Artykuł metodologiczny

Metoda wyboru aptamerów przełączających strukturę zastosowana do kolorymetrycznego testu nanocząstek złota

DOI:

10.3791/52545

⸱

28 lutego 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1711th Human Performance Wing, Human Effectiveness Directorate, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 2The Henry M. Jackson Foundation, 3UES, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępny jest protokół do wyboru aptamerów przełączających strukturę dla małych cząsteczek w oparciu o przestrajalną metodę selekcji kulek magnetycznych z regulacją. Aptamery wybrane ze względu na właściwości przełączania struktur są korzystne w testach, które wymagają zmiany konformacyjnej w celu zasygnalizowania obecności celu, takich jak opisany test nanocząstek złota.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe cząsteczki stanowią bogate cele dla zastosowań biosensorycznych ze względu na ich fizjologiczne implikacje jako biomarkery różnych aspektów ludzkiego zdrowia i wydajności. Aptamery kwasów nukleinowych są coraz częściej stosowane jako elementy rozpoznające na platformach biosensorów, ale wybór aptamerów w kierunku celów dla małych cząsteczek wymaga specjalnych rozważań projektowych. W pracy opisano modyfikację i krytyczne etapy metody mającej na celu selekcję aptamerów przełączających strukturę do celów małocząsteczkowych. Sekwencje wiążące z biblioteki DNA zhybrydyzowane z komplementarnymi sondami wychwytywania DNA na kulkach magnetycznych są oddzielane od niewiążących poprzez zmianę konformacji wywołaną przez cel. Metoda ta jest korzystna, ponieważ sekwencje wiążące macierz nośną (kulki) nie będą dalej amplifikowane i nie wymagają unieruchomienia cząsteczki docelowej. Jednak temperatura topnienia sondy wychwytującej i biblioteki jest utrzymywana na poziomie lub nieco powyżej RT, tak że sekwencje, które dehybrydyzują w oparciu o termodynamikę, będą również obecne w roztworze supernatantu. To skutecznie ogranicza wydajność partycjonowania (zdolność do oddzielania docelowych sekwencji wiążących od niewiążących), a zatem do usunięcia sekwencji tła potrzebnych będzie wiele rund selekcji. Opisana metoda różni się od poprzednich wyborów aptamerów z przełączaniem struktury ze względu na implementację etapów selekcji negatywnej, uproszczone monitorowanie wzbogacania oraz wydłużenie długości sondy wychwytującej po wzbogaceniu selekcji w celu zapewnienia większej rygorystyczności. Wybrane aptamery do przełączania struktur są korzystne w platformie testowej nanocząstek złota, która informuje o obecności cząsteczki docelowej w wyniku zmiany konformacyjnej aptameru. Test nanocząstek złota został zastosowany, ponieważ zapewnia prosty, szybki odczyt kolorymetryczny, który jest korzystny w środowisku klinicznym lub wdrożonym. Rozważania projektowe i optymalizacyjne zostały przedstawione dla testu jako dowód słuszności zasady pracy w buforze, aby zapewnić podstawę do dalszego rozszerzenia prac w kierunku biodetekcji małych cząsteczek w płynach fizjologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe cząsteczki od dawna są uznawane za odgrywające istotną rolę w różnych procesach biologicznych, takich jak fizjologiczna toksyczność lub odżywianie, sygnalizacja komórkowa i jako farmaceutyczne metody leczenia choroby1. Zasugerowano również, że różne małe cząsteczki są biomarkerami wskazującymi na stany fizjologiczne, w tym stres2,3, zmęczenie4 i chorobę5. Na przykład podwyższony poziom kortyzolu koreluje ze stresem, który może skutkować zmniejszoną wydajnością fizjologiczną i innymi schorzeniami6-8. Podobnie, zmiany w proporcjach niektórych peptydów w ślinie są predyktorem zmęczenia, gdzie objawy fizjologiczne obejmują brak koncentracji, upośledzony czas reakcji i zmniejszone funkcje poznawcze4. W związku z tym opracowanie specyficznych dla celu bioczujników do monitorowania poziomów małych cząsteczek może stanowić nieoceniony wskaźnik do oceny zdrowia i możliwości wydajnościowych danej osoby.

Historycznie rzecz biorąc, wykrywanie małych cząsteczek było wykonywane za pomocą pracochłonnych technik separacji lub rozpoznawania na podstawie przeciwciał6,7. Ostatnio aptamery9,10 kwasów nukleinowych pojawiły się jako elementy rozpoznające, które mają wyraźną przewagę nad przeciwciałami w określonych zastosowaniach. Dzięki swojej zdolności do wiązania celu o różnej wielkości, od jonów metali11 do tkanek12, aptamery są szeroko stosowane jako elementy rozpoznające w platformach biosensorycznych13,14. W porównaniu z przeciwciałami, aptamery są syntetyzowane chemicznie, a zatem łatwo jest wprowadzić powtarzalne modyfikacje chemiczne w celu unieruchomienia powierzchni lub raportowania. Aptamery mogą być selekcjonowane z wysoką swoistością docelową w pożądanych warunkach poprzez modyfikację zastosowanych warunków selekcji, podczas gdy przeciwciała są ograniczone do warunków fizjologicznych15,16. Ponadto aptamery są zdolne do większej gęstości ligandów ze względu na ich mniejszy rozmiar, co skutkuje wyższą wydajnością sygnalizacji celu na platformie biosensorów, a zwiększona stabilność aptamerów pozwala na wielokrotne użycie i długoterminowe przechowywanie czujników16.

Aptamery są generowane przy użyciu procedury znanej jako SELEX, w której początkowa biblioteka sekwencji jest ewoluowana od 1013-10 15 unikalnych cząsteczek do wzbogaconej końcowej puli zawierającej kilka (10 1-102) sekwencji z potencjałem do wiązania docelowej cząsteczki. Końcowa wzbogacona pula jest następnie sekwencjonowana, a stałe dysocjacji (Kd) uzyskuje się z testów wiązania sekwencji o największej liczbie kopii z cząsteczką docelową. Ewolucja puli do ostatecznej wzbogaconej populacji jest śledzona poprzez monitorowanie procentu puli wiążącej cel w każdej rundzie, aż do uzyskania maksymalnego wzbogacenia. Odbywa się to w ciągu kilku rund ewolucyjnych, w których sekwencje wiążące są oddzielane od substancji niewiążących i amplifikowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Zdolność do skutecznego podziału i zatrzymywania spoiw jest jednym z głównych wyznaczników efektywności selekcji i bezpośrednio wpływa na charakterystykę wybranych aptamerów15. Etap partycjonowania SELEX jest trudniejszy dla małych cząsteczek, ponieważ nie posiadają one wielkości ani różnorodności grup funkcyjnych, które wspomagają proces partycjonowania celów białkowych1,15. Na przykład wiele platform partycjonowania białek opiera się na wielkości lub separacji opartej na ładunku, jednak właściwości związanych kompleksów docelowych DNA-małych cząsteczek na ogół nie różnią się znacząco od właściwości sekwencji niewiążących, co skutkuje nieefektywnym partycjonowaniem1. Alternatywne metody partycjonowania SELEX mogą obejmować unieruchomienie lub znakowanie celu, co potencjalnie zmienia charakterystykę wiązania małej cząsteczki. W związku z tym zaprojektowanie procedury selekcyjnej do generowania aptamerów dla celów małocząsteczkowych wymaga szczególnej uwagi.

Do oryginalnej metodologii SELEX zastosowano różne modyfikacje, aby zwiększyć efektywność partycjonowania procedury, poprawić powinowactwo lub specyficzność sekwencji w końcowej puli, lub uczynić ją bardziej podatną na różne zastosowania15,16. Jedna z modyfikacji SELEX, zdolna do selekcji małych cząsteczek, została zaprojektowana w celu wygenerowania aptamerów przełączających strukturę, czyli aptamerów, które ulegają zmianie konformacyjnej po interakcji z cząsteczką docelową17,18. W jednym z przykładów tej metody biblioteka jest hybrydyzowana z krótkim fragmentem niewiążącego komplementarnego DNA (cDNA) unieruchomionego na kulkach magnetycznych17. Po związaniu celu, konformacyjna zmiana sekwencji wiążących umożliwia im dehybrydyzację z cDNA, uwalniając je do roztworu supernatantu, podczas gdy niewiążące pozostające zhybrydyzowane z cDNA / kulkami są magnetycznie partycjonowane i odrzucane. Ta metoda jest korzystna dla małych cząsteczek, ponieważ nie wymaga unieruchomienia ani znakowania cząsteczki docelowej w celu uzyskania separacji.

