Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52565

⸱

18 marca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Division, King's College London BHF Centre

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Streszczenie

Budowa przewodów naczyniowych jest podstawową strategią chirurgicznej naprawy uszkodzonych i uszkodzonych naczyń krwionośnych wynikających z chorób sercowo-naczyniowych. Obecny protokół przedstawia skuteczną i powtarzalną strategię, w której funkcjonalne przeszczepy naczyń krwionośnych inżynierii tkankowej mogą być generowane przy użyciu częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) z ludzkich fibroblastów. Zaprojektowaliśmy bezkomórkowy bioreaktor rusztowania naczyń krwionośnych, który ściśle naśladuje strukturę białka macierzy i przepływ krwi, który istnieje w natywnym naczyniu, do wysiewu komórek śródbłonka PiPSC lub komórek mięśni gładkich przed wszczepieniem myszom. Wykazano, że podejście to jest korzystne, ponieważ myszy z niedoborem odporności, którym wszczepiono przeszczepy pochodzące z PiPSC, wykazywały znacznie zwiększony wskaźnik przeżycia 3 tygodnie po operacji. Protokół ten stanowi cenne narzędzie dla medycyny regeneracyjnej, inżynierii tkankowej i potencjalnie specyficznej dla pacjenta terapii komórkowej w najbliższej przyszłości.

Wprowadzenie

Budowa kanałów naczyniowych jest podstawową strategią chirurgicznej naprawy uszkodzonych i uszkodzonych naczyń krwionośnych wynikających z chorób sercowo-naczyniowych. Do tej pory materiały do przeszczepów stosowane w chirurgii obejmują biokompatybilne polimery syntetyczne (politetrafluoroetylen [teflon], spieniony politetrafluoroetylen [ePTFE; Gore-Tex] lub politereftalan etylenu [Dacron]), przeszczepy allogeniczne, tkanka autologiczna (osierdzie lub żyła odpiszczelowa) i ksenoprzeszczepy1. Chociaż najczęściej stosowane są sztuczne przeszczepy (np. Gore-Tex i Dacron), materiały te prawdopodobnie powodują liczne krótko- i długoterminowe powikłania, w tym zwężenie, odkładanie się wapnia, zakrzepliwą embolizację i infekcje. Chociaż u pacjentów z przeszczepami biologicznymi obserwuje się zmniejszone zdarzenia zakrzepowo-zatorowe, nadal napotykają ograniczenia, takie jak wtórne niepowodzenie przeszczepu i skrócona trwałość z powodu degradacji zwapnienia2. Dlatego, pomimo znacznego postępu w technikach chirurgicznych na przestrzeni lat, badacze i klinicyści nadal są obciążeni potrzebą zidentyfikowania idealnego przewodu dla chorób naczyniowych. Niedawno w dziedzinie inżynierii tkanki naczyniowej opracowano koncepcję, w której komórki są włączane do biodegradowalnych rusztowań, w celu stworzenia środowiska biomimetycznego, które uosabia funkcjonalne naczynie do udanego szczepienia1. Zasadniczo, sukces konstruktów naczyniowych zależy od trzech podstawowych elementów; Komórki, które składają się na rusztowanie, tj. wewnętrzną warstwę komórek śródbłonka i warstwę komórek mięśni gładkich, rusztowanie zawierające odpowiednią macierz zewnątrzkomórkową zapewniającą właściwości mechaniczne porównywalne z natywnym unaczynieniem oraz sygnalizację molekularną/komórkową, która jest wymagana do zainicjowania/regulacji naprawy.

