Model uszkodzenia przewodu tętnicy udowej myszy w restenozie jest technicznie wymagający. W tym protokole pokazujemy kluczowe szczegóły techniczne niezbędne do skutecznego wykonania urazu drutu w celu wywołania spójnej neointimy do badań restenozy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysi model restenozy tętniczej: techniczne aspekty uszkodzenia drutu udowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroba sercowo-naczyniowa spowodowana miażdżycą jest główną przyczyną zgonów w krajach rozwiniętych. Zwężenie światła naczynia, spowodowane rozwojem blaszki miażdżycowej lub pęknięciem powstałych blaszek miażdżycowych, przerywa normalny przepływ krwi, prowadząc do różnych chorób, takich jak zawał mięśnia sercowego i udar mózgu. W klinice powszechnie wykonuje się zabiegi wewnątrznaczyniowe, takie jak angioplastyka, w celu ponownego otwarcia światła. Jednak zabiegi te nieuchronnie uszkadzają ścianę naczynia, a także śródbłonek naczyń krwionośnych, wywołując nadmierną reakcję gojenia i rozwój płytki neowewnętrznej, która rozciąga się do światła, powodując restenozę naczynia (ponowne zwężenie). Retenoza pozostaje główną przyczyną niepowodzeń wewnątrznaczyniowego leczenia miażdżycy. W związku z tym przedkliniczne modele zwierzęce restenozy są niezwykle ważne dla badania mechanizmów patofizjologicznych, a także podejść translacyjnych do interwencji naczyniowych. Spośród kilku mysich modeli eksperymentalnych, uszkodzenie drutu tętnicy udowej jest powszechnie akceptowane jako najbardziej odpowiednie do badań restenozy po angioplastyce, ponieważ bardzo przypomina procedurę angioplastyki, która uszkadza zarówno śródbłonek, jak i ścianę naczynia. Jednak wielu badaczy ma trudności z wykorzystaniem tego modelu ze względu na jego wysoki stopień trudności technicznej. Dzieje się tak przede wszystkim dlatego, że metalowy drut musi zostać wprowadzony do tętnicy udowej, która jest około trzy razy cieńsza niż drut, aby wytworzyć wystarczający uraz, aby wywołać wydatną neointimę. W tym miejscu opisujemy podstawowe szczegóły chirurgiczne, aby skutecznie przezwyciężyć główne trudności techniczne tego modelu. Postępując zgodnie z przedstawionymi procedurami, wykonanie urazu drutu tętnicy udowej myszy staje się łatwiejsze. Po zapoznaniu się z nią całą procedurę można wykonać w ciągu 20 minut.
Wprowadzenie
W erze rozszerzonego zastosowania leczenia wewnątrznaczyniowego w różnych chorobach sercowo-naczyniowych, restenoza po angioplastyce jest jednym z głównych problemów dla pacjentów poddawanych takim zabiegom. Uszkodzenie śródbłonka naczyń krwionośnych w czasie angioplastyki, w połączeniu z tłem miażdżycowym, indukuje nadmierną proliferację komórek mięśni gładkich w warstwie przyśrodkowej, powodując przerost neointimali. 1,2 Realny model zwierzęcy, który podsumowuje przerost neointimy po angioplastyce, jest zatem ważny nie tylko dla badania mechanizmów choroby, ale także dla opracowania skutecznych metod leczenia tej patologii.