Aptamery, które są zdolne do zmiany struktury, posiadają cenną cechę dla każdej potencjalnej platformy biosensorów, która wymaga zmiany struktury aptamerów w celu wykrycia obecności docelowej cząsteczki. W szczególności aptamery można łączyć z nanocząstkami złota (AuNP) w celu stworzenia testów, które działają w oparciu o zasadę przełączania struktury w celu wytworzenia odpowiedzi kolorymetrycznej w obecności cząsteczki docelowej po prowokacji solą19,20. W teście AuNP aptamer jednoniciowego DNA (ssDNA) początkowo adsorbuje się na powierzchni AuNP i chroni go przed prowokacją solą. Obecność celu indukuje zmianę konformacyjną w aptamerze, który odsłania powierzchnię AuNP, powodując zmianę koloru z czerwonego na niebieski po dodaniu soli. Wykazano również, że testy AuNP wzmacniają sygnał, przy czym aptamery powinowactwa mikromolowego mogą wykrywać cel na poziomach o rzędy wielkości niższych niż stała dysocjacji (Kd)21. Cecha ta jest szczególnie atrakcyjna w przypadku celów małocząsteczkowych, w których powinowactwo zwykle waha się od niskich stężeń mikromolowych do milimolowych1,15. Ogólnie rzecz biorąc, test jest również szybki i stosunkowo prosty do wykonania, co zachęca do dalszych badań nad testami aptamer-AuNP jako platformami wykrywania bioczujników.

Celem tej pracy jest dostarczenie uniwersalnego protokołu wyboru aptamerów przełączających strukturę na małe cząsteczki do zastosowań biosensorycznych, wykorzystując marker stresu kortyzol jako reprezentatywną cząsteczkę. Schemat detekcji biosensora AuNP jest interesujący ze względu na prostotę obsługi i odczyt kolorymetryczny, ale aptamery przełączające strukturę mają zastosowanie do alternatywnych wyjść platformy detekcyjnej, takich jak elektrochemiczna22 lub fluorescencja23, które zapewniają również wykrywanie poprzez zmianę konformacji aptameru po związaniu celu. W porównaniu z poprzednimi metodami, w projekcie uwzględniono wiele etapów selekcji negatywnej17,18 i zaimplementowano prosty schemat wykrywania wzbogacenia oparty na promieniowaniu UV (ryc. 1). Protokół ten jest przeciwieństwem schematu wykrywania wzbogacania radioligandów stosowanego w starszych metodach17. Proponowana metoda obejmowała również zwiększenie długości sond wychwytujących cDNA używanych w selekcji w celu zwiększenia wydajności partycjonowania i skutecznego dostrojenia rygorystyczności selekcji po zaobserwowaniu maksymalnego wzbogacenia24. Dostrojona rygorystyczność doprowadziła do niższego całkowitego procentu DNA wymytego przez cel w końcowej puli, ale skutkowała wyższą liczbą kopii sekwencji, która wiązała się ze zwiększonym powinowactwem w porównaniu z sekwencją o najwyższej liczbie kopii z wcześniejszej rundy. Sekwencja o najwyższym numerze kopii z końcowej puli została zastosowana do testu AuNP w celu zilustrowania, że sekwencja była podatna na platformę, która wymaga zmiany strukturalnej w celu wskazania docelowego wiązania. Ten test oparty na buforze pokazuje, że odpowiedź testu AuNP może być modyfikowana poprzez zmianę gęstości DNA nałożonego na powierzchnię i służy jako praca dowodowa w celu poświęcenia przyszłych wysiłków badawczych na opracowanie małocząsteczkowych bioczujników AuNP opartych na aptamierach w płynach fizjologicznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i synteza bibliotek i podkładów

  1. Zaprojektuj początkową bibliotekę i elementarze (ten temat był obszernie omawiany w poprzednich publikacjach)25,26.
    1. Zsyntetyzuj następujące sekwencje do tego badania, używając standardowej chemii fosforoamidytu:
      Biblioteka: GAATGGATCCACATCCATGG-N 40-TTCACTGCAGACTTGACGACGAAGCTTGACGAA
      Elementarz do przodu: GGAATGGATCCACATCCATGG
      Odwrócony elementarz: Biotyna-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA
    2. Zaprojektuj sondy wychwytujące cDNA tak, aby były komplementarne z regionem 5' biblioteki. Wybierz początkową długość, analizując oprogramowanie do pomiaru temperatury topnienia online, aby zapewnić temperaturę topnienia nieco wyższą od RT, przy czym każda kolejna zasada zapewnia zwiększoną temperaturę topnienia.
      Sonda wychwytująca: CCATTCC-Biotin
      Sonda wychwytująca: TCCATTCC-Biotin
      Sonda wychwytująca: ATCCATTCC-Biotyna
  2. Oczyść bibliotekę za pomocą standardowej HPLC. Odsalanie jest wystarczające dla starterów i sond wychwytujących. Oligonukleotydy należy rozpuścić w wodzie wolnej od nukleaz o pożądanym stężeniu i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy.

2. Bufor, biblioteka i przygotowanie próbki

  1. Przygotować 500 ml buforu w wodzie miliporowej lub wolnej od nukleaz o stężeniach 50 mM Tris, 137 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 7,4. Przefiltrować bufor przez sterylną membranę 0,2 μm; Przechowywanie jest możliwe w warunkach otoczenia przez wiele miesięcy.
    1. Alternatywnie należy użyć innych, takich jak PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy) itp.
  2. Ustaw dwa termomiksery; ustaw jeden na 95 °C, a drugi trzymaj w temperaturze otoczenia (~20 °C w tej pracy). Przygotuj wiaderko na lód.
  3. Podgrzeć/schłodzić bibliotekę DNA, umieszczając 100 μl biblioteki (~2,5 nmol dla 1015-10 16 sekwencji) w termomikserze ustawionym na 95 °C na 5 minut. Umieść probówkę na lodzie podczas przygotowywania kulek magnetycznych (sekcje 3.1-3.6). Określić rzeczywiste stężenie biblioteki DNA poprzez absorpcję UV przy λ = 260 nm i stosując odpowiedni współczynnik konwersji dla biblioteki.
  4. Przygotować docelowe roztwory podstawowe w podłożu odpowiednim do docelowej rozpuszczalności.
    1. Przygotuj zapasy analitu 100 mM w DMSO. Stada te są zdolne do życia przez około 1 miesiąc, gdy są przechowywane w warunkach otoczenia, ale różne cele będą wykazywać różne profile degradacji.