Długoterminowa drożność przeszczepów i trwały rozwój tkanek nowotworowych są wysoce zależne od skutecznego zasiewania komórek na rusztowaniach, co sprawia, że decyzja o typie komórki ma kluczowe znaczenie. Kilka doniesień wskazuje na wykorzystanie dojrzałych komórek śródbłonka i mięśni gładkich z różnych źródeł do opracowania przewodów o małej średnicy3-6. Choć obiecująca, brak wystarczającej ilości naczyń autologicznych do uzyskania dojrzałych komórek śródbłonka i mięśni gładkich pozostaje znacznym obciążeniem. Ostatnio komórki macierzyste z różnych źródeł zostały wykorzystane do zastosowań w inżynierii tkanek naczyniowych. Rzeczywiście, różne typy komórek macierzystych, w tym embrionalne komórki macierzyste7, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC)8,9, PiPSC10,11, komórki jednojądrzaste pochodzące ze szpiku kostnego12, mezenchymalne komórki macierzyste13, komórki progenitorowe śródbłonka i antygen komórek macierzystych pochodzących ze ściany naczynia dorosłego-1 (Sca-1) + komórki macierzyste/progenitorowe14,15 wykazano, że wszystkie są zdolne do różnicowania się w funkcjonalne komórki śródbłonka lub mięśni gładkich w odpowiedzi na określone pożywki i warunki hodowli. Co więcej, nieograniczona zdolność komórek macierzystych do samoodnawiania się czyni je lepszymi kandydatami, w przeciwieństwie do dojrzałych komórek śródbłonka i mięśni gładkich, które mogą dzielić się tylko skończoną liczbę razy, zanim ulegną zatrzymaniu wzrostu i starzeniu się.

Wybór materiału na rusztowanie do wytworzenia udanego naczynia do szczepienia zależy od kilku czynników, takich jak biokompatybilność, właściwości biomechaniczne i szybkość biodegradacji. Zasadniczo materiały używane do tworzenia rusztowań dla przeszczepów powinny być biodegradowalne i nie będą generować niepotrzebnych odpowiedzi immunologicznych biorcy. Dodatkowo musi obejmować odpowiednią porowatość i mikrostrukturę do przyczepiania komórek i późniejszego przetrwania. Do tej pory najczęstszymi materiałami stosowanymi do rusztowań w inżynierii tkanek naczyniowych są polimery kwasu poliglikolowego, kwasu polimlekowego i poli ε-kaprolaktonu16. Ostatnio z pewnym powodzeniem zastosowano również bezkomórkowe materiały biologiczne. Kilka laboratoriów wykazało, że wysiewanie bezkomórkowych naczyń ludzkich, kłów lub świń komórkami autologicznymi zapewniło przeszczep biologiczny, który był odporny na krzepnięcie i przerost błony wewnętrznej17-19. Inne strategie w inżynierii tkanki naczyniowej obejmują przeszczepy naczyniowe oparte na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej, np. Wysiewanie komórek w żelu fibrynowym13 i generowanie arkuszy komórkowych bez podparcia rusztowania20, 21.

Obecny protokół demonstruje różnicowanie ludzkich PiPSC na funkcjonalne komórki śródbłonka i mięśni gładkich, generowanie bioreaktora składającego się z bezkomórkowego rusztowania naczyniowego do przechowywania funkcjonalnych komórek naczyniowych pochodzących z PiPSC, oraz szczepienie naczyń inżynierii tkankowej myszom z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID). PiPSC są optymalnym typem komórek do wykorzystania w inżynierii tkankowej przeszczepów naczyń, ponieważ komórki te nie tworzą guzów u myszy ani nie wywołują odpowiedzi etycznych i alloimmunologicznych. Ponadto wykazaliśmy, że strategia generowania komórek śródbłonka PiPS i komórek mięśni gładkich PiPS jest wydajna i powtarzalna10,11. Następnie zaprojektowaliśmy bezkomórkowe naczynie do wysiewu komórek naczyniowych pochodzących z PiPSC, aby ściśle naśladować białka macierzy istniejące w natywnym naczyniu, zwiększając w ten sposób skuteczność szczepienia i przeżycia. Ponadto decelularyzacja naczyń krwionośnych przed wysiewem PiPSC zapobiega występowaniu reakcji zapalnych wywoływanych przez typy komórek odpornościowych, takie jak makrofagi. Co ważniejsze, protokół ten nie tylko stanowi metodologię generowania obiecujących kanałów naczyniowych do translacji na ludzi, ale także dostarcza cennych środków do badania i zrozumienia mechanizmów molekularnych, które rządzą regeneracją tkanki naczyniowej za pomocą modeli mysich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przeprowadzać wszystkie doświadczenia na zwierzętach zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi.

