Diagnoza zakażenia Eimeria u kurcząt pozostaje wymagająca. Podejścia oparte na morfologii pasożytów i patologii żywiciela są zwykle niejednoznaczne, podczas gdy podejścia molekularne oparte na PCR okazały się wymagające pod względem kosztów i wiedzy specjalistycznej. Celem tego protokołu jest ustanowienie amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) jako prostej diagnostyki molekularnej infekcji eimeriana.
Artykuł metodologiczny
Testy amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do specyficznego dla gatunku wykrywania emerii, które infekują kurczaki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pasożyty gatunków Eimeria, pierwotniaki, które powodują chorobę jelit kokcydiozę, stanowią poważne zagrożenie dla produkcji i dobrostanu kurcząt. W przypadku braku skutecznej kontroli kokcydioza kliniczna może być katastrofalna. Oporność na chemoprofilaktykę często stosowaną do zwalczania Eimeria jest powszechna, a subkliniczne zakażenie jest powszechne, wpływając na współczynniki wykorzystania paszy i podatność na inne patogeny, takie jak Clostridium perfringens. Pomimo dostępności narzędzi opartych na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), diagnoza zakażenia Eimeria nadal opiera się prawie wyłącznie na tradycyjnych podejściach, takich jak ocena zmian i morfologia oocyst, ale żadne z nich nie jest proste. Ograniczenia istniejących narzędzi molekularnych obejmują wymóg specjalistycznego sprzętu i trudności w dostępie do DNA jako matrycy. W odpowiedzi opracowano prosty protokół przygotowania terenowego DNA oraz panel specyficznych dla gatunku testów amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) dla siedmiu Eimeria, u których rozpoznano zakażenie kurcząt. Obecnie przedstawiamy szczegółowy protokół opisujący przygotowanie genomowego DNA z tkanki jelitowej pobranej pośmiertnie, a następnie konfigurację i odczyt testów LAMP. LAMP specyficzny dla gatunku Eimeria może być stosowany do monitorowania występowania pasożytów, oceny skuteczności strategii przeciwkokcydiowej w gospodarstwie oraz do diagnozowania subklinicznych infekcji lub chorób klinicznych o szczególnej wartości, gdy nadzór ekspertów jest niedostępny.
Wprowadzenie
Światowa produkcja kurczaków wzrosła dziesięciokrotnie w ciągu ostatnich 50 lat, a w krajach rozwijających się nastąpił prawie czterokrotny wzrost obserwowany w krajach rozwiniętych (www.faostat.org). Wraz ze wzrostem znaczenia produkcji kurczaków dla światowego bezpieczeństwa żywnościowego wzrósł również profil patogenów, które mogą powodować poważne choroby u kurcząt. Jednym z najlepszych przykładów są gatunki Eimeria, wszechobecne pasożytnicze pierwotniaki, które mogą powodować kokcydiozę choroby jelit1. Wszędzie tam, gdzie hodowane są kurczaki, jeden lub więcej gatunków Eimeria może być powszechnych2-4. W krajach rozwiniętych Eimeria są kontrolowane głównie za pomocą chemoprofilaktyki, w której stosuje się programy wahadłowe lub rotacyjne w celu zminimalizowania wpływu oporności5. Szczepionki zawierające żywe drobnoustroje są również stosowane w systemach, w których wartość ptaków jest wystarczająca, aby uzasadnić koszt (np. w przypadku stada hodowlanego, niosek i niektórych brojlerów5). W wyniku tych działań kokcydioza kliniczna jest często dobrze kontrolowana, chociaż częste jest zakażenie subkliniczne5. W krajach rozwijających się szczepienia są rzadkością, a stosowanie leków często jest mniej świadome. W konsekwencji kokcydioza subkliniczna i kliniczna jest bardziej powszechna i wywiera znaczący wpływ ekonomiczny3.