3. Przygotowanie koralików magnetycznych i wstępna runda selekcji

  1. Vortex 6,7 x 108 kulek/ml kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną i usunąć 400 μl do nowej probówki do mikrowirówki. Umieść rurkę na magnesie na 2 minuty i usuń supernatant.
  2. Umyj kulki, dodając 400 μl bufora wiążącego, wirując i odsysając supernatant po umieszczeniu rurki na magnesie w celu oddzielenia kulek. Powtórz ten proces trzy razy.
  3. Unieruchomić sondę wychwytującą na kulkach magnetycznych poprzez ponowne zawieszenie kulek w buforze wiążącym o pojemności 400 μl z sondą wychwytującą 50 μM (końcową) i inkubację przez 10 minut z delikatnym mieszaniem na termomikserze w warunkach otoczenia.
  4. Przemyć kulki trzykrotnie 400 μl buforu wiążącego, powtarzając etapy płukania opisane w sekcji 3.2 w celu usunięcia wolnej sondy wychwytującej.
  5. Zawiesić kulki w 400 μl bufora wiążącego. Usunąć 100 μl roztworu kulki do następnych etapów i zachować pozostałe 300 μl w temperaturze 4 °C do wykorzystania w kolejnych rundach selekcji przez maksymalnie trzy tygodnie.
  6. Przepłukać kulki dwukrotnie 200 μl buforu wiążącego, jak opisano w sekcji 3.2.
  7. Dodać 100 μl schłodzonego zatrzaskowo DNA z sekcji 2.3 do przemytych kulek i inkubować przez 30 minut z delikatnym mieszaniem za pomocą termomiksera w warunkach otoczenia.
    UWAGA: Stężenia DNA w pierwszych rundach są wyższe niż w kolejnych rundach, aby zminimalizować utratę sekwencji we wcześniejszych rundach, w których teoretycznie występują unikalne sekwencje.
  8. Określić ilościowo DNA w supernatencie za pomocą absorpcji UV, jak w sekcji 2.3 i odjąć ją od początkowej ilości dodanej w sekcji 3.7, aby ocenić ilość DNA związanego z kulkami.
    1. Przepłukać kulki 200 μl buforem wiążącym, a następnie dwukrotnie przepłukać 200 μl buforem wiążącym z delikatnym mieszaniem na termomikserze przez 5 minut w warunkach otoczenia.
  9. Zawiesić kulki w 200 μl 100 μM tarczy rozcieńczonej w buforze wiążącym i obracać na termomikserze przez 30 minut w warunkach otoczenia. Roztwory robocze należy przygotowywać na świeżo na początku każdego dnia przed selekcją, ponieważ zaobserwowano, że cel i grupa kontrolna agregują się z roztworu wodnego w miarę upływu czasu. Zachować roztwór supernatantu, który zawiera sekwencje eluowane do celu, do dalszych badań.
  10. Dokonać selekcji negatywnej po zakończeniu 1-2 rund, dodając 200 μl 1 μM progesteronu do kulek przygotowanych w sekcji 3.8.1. Delikatnie wstrząsaj przez 30 minut na termomikserze w temperaturze otoczenia.
  11. Użyć podstawki magnetycznej do wychwycenia kulek i odrzucenia supernatantu, przemłukując kulki dwukrotnie w 200 μl buforu wiążącego przed dodaniem kortyzolu, jak w sekcji 3.9.

4. Monitorowanie wzbogacenia, PCR i generowanie jednoniciowego DNA

  1. Dodać roztwór supernatantu do kasety dializacyjnej w celu monitorowania wzbogacenia selekcji. Dializa jest niezbędna do usunięcia kortyzolu z eluowanego DNA, ponieważ kortyzol jest obecny w znacznie wyższych stężeniach niż DNA, a także ma pik absorpcji UV, który nakłada się na standardowe DNA UV λmax = 260 nm.
    1. Wykonuj ten krok co drugą rundę (rundy 2, 4, 6 i 8) we wczesnych rundach selekcji. Zmniejsza to utratę próbki, gdy występuje potencjalnie niewielka liczba kopii każdej sekwencji (najwyższa różnorodność). Aby uzyskać szybsze wyniki, można również zastosować alternatywne metody, takie jak kolumny wykluczające rozmiar.
  2. Kasetę z próbką należy dwukrotnie dializować w świeżych 250 ml buforu wiążącego przez 2 godziny w warunkach otoczenia. Wymienić bufor i inkubować w temperaturze 4 °C O/N.
  3. Przeanalizować dializowaną pulę za pomocą spektroskopii UV w celu określenia procentu DNA eluowanego przez cel (porównaj z wynikami sekcji 3.8).
  4. Przygotuj 3% żel agarozowy z 1% w/v bromkiem etydyny. W tej pracy przygotuj żel z 1,5 g agarozy, 50 ml buforu TAE (40 mM octanu tris, 1 mM EDTA, pH = 8,0) i 10 μl bromku etydyny.
  5. Zoptymalizuj cyklicznie dializowaną pulę, wykonując PCR na małą skalę (5 x 50 μl podwielokrotności) przy użyciu ~5-15 cykli. W przypadku składników PCR należy użyć 1x buforu reakcyjnego PCR (wszystkie stężenia końcowe), 200 μM dNTP, 10% objętości reakcji matrycy DNA, 500 nM każdego startera i polimerazy 2,5 U (zapas 2,5 U/μl).
    1. Uruchom PCR w zoptymalizowanych warunkach w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, a następnie powtórz cykle 95 °C (30 sekund), 55 °C (30 sekund) i 72 °C (1 min), a następnie końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C (10 min) i przytrzymaj w temperaturze 4 °C.
    2. Do porównania użyj standardowej drabiny o ciśnieniu 25 pz i zobrazuj na obrazie żelowym. Wybierz liczbę cykli, która daje pasmo o największej intensywności przy odpowiednim znaczniku rozmiaru bez niepożądanych produktów ubocznych.
    3. Przeanalizuj wyniki optymalizacji cyklu, łącząc 10 μl każdego cyklu PCR z 2 μl 6x niebiesko-pomarańczowego barwnika ładującego i ładując do 5 oddzielnych dołków 3% żelu agarozowego przygotowanego w kroku 4.4 (125 V przez 45 min).
  6. Wykonać PCR na dużą skalę, wykorzystując warunki i odpowiednią liczbę cykli określoną w sekcji 4.5. Zazwyczaj wymagane było 6-8 ml reakcji PCR, aby uzyskać 1-2,5 nmol używane dla każdej rundy w tej selekcji. Użyj probówek z 8 paskami, aby uprościć obsługę wielu probówek wymaganych do porcjowania tej objętości do amplifikacji PCR.
  7. Przygotować 3% żel agarozowy zgodnie z opisem w sekcji 4.4 i sprawdzić, czy prążek produktu PCR znajduje się we właściwym miejscu, postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcjach 4.5.2-4.5.3.
  8. Przekształć cały dwuniciowy produkt DNA z sekcji 4.7 na jednoniciowy DNA, wykonując czynności opisane poniżej:
    1. Dodaj 300 μl kulek pokrytych streptawidyną (nie magnetycznych) do małej kolumny zablokowanej frytkami. Przemyć kulki 5 ml buforu wiążącego, dołączając strzykawkę typu luer-lock i delikatnie naciskając na tłok. Wyjąć strzykawkę z kolumny i wyjąć tłok ze strzykawki w pozycji off-line po dodaniu każdego materiału, tak aby kulki nie zostały naruszone przez aspirację tłoka.
    2. Dodać produkt do PCR i przepuścić go przez kolumnę, delikatnie naciskając na tłok. Użyć kilku kolumn tak, aby do każdej kolumny nie dodać więcej niż 1-1,2 ml produktu PCR. Odrzuć końcowy przepływ, ponieważ DNA zostanie zatrzymane na kolumnie przez ugrupowanie biotyny na nici antysensownej.
    3. Przepłukać kolumnę 5 ml buforu wiążącego.
    4. Dehybrydyzacja DNA przez dodanie 0,5 ml 0,2 M NaOH. Zachowaj eluat, ponieważ zawiera jednoniciowy zmysłowy DNA.
  9. Odsalić ssDNA w 0,2 M NaOH, dodając 0,5 ml do kolumny odsalającej przygotowanej przez przemycie wodą wolną od nukleaz. Odrzuć początkowe 0,5 ml płynu, a następnie dodaj 1 ml wody wolnej od nukleazy i zbierz tę odsoloną próbkę ssDNA. Na każdą porcję 0,5 ml wymagane będzie użycie wielu kolumn odsalających.
    1. Oznaczyć stężenie DNA eluowanego przez absorpcję UV przy λ = 260 nm.
    2. Wysuszyć próżniowo próbkę i rozpuścić ją w odpowiedniej objętości buforu wiążącego. Jeśli nie uzyskano wystarczającej ilości DNA do następnej rundy selekcji, powtórzyć sekcje 4.6-4.9.2.