Myszy stanowią doskonały model zwierzęcia do rekapitulacji przerostu neointymalnego z następujących powodów: genetyczne podłoże myszy eksperymentalnych jest dobrze znane; dostępna jest szeroka gama genetycznie modyfikowanych szczepów; 2 Uzyskanie rodzeństwa z miotu o tym samym pochodzeniu jest łatwe; A koszt zwierząt jest stosunkowo niski. Model podwiązania tętnic i model uszkodzenia drutu to dwa najczęstsze mysie modele mechanicznie indukowanego przerostu neointimalnego. Model podwiązania tętnic jest łatwy do stworzenia, ale fizjologicznie różni się od rzeczywistego zabiegu angioplastyki. Model uszkodzenia drutu ściśle naśladuje rzeczywiste zabiegi angioplastyki, ale jest technicznie trudny ze względu na mały rozmiar tętnic myszy. 2,3 Sata i wsp. jako pierwsi opisali metodę uszkodzenia drutu w tętnicach udowych myszy w oparciu o anatomiczną strukturę naczyń krwionośnych i zastosowanie elastycznego drutu o odpowiedniej wielkości. Wykorzystując tę technikę, udało im się w powtarzalny sposób wywołać przerost neointimal u różnych szczepów myszy. 4
Chociaż uraz drutu udowego jest dobrze znanym modelem, niektóre techniczne aspekty tej techniki są bardzo trudne w porównaniu z innymi modelami, takimi jak podwiązanie. 5 Celem tego artykułu jest szczegółowe opisanie naszych procedur leczenia urazów za pomocą mysiego drutu, który jest zmodyfikowaną wersją oryginalnej metody Sata. Wprowadziliśmy dwie główne modyfikacje: 1) Zapętlenie tylko tętnic i 2) Brak stosowania lidokainy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury są zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (National Academies Press, wydanie 8, 2011) oraz protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Wisconsin. Wszystkie operacje wykonywano w znieczuleniu izofluranem (poprzez inhalację, szybkość przepływu 2 ml/min) i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie. Zwierzęta zostały poddane eutanazji w komorze stopniowo napełnianej CO2 .
1. Indukcja znieczulenia ogólnego i nacięcie skóry
- Należy użyć samców myszy C57BL/6 w wieku 12–16 tygodni i wadze 23–28 g. Znieczulenie zwierzęcia izofluranem za pomocą aparatu znieczulającego o zamkniętym obwodzie. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, szczypiąc go w palec u nogi. Nałóż maść na oczy ze sztucznymi łzami, aby zapobiec wysuszeniu.
- Umieść mysz w pozycji leżącej z lekko odwodzoną lewą tylną kończyną i lekko zgiętym stawem kolanowym. Ogol włosy w okolicy lewej górnej części uda i zdezynfekuj skórę chlorheksydyną, nałożoną trzykrotnie za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką. Użyj gorącego sterylizatora kulek, aby narzędzia były wysterylizowane podczas operacji.
- Umieść wysterylizowaną serwetę z gazy na lewej nodze. Wykonaj proste, podłużne nacięcie skóry o długości 1,5 cm na lewym przyśrodkowym udzie od stawu kolanowego do pachwiny (ryc. 1A).
2. Odsłonięcie tętnicy udowej i gałęzi
UWAGA: Rysunek 1B pokazuje ogólną anatomię układu krwionośnego w górnej części uda. Tętnicę udową powierzchowną (SFA) można obserwować pod mikroskopem preparacyjnym, gdy nacięcie skóry jest prawidłowo wykonane wzdłuż linii środkowej przyśrodkowego uda.
- Otwórz cienką powięź pokrywającą SFA za pomocą cienkiej pęsety, a następnie zapętl SFA nylonowym szwem 9-0.
UWAGA: W tym procesie nerw udowy można łatwo odłożyć na bok, ale sąsiednia żyła udowa wymaga szczególnej uwagi, ponieważ jej ściana jest tak cienka, że łatwo ulega perforacji i krwawieniu. Kluczową techniką jest skupienie się na samej tętnicy; Dopóki rozwarstwienie jest przeprowadzane w pobliżu tętnicy, można uniknąć przypadkowego uszkodzenia żyły. - Po zapętleniu SFA przytrzymaj szew kleszczami do komarów i pociągnij go lekko w dół. Ten manewr ułatwia dalszą sekcję, ale aby uniknąć uszkodzenia tętnicy, nie ciągnij zbyt mocno.