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych

  1. Przygotuj pożywkę hodowlaną dla ludzkiej linii komórkowej fibroblastów CCL-153: Pożywka F-12K, 10% płodowa surowica bydlęca (FBS) oraz 100 U/ml penicyliny i streptomycyny.
  2. Przygotuj pożywkę do przeprogramowania do generowania PiPSC: zmodyfikowana pożywka orła Knockout Dulbecco (DMEM) zawierająca 20% zamiennik surowicy nokautującej, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 0,1 mM minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) aminokwasów endogennych, 10 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów 2 (bFGF-2) oraz 100 U / ml penicyliny i streptomycyny. Dodawaj bFGF-2 na świeżo za każdym razem przed użyciem podłoża.
  3. Wytwarzaj pożywki różnicujące (DM) w celu indukcji różnicowania komórek mięśni gładkich (SMC): pożywki α-MEM zawierające 10% FBS, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 100 U / ml penicyliny i streptomycyny oraz 25 ng / ml płytkowego czynnika wzrostu (PDGF-ββ).
  4. Wykonaj pożywkę różnicującą śródbłonek (EC-DM) w celu wywołania różnicowania komórek śródbłonka (EC): pożywki wzrostu śródbłonka-2 (EGM-2) zawierające 50 ng / ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) oraz 100 U / ml penicyliny i streptomycyny.

2. Przeprogramowanie ludzkich fibroblastów na częściowo indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (PiPSC)

  1. Hodowla ludzkiej linii komórkowej fibroblastów CCL-153 na 0,04% kolbach pokrytych roztworem żelatyny w pożywce hodowlanej.
  2. Pasaż komórek co 3 dni w stosunku 1:6. Użyj komórek przed pasażem 9, aby uzyskać optymalną wydajność wytwarzania PiPSC. Komórki są gotowe do transfekcji po osiągnięciu 80 - 90% konfluencji.
  3. Linearyzuje policistroniczny plazmid pCAG2LMKOSimO zawierający 4 czynniki przeprogramowujące: czynnik transkrypcyjny wiążący oktamery 4 (OCT4), SOX2, czynnik podobny do Kruppela 4 (KLF4) i C-MYC (pCAG-OSKM). Trawić 5 μg plazmidu za pomocą 5 jednostek enzymu restrykcyjnego PvuI przez 3 godziny w temperaturze 37 °C. Oczyść plazmid za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z protokołem producenta.
  4. Transfekcja 2 x 106 ludzkich fibroblastów za pomocą 4 μg zlinearyzowanego plazmidu pCAG-OSKM za pomocą elektroporacji za pomocą zestawu do nukleofekcji ludzkiego fibroblastu skórnego (NHDF) zgodnie z protokołem producenta. Delikatnie wysiewać transfekowane komórki na wstępnie pokrytej żelatyną kolbie T25 o sile 0,04% zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanego podłoża do przeprogramowywania.
  5. Po 24 godzinach zmień pożywkę na suplementy 25 μg/ml neomycyny, aby wybrać czystą populację transfekowanych komórek.
  6. Zmieniaj podłoże co drugi dzień do 4,
    Uwaga: Ludzkie fibroblasty stają się PiPSC po 4 dniach przeprogramowania.

3. Różnicowanie PiPSC na komórki śródbłonka i mięśni gładkich

  1. Nasiona PiPSC na wstępnie powlekanych naczyniach kolagenowych zawierających DM przez 4 dni w celu wywołania różnicowania w SMC. Zmieniaj podłoże co drugi dzień aż do 4 dnia.
  2. Nasiona PiPSC na wstępnie powlekanych naczyniach kolagenowych zawierających śródbłonek-DM przez 6 dni w celu wywołania różnicowania w komórki śródbłonka. Zmieniaj podłoże co drugi dzień aż do 6 dnia.