5. Kolejne rundy selekcji i sekwencjonowania

  1. Należy dostosować rygorystyczność warunków selekcji w zależności od wyników monitorowania wzbogacania (sekcja 4.1). Ogólnie rzecz biorąc, należy zaostrzyć warunki w kolejnych rundach selekcji, aby wybrać spoiwo o najwyższym powinowactwie z puli.
    UWAGA: Może to obejmować kombinację zwiększania stężenia DNA, zwiększania liczby, czasu lub objętości etapów mycia, zmniejszania stężenia docelowego, zwiększania stężenia związku selekcji negatywnej lub wielu innych metod27.
    1. Zastosować odpowiednie kontrole, jeśli jest to właściwe, aby zapewnić specyficzność sekwencji dla cząsteczki docelowej. W tej pracy zastosuj cząsteczkę selekcji negatywnej (progesteron) do układu (Tabela 1), zaczynając od rundy 3 i zwiększając stężenie przez cały czas selekcji. Zaczynając od rundy 11, wstępnie inkubuj pulę DNA przez 30 minut z 10-20 μM progesteronem przed unieruchomieniem na kulkach (przed sekcją 3.7).
    2. Zwiększ długość sondy wychwytującej po zaobserwowaniu maksymalnego wzbogacenia.
  2. Przygotuj końcową pulę (runda 15) i inne pule reprezentujące maksymalnie wzbogacone (runda 13) i minimalnie wzbogacone (runda 6) warunki do sekwencjonowania przez amplifikację PCR z kompatybilnymi starterami i polimerazą o wysokiej wierności.
    1. Ustaw objętość reakcyjną 50 μl, używając końcowych stężeń 1x (bufor reakcyjny), 200 μM (każdy dNTP), 400 nM (każdy starter), 0,5 μl puli DNA i 0,5 μl polimerazy. Optymalizuj cykl dla każdej rundy, wykonując kroki opisane w sekcji 4.5, używając tych samych warunków PCR, z wyjątkiem 7-minutowego przetrzymywania w temperaturze 72 °C dla końcowego przedłużenia.
    2. Wyślij 50 μl przygotowanych pul do zakładu sekwencjonowania w probówkach do mikrowirówek z nakrętkami dokładnie uszczelnionymi folią bez kleju. Umieść probówki w stożkowej tubie o pojemności 15 ml wypełnionej folią bąbelkową i wyślij O/N z wkładami z lodu do zakładu sekwencjonowania.
  3. Określ liczbę kopii każdej sekwencji, aby ocenić wzbogacenie sekwencjonowanych pul.
    1. Użyj kroków zapisu/sortowania kodu (patrz Plik kodu uzupełniającego) dla danych sekwencjonowania nowej generacji w formacie FASTA, aby określić częstotliwość/liczbę kopii każdej sekwencji powtórzonej w danych dla wszystkich pul dostarczonych przez urządzenie do sekwencjonowania:
  4. Analizuj specyficzność i powinowactwo sekwencji numerów o najwyższej kopii. Rodzaj interakcji (białko lub mała cząsteczka), właściwości strukturalne aptameru po związaniu i oczekiwane powinowactwo będą decydować o tym, która metoda jest odpowiednia. Temat ten jest omówiony bardziej szczegółowo w wielu pozycjach bibliograficznych1,28-30.

6. Synteza i detekcja AuNP

  1. Zsyntetyzować AuNP przy użyciu metody redukcji cytrynianu21. Wymieszaj 98 ml wody Millipore z 2 ml 50 mM HAuCl4 i podgrzej do wrzenia.
  2. Dodaj 10 ml 38,8 mM cytrynianu sodu, gdy tylko zacznie się refluks. Kolor zmieni się na czerwony po kilku minutach. Kontynuuj mieszanie roztworu przez 20 minut przy wyłączonym ogniu.
  3. Poczekaj, aż roztwór AuNP ostygnie do temperatury pokojowej, a następnie przefiltruj przez membranę poliestrową 0,2 μm. Przechowywać wszystkie zawiesiny AuNP w ciemnobursztynowej butelce.
  4. Obliczyć stężenie AuNP przez absorpcję UV, stosując współczynnik ekstynkcji 2,4 x 108 L mol-1 cm-1 31. Stężenie w tej pracy wynosiło 10 nM, przy wielkości 17 ± 0,6 nm określonej przez dynamiczne rozpraszanie światła21.
  5. Inkubować DNA z 10 nM AuNP przez 1 godzinę w warunkach otoczenia chronionych folią aluminiową. Zmieniaj objętość AuNP, aby zapewnić wystarczającą ilość roztworu, aby umożliwić wykonanie wszystkich pożądanych testów (~1-2 ml). W tej pracy zbadano gęstości obciążenia wynoszące 73, 120 i 200 D/NP (cząsteczki DNA na AuNP), a objętość i stężenia będą się odpowiednio różnić.
  6. Rozcieńczyć roztwór DNA/AuNP w stosunku 1:1 za pomocą buforu HEPES (20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH = 7,4). Pozwól mieszaninie zrównoważyć się w temperaturze pokojowej przykrytej folią aluminiową.
    UWAGA: Czas potrzebny na ten krok będzie musiał zostać zoptymalizowany przez badacza. W tej pracy badano czasy od kilku minut do O/N.
  7. Przygotować roztwory podstawowe analitu (kortyzolu, kwasu cholowego, 2-metoksynaftalenu) o stężeniu 100 mM w DMSO i przykryć folią aluminiową. Przed każdym doświadczeniem sporządzić świeże roztwory początkowe, rozcieńczając podstawowy materiał do 100 μM w rozcieńczeniu buforu wiążącego kortyzol w stosunku 1:3 (sekcja 2.1). Roztwór początkowy należy następnie rozcieńczyć buforem wiążącym w stężeniu 1:3 w taki sposób, aby dodać stałą objętość (10 μl) tarczy w celu wytworzenia zakresu stężeń.
  8. Zoptymalizuj wymagane stężenie soli, dodając 80 μl roztworu DNA/AuNP z 10 μl buforu wiążącego 1/3 (określanego jako "ślepa próba").
    1. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać różne objętości roztworu NaCl. Zwróć uwagę na objętość soli, która wywołuje ledwo zauważalną wizualnie zmianę w kierunku niebieskiego odcienia po dodaniu soli (13-40 μl 1 M NaCl użytego w tej pracy). Stanowi to dobry punkt wyjścia, ale może wymagać dalszej korekty po uzyskaniu wyników, w tym dodania celu.
  9. Połączyć 80 μl roztworu DNA/AuNP z 10 μl roztworu docelowego i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Użyć 96-dołkowej płytki i pipety wielokanałowej do jednoczesnej analizy wielu docelowych stężeń, zawsze z włączeniem ślepej próby (sekcja 6.8).
    1. Dodać odpowiednią objętość roztworu NaCl (w tej pracy zastosowano 13 μl 1 M NaCl) i natychmiast przeanalizować absorbancję przy 650 i 530 nm za pomocą czytnika płytek.
  10. Wykreślić wyniki jako stosunek wartości absorbancji (E650/E530) do stężenia docelowego znormalizowany w stosunku do pomiaru ślepej próby.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rygorystyczność warunków była początkowo utrzymywana na niskim poziomie, aby zachować cząsteczki wiążące występujące w niskiej liczbie kopii w pierwszych kilku rundach. W pierwszej rundzie zastosowano w szczególności najniższy rygor, aby zachować białka wiążące występujące zazwyczaj jako unikalne sekwencje, co przejawiało się wysokimi stężeniami kortyzolu i DNA oraz brakiem etapów selekcji negatywnej. Sukces tej selekcji aptamerów jest wykazany przez ewolucję pul z niskiego procenta elucji przez cel (runda 2) do wyższej frakcji elucji przez cel, która pozostaje stosunkowo stała w rundach 12-13 (Tabela 1). Taki poziom plateau DNA elucjowanego przez cel jest tradycyjnie punktem końcowym selekcji („wzbogacenia”). Jednak w tej metodzie rygorystyczność selekcji po wzbogaceniu została dodatkowo zwiększona poprzez wydłużenie sondy wychwytującej cDNA (Rycina 1). Wydłużenie tej sondy zwiększa siłę hybrydyzacji pomiędzy cDNA a pulą, co podnosi temperaturę topnienia (Tm) kompleksu i wymaga silniejszej interakcji między celem a sekwencją, aby uwolnić sekwencje wiążące do roztworu. W pierwszej rundzie selekcji zastosowano słabszą interakcję cDNA ze względu na jedną bazę G mniej na końcu 5´ biblioteki. Jest to zgodne z ogólnie niższym rygorem warunków w pierwszej rundzie i nie oczekuje się, aby miało to znaczący wpływ na selekcję, poza umożliwieniem przejścia do następnej rundy większej liczby potencjalnych cząsteczek wiążących, a także sekwencji tła (dehybrydyzacja oparta na termodynamice). Sekwencje tła te były minimalizowane w miarę postępu selekcji w stronę wzbogacenia poprzez stosowanie bardziej rygorystycznych warunków w kolejnych rundach selekcji. Gdy cDNA wydłużono z 7-meru do 8-meru w rundzie 14, procent DNA elucjowanego przez cel spadł z 15,3% do 11,1% przy wzroście Tm z 19,2 °C do 26,7 °C. W rundzie 15 cDNA przedłużono dalej do 9-meru z Tm wynoszącą 31,3 °C, co obniżyło całkowitą ilość elucjowanego materiału do 3,3%.