- Kontynuuj preparowanie tętnicy proksymalnie, aby odsłonić i zapętlić wspólną tętnicę udową (CFA) za pomocą nylonowego szwu 9-0.
UWAGA: Zwykle zapętlenie CFA w punkcie dystalnym do tętnicy nadbrzusza (ryc. 1B) wystarcza do wprowadzenia drutu. W ten sam sposób trzymaj pętlę do szwów CFA za pomocą kleszczyków do komarów. - Pociągnij pętlę szwów CFA do góry, a pętlę do szwów SFA w dół, aby odsłonić rozwidlenie SFA i głębokiej tętnicy udowej (DFA). DFA, główna gałąź CFA, idzie w kierunku mięśnia uda (ryc. 1B).
UWAGA: Przewód zostanie później włożony z DFA. - Zapętl DFA ze szczególną ostrożnością, ponieważ sąsiednia żyła jest splątana pod tętnicą. W przypadku krwawienia z żyły, prosty ucisk gazą trwający od 30 do 60 sekund jest zwykle wystarczający do wytworzenia hemostazy.
- Po zapętleniu DFA nylonowym szwem 9-0 upewnij się, że wszystkie trzy pętle szwów są we właściwych pozycjach (Rysunek 2A).
- Kontynuuj dystalną sekcję DFA, aby podwiązać tętnicę w punkcie jak najdalej od rozwidlenia. Wytnij dodatkowy szew, ale pozostaw pewną długość, aby oba końce można było przytrzymać za pomocą kleszczyków do komarów, które stabilizują DFA, ułatwiając wprowadzenie drutu.
3. Tworzenie uszkodzenia drutu
- Włóż przewód przez DFA
- Odcedź szwy CFA, SFA i DFA, aby ustalić tymczasowy hemostat.
- Zrób mały otwór w DFA za pomocą mikronożyczek. Włóż końcówki zakrzywionej mikropęsety, aby rozszerzyć otwór wystarczająco duży, aby zmieścił się w nim drut o średnicy 0,015 cala (rysunek 2B pokazuje różnicę wielkości między tętnicą a drutem).
- Przed wykonaniem otworu w DFA poluzuj pętlę szwów CFA i delikatnie zaciśnij/ściśnij DFA kilka razy za pomocą pęsety z końcówką. Ten manewr znacznie rozszerza średnicę tętnicy, aby ułatwić wprowadzanie drutu. Dokładne zwilżenie drutu za pomocą PBS jest również ważne dla płynnego włożenia.
- Robiąc otwór w DFA, nie przycinaj ściany tętnicy, ale wykonaj mały szczypiec w kształcie litery V i ściśnij klapkę mikropęsetą z ostrą końcówką w celu manipulacji.
- Przełóż drut przez odpowiednio rozszerzony otwór w DFA. Delikatnie przesuń drut w kierunku tętnicy biodrowej, jednocześnie poluzowując pętlę szwów wokół CFA. W większości przypadków wystarczy 5–8 mm, aby pokryć całą długość CFA (rysunek 2C). Nie wkładaj drutu na siłę, ponieważ perforacja tętnicy zwykle powoduje utratę myszy. Skrócenie drutu do długości około 15 mm pomaga w obsłudze.
- Pozostaw drut w środku na 1 minutę
- Po włożeniu drutu na optymalną długość pozostaw go na 1 minutę, aby nadmiernie rozciągnąć ścianę tętnicy. Zwilż drut i tętnice PBS, aby zapobiec wysuszeniu. Kolejny nylonowy szew 9-0 można umieścić wokół DFA proksymalnie do punktu wprowadzenia drutu w tym czasie oczekiwania. Ten szew zostanie później użyty do zamknięcia otworu w DFA po usunięciu drutu.