Diagnoza infekcji eimerian tradycyjnie opierała się na pośmiertnej ocenie zmian chorobowych, chociaż nawet autorzy najczęściej używanego systemu punktacji skomentowali, że dla niektórych gatunków "wydaje się wątpliwe, czy taka procedura powinna być podejmowana w przypadku jakichkolwiek innych infekcji poza umiarkowanie ciężkimi"6. Dodatkowe dowody można zebrać poprzez mikroskopowe wykrywanie etapu cyklu życiowego oocysty odpornej na warunki środowiskowe w próbkach kału lub ściółki, chociaż nakładająca się morfologia może zmylić wszystkich oprócz eksperta6,7. Alternatywy molekularne wykorzystujące reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), losową amplifikację polimorficznego DNA PCR (RAPD-PCR) i technologie ilościowego PCR są dostępne od 20 lat8-10, ale do tej pory nie stały się popularne. Względne koszty i zapotrzebowanie na specjalistyczny sprzęt laboratoryjny lub przetwarzanie ograniczyły ich zastosowanie, pomimo często subiektywnego i wymagającego technicznie charakteru starszych podejść opartych na patologii i mikroskopii10,11. Takie ograniczenia mogą być wyolbrzymione w wielu biedniejszych regionach świata, takich jak Azja Południowo-Wschodnia, gdzie wpływ kokcydiozy na ubóstwo może być proporcjonalnie większy12. W odpowiedzi istnieje wyraźne zapotrzebowanie na nowe, proste i czułe, ale opłacalne testy diagnostyczne specyficzne dla gatunku Eimeria.
Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to łatwa do przygotowania technika sterowana polimerazą DNA, która jest w stanie amplifikować duże ilości DNA. Co najważniejsze, LAMP wykorzystuje polimerazę DNA Bst zamiast polimerazy DNA Taq powszechnie stosowanej w PCR, co ułatwia amplifikację DNA w jednej stałej temperaturze bez konieczności cykli termicznych13,14. LAMP może być stosowany nawet w najbardziej prymitywnym laboratorium lub w terenie. Charakteryzujące się względną opornością na wiele inhibitorów PCR, wysoką czułością i swoistością, testy LAMP zostały opracowane dla szerokiego zakresu patogenów, w tym wirusa zakaźnej choroby kaletki maziowej, Clostridium perfringens i Cryptosporidium15-17. W odpowiedzi na zapotrzebowanie na nową, opłacalną diagnostykę specyficzną dla gatunku Eimeria, opracowano panel testów LAMP specyficznych dla każdego z siedmiu gatunków Eimeria, które infekują kurczęta18. Zastosowania nowych testów obejmują monitorowanie występowania pasożytów, co ma szczególne znaczenie ze względu na powiązanie gatunków takich jak Eimeria maxima lub Eimeria necatrix o słabych wynikach ekonomicznych3,4. Inne zastosowania obejmują ocenę skuteczności strategii przeciwkokcydiowej gospodarstwa, diagnostykę subklinicznego zakażenia lub choroby klinicznej oraz ocenę ryzyka, jakie Eimeria stwarza dla gospodarstwa.
Protokół
1. Przygotowanie szablonu
UWAGA: Każdy genomowy szablon DNA, co do którego istnieje podejrzenie, że zawiera DNA pochodzące od jednego z siedmiu gatunków Eimeria, które infekują kurczaki, może być użyty jako szablon do identyfikacji gatunków Eimeria na podstawie LAMP. Próbki tkanki jelitowej do polowej analizy diagnostycznej powinny być pobierane podczas rutynowej sekcji zwłok, jak opisano tutaj.
- Wybierz odcinek (lub odcinki) jelita, które chcesz przebadać. Tabela 1 zawiera wytyczne dotyczące wyboru miejsc pobierania próbek i gatunków Eimeria, których występowanie jest najbardziej prawdopodobne18, a rysunek 1 przedstawia specyficzny dla danego gatunku zakres rozmieszczenia i lokalizację miejsc pobierania próbek.
UWAGA: Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ Eimeria jest w szczególności specyficzna dla miejsca hosta. Każdy gatunek, który zakaża kurczaki, jest definiowany przez region jelitowy, na który jest ukierunkowany19. Na decyzję może mieć wpływ wcześniejsze doświadczenia w gospodarstwie, zainteresowanie jednym lub kilkoma określonymi gatunkami Eimeria lub inne wskaźniki diagnostyczne6. - Za pomocą sterylnych nożyczek lub skalpela należy obciąć 5 cm lub dłuższe odcinki jelita wybrane do badania na obecność Eimeria. Opcjonalnie należy przechowywać próbki do późniejszej analizy w utrwalaczu, takim jak na przykład RNAlater18 lub 95% etanol.