4. Przygotowanie przeszczepu aorty bez komórek

Uwaga: Wszystkie roztwory i sprzęt powinny być sterylne.

  1. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy i unieruchamiaj mysz w pozycji leżącej pod mikroskopem preparacyjnym.
  2. Przeciąć mostek i okolice klatki piersiowej, aby otworzyć klatkę piersiową. Usuń serce, płuca i przełyk, aby odsłonić aortę. Delikatnie usuń tłuszcz wokół aorty za pomocą kleszczy.
  3. Odetnij aortę od przedniego końca nożyczkami i delikatnie przytrzymaj koniec kleszczami. Odłącz aortę od kolumny kręgosłupa z tyłu przez rozwarstwienie. Ostrożnie zamknij wszystkie rozgałęziające się tętnice od aorty poprzez podwiązanie bipolarnym elektrokoagulatorem i przecięcie nożyczkami od drugiego końca podwiązania.
  4. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml przepłukać światło aorty 3 ml roztworu soli fizjologicznej zawierającego 100 j. heparyny, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów krwi.
  5. Przetnij tylny koniec aorty, zanim rozgałęzi się do nerki. Zachowanie integralności aorty jest bardzo ważne podczas całego zabiegu.
  6. Przepłukać światło aorty 5 ml 0,075% roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS) rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  7. Namocz aortę piersiową w 0,075% roztworze SDS na 10 cm szalce Petriego. Umieść szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej na 2 godziny przy 150 obr./min przy natężeniu obrotów.
  8. Przepłukać światło aorty 5 ml PBS.
  9. Namocz aortę w PBS na 10 cm szalce Petriego. Umieść szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej na 2 godziny przy 150 obr./min przy RT. Odświeżaj PBS co 20 minut.
  10. Przepłukać światło aorty 5 ml PBS.
  11. Pozbawiony komórek przeszczep aorty należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.

5. Podwójne rozsiewanie PiPSC i kondycjonowanie bioreaktora

Uwaga: Wszystkie roztwory i sprzęt powinny być sterylne. Wszystkie operacje należy wykonywać w kapturze do hodowli tkankowych.

