Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia konfokalna jest metodą z wyboru do analizy lokalizacji wielu typów komórek w złożonych tkankach, takich jak szpik kostny. Jednak analiza i kwantyfikacja lokalizacji komórkowej jest trudna, ponieważ w wielu przypadkach opiera się na ręcznym liczeniu, co wiąże się z ryzykiem wprowadzenia błędu systematycznego zależnego od oceniającego i zmniejszenia wiarygodności między oceniającymi. Co więcej, często trudno jest ocenić, czy kolokalizacja między dwiema komórkami wynika z losowego pozycjonowania, zwłaszcza gdy typy komórek różnią się znacznie częstotliwością ich występowania. W tym miejscu przedstawiono metodę bezstronnej kwantyfikacji kolokalizacji komórkowej w szpiku kostnym. Protokół opisuje przygotowanie próbki stosowanej w celu uzyskania wycinków histologicznych całych mysich kości długich, w tym szpiku kostnego, a także protokół barwienia i pozyskiwanie obrazów o wysokiej rozdzielczości. Przedstawiono przebieg analizy obejmujący proces od rozpoznawania typów komórek krwiotwórczych i niekrwiotwórczych w dwuwymiarowych (2D) obrazach szpiku kostnego do kwantyfikacji bezpośrednich kontaktów między tymi komórkami. Obejmuje to również analizę sąsiedztwa w celu uzyskania informacji o mikrośrodowisku komórkowym otaczającym określony typ komórki. Aby ocenić, czy kolokalizacja dwóch typów komórek jest jedynie wynikiem losowego rozmieszczenia komórek, czy też odzwierciedla preferencyjne powiązania między komórkami, stosuje się narzędzie symulacyjne, które jest odpowiednie do testowania tej hipotezy w przypadku komórek krwiotwórczych i zrębowych. Podejście to nie ogranicza się do szpiku kostnego i może zostać rozszerzone na inne tkanki, aby umożliwić odtwarzalną, ilościową analizę danych histologicznych.
Wprowadzenie
Ze względu na niedawny szybki rozwój technologiczny w mikroskopii, w tym obrazowanie optyczne, analiza komórek w kontekście całej tkanki staje się coraz bardziej dostępna dla immunologów. Charakterystyka pojedynczych komórek w zawiesinie stanowi cenną i niezbędną metodę zrozumienia funkcji komórkowych i molekularnych. Jednak analiza komórek w ich (mikro)anatomicznym środowisku jest niezbędna do zrozumienia interakcji między różnymi typami komórek, które współpracują w złożonych procesach, takich jak rozwój odpowiedzi immunologicznej.
Chociaż stosunkowo łatwo jest uzyskać informacje jakościowe z obrazów, ilościowe określenie tych danych pozo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez odpowiednie komitety państwowe ds. dobrostanu zwierząt (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin) i zostały przeprowadzone zgodnie z aktualnymi wytycznymi i przepisami (licencja na eksperymenty na zwierzętach G0194/11).
1. Generacja fluorescencyjnych myszy chimerycznych w szpiku kostnym
UWAGA: Generowanie fluorescencyjnych chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu wizualizacji komórek zrębu szpiku kostnego odbywa się zgodnie z opisem poprzednio9.
- Rozpocznij leczenie myszy Del-Cre x ROSA-tdRFP (myszy eksprymujące tandemowe białko ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przygotowanie kriosiekcji nieodwapnionej kości metodą taśmową Kawamoto pozwala na wycięcie całej kości jako nienaruszonego przekroju, w którym szpik kostny obszaru endostealnego pozostaje przylegający do zmineralizowanej tkanki kostnej, zarówno w trzonie, jak i w obszarach nasadowych o wysokiej gęstości kości beleczkowej (Rysunek 1). Barwienie jąder komórkowych w przekrojach wykazuje, że mimo iż nie można całkowicie uniknąć niewielkich pęknięć w preparacie, struktura zatok i tętnic, a także sieć retikula.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo postępów w nowoczesnych metodach obrazowania optycznego, analiza danych histologicznych jest wciąż często utrudniana przez brak odpowiednich narzędzi i metod kwantyfikacji lub przez stronnicze analizy koncentrujące się na niewielkim obszarze zainteresowania. Przedstawione tutaj podejście synergistyczne łączy analizę obrazu obejmującą cały obszar szpiku kostnego, zautomatyzowaną segmentację i rozpoznawanie obiektów różnych typów komórek krwiotwórczych i zrębowych, analizę ko-lokalizacji, a na koniec narzędzie do wa.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Juan Escribano Navarro jest powiązany z Wimasis GmbH, Monachium, Niemcy. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Andreasowi Radbruchowi za cenne dyskusje. Jesteśmy wdzięczni Sabine Gruczek, Patrickowi Thiemannowi i Manueli Ohde za pomoc w opiece nad zwierzętami oraz Robertowi Güntherowi za doskonałą pomoc techniczną. Dziękujemy naszym przeszkolonym oceniającym: Laurze Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florence Pache i Katharinie Horn za ocenę próbek histologicznych oraz Randy'emu Lindquistowi za korektę manuskryptu. Dziękujemy J. i N. Lee z Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, USA za przeciwciała specyficzne dla MBP.