UWAGA: W przypadku przechowywania w etanolu próbkę należy przed użyciem dokładnie umyć w sterylnym buforze kwasu tris-etylenodiaminotetraoctowego (TE). - Przeciąć próbkę wzdłużnie, usunąć większość treści jelitowej (jeśli jest obecna) i zeskrobać komórki z warstwy błony śluzowej za pomocą krawędzi sterylnego szklanego szkiełka mikroskopowego lub ostrza nożyc sterylizowanych etanolem/płomieniem. Opcjonalnie w przypadku próbki zbiorczej należy umieścić komórki ze wszystkich czterech specyficznych dla gatunku miejsc jelitowych w jednej probówce.
- Zeskrobany materiał umieścić w sterylnej 1,5 ml zakręcanej probówce mikrowirówkowej zawierającej 100 μl sterylnego buforu TE zawierającego 10% (w/v) żywicy Chelex 100.
- Potrząsaj energicznie każdą próbką przez 1 minutę. Upewnij się, że nakrętka jest mocno zamknięta, a następnie inkubuj we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut.
- Po ugotowaniu pozostaw każdą próbkę do ostygnięcia w temperaturze otoczenia przez 1-2 minuty.
- Odwirować każdą próbkę za pomocą mikrowirówki na najwyższych obrotach (np. ~10 000 x g) przez 1 minutę.
- Zebrać 2 μl otrzymanego supernatantu, który ma być matrycą w każdym teście LAMP, który ma być przeprowadzony. Opcjonalnie połącz więcej niż jedno miejsce jelitowe w jednej probówce, aby zapewnić test wielomiejscowy.
2. Przygotowanie podkładu Eimeria LAMP (test wstępny)
- Przygotować podkłady Eimeria LAMP odpowiednie na 100 testów:
- Rozpuścić każdy liofilizowany starter Eimeria LAMP, dodając wodę molekularną do stężenia 100 μM (zgodnie ze specyfikacją producenta). Jeśli nie zostanie określony, oblicz wymaganą objętość wody o jakości cząsteczkowej, używając masy fizycznej i cząsteczkowej każdego startera.
- Pobrać pipetą 60 μl wody molekularnej do oddzielnej probówki mikrowirówkowej typu flip-top o pojemności 0,5 ml dla każdego gatunku Eimeria, który ma być oznaczony.
- Dodać do wody startery FIP, BIP, F3, B3, LF i LB specyficzne dla docelowych gatunków Eimeria, korzystając z objętości podanych w tabeli 2, tworząc serię siedmiu specyficznych dla gatunku mieszanek starterów.
- Krótko wymieszaj roztwór podkładu, a następnie pulsuj mikrofuge i zamroź, aż będzie to wymagane.
- Przygotować wzorcową mieszankę reakcji LAMP dla każdego gatunku Eimeria, który ma być oznaczony. Pomnożyć objętości podane w tabeli 3 przez liczbę próbek i dodać trzy do zapasowej próbki do kontroli dodatniej, kontroli ujemnej i pipetowania. Pipetować do probówki do mikrowirówki typu flip-top o pojemności 0,5 lub 1,5 ml.
3. Test LAMPY Eimeria
- Odpipetować 23 μl specyficznej dla gatunku Eimeria polimerazy Bst DNA/mastermix LAMP do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
- Dodać 2 μl matrycy DNA (przygotowanej w sekcji 1), uzyskując końcową objętość reakcyjną 25 μl.
- Dodać 2 μl genomowego DNA specyficznego dla gatunku Eimeria do jednej reakcji (kontrola pozytywna). Dodać 2 μl wody molekularnej do reakcji (kontrola ujemna).
UWAGA: Jeśli genomowe DNA specyficzne dla gatunku nie jest dostępne, zamiast tego można użyć wcześniej dodatniego wyniku testu LAMP lub standardowego produktu PCR. - Inkubować w łaźni wodnej lub bloku grzewczym w temperaturze 62oC przez 30 minut. Opcjonalnie dezaktywować polimerazę DNA Bst przez ogrzewanie do 80oC przez 10 minut, jeśli reakcja nie ma być natychmiast odczytana.