Dalsze informacje na temat wzbogacenia można uzyskać poprzez sekwencjonowanie kilku pul, zarówno przykładów wzbogaconych, jak i niewzbogaconych, aby śledzić postęp pul w każdej rundzie. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) stało się potężną metodą sekwencjonowania w procesach selekcji, głównie ze względu na uzyskanie większej liczby odczytów sekwencji (całkowita liczba raportowanych sekwencji) w porównaniu z sekwencjonowaniem metodą Sangera. Wyższa liczba odczytów zapewnia większe pokrycie całkowitej liczby sekwencji w puli, dając pełniejszy obraz różnorodności sekwencji. NGS eliminuje również błąd klonowania32 i pozwala na sekwencjonowanie wielu pul w jednej partii dzięki zastosowaniu kodów kreskowych (bar codes)24,33. NGS wykorzystano do analizy postępu wzbogacenia z trzech oddzielnych pul w tej selekcji próbek (Rycina 2). Jako reprezentatywne punkty selekcji wybrano pule z rundy 6 (lekkie wzbogacenie w porównaniu z rundą 2 według % elucji), rundy 13 (najwyższe wzbogacenie) oraz rundy 15 (najwyższa rygorystyczność). Liczby kopii każdej unikalnej sekwencji przedstawiono jako procent całkowitej liczby odczytów sekwencji dla każdej puli. Sekwencja najwyżej sklasyfikowana (o najwyższej liczbie kopii) stanowiła zaledwie 0,1% wszystkich sekwencji w rundzie 6 (łącznie 33 435 sekwencji, 22 463 unikalne sekwencje). W miarę jak pula staje się maksymalnie wzbogacona w rundzie 13, udział najwyżej sklasyfikowanej sekwencji wzrasta do 15,4% całej puli (łącznie 17 681 sekwencji, 2 987 unikalne sekwencje), co jest wartością 150-krotnie wyższą niż w rundzie 6, pomimo jedynie ok. 5-krotnego wzrostu wzbogacenia obserwowanego w UV. W rundzie 15 (łącznie 28 919 odczytów sekwencji, 2 980 unikalne sekwencje) udział pojedynczej, najwyżej sklasyfikowanej sekwencji skoczył do 44,9% wszystkich sekwencji, mimo że monitorowanie wzbogacenia w UV wykazało, iż ilość elucjowana przez cel była ok. 5x niższa niż w rundzie 13 (Tabela 1). Wzbogacenie jest również widoczne w niższym procencie unikalnych sekwencji (od 67% w rundzie 6 do 10% w rundzie 15), w miarę jak pula ewoluuje z wielu do kilku sekwencji o potencjalnym powinowactwie do celu. Dodatkowo, najwyżej sklasyfikowana sekwencja w rundzie 13 (15-3) była sekwencją o trzeciej najwyższej liczbie kopii w rundzie 15 po wydłużeniu cDNA, a sekwencja sklasyfikowana na drugim miejscu w rundzie 13 stała się sekwencją o najwyższej liczbie kopii w rundzie 15 (15-1):

15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT
CACTGCAGACTTGACGAAGCTT

Poprzednie badania analizowały wiązanie tych dwóch sekwencji za pomocą mikrotermeforezy oraz dializy równowagowej24. Wyniki wykazały znaczące wiązanie kortyzolu dla sekwencji 15-1 (Kd = 6.9 ± 2.8 µM w dializie równowagowej; 16.1 ± 0.6 µM w mikrotermeforezie), podczas gdy między kortyzolem a sekwencją 15-3 zaobserwowano minimalne wiązanie. Wskazuje to, że zwiększona długość sondy przechwytującej w 15. rundzie pomogła w zapewnieniu warunków wyższej rygorystyczności w celu wyodrębnienia ligandu o wyższym powinowactwie. Ponadto żadna z sekwencji nie wykazała zauważalnego wiązania z cząsteczką selekcji negatywnej, progesteronem, co dowodzi, że wprowadzenie etapów selekcji negatywnej było korzystne dla procedury.

Fakt, że po zastosowaniu warunków o zwiększonej rygorystyczności w kolejnych rundach selekcji pojawił się ligand o wyższym powinowactwie po maksymalnym wzbogaceniu (określonym tradycyjną metodą analizy procenta DNA elukowanego przez cel), potwierdza zasadność metody wydłużania sondy cDNA do wychwytu po etapie wzbogacenia. Wynik ten pokazuje, że liczba kopii w zsekwencjonowanej puli oraz powinowactwo do celu mogą być powiązane jedynie w określonych warunkach24,34, co stoi w sprzeczności z wcześniejszym doniesieniem sugerującym bezpośrednią korelację35. Podkreśla to również zaletę monitorowania wzbogacenia za pomocą NGS, a nie wyłącznie strategią obliczania % elukowanego, powszechną w większości selekcji, która może naturalnie zmieniać się z rundy na rundę w miarę stosowania warunków o większej rygorystyczności. Niemniej jednak, % elukowanego jest użyteczny do monitorowania wzbogacenia, gdy w kilku rundach stosuje się podobne warunki. Na przykład rundy 6-10 odbywały się w podobnych warunkach, bez istotnej zmiany w stopniu wzbogacenia (Tabela 1). Gdy obserwuje się to przez kilka rund, warunki są prawdopodobnie zbyt rygorystyczne, aby promować wzbogacenie, i badacz powinien zmniejszyć rygorystyczność w następnej rundzie. Przykładowo, stężenie kortyzolu zwiększono z 35 µM do 100 µM w rundach 11-13, a % elukowanego wzrósł z 2,5% w rundzie 10 do 14,5% w rundzie 12. Zatem % elukowanego może służyć jako wytyczna do dostosowywania rygorystyczności w trakcie selekcji, gdy porównuje się podobne warunki między rundami, i może dostarczać informacji uzupełniających do NGS w celu wyznaczenia punktu końcowego selekcji.

Sekwencję 15-1 zastosowano w teście AuNP, aby sprawdzić, czy sekwencja wybrana w sposób mający na celu stworzenie aptameru przełączającego strukturę będzie funkcjonować w teście opierającym się na zmianie strukturalnej po związaniu celu w celu wywołania odpowiedzi. Poprzednie wstępne badania wykazały, że test AuNP z zastosowaniem 15-1 reagował na biomarker stresu, kortyzol, ale nie na dwa inne markery stresu, epinefrynę i norepinefrynę, ani na kwas choliczny, marker choroby wątroby strukturalnie podobny do kortyzolu24. Odpowiedź zaobserwowano w normalnym zakresie wolnego kortyzolu raportowanego w ludzkiej surowicy (~150-600 nM)6, co potwierdziło, że aptamer wybrany pod kątem zmiany strukturalnej po związaniu kortyzolu wywołuje odpowiedź w teście AuNP. W obecnej pracy charakterystyka systemu została rozwinięta poprzez dostosowanie pokrycia (gęstości) 15-1 na powierzchni AuNP. Przy zastosowaniu tego samego zestawu warunków pokrycie DNA zwiększono z 73 D/NP (cząsteczek DNA/AuNP) do 120 D/NP i 200 D/NP (Rysunek 3). Kwas choliczny wywołał minimalną odpowiedź, z wyjątkiem stężenia 10 µM przy 200 D/NP. Odpowiedź testu malała wraz ze wzrostem pokrycia, podobnie jak granice detekcji (LOD). LOD wynosiła 29,5 nM dla 73 D/NP, 145,2 nM dla 120 D/NP i 27,3 µM dla 200 D/NP. Wynik ten jest zgodny z pracą Smith et al., którzy wykazali, że odpowiedź testu AuNP z wykorzystaniem aptameru kokainowego malała, gdy pokrycie aptameru zwiększono z 60 D/NP do 300 D/NP36. Sugeruje to, że zakres detekcji interesującego celu może być dostosowany poprzez optymalizację pokrycia powierzchni DNA w teście AuNP. Mogłoby to być korzystne na przykład przy porównywaniu zakresu wolnego kortyzolu w ludzkiej surowicy (~150-600 nM) i w ludzkiej ślinie (~5-25 nM)6,37. Chociaż płyny fizjologiczne są znacznie bardziej złożone niż ten test buforowy, wyniki stanowią rozszerzenie prac dowodzących zasady działania, wykazując, że warunki AuNP można dostosować w zależności od zastosowania oraz że dalsze prace nad rozszerzeniem medium na płyny biologiczne byłyby interesujące dla środowiska zajmującego się biosensorami.