Ta praca była wspierana przez DFG HA5354/4-1, przez JIMI-a główny grant sieci ośrodków DFG na mikroskop....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Neomycyna |  Sigma | N6386 SIGMA | Hydrat soli trysiarczanu neomycyny, kod zagrożenia UE: GHS08 |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml zawiera: 50.000 I.E. palmitynianu retinylu, 5.000 I.E. cholekalcyferolu, 30 mg octanu tokoferolu, 100 mg kwasu askorbinowego, 1 mg kwasu sorbowego, 200 mg polioksylowanego oleju rycynowego 35, 0,5 mg galianu propylu | |
| Bufor transferowy (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicyliny/streptomycyny) | Sigma | P4333, H3375 | |
| Hapten 4-hydroksy-3-nitrofenyloacetylokoniugowany z gamma globuliną kurcząt | |||
| Gamma globulina kurcząt (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | |
| 20% roztwór paraformaldehydu (klasa EM) | Science Services | 15713 | Kody zagrożenia UE: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-sacharoza | Carl Roth | 4621.1 | |
| Suchy lód | |||
| Aceton | Sigma-Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | Kody zagrożenia UE: GHS02, GHS07 |
| Heksan | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | Kody zagrożenia UE: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09 |
| Formy do kriosekcji Tissue-Tek (standardowe) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | |
| Medium do zatapiania SCEM Kawamoto | Section-Lab, JP | ||
| Zestaw do przygotowania krioprzekrojów Kawamoto | Section-Lab, JP | ||
| Kriofolia Kawamoto typ 2C(9) | Section-Lab, JP | ||
| Nóż do mikrotomu MX35 premier plus, niski profil | Thermo Scientific | 3052835 | Dł. x szer.: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), grubość: 0.25 mm (0.01") |
| Poliklonalne królicze przeciwciało anty-RFP, biotynilowane | Rockland | 600-406-379 | |
| Streptawidyna Alexa Fluor 555 | Life Technologies | S-32355 | |
| Szczurze anty-MBP | J. and N. Lee | dostępne od: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., klon MT-14.7 | |
| Kozie anty-szczurze Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | |
| Szczurze anty-B220 - Alexa Fluor 594 | wyprodukowane i sprzężone wewnętrznie (DRFZ), klon RA3.6B2, Alexa Fluor 594 z Life Technologies | ||
| Mysie anty-łańcuch lekki l1 -FITC | wyprodukowane i sprzężone wewnętrznie (DRFZ), klon LS136 | ||
| Szczurze anty-łańcuch lekki k - FITC | wyprodukowane i sprzężone wewnętrznie (DRFZ), klon 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu dichlorowodorek) | Sigma | D9542 SIGMA | |
| Fluorescencyjne medium montażowe | DAKO | S3023 | |
| Szkiełka nakrywkowe (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | |
| Szkiełka Superfrost (75 x 25 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny | wyposażony w linie laserowe 405, 488, 561, 594, 633 nm oraz obiektyw powietrzny 20X/0.8 NA. Użyto mikroskopu Zeiss LSM710 oraz oprogramowania Zen 2010 w wersji 6.0. | ||
| Zautomatyzowane narzędzia do analizy obrazów szpiku kostnego | Wimasis, Monachium | Narzędzie do kontaktu komórek oraz narzędzie do sąsiedztwa komórek zostaną udostępnione przez firmę Wimasis na życzenie. | |
| Środowisko uruchomieniowe VC2012 | Microsoft | bezpłatne pobieranie | |
| Narzędzie symulacyjne do losowego rozmieszczania komórek | dostępne od nas na życzenie | ||
| Oprogramowanie do analizy obrazu z funkcjami segmentacji obrazu | Do pomiaru rozkładu wielkości komórek hematopoetycznych w szpiku kostnym użyto programu Volocity (Perkin Elmer) (Rycina 5). Alternatywami są Definiens Image Analysis (Definiens) lub Cell Profiler (bezpłatne pobieranie) | ||
| Oprogramowanie do analizy obrazu Fiji | bezpłatne pobieranie. Program Fiji był używany przez przeszkolonych oceniających do ręcznego liczenia komórek (Rycina 3). |
Bibliografia
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