4. Odczyt testu LAMP
- Na zakończenie inkubacji oceń barwę każdej reakcji na oko w świetle wewnętrznym. Wyniki ujemne mają kolor różowy do fioletowego, wyniki pozytywne wydają się błękitne20.
- Opcjonalnie potwierdzić wynik testu LAMP w laboratorium, mieszając 5 μl produktu reakcji LAMP z 1 μl buforu ładującego żel DNA do elektroforezy w żelu agarozowym przy użyciu 2% żelu agarozowego w 1 x buforze Tris/Boran/EDTA (TBE), wstępnie wybarwionego przy użyciu barwienia kwasem nukleinowym (5 μl na 50 ml agarozy). Dodać 5 μl drabinki DNA o wielkości cząsteczkowej 1 Kb do toru 1 żelu, aby umożliwić obliczenie wielkości fragmentu.
Wyniki
Walidacja testu
Podczas walidacji każdy test LAMP specyficzny dla gatunków Eimeria został sprawdzony przy użyciu panelu czystych próbek DNA reprezentujących wszystkie siedem gatunków Eimeria infekujących kurczaki, a także genomowego DNA kurczaka jako kontroli gospodarza. Do rozdzielenia wyników każdego testu wykorzystano elektroforezę w żelu agarozowym, która wykazała absolutną specyficzność gatunkową bez reaktywności krzyżowej z gospodarzem18. Następnie seria dziesięciokrotnych rozcieńczeń szeregowych, przygotowana przy użyciu oczyszczonego genomowego DNA Eimeria tenella, wykazała granicę czułości testu między jedną a dziesięcioma kopiami genomu18. Nie określono górnej granicy, a wyniki dodatnie uzyskano aż do najwyższego stężenia włącznie (100 000 kopii genomu)18.
Zastosowanie w próbkach terenowych
Próbki pobrane do badań w kierunku Eimeria pochodzą najczęściej od kurczaków znalezionych martwych, usuniętych z powodu złego stanu zdrowia lub pobranych w ramach rutynowego nadzoru sanitarnego, co oznacza, że w ramach rutynowych działań wielkość próby wynosi zazwyczaj od jednej do trzech osobników. Badanie trzech ptaków pobranych z amerykańskiej fermy brojlerów w ramach programu nadzoru pozwoliło na uzyskanie trzech zestawów próbek jelitowych. Celowe zastosowanie gatunkowych testów LAMP, z priorytetem dla preferowanych obszarów jelit dla każdego gatunku Eimeria (Tabela 1), umożliwiło wizualną identyfikację infekcji eimeriozą u wszystkich badanych ptaków przy użyciu błękitu hydroksynaftolowego jako wskaźnika (Rysunek 2A). Kolor uzyskany w negatywnej reakcji LAMP przy użyciu błękitu hydroksynaftolowego może mieć odcień od fioletowego do różowego, ale zawsze wyraźnie różni się od koloru niebieskiego uzyskiwanego w wyniku pozytywnym. Potwierdzenie za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym dostarczyło porównywalnych wyników (Rysunek 2B). Podczas zastosowania w warunkach terenowych użytkownik może zdecydować o przeprowadzeniu pełnego screeningu w kierunku wszystkich siedmiu gatunków lub skupić się wyłącznie na gatunkach uznanych za istotne lub znanych z obecności na fermie bądź w okolicy.
Niepowodzenie w ustanowieniu metod opartych na PCR jako diagnostyki występowania Eimeria podkreśla wymóg prostoty w każdym nowym teście. Chociaż LAMP oferuje prostsze przygotowanie i przetwarzanie niż PCR, konieczność badania wielu miejsc w jelitach każdego ptaka pozostaje zniechęcająca. Bardziej atrakcyjne wydaje się prawdopodobnie przygotowanie jednej wspólnej próbki DNA na ptaka, którą następnie można poddać jednemu lub kilku testom LAMP. Przetwarzanie jednej wspólnej próbki na ptaka, reprezentującej materiał pobrany z każdego z określonych miejsc w jelitach opisanych w Tabeli 1 i połączony przed przygotowaniem DNA, w celu przetestowania go wszystkimi siedmioma testami LAMP, dało taki sam wynik, jak w przypadku przetwarzania każdego miejsca w jelitach oddzielnie (Rysunek 2 w porównaniu z Rysunkiem 3).