  1. Zmontuj obwód przepływu bioreaktora, jak pokazano na rysunku 1. Podłączyć komorę inkubacyjną, zbiornik mediów, pompę perystaltyczną i komorę zgodności za pomocą przewodów. Minimalna objętość podłoża potrzebna do krążenia wynosi 40 ml.
  2. Wstępnie kondycjonuj naczynie pozbawione komórek pożywką hodowlaną, mocząc aortę w pożywce DM na 10-centymetrowej szalce Petriego. Umieść szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej na 1 godzinę przy 50 obr./min przy natężeniu prądu.
  3. Włóż nylonowe rurki o długości 1 cm (średnica zewnętrzna 0,9 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm) do obu końców naczynia bezkomórkowego pod mikroskopem. Zwiąż naczynie i rurki za pomocą 8-0 szwy jedwabne.
  4. Zamontuj zdecelularyzowany przeszczep aorty w komorze inkubacyjnej, łącząc rurki nylonowe z portami wlotowymi i wylotowymi (rurka 1/32") ze ściany komory. Utrzymywać komorę inkubacyjną z 5 ml pożywki za każdym razem.
  5. Trypsynizuj PiPSC, dodając wstępnie podgrzaną trypsynę, aby przykryć naczynie hodowlane i delikatnie kołysz naczynie 10 razy. Wyrzuć trypsynę i pozostaw naczynie w inkubatorze na 2 - 3 minuty. Dodaj podgrzaną pożywkę hodowlaną do naczynia i wymieszaj pożywkę z komórkami.
  6. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Odwirować dwie porcje zawiesin komórkowych zawierających 5 x10 po 5 komórek każda przez 5 minut przy 300 x g. Całkowicie odessać supernatant.
  7. Po całkowitym odessaniu supernatantu ponownie zawiesić 1 osad z granulek komórek PiPS w 50 μl s.m. Wstrzyknąć tę zawiesinę komórek do światła naczynia pozbawionego komórek.
  8. Następnie ponownie zawiesić drugą osadkę komórek PiPS w 100 μl Matrigel. Ostrożnie pipetować mieszaninę na bezkomórkowy przeszczep aorty.
  9. Odczekaj 10 - 15 minut, aż mieszanina zmieni się w stan żelowy i równomiernie owinie się wokół zewnętrznej powierzchni naczynia. Napełnij komorę inkubacyjną DM.
  10. Umieścić całe ustawienie bioreaktora w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Ręcznie obracać przeszczep pozbawiony komórek o 90° wokół osi podłużnej co pół godziny w ciągu pierwszych 2 godzin.
  11. Utrzymuj hodowlę statyczną przez 12 godzin, aby umożliwić adhezję komórek.
  12. Dostarczaj DM przez światło przez pompę perystaltyczną, aby indukować różnicowanie komórek mięśni gładkich. Rozpocznij początkowe natężenie przepływu od 5 ml/min i stopniowo zwiększaj do 20 ml/min w ciągu 24 godzin.
  13. Utrzymuj natężenie przepływu czynnika krążącego na poziomie 20 ml/min przez 24 godziny.
  14. Zatrzymaj przepływ medium i wyjmij ustawienie bioreaktora z inkubatora.
  15. Ponownie zasiej światło przeszczepu za pomocą PiPSC. Trypsynizować, liczyć i odwirować 1 x 106 PiPSC, jak w krokach 5.5 - 5.6. Zawiesić komórki w 50 μl pożywki EGM-2 zawierającej 50 ng/ml VEGF. Wstrzyknąć mieszaninę komórek do światła przeszczepu.
  16. Zmienić pożywkę w komorze inkubacyjnej i całym krążeniu na pożywkę EGM-2 zawierającą 50 ng/ml VEGF w celu wywołania różnicowania śródbłonka.
  17. Przenieś ustawienie bioreaktora z powrotem do inkubatora. Ręcznie obracaj przeszczep o 90° co 30 minut przez pierwsze 2 godziny, a następnie utrzymuj posiew statyczny przez 12 godzin.
  18. Rozpocznij przepływ w obiegu od 5 ml/min i stopniowo zwiększaj do 35 ml/min. Utrzymuj przepływ na poziomie 35 ml/min przez 5 dni. Zmieniaj pożywkę krążącą i komorową co drugi dzień.
  19. Zbierz zmodyfikowany przeszczep do dalszego szczepienia myszy.