Proces separacji magnetycznej biblioteki DNA; schemat oczyszczania białek i amplifikacji PCR.
Rycina 1. Przegląd metody selekcji z przełączaniem struktury. Mała biotynowana sonda przechwytująca cDNA jest unieruchomiona na kuleczkach magnetycznych powlekanych streptawidyną. cDNA jest komplementarne do regionu 5´ biblioteki, co powoduje hybrydyzację biblioteki z kuleczkami. Po dodaniu celu następuje zmiana konformacyjna, która uwalnia sekwencje wiążące z kuleczki, umożliwiając frakcjonowanie przy użyciu magnesu. Nadpływ jest zatrzymywany w celu monitorowania wzbogacenia (% DNA eluowanego przez cel) metodą UV po dializie celu z DNA. Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy cząsteczka celu absorbuje w tym samym zakresie UV co DNA. Następnie sekwencje są amplifikowane metodą PCR i przygotowywane do kolejnej rundy selekcji. W miarę postępu selekcji stosowana jest selekcja negatywna, w której sekwencje eluowane przez cząsteczkę selekcji negatywnej są odrzucane, a następnie kuleczki z potencjalnymi binderami celu są inkubowane z celem. Długość sondy cDNA jest zwiększana po osiągnięciu maksymalnego wzbogacenia (% eluowanych), aby zwiększyć rygorystyczność selekcji. Rycina ta została przedrukowana za zgodą24. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Runda[Kortyzol] (µM)[Progesteron] (µM)Związane DNA (pmol)% eluego przez celDługość cDNA
11000357.57N/D7-mer
2500145.491.47-mer
3501188.74N/D7-mer
4505336.42.37-mer
535588.05N/D 7-mer
63510303.893.17-mer
73510255.01N/D 7-mer
83510236.812.17-mer
93510318.952.67-mer
103510297.182.57-mer
1110010147.61N/D7-mer
1210010154.3614.57-mer
1310010150.3915.37-mer
147520247.7111.18-mer
155040409.633.39-mer

Tabela 1. Postęp selekcji i wzbogacenie według % elucji24. Oznaczenie N/A (nie dotyczy) pojawia się przy rundach, w których monitorowanie wzbogacania metodą dializy/UV nie było przeprowadzane w wczesnych etapach selekcji, aby ograniczyć utratę sekwencji o niskiej liczbie kopii. Tabela została przedrukowana za zgodą24.

Wykresy kołowe porównujące rozkład danych w rundach 6, 13, 15; pokazujące procentowy udział w rankingu.
Rysunek 2. Wzbogacenie selekcji określone przez sekwencjonowanie nowej generacji. (A) Runda 6; (B) Runda 13; (C) Runda 15. Sekwencje zostały uszeregowane według liczby kopii. Udział sekwencji o najwyższej liczbie kopii wzrósł z niskiego procentu całej zsekwencjonowanej puli w rundzie 6 (0,1%) do wysokiego procentu w rundzie 15 (44,9%), w miarę jak pula była wzbogacana o sekwencje wiążące kortyzol. Rysunek przedrukowano za zgodą24. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres stosunku absorbancji, przedstawiający A650/530 w funkcji stężenia analitycznego (µM) z paskami błędów.
Rycina 3. Odpowiedź testu AuNP przy zmiennym stopniu pokrycia aptamerem 15-1. Gęstość aptameru inkubowanego z AuNP zwiększano z 73 D/NP (czerwony trójkąt) do 120 D/NP (zielony kwadrat) i 200 D/NP (niebieskie koło). Odpowiedzi na kortyzol zaznaczono ciemnymi kolorami, a odpowiedź na kwas cholowy jasnymi kolorami. Odpowiedź testu dla kortyzolu uległa poprawie przy niższych gęstościach, co obniżyło LOD oraz zakres wykrywalności celu. Warunki zapewniające najwyższą odpowiedź na kortyzol (73 D/NP) zostały dalej scharakteryzowane w zakresie liniowym, aby uzyskać więcej punktów w oczekiwanym normalnym zakresie wolnego kortyzolu raportowanym w surowicy ludzkiej (~150-500 nM) i ślinie (5-25 nM)6,37. Minimalna odpowiedź na kwas cholowy przy zastosowaniu tych samych warunków 73 D/NP została szczegółowo opisana w poprzednich pracach24. Wszystkie wykresy przedstawiają średnią ± SEM dla pomiarów powtórzonych dwukrotnie lub trzykrotnie.

Schemat żelu do elektroforezy, rozdział DNA, porównanie cykli PCR, drabinka z markerami 75 bp i 25 bp.
Rycina 4. Reprezentatywne wyniki optymalizacji cykli PCR. Od lewej do prawej studzienki reprezentują: 4 cykle, 6 cykli, 8 cykli, 10 cykli, 12 cykli, kontrolę negatywną (brak matrycy DNA), standardową drabinkę DNA 25 bp. Optymalne warunki zaobserwowano dla 8 cykli, gdzie pojedynczy prążek produktu wykazuje wysoką intensywność, bez obecności produktów nadmiernej amplifikacji widocznych przy większej liczbie cykli.

Wykres stosunku absorbancji A650/530 w funkcji stężenia analitycznego z wynikami testu kolorymetrycznego.
Rycina 5. Optymalizacja czasu inkubacji w teście AuNP. Czas inkubacji w etapie AuNP/DNA przy 73 D/NP został zredukowany z O/N (Rycina 3) do 30 min, a po inkubacji z celem niezwłocznie dodano sól, zamiast czekać 20 min (Rycina 3). (A) Odpowiedź zaobserwowano dla kortyzolu (niebieskie romby), ale nie dla kwasu cholowego (zielone kółka) ani 2MNP (2-metoksynaftalenu; czerwone kwadraty). Wszystkie wykresy przedstawiają średnią ± SEM dla pomiarów wykonanych w dubletach lub tripletach. (B) Od lewej do prawej: próbka ślepa, 10 µM kortyzolu, 10 µM kwasu cholowego, 10 µM 2MNP. Zmiana wizualna dla kortyzolu jest widoczna gołym okiem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fakt, że małe cząsteczki mają znaczenie biologiczne, ale stanowią tylko 19% wszystkich zgłoszonych aptamerów, sprawia, że metody selekcji aptamerów, które mają zastosowanie do małych cząsteczek, mają ogromne znaczenie. SELEX małych cząsteczek jest szczególnie trudny, ponieważ mniej grup funkcyjnych, motywów strukturalnych i powierzchni jest dostępnych do interakcji z sekwencjami w porównaniu z białkami1 i szacuje się, że mniej niż 30% selekcji dla wszystkich próbowanych celów zakończyło się aptamerem38. Dlatego trzeba być wyjątkowo świadomym projektu i wykonania eksperymentu, aby skutecznie dobrać aptamer do celu małocząsteczkowego.