Rycina 1. Miejsca pobierania próbek z jelit do detekcji metodą LAMP gatunków pasożytów z rodzaju Eimeria infekujących kurczaki. Regiony jelit atakowane przez poszczególne gatunki Eimeria zostały zaznaczone kolorowymi liniami, a preferowane miejsca pobierania próbek wskazano numerem pomiędzy czarnymi liniami przerywanymi (E. acervulina: żółty/1, E. brunetti: różowy/2, E. maxima: niebieski/3, E. mitis: pomarańczowy/4, E. necatrix: czerwony/5, E. praecox: zielony/6 oraz E. tenella: szary/7). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 2. Diagnostyka LAMP infekcji eimeriozowej u trzech komercyjnych kurcząt brojlerów. Reakcje LAMP analizowane przy użyciu (A) błękitu hydroksynaftolowego, gdzie reakcja jasnoniebieska była pozytywna, a reakcja od fioletowej do różowej była negatywna, oraz (B) elektroforezy w żelu agarozowym. Pobrane miejsca z jelit przedstawiono w Tabeli 1 dla każdego gatunku pasożyta. A = E. acervulina, B = E. brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox oraz T = E. tenella. Ścieżka 1 zawierała drabinę DNA GeneRuler 1Kb. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 3. Diagnostyka infekcji eimeriozą metodą LAMP z wykorzystaniem prób połączonych od trzech oddzielnych komercyjnych kurcząt brojlerów. Reakcje LAMP rozdzielone z użyciem błękitu hydroksynaftolowego, gdzie błękitny kolor reakcji oznaczał wynik dodatni, a kolor od fioletowego do różowego oznaczał wynik ujemny. A = E. acervulina, B = E. brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox oraz T = E. tenella. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
| Miejsce pobierania próbek | Eimeria test gatunkowy (najbardziej prawdopodobny) |
| Dwunastnica (D) | *E. acervulina*, *E. praecox* |
| Jejunum/ileum* (jelito czcze/kręte) | E. maxima, E. necatrix |
| Kieka (C) | E. necatrix, E. tenella |
| Końcowy odcinek jelita krętego (TI) | E. brunetti, E. mitis |
| Próba zbiorcza (P) | E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox, E. tenella |
Tabela 1. Wybór testów dla gatunków kandydackich Eimeria specyficzny dla regionu jelit. Wybór regionu do pobrania próbek różni się dla każdego gatunku Eimeria, co zilustrowano na Rysunku 1. Próbki połączone obejmują materiał pobrany ze wszystkich czterech specyficznych miejsc, który następnie został złączony w celu przygotowania DNA.
| Starter* | Stężenie zapasu (µM) | Objętość (µl) |
| Woda | - | 60 |
| Forward Inner Primer (FIP) | 100 | 40 |
| Backward Inner Primer (BIP) | 100 | 40 |
| Forward Outer Primer (F3) | 100 | 10 |
| Backward Outer Primer (B3) | 100 | 10 |
| Loop Forward (LF) | 100 | 20 |
| Loop Backward (LB) | 100 | 20 |
| Suma | 200 |
Tabela 2. Przygotowanie premiksu starterów LAMP. Składniki i proporcje wymagane do przygotowania premiksu starterów do metody LAMP. Podane objętości dotyczą 100 reakcji LAMP. *Tożsamość starterów zgodnie z Materiałami oraz opracowaniem Barkway et al (2011)18.
| Stężenie zapasun | Końcowe stężenie w reakcjin | Objętość na reakcjęµl) | |
| podwójnie destylowana woda | - | - | 10.1 |
| bufor ThermoPol | 10 x | 1 x | 2.5 |
| MgSO₄4 | 100 mM | 2 mM | 0.5 |
| Mieszanina starterów* | Tabela 2 | 2.5 | |
| dNTP | 25 mM | 400 µM | 0.4 |
| Betaina | 5 M | 1 M | 5 |
| Błękit hydroksynaftolowy | 3 mM | 120 µM | 1 |
| Polimeraza DNA Bst | 8 000 U/ml | 8 U | 1 |
| Suma | 23 | ||
Tabela 3. Przygotowanie mastermixu do reakcji LAMP. *Specyficzny dla gatunków Eimeria.