6. Szczepienie podwójnie nasiennego szczepu PiPSC myszom

  1. Użyj NOD. Samce myszy CB17-Prkdcscid/NcrCrl jako biorcy przeszczepu naczyniowego. Zawsze upewnij się, że myszy mają około 10 tygodni, ważą około 25 - 35 g i są w dobrym stanie zdrowotnym.
  2. Znieczulić mysz biorcy, podając kombinację Hypnorm (25 mg/kg) i Hypnovel (25 mg/kg) dootrzewnowo. Nałóż maść okulistyczną wazeliny na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Potwierdź skuteczne znieczulenie, upewniając się, że myszy mają rozluźnione mięśnie i oddychają równomiernie.
    1. Ustaw mysz w pozycji leżącej na plecach z ogoloną i wyprostowaną szyją. Podawać siarczan atropiny (1,7 mg/kg) w połączeniu ze środkami znieczulającymi, aby zapewnić, że drogi oddechowe myszy pozostaną czyste.
  3. Przygotuj nacięcie w linii środkowej od żuchwy do mostka myszy. Pod mikroskopem preparacyjnym z 5- do 10-krotnym wzmocnieniem unieś prawe gruczoły ślinowe na boki i usuń prawy mięsień obojczykowy, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną wspólną.
  4. Delikatnie usuń przyczepione tkanki, aby zmobilizować prawą tętnicę szyjną wspólną od dystalnego końca w kierunku bliższego końca. Podwiązaj środkową część tętnicy szyjnej wspólnej dwukrotnie za pomocą 8-0 Jedwab zszyj i rozkrój między dwoma krawatami.
  5. Przełóż przez mankiet wykonany z autoklawowalnej nylonowej rurki na każdym końcu naczynia i przymocuj każdy koniec za pomocą zacisków do mikrohemostatu.
  6. Zdejmij opaskę szwową z jednego końca i nałóż kroplę heparyny (100 j./ml). Natychmiast po tym odwróć dystalny koniec tętnicy, aby pokryć cały korpus mankietu i umocuj odwrócone naczynie za pomocą 8-0 jedwabny szew do mankietu.
    1. Powtórz tę samą procedurę dla drugiej części tętnicy. Przepłucz tętnicę roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć skrzepy krwi.
  7. Wszczepić przeszczep naczynia pozbawionego komórek między dwoma końcami tętnicy szyjnej, przesuwając pozbawione komórek końce naczynia nad mankietami tętnic i mocując je za pomocą 8-0 szwy jedwabne. Usuń zaciski naczyniowe z obu końców przed oceną pulsacji przeszczepu.
  8. Ustaw prawy gruczoł ślinowy z powrotem w jego pierwotnej pozycji. Zamknij skórę w miejscu chirurgicznym za pomocą przerwanego szwu za pomocą szwu poliglaktynowego 6-0.
  9. Konsekwentnie obserwuj parametry życiowe myszy po zakończeniu zabiegu, aż do odzyskania przytomności. Uśmierc myszy biorcy przez zwichnięcie szyjki macicy i przeszczepy naczyń do pobrania 24 godziny lub 3 tygodnie później w celu dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślną generację PiPSC potwierdzono 4 dni po nukleofekcji fibroblastów ludzkich zlinearyzowanym plazmidem pCAG2LMKOSimO niosącym 4 czynniki transkrypcyjne: OCT4, SOX2, KLF4 oraz c-MYC (OSKM). PiPSC wykazywały wyraźnie odmienny fenotyp w porównaniu z fibroblastami (Ryc. 2A) i wykazywały ekspresję 4 czynników przeprogramowania na poziomie mRNA (Ryc. 2B) oraz białka (Ryc. 2C)10. Skuteczność przeszczepu naczyniowego opartego na PiPSC w wysokim stopniu zależy od ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecny protokół wskazuje na solidną, szybką, prostą, wydajną i powtarzalną strategię, w której funkcjonalne naczynia inżynierii tkankowej mogą być generowane przy użyciu PiPSC z ludzkich fibroblastów. Technika ta stanowi cenne narzędzie dla medycyny regeneracyjnej, inżynierii tkankowej i potencjalnie specyficznej dla pacjenta terapii komórkowej w najbliższej przyszłości. Kluczowe kroki w celu zapewnienia skuteczności protokołu obejmują przygotowanie PiPSC, przygotowanie sterylnych i w pełni pozbawionych komórek przeszcze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez The British Heart Foundation i The Oak Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ludzkie fibroblasty CCL-153ATCCCCL-153Prenatalne ludzkie fibroblasty embrionalne
ATCC F-12K Pożywka (modyfikacja Kaighna pożywki F-12 Hama)ATCC30-2004
Surowica bydlęcapłodu ATCC30-2020
Pożywka Knockout DMEM zoptymalizowana pod kątem embrionalnych komórek macierzystychTechnologie życia (Gibco)12660-012
Technologie zastępowania żywotności w surowicy nokautującej(Invitrogen)10828-028
Human Basic FGF-2 Miltenyi Biotech130-093-837
alfa-MEM mediumTechnologie życia (Invitrogen)32571093
Ludzki PDGFR& D System120-HD-001
Roztwór żelatyny 2%SigmaG1393
Plazmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)Addgene20866