- Odzyskaj drut i wznów przepływ krwi
- Przytrzymaj drut kleszczami do kaniulacji naczyń i delikatnie pociągnij go do tyłu; drut powinien być płynnie wyjęty. Aby przezwyciężyć wszelki opór, zwykle spowodowany przyleganiem drutu do ściany tętnicy, pomocne jest odciągnięcie drutu z delikatnym obrotem. Ponownie, silny manewr może spowodować utratę zwierząt.
- Po wyjęciu drutu, podwiązać DFA w miejscu rozwidlenia za pomocą nylonowego szwu 9-0. Nie należy podwiązywać zbyt blisko rozwidlenia, ponieważ mogłoby to zagrozić odpływowi krwi do SFA.
- Poluzuj pętle szwów SFA i CFA, aby wznowić normalny przepływ krwi. Należy pamiętać, że CFA jest dobrze rozszerzony przez wprowadzenie drutu (rysunek 2D).
4. Zamykanie skóry i pielęgnacja pooperacyjna
- Kontroluj spady. Drobne sączenie można zatrzymać za pomocą prostej kompresji; Niektóre poważne krwawienia tętnicze będą wymagały szwów z nylonowym szwem 11-0. Te zszyte tętnice ostatecznie doprowadzą do niedrożności tętnic.
- Zamknij ranę skóry zszywaczami do skóry (zwykle 3–4 zszywkami). Utrzymuj obszar rany wysterylizowany, stosując roztwór chirurgiczny z chlorheksydyną.
- Stosuj zabiegi pooperacyjne. Kontroluj ból myszy za pomocą podskórnych wstrzyknięć buprenorfiny. Trzymaj mysz na podkładce rozgrzewającej, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek. Trzymaj go w czystej klatce bez towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Cztery tygodnie po operacji pobierz uszkodzoną drutem tętnicę udową i przygotuj preparat w bloku parafiny w celu analizy formowania się neointimy. Wprowadź zwierzę w znieczulenie ogólne zgodnie z powyższym opisem. Natychmiast otwórz klatkę piersiową i wprowadź igłę motylkową o rozmiarze 20G do lewej komory serca. Podłącz linię do butelki z infuzją. Przeprowadź perfuzyjną fiksację via kroplową infuzję PBS, a następnie 4 % paraformaldehydu (zazwyczaj po 10–20 ml każdego z roztworów). Butelkę z infuzją umieść około...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Procedura uszkodzenia drutu ma zastosowanie do wszystkich szczepów myszy, o ile ich struktury anatomiczne są podobne. 4 W tym artykule użyliśmy samców myszy C57BL/6 w wieku 12–16 tygodni. Jak dowiedzieliśmy się z naszych wstępnych badań, tętnice udowe myszy w wieku poniżej 10 tygodni są często tak małe, że wprowadzenie drutu jest dość trudne. Z drugiej strony, wprowadzenie drutu u myszy starszych niż 16 tygodni jest technicznie łatwiejsze, ale zwykle powoduje bardziej zmienny przerost neointhemal. Samice myszy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Wisconsin Partnership Program New Investigator Award (ID 2832), National Heart, Lung, Blood Institute R01 Grant (HL-068673) oraz Grant szkoleniowy T32 (HL-110853). Dziękujemy grupie dr Meliny Kibbe z Northwestern University za dostarczenie pomocnych informacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stała prowadnica drutu rdzeniowego | Cook | G02426 | Średnica 0,015 cala, proste |
| kleszcze dylatacyjne | Roboz | RS-4927 | Zakrzywione, końcówki |
| Pęsety Dumont #5 | World Precision Instruments | 14095 | Proste, ostre końcówki |
| Kleszcze do kaniulacji naczyń Dumont | World Precision Instruments | 503373 | |
| Nożyczki McPherson-Vannas | World Precision Instruments | 501234 | |
| Szczypce do komarów | Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Szew 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterylny 11-0, 70 mikrometrów, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Jednorazowa skóra Zszywacz | 3M | DS-25 |
Bibliografia
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
- Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