Dyskusja
Testy LAMP specyficzne dla gatunku Eimeria opisane w tym artykule oferują nowy zestaw narzędzi diagnostycznych wspierających skuteczną kontrolę kokcydiów i choroby kokcydiozy. Skutki zakażenia eimerianem mogą obejmować poważne straty ekonomiczne, a także poważnie zagrożony dobrostan ptaków i zwiększoną podatność na kolonizację przez patogeny odzwierzęce21. Możliwości monitorowania stad pod kątem występowania niektórych lub wszystkich gatunków Eimeria mogą stanowić wczesne ostrzeżenie o załamaniu się skuteczności zwalczania przeciwkokcydiowego. Do kluczowych zalet LAMP należy silna swoistość docelowa, wynikająca z wymogu sześciu różnych celów sekwencji DNA, a także wysoka czułość, zwiększona przez włączenie starterów pętlowych13, chociaż jakościowy, a nie ilościowy charakter LAMP można uznać za ograniczenie. Obecnie nie jest możliwe odróżnienie ucieczki pasożyta o niskim poziomie od rutynowej chemioprofilaktyki lub replikacji żywej szczepionki od niekontrolowanej replikacji eimerianu. Niemniej jednak techniczna łatwość protokołu i ostatecznego odczytu oferuje znaczną poprawę w porównaniu z istniejącymi specjalistycznymi i często subiektywnymi podejściami opartymi na patologii i morfologii6,7. Każdy test można wykonać za koszt ~ 0,75 GBP za próbkę, niezależnie od kosztów pracy i konfiguracji sprzętu. W związku z tym testy LAMP są również bardziej opłacalne niż inne metody diagnostyki molekularnej, takie jak PCR, ponieważ wymagają inkubacji izotermicznej bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.
Przez wiele lat dostęp do genomowego DNA Eimeria jako matrycy ograniczał rozwój i zastosowanie diagnostyki pola molekularnego. Oocysta jest najłatwiej dostępną fazą cyklu życiowego eimerii, ale rutynowa ekstrakcja DNA wymaga wyposażenia laboratoryjnego22. Inne, bardziej labilne etapy cyklu życiowego jelit wymagają oczyszczenia przed przygotowaniem DNA, aby zapobiec zahamowaniu PCR i wynikającej z tego utracie wrażliwości23,24. Możliwość ekstrakcji eimerianowego DNA o jakości odpowiedniej dla LAMP przy użyciu sprzętu nie bardziej specjalistycznego niż mikrowirówka i łaźnia wodna, uzupełniona adsorpcją inhibitora przy użyciu żywicy chelex, sprzyja obecnie szerszemu zastosowaniu biologii molekularnej w diagnostyce eimeriańskiej. Co ciekawe, doniesienia o wykryciu ilościowego DNA Eimeria mierzonego PCR w tkance jelitowej 20 dni po rozpoczęciu infekcji pasożytem, 11 dni po ostatnim wykrywalnym wyprowadzeniu oocysty, rodzi sugestię, że LAMP może być stosowany do wykrywania rozwiązanej ekspozycji na pasożyty, jak również trwającej infekcji, nawet po ustąpieniu wszelkich widocznych zmian25.