Opisana w tej pracy metoda selekcji aptamerów jest korzystna, ponieważ ma zastosowanie do małych cząsteczek bez konieczności jakiejkolwiek modyfikacji chemicznej, która może zmienić ich właściwości wiązania. Jest również oparty na elucji, co oznacza, że ponieważ DNA, a nie cel, jest początkowo wiązany, a następnie eluowany z kulek magnetycznych przez cel, DNA oddziałujące z matrycą kulkową nie zostanie amplifikowane w następnej rundzie selekcji, ponieważ spoiwa do cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania są uwalniane do buforu supernatantu, a niespecyficzne spoiwa matrycy pozostają związane. I odwrotnie, metoda selekcji negatywnej względem matrycy jest wymagana w przypadku metod, które unieruchamiają cel do stałego nośnika w każdej rundzie, ponieważ DNA, które oddziałuje z matrycą, zostanie amplifikowane oprócz docelowych spoiw1. Obecna metoda została opracowana jakostrategia ograniczonej selekcji. Oznacza to, że Tm hybrydyzacji cDNA/puli był utrzymywany blisko RT. Morse zastosował podobną strategię, ale zastosował 6-merową sondę cDNA z Tm < 10 °C z warunkami selekcji w temperaturze 4 °C17. Nasz wniosek dotyczył testu biosensorycznego wykonanego w RT, więc długość cDNA została odpowiednio dostosowana. Dzięki temu rygorystyczność selekcji jest na tyle niska, że potencjalne spoiwa nie są tracone, ponieważ docelowa interakcja wiążąca zachodzi w odległym miejscu, które nie wywołuje zmiany konformacyjnej zdolnej do zakłócenia wiązania cDNA. Jednak wydajność partycjonowania proponowanej metody jest niska, ponieważ niektóre sekwencje ulegną dehybrydyzacji wyłącznie w oparciu o termodynamikę. W przeciwieństwie do tego, Nutiu i in. zastosowali 15-merowe cDNA i byli w stanie zidentyfikować aptamery tylko dla dwóch z czterech celów, prawdopodobnie dlatego, że Tm 15-meru było zbyt wysokie, aby umożliwić uwolnienie przez małą cząsteczkę docelową18. W związku z tym, podczas gdy obecna strategia selekcji będzie wymagała wielu rund w celu usunięcia sekwencji tła, kontrolując rygorystyczność selekcji i minimalizując utratę potencjalnych spoiw, prawdopodobieństwo sukcesu zostanie zwiększone.

Wielu badaczy, którzy dopiero zaczynają przygodę z selekcją aptamerów, nie zdaje sobie sprawy z ważnych aspektów związanych z PCR potencjalnych substancji wiążących. Optymalizacja cyklu (sekcja 4.5) jest konieczna, ponieważ nadmierna amplifikacja bibliotek DNA wytwarza niepożądane produkty uboczne (zwykle o większych rozmiarach) przy dużej liczbie cykli, a pożądany produkt może całkowicie zniknąć przy nadmiarze zaledwie 5 cykli39. W przypadku nadmiernej amplifikacji produkty PCR nie reprezentują już tych sekwencji eluowanych przez cel, a szanse na powodzenie selekcji są znacznie zmniejszone. Rysunek 4 ilustruje przykład optymalizacji cyklu z rundy 5 w tej pracy. Najniższy cykl wytwarza minimalne pasmo produktu, pasmo zwiększa się w ciągu 8 cykli; Po 10 cyklach pasmo rozpoczyna przejście do produktu o wyższym rozmiarze z nadmiernym wzmocnieniem i prawie w całości składa się z nadmiernie wzmocnionego produktu w ciągu 12 cykli. Innym szczegółem, który wielu badaczy niedoświadczonych w SELEX może przeoczyć, jest to, że cała pula musi zostać amplifikowana w amplifikacji PCR na dużą skalę (sekcja 4.6) w pierwszej rundzie, aby złagodzić utratę spoiw. Liczba unikalnych sekwencji możliwych z oligonukleotydów wynosi 4N, gdzie 4 oznacza cztery zasady kwasu nukleinowego, a N to liczba zasad w losowym regionie biblioteki. W przypadku tej pracy N = 40, co daje przestrzeń sekwencji 1,2 x 1024 możliwych unikalnych sekwencji. Biblioteka o długości 2,5 nmol użyta w pierwszej rundzie selekcji odpowiada ~1015 cząsteczkom, co oznacza, że każda kopia DNA jest prawdopodobnie reprezentowana w początkowej puli jako unikalna sekwencja. Dlatego cała objętość DNA wymyta z kulek przez cel musi zostać amplifikowana, aby zachować kopię każdego potencjalnego spoiwa do następnej rundy selekcji. Po tym początkowym wzmocnieniu dostępnych jest wiele kopii do wyboru w kolejnych rundach, w których zakłada się jednorodny roztwór do pobierania próbek.

Koncentracja celu powinna być również dokładnie przemyślana w każdej rundzie. Nutiu i wsp. zastosowali docelowe stężenie 1 mM w całym procesie selekcji i wybrali aptamer ATP o Kd = 600 μM18. Zarówno obecne prace, jak i badania Morse'a17 rozpoczęły się od celu 100 μM, zmniejszając się w trakcie selekcji i zaowocowały aptamerami o niskim powinowactwie mikromolowym. Dokładnie to, w której rundzie należy zwiększyć surowość (niższe stężenie docelowe), zależy od tego, kiedy zaobserwowano wzbogacenie. Kolejnym krytycznym krokiem jest zastosowanie odpowiednich etapów selekcji negatywnej, aby aptamery wykazywały swoistość dla cząsteczki docelowej. To, które formanty zostaną użyte, zależy od zamierzonego zastosowania wybranego aptamera. Na przykład aptamer 15-1 został zaprojektowany do działania jako element rozpoznający w teście biosensorycznym kortyzolu, więc progesteron został użyty jako cząsteczka selekcji negatywnej, ponieważ jest metabolicznym prekursorem kortyzolu, który znajduje się w płynach fizjologicznych40. Aptamer ATP wybrany przez Nutiu i wsp. nie zawierał etapu selekcji negatywnej i oddziałuje ze strukturalnie podobnymi cząsteczkami, w tym ADP, AMP, adenozyną i dATP18.

Ostatnią uwagą do rozważenia jest to, że test AuNP często wymaga znacznej optymalizacji dla każdej pary aptamer/cel. Szukanie objętości soli, która wywołuje ledwo zauważalną wizualnie zmianę w kierunku niebieskiego odcienia po dodaniu soli, jest dobrym punktem wyjścia, ale może być konieczne dostosowanie punktu początkowego, aby zaobserwować reakcję. Odkryliśmy również, że test daje drastycznie różne odpowiedzi w zależności od stężenia buforu (bufor selekcyjny może wymagać rozcieńczenia, ponieważ wysokie stężenie soli w często powoduje agregację) i składu, stopnia pokrycia DNA (ryc. 3), przygotowania próbki (niektóre rozpuszczalniki organiczne używane do rozpuszczenia celu mogą powodować wysokie tło, które maskuje odpowiedź celu), temperatura, rodzaj i stężenie soli oraz czas inkubacji (zarówno DNA z AuNP, jak i DNA/AuNP z celem). W pełni zoptymalizowanych warunkach wyniki są zwykle obserwowane przy docelowym czasie inkubacji <5 minut, co pokazuje korzyści płynące z szybkiej odpowiedzi docelowej platformy biosensorycznej AuNP. Na przykład na rysunku 5 czas inkubacji etapu aptamer/AuNP został skrócony z O/N (rysunek 3) do 30 minut, a sól dodano natychmiast (<10 s) po dodaniu celu, a nie 20 minut później (ryc. 3) przy gęstości obciążenia 73 D/NP. Zwiększyło to odpowiedź kortyzolu do ~ 82% wyższej niż ślepa próba (Figura 5A) przy docelowym stężeniu 10 μM w porównaniu z ~ 40% przy poprzednich warunkach (Figura 3). Odpowiedź tę można odróżnić gołym okiem (ryc. 5B). Należy zauważyć, że liniowy zakres wykrywania kortyzolu różni się od poprzednich warunków, co sugeruje, że warunki te można zoptymalizować pod kątem pożądanego zakresu wykrywania. Kontrole kwasu cholowego i 2-metoksynaftalenu (2MNP) nie dały istotnej odpowiedzi (ryc. 5A-B). Naukowcy muszą mieć świadomość, że skrócenie czasu inkubacji może ułatwić zwiększoną reakcję analitów na powierzchnię AuNP, co może przyczynić się do ogólnego wzmocnienia sygnału (docelowego) lub tła (cząsteczki niedocelowe). W związku z tym konieczne jest staranne zaprojektowanie testu AuNP i charakterystyka działania dla każdej pary aptamer/cel.