  Enzym restrykcyjny PvuINew England BiolabsRO150S
SureClean PlusBiolineBIO-37047
Zestaw Nucelofekcji (zestaw NHDF)LONZAVPD-1001
NeomycynaSIGMAG418
KL 1500 LCD, oświetlenie do mikroskopii stereoskopowejSCHOTTKL 1500 LCDOświetlenie światłem zimnym do mikroskopii stereoskopowej
Mikroskop sterograficzny Nikon Zoom SMZ800NikonSMZ800
Sól sodowa heparynySigmaH3393
10% roztwór podstawowy SDS Odczynnik do biologii molekularnejSevern BiotechCAS 151-21-3
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigmaD8537
Matrigel (10 mg / ml)BDA6661
Wytrząsarka IKA Vibrax z platformą wibracyjną VX 7 Jepson Bolton's, Janke& KunkelS32-102
Masterflex L/S Cyfrowy napęd pompyCole-ParmerWZ-07523-80
Masterflex L/S 6-kanałowa, 6-rolkowa głowica pompy z wkłademCole-ParmerEW-07519-15
Masterflex L/S duże wkłady do głowicy pompyCole-ParmerEW-07519-75
Rurka silikonowa Masterflex utwardzana platyną, L/S 14, 25 ftCole-Parmer WZ-96410-14Rurka przechodzi przez pompę perystaltyczną
0,5 mm ID, 0,8 mm OD Rurki silikonoweSILEXN/ARurki łączą komorę inkubacyjną, zbiornik mediów i komorę zgodności 
Reduktor mocujący 0,5 do 1,6, naturalny polipropylineIbidi10829Adapter łączy powyżej dwa typy
wężyków Rurka 1/32", ID 0,01" (250µ m) Materiał: PEEKLabSmithT-132-010PRurka przez ścianę komory inkubacyjnej, która łączy przeszczep z rurką zewnętrzną
Złączki jednoczęściowe LabSmithT-132-100Zamocuj powyższe rurki przez ściankę komory inkubacyjnej
Rurki nylonowe (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm) Rurki Smiths MedicalN/Awkładane są do dwóch końców przeszczepu aorty
NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl myszCharles River
Nici chirurgiczne, 8-0  jedwabETHICONW819
HypnormVetapharmVm21757/4000Neuroleptanalgezik do stosowania u myszy
Hypnovel (Midazolam)Roche59467-70-8Indukcja znieczulenia
Mikroskop preparacyjnyCarl ZeissRurka nylonowa Stemi 2000
Portex LTD800/200/100/200o średnicy 0,65 mm i długości 1 mm; do wykonania mankietu tętniczego
ElektrokoagulatorMartin SN 54.131Podwiązanie gałęzi tętnic na aorcie
Bipolarne kleszcze mikrohemostatoweMartin80-91-12-04Mocowanie końców naczyń
Rozszerzacz naczyniaS& TJFX-7
Rozszerzacz naczyniaS& TJFL-3dZ
Rozszerzacz naczyniaS& TD-5aZ
Mini aplikator AESCULAPFE572K
Mikro klipsy hemostatyczneAESCULAPFE720K
Nici chirurgiczne, 6-0VICRYL ETHICONV489

Bibliografia

  1. Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
  2. Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
  3. Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
  4. Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. Tissue engineering of blood vessel. J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).
  5. Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
  6. Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
  7. Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118(2014).
  8. Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
  9. Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
  10. Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
  11. Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
  12. Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
  13. Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
  14. Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
  15. Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
  16. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
  17. Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2(2013).
  18. Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
  19. Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
  20. Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
  21. Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
  22. Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
  23. Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
  24. Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
  25. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
  26. McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
  27. Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

cz ciowo indukowane pluripotencjalne kom rki macierzystedecelularyzowane przeszczepy aortyobw d przep ywowy bioreaktoratechnika podw jnego zasiewuprocedura przeszczepiania u myszyr nicowanie r db onka i mi ni g adkichterapia chor b uk adu sercowo naczyniowegopodej cie medycyny regeneracyjnejmodel myszy z niedoborem odporno ci
Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.