Stosunkowo niski koszt i niskie wymagania techniczne diagnostyki LAMP Eimeria mogą sprzyjać ich zastosowaniu w krajach rozwijających się, gdzie inne, bardziej ugruntowane podejścia mogą być niedostępne lub nieodpowiednie. Aby miało to zastosowanie, każdy test musi być w stanie wykryć wszystkie szczepy, które mogą krążyć w każdym regionie. Chociaż wiedza na temat różnorodności genetycznej dominującej wśród gatunków Eimeria jest ograniczona26, zastosowanie sekwencji docelowych wcześniej zatwierdzonych do stosowania w ilościowym PCR ze szczepami z Afryki, Azji, Europy i Ameryki Południowej dostarcza pewnych dowodów na ochronę, wspierając użyteczność tych testów LAMP na całym świecie10.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Praca wykonana w tym badaniu była częściowo wspierana przez Royal Veterinary College poprzez fundusz studenckich projektów badawczych, a także przez Radę Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych oraz Departament Rozwoju Międzynarodowego (numer grantu BB/H009337/2). Rękopis ten został opatrzony przez RVC PPB_00795 referencyjnym.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RNAlater | Ambion | AM7024 | |
| Etanol | VWR Chemicals | 20821.321 | Uwaga, wysoce łatwopalny |
| 100 x koncentrat buforowy Tris-EDTA (TE) | Żywica Sigma-Aldrich | T9285 | |
| Chelex 100 | Bio-Rad | 142-1253 | |
| Woda molekularna | Invitrogen | 10977035 | |
| E. acervulina F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCTAACATTTCGCTTCACGGAC |
| E. acervulina B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ATGAGCAAGTGGAACACCTTG |
| E. acervulina FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT |
| E. acervulina BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG |
| E. acervulina LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TAAGGTTACACCCGTGGAGG |
| E. acervulina LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCATGCACAAAGCGACTT |
| E. brunetti F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GGCCATCAAGTTCCATGAGC |
| E. brunetti B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TCAACCTCCTGAGTGTGGTT |
| E. brunetti FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | * GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT |
| E. brunetti BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTCTC |
| E. brunetti LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAACGCTCGAACATGGC |
| E. brunetti LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CTTCTCCACAGACCCAGAGGT |
| E. maxima F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | * ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT |
| E. maxima B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG |
| E. maxima FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG |
| E. maxima BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA |
| E. maxima LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | * CAAGCCTACGCGGACATC |
| E. maxima LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TTATGCAGCTGGGTCAACG |
| E. mitis F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ACGATAGCCAAGACACGTAAGG |
| E. mitis B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA |
| E. mitis FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT |
| E. mitis BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG |
| E. mitis LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TCCATGCATCCCCTTGTT |
| E. mitis LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGTGGGCACAGATTGATTC |
| E. necatrix F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TGGCTTTCCCGCGTACC |
| E. necatrix B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGGCCCAACACAAAGACTG |
| E. necatrix FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA |
| E. necatrix BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC |
| E. necatrix LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTCTGTAACTTGGGACGTTGT |
| E. necatrix LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAACAGCCGGAGCCTCTC |
| E. praecox F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT |
| E. praecox B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCGCACGAATCTGAATCACAC |
| E. praecox FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG |
| E. praecox BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT |
| E. praecox LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAATAGCATTGCCAGGTGG |
| E. praecox | LF Sigma-Aldrich | VC00021*GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC | |
| E. tenella F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTTGTGAAGGTCAGCGTG |
| E. tenella B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | * GCTGAGTCCATACGTACTTCCT |
| E. tenella FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT |
| E. tenella BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT |
| E. tenella LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCATGTGCAGTTGAAGACA |
| E. tenella LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCAAATGTATCTGCTAGTTATA TTAACAAG |
| 10 x bufor reakcyjny ThermoPol | New England Biolabs | B9004S | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| dNTPs | Promega | U1330 | |
| Roztwór betainy (5 M) | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Polimeraza Bst | New England Biolabs | M0275S | |
| w wodzie molekularnej. | |||
| UltraPure | agaroza Invitrogen | 16500-500 | |
| 10 x Bufor Tris/Boran/EDTA (TBE) | Invitrogen | AM9863 | |
| Niebiesko-pomarańczowy barwnik ładujący DNA (x6) | Promega | G1881 | |
| GeneRuler 1Kb drabinka DNA | Thermo Scientific | SM0313 | |
| SafeView barwnik kwasów nukleinowych | NBS Biologicals | NBS-SV |
Bibliografia
- Chapman, H. D., et al. A selective review of advances in coccidiosis research. Adv Parasitol. 83, 93-171 (2013).
- Shirley, M. W., Smith, A. L., Tomley, F. M. The biology of avian Eimeria with an emphasis on their control by vaccination. Adv Parasitol. 60, 285-330 (2005).