Procedura ta opisuje protokół wyboru aptamerów przełączających strukturę małych cząsteczek, które działają w platformie biodetekcyjnej, takiej jak opisany test AuNP, które wymagają zmiany konformacyjnej DNA w celu wykrycia obecności celu. Metodę tę można jednak zastosować do innych systemów biosensorów, takich jak elektrochemiczne lub fluorescencyjne, które działają w oparciu o to samo założenie dla praktycznie każdej wielkości obiektu. Moc protokołu może być dalej rozwijana eksperymentalnie za pomocą kilku podejść. Po pierwsze, sama selekcja może być potencjalnie ulepszona poprzez badanie metod optymalizacji, takich jak określenieidealnego TM hybrydyzacji cDNA/biblioteki, która zapewnia interakcję, która jest wystarczająco słaba, aby oddziaływać z celem małej cząsteczki, ale wystarczająco silna, aby zmniejszyć ilość sekwencji tła zdehybrydyzowanych wyłącznie z termodynamiki. Pozwoli to skondensować liczbę cykli wymaganych do selekcji, oszczędzając czas pracy i zmniejszając zużycie odczynników. Dalsze badania nad modyfikacjami selekcji miałyby na celu określenie najkorzystniejszych stężeń kulek i DNA, tak aby zróżnicowana populacja sekwencji była wystawiona na działanie celu, zwłaszcza w początkowej rundzie. Sukces tych eksperymentów potwierdzających słuszność zasady stanowi podstawę do inwestowania dalszych zasobów w optymalizację i dostosowanie testu buforowego AuNP do płynów fizjologicznych. Istnieje uzasadniona potrzeba stworzenia szybkiej, solidnej platformy biosensorycznej, która może funkcjonować jako narzędzie diagnostyczne stanu fizjologicznego danej osoby, a dalszy rozwój testu AuNP w ludzkiej surowicy, pocie lub ślinie wypełniłby tę obecną lukę.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie o dystrybucji A: Zatwierdzone do publicznego rozpowszechniania; dystrybucja jest nieograniczona (88 ABW-2014-4103). Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone, gdy autor (JAM) otrzymał nagrodę National Research Council Research Associateship Award w Laboratoriach Badawczych Sił Powietrznych. Współautor MW był stypendystą Wright Scholar Fellowship wspieranym przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych. Prace te były wspierane przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych, Laboratorium Badawcze Sił Powietrznych oraz Bio-X Strategic Technology Thrust.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dynabeads M280 StreptavidinInvitrogen112.06DKompatybilny z magnesem DynaMag-2
Magnes DynaMag-2Invitrogen12321DKompatybilny z Dynabeads M280 Streptawidyna
Streptawidyna Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-5113-01Jest to produkt o wysokiej gęstości streptawidyny do przygotowania ssDNA
HydrokortyzonSigmaH4001≥ 98%
ProgesteronSigmaP0130≥ 99%
Kwas cholowy SigmaC1129≥ 98%
NanoDrop ND-1000NanoDropND-1000Zastąpiony przez model ND-2000
Tris BasePromegaH5135≥ 99,9%
Chlorek soduSigmaS9888≥ 99,5%
Chlorek magnezu sześciowodnyFluka63068≥ 98%
500 ml System filtracyjnyCorning4307690,22 &mikro; m Membrana octanu celulozy
Biblioteka DNA OperonNiestandardowaHPLC oczyszczona
Wszystkie inneDNA IDTCustomCapture — odsolone; Aptamery —
Termomikser HPLC EppendorfRKażdy model z  regulacją temperatury i prędkości mieszania będzie działał
PfuUltra II Fusion HotStart Polimeraza DNA, 400 rxnAgilent600674Taq polimeraza może być również stosowana
Mieszanka deoksynukleotydów, klasa PCR Agilent200415Będą tu pracować inne marki
10x Sklonowany bufor polimerazy DNA PfuAgilent200532Ten bufor został zoptymalizowany pod kątem polimerazy PfuUltra II
GeneAmp PCR SystemApplied Biosystems9700Każdy model, który pozwala badaczowi otworzyć pokrywę w celu optymalizacji cyklu, będzie działał
Agarose-LEAmbionAM9040≥ 99,9%
Bromek etydynySigmaE-1510Ostra toksyczność, wdychanie; podejrzenie rakotwórczości
Puste kolumny syntezy, 1 i mikro; m Expedite StyleGlen Research20-0021-01Ten model jest idealny ze względu na złączkę Luer-Lok do łączenia ze strzykawką
Filtry zamienne ExpediteGlen Research20-0021-0F1 µ rozmiar m
Illustra NAP-25 KolumnyGE Healthcare17-0852-01Każda marka z kolumną filtracyjną z żelu żywicznego klasy DNA będzie działać
Kaseta do dializy Slide-A-LyzerThermoFisher Scientific662052k MWCO używany
hydrat chlorku złota(III)Sigma25416999,999% czystość jest ważna
Cytrynian sodu dwuwodnySAFCW302600Odkryliśmy, że związek produkowany przez różnych producentów ma duży wpływ na testy AuNP
SpectraMax Urządzenia molekularneM5Wyniki były podobne do systemu Bio-TEK
SynergyBio-TEKHTWyniki były podobne do systemu urządzeń molekularnych
Bufor HEPESAmrescoJ848Każda marka, która wytwarza produkt sterylizowany, będzie działać
250 ml System filtrówCorning4307670,22 i mikro; m Membrana z octanu celulozy
Spektrofotometr UVVarianCary 300 Sprawdzą się tu inne marki
Strzykawka 5 mlBecton-Dickinson309646Ten model jest idealny ze względu na złączkę Luer-Lok do połączenia z kolumną Expedite
ThermoEC Minicell PrimoThermoFisher ScientificEC320Kompatybilny z zasilaczem
Zasilacz Fisher ScientificFB300Kompatybilny z ThermoEC Minicell Primo
Dimethyl SulfoxideSigmaD8418Łatwopalny płynna
2-metoksynaftalenSigma14824599%
Płytka testowaCorning337096-dołkowa płaska denna, sterylna
sondy i startery czystość

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).
  2. Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).
  3. Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress. Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).
  4. Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation. J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).
  5. Kwak, J., et al. Volatile biomarkers from human melanoma cells. J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).
  6. Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System. Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).
  7. Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. Antibody functionalized interdigitated μ-electrode (IDμE) based impedimetric cortisol biosensor. Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).
  8. Kapczinski, F., et al. Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment. Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).
  9. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  10. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  11. Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. Selection of an RNA domain that binds Zn2. RNA. 1 (5), 538-550 (1995).
  12. Liu, J., et al. Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue. PlosOne. 7, e37789(2012).
  13. McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules. Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).
  14. Huang, L., et al. A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine. Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).
  15. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX—A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).
  16. Jayasena, S. D. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics. Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).
  17. Morse, D. P. Direct selection of RNA beacon aptamers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).
  18. Nutiu, R., Li, Y. Structure-Switching Signaling Aptamers. J. Am. Chem. Soc. 125 (16), 4771-4778 (2003).
  19. Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem. Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).
  20. Li, H., Rothberg, L. J. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
  21. Chávez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer–gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).
  22. Hagen, J. A., et al. Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation. Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).
  23. Han, K., Liang, Z., Zhou, N. Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors. Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).
  24. Martin, J. A., Chávez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
  25. Hall, B., et al. Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection. Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).
  26. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  27. Djordjevic, M. SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways. Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).
  28. Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. Targeting RNA with Small Molecules. Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).
  29. Jing, M., Boswer, M. T. A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).
  30. Sachs, E. -F., Diederichsen, U. Binding of Triostin Analogues to DNA. , AN NT008. (2011).
  31. Liu, J., Lu, Y. Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes. Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).
  33. Martin, J. A., et al. Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin. Plos One. 8 (3), e57341(2013).
  34. Schütze, T., et al. Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing. Plos One. 6 (12), e29604(2011).
  35. Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing. Plos One. 6 (5), (2011).
  36. Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
  37. Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -C., Hudgens, G. A. Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).
  38. Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. Plos One. 5 (12), (2010).
  39. Musheev, M. U., Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue. Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).
  40. Wiebe, J. P. Progesterone metabolites in breast cancer. Endocr.-Relat. Cancer. 13 (3), 717-738 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Selekcja za pomoc kulek magnetycznychetapy selekcji negatywnejdetekcja kortyzoluwzbogacanie biblioteki DNAimmobilizacja sond przechwytuj cychprotok amplifikacji PCRkulki pokryte streptawidyndetekcja zmian konformacyjnych

Powiązane artykuły