. Pliki .rect zapisują współrzędne symulowanych komórek jako prostokąty i w ten sposób można je w razie potrzeby przekształcić w symulowane obrazy.
11. Rozpocznij symulację, klikając "Uruchom symulację".
    UWAGA: Narzędzie symulacyjne automatycznie generuje plik .csv dla 1 000 symulacji każdego obrazu, w tym średniej liczby kontaktów i liczby okolic dla komórek czerwonych, zielonych i niebieskich z komórkami czerwonymi, zielonymi, niebieskimi i zrębowymi dla każdego zestawu powtarzających się symulacji. Dodatkowo dla wszystkich tych wartości podane są średnie z 1000 symulacji z odchyleniem standardowym (STD) i błędem standardowym średniej (SEM).
12. Określ średnie częstotliwości kontaktu i częstotliwości sąsiedztwa dla jednego zestawu 1 000 symulowanych obrazów. W tym celu należy podzielić średnią liczbę kontaktów i okolic przez zarejestrowaną liczbę komórek na obrazie. Porównaj częstotliwości z wynikami automatycznej analizy kolokalizacyjnej zarejestrowanego obrazu.
13. Zastosuj odpowiednie metody statystyczne w zależności od analizy¹⁹ (na rysunku 7 użyliśmy dwustronnego testu rang ze znakiem Wilcoxona).

Wyniki

Wycinanie kriosekcji nieodwapnionej kości metodą taśmy Kawamoto pozwala na przecięcie całej kości jako nienaruszonego przekroju, z szpikiem kostnym obszaru śródkostnego nadal przyczepionym do zmineralizowanej kości, zarówno w trzonie, jak i w obszarach nasadowych o dużej gęstości kości beleczkowej (Rysunek 1). Barwienie jądrowe skrawków ujawnia, że chociaż nie można w pełni uniknąć małych pęknięć w preparacie, struktura sinusoid i tętnic oraz siatkowata sieć miąższu pozostają nienaruszone.

Dyskusja

Pomimo postępu w nowoczesnych metodach obrazowania optycznego, analiza danych histologicznych jest nadal często utrudniona przez brak odpowiednich narzędzi i metod kwantyfikacji lub przez tendencyjne analizy, które koncentrują się na niewielkim obszarze zainteresowania. Przedstawione tutaj podejście synergiczne łączy analizę obrazu obejmującą cały obszar szpiku kostnego, automatyczną segmentację i rozpoznawanie obiektów różnych typów komórek krwiotwórczych i zrębowych, analizę kolokalizacji i wreszcie narzędzie do walida...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Neomycin	Sigma	N6386 SIGMA	Hydrat soli trisiarczanu neomycyny, kod zagrożenia UE: GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 ml zawiera: 50.000 I.E. palmitynian retinylu, 5.000 I.E. cholekalcyferol, 30 mg octan tokoferylu, 100 mg kwas askorbinowy, 1 mg kwas sorbowy, 200 mg polioksylu 35 olej rycynowy, 0,5 mg galusan propylu
Bufor transferowy (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicyliny/streptomycyny)	Sigma	P4333, H3375
Hapten 4-hydroksy-3-nitrofenyloacetylowy sprzężony z gamma globuliną
Gamma globulina kurczaka (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% roztwór paraformaldehydu (klasa EM)	Science Services	15713	Kody zagrożeń UE: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sacharoza	Carl Roth	4621.1
Suchy lód
Aceton	Sigma-Aldrich	179124 Kody zagrożeń SIGMA-ALDRICH	EU: GHS02, GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich 208752 Sigma-Aldrich		Kody zagrożeń UE: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard)	Sakura	4557	25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T.	Sakura	4583
	do osadzania SCEM firmy Kawamoto
Kawamoto	Section-Lab,
Kawamoto typ 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	dł. x szer.: 80 x 8 mm (31,5 x 3,13"), grubość: 0,25 mm (0,01")
Poliklonalne królicze przeciwciało anty-RFP, biotynylowane	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptawidyna	Życie Technologie	S-32355
Szczur anty-MBP	J. i N. Lee		Dostępne w: J. i N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, USA, klon MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647	Life Technologies	A-21247
Anty-B220 dla szczurów - Alexa Fluor 594			wyprodukowany i sprzężony we własnym zakresie (DRFZ), klon RA3.6B2, Alexa Fluor 594 z Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC			wyprodukowany i sprzężony we własnym zakresie (DRFZ), klon LS136
Rat anti-k light chain - FITC			wyprodukowany i sprzężony we własnym zakresie (DRFZ), klon 187.1
DAPI (4′,6-dichlorowodorek dimidino-2-fenyloindolu)	Sigma	D9542 SIGMA
	do montażu fluorescencyjnego	S3023
Szkiełka nakrywkowe (24 x 24 x 0,13-0,16 mm)	Carl Roth	H875.2
Okulary do slajdów Superfrost (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
Laserowy skaningowy mikroskop			wyposażony w linie laserowe 405, 488, 561, 594, 633 nm i soczewkę obiektywu powietrznego 20X/0,8 NA. Korzystaliśmy z oprogramowania Zeiss LSM710 oraz Zen 2010 w wersji 6.0.
Zautomatyzowane narzędzia do analizy obrazu szpiku	kostnego Wimasis, Monachium		Narzędzie do kontaktu z komórkami i narzędzie do sąsiedztwa komórek zostaną udostępnione przez Wimasis na żądanie.
Środowisko uruchomieniowe VC2012	Microsoft		bezpłatne pobranie
Narzędzie symulacyjne do losowego pozycjonowania			dostępne u nas, na życzenie
Oprogramowanie do analizy obrazu z funkcjami			segmentacji obrazuUżyliśmy Volocity (Perkin Elmer) do pomiaru rozkładu wielkości komórek typów komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym (Rysunek 5). Alternatywą jest Definiens Image Analysis (Definiens) lub Cell Profiler (do pobrania za darmo)
Oprogramowanie do analizy obrazu Fidżi			darmowe pobranie. Fidżi był używany przez przeszkolonych oceniających do ręcznego liczenia komórek (Rysunek 3).