- Fornace, K. M., et al. Occurrence of Eimeria species parasites on small-scale commercial chicken farms in Africa and indication of economic profitability. PLoS ONE. 8 (12), e84254(2013).
- Schwarz, R. S., Jenkins, M. C., Klopp, S., Miska, K. B. Genomic analysis of Eimeria spp. populations in relation to performance levels of broiler chicken farms in Arkansas and North Carolina. J Parasitol. 95 (4), 871-880 (2009).
- Peek, H. W., Landman, W. J. Coccidiosis in poultry: anticoccidial products, vaccines and other prevention strategies. Vet Q. 31 (3), 143-161 (2011).
- Johnson, J., Reid, W. M. Anticoccidial drugs: lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chickens. Exp Parasitol. 28 (1), 30-36 (1970).
- Haug, A., Gjevre, A. G., Skjerve, E., Kaldhusdal, M. A survey of the economic impact of subclinical Eimeria infections in broiler chickens in Norway. Avian Pathol. 37 (3), 333-341 (2008).
- Procunier, J., Fernando, M., Barta, J. Species and strain differentiation of Eimeria spp. of the domestic fowl using DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers. Parasitology Research. 79 (2), 98-102 (1993).
- Schnitzler, B. E., Thebo, P. L., Mattsson, J. G., Tomley, F. M., Shirley, M. W. Development of a diagnostic PCR assay for the detection and discrimination of four pathogenic Eimeria species of the chicken. Avian Pathol. 27 (5), 490-497 (1998).
- Vrba, V., Blake, D. P., Poplstein, M. Quantitative real-time PCR assays for detection and quantification of all seven Eimeria species that infect the chicken. Vet Parasitol. 174 (3-4), 183-190 (2010).
- Morris, G. M., Gasser, R. B. Biotechnological advances in the diagnosis of avian coccidiosis and the analysis of genetic variation in Eimeria. Biotechnol Adv. 24 (6), 590-603 (2006).
- Perry, B., Randolph, T., McDermott, J., Sones, K., Thornton, P. Investing in animal health research to alleviate poverty. , ILRI (International Livestock Research Institute). Nairobi, Kenya. (2002).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers). Mol Cell Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), E63(2000).
- Kaneko, I., et al. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples by using molecular methods. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7526-7532 (2011).
- Karanis, P., et al. Development and preliminary evaluation of a loop-mediated isothermal amplification procedure for sensitive detection of cryptosporidium oocysts in fecal and water samples. Appl Environ Microbiol. 73 (17), 5660-5662 (2007).
- Xue, C., et al. Rapid detection of Infectious bursal disease virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. J Vet Diagn Invest. 21 (6), 841-843 (2009).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. BMC Vet Res. 7 (1), 67(2011).
- Long, P., Joyner, L., Millard, B., Norton, C. A guide to laboratory techniques used in the study and diagnosis of avian coccidiosis. Folia Veterinaria Latina. 6 (3), 201-217 (1976).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. BioTechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Arakawa, A., Baba, E., Fukata, T. Eimeria tenella infection enhances Salmonella typhimurium infection in chickens. Poult Sci. 60 (10), 2203-2209 (1981).
- Blake, D. P., Smith, A. L., Shirley, M. W. Amplified fragment length polymorphism analyses of Eimeria spp.: an improved process for genetic studies of recombinant parasites. Parasitol Res. 90 (6), 473-475 (2003).
- Lund, M., Nordentoft, S., Pedersen, K., Madsen, M. Detection of Campylobacter spp. in chicken fecal samples by real-time PCR. J Clin Microbiol. 42 (11), 5125-5132 (2004).
- Raj, G. D., et al. Real-time PCR-based quantification of Eimeria genomes: a method to outweigh underestimation of genome numbers due to PCR inhibition. Avian Pathol. 42 (4), 304-308 (2013).
- Blake, D. P., Hesketh, P., Archer, A., Shirley, M. W., Smith, A. L. Eimeria maxima: the influence of host genotype on parasite reproduction as revealed by quantitative real-time PCR. Int J Parasitol. 36 (1), 97-105 (2006).
- Beck, H. P., et al. Molecular approaches to diversity of populations of apicomplexan parasites. Int J Parasitol. 39 (2), 175-189 (2009).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie