Artykuł metodologiczny

Analiza autofagii u Penicillium chrysogenum przy użyciu podkładek głodowych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52577

⸱

1 lutego 2015

1LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF), Senckenberg Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Wygodna i skuteczna metoda badania autofagii u Penicillium chrysogenum za pomocą podkładek głodowych (mieszaniny agarozy i wody z kranu w szkiełku mikroskopowym zawierającym centralną jamę) jest przedstawiona tutaj.

Streszczenie

Badanie systemów kontroli jakości sieci komórkowych stało się bardzo dynamiczną i istotną dziedziną współczesnych badań. Stało się jasne, że komórki posiadają kilka linii obrony przed uszkodzeniem biologicznie istotnych cząsteczek, takich jak kwasy nukleinowe, lipidy i białka. Oprócz dynamiki organelli (fuzja/rozszczepienie/ruchliwość/dziedziczenie) i ściśle kontrolowanej aktywności proteazy, degradacja nadmiarowych, uszkodzonych lub uszkodzonych organelli przez autofagię (komórkowe "samozjadanie") spotkała się z dużym zainteresowaniem społeczności naukowej. Regulacja autofagii jest dość złożona i zależy od czynników genetycznych i środowiskowych, z których wiele nie zostało do tej pory wyjaśnionych. Tutaj przedstawiono nowatorską metodę, która pozwala na wygodne badanie autofagii w grzybie nitkowatym Penicillium chrysogenum. Opiera się na wzroście grzyba na tak zwanych "poduszkach głodowych" w celu stymulacji autofagii w powtarzalny sposób. Próbki są bezpośrednio oznaczane za pomocą mikroskopii i oceniane pod kątem indukcji / postępu autofagii. Przedstawiony tutaj protokół nie jest ograniczony do stosowania z P. chrysogenum i może być łatwo dostosowany do stosowania u innych grzybów strzępkowych.

Wprowadzenie

Grzyby strzępkowe są doskonałymi systemami modelowymi do badania procesów rozwojowych. Oferują one szereg korzyści eksperymentalnych, takich jak tania uprawa, duża liczba potomstwa i dostępność genetyczna. Ten ostatni punkt ma szczególne znaczenie dla konstrukcji transformantów, które pozwalają na zbadanie znaczenia dotychczas niescharakteryzowanych genów dla różnych mechanizmów komórkowych. Grzyby strzępkowe odegrały zasadniczą rolę w wyjaśnieniu kilku elementów i mechanizmów komórkowych szlaków kontroli jakości, takich jak aktywność proteazy w degradacji nieprawidłowych białek, dynamika mitochondriów w celu utrzymania integralności mitochondriów i autofagia w celu usunięcia nadmiaru i/lub dysfunkcyjnych składników komórek oraz w utrzymaniu żywotności komórek w czasach głodu1,2,3.

Istnieje kilka eksperymentalnych technik dostępnych do badania autofagii u grzybów strzępkowych 2: (i) badanie wakuoli, jeśli zawierają gęste ciała autofagiczne, gdy proteazy są hamowane przez transmisyjną mikroskopię elektronową 4, (ii) wizualizacja autofagosomów poprzez monitorowanie ognisk GFP-Atg8 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej 5,6 oraz (iii) wykrywanie zakwaszonych struktur autofagosomalnych za pomocą barwnika fluorescencyjnego monodansyl kadaweryna 7.

Tutaj prezentowana jest nowatorska metoda uprawy Penicillium chrysogenum do badań nad autofagią. Głównym elementem jest "podkładka głodowa", która składa się po prostu z 1% agarozy rozpuszczonej w wysterylizowanej wodzie z kranu. Dodatkowe związki (np. stresory, zmiatacze, modulatory autofagii) można dodawać do podkładki, o ile nie wykazują one autofluorescencji. Podkładka znajduje się w szkiełkach mikroskopowych, które zawierają płytką wgłębienie centralne. Ta podkładka jest zaszczepiana albo zawiesiną zarodników, albo małymi fragmentami grzybni. To ostatnie jest wskazane, jeśli szczep będący przedmiotem zainteresowania nie jest w stanie efektywnie zarodnikować (np. Δatg1 szczepy 8). Szkiełka są umieszczane w mokrych komorach (można je łatwo zbudować, używając pustych pojemników na końcówki do pipet), aby zapobiec wysuszeniu próbki i są inkubowane w temperaturze pokojowej. W tych warunkach P. chrysogenum jest w stanie rosnąć przez kilka dni. Autofagię można zaobserwować mikroskopowo poprzez powiększenie wakuolowe, które jest dodatnim markerem autofagii grzybów. W tym artykule wykorzystano szczep P. chrysogenum (Wisconsin 54-1255), który tworzy zielone białko fluorescencyjne, które jest skierowane do peroksysomów przez jego C-końcową sekwencję "SKL" 9. Dzięki temu możliwe jest monitorowanie degradacji peroksysomów. Możliwe jest również znakowanie innych przedziałów komórki (np. mitochondriów) za pomocą odpowiednich sygnałów lokalizacyjnych i analizowania ich degradacji. Chociaż przedstawiono tu dane z P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL), z pewnością możliwe jest zastosowanie metody "podkładki głodowej" również w odniesieniu do innych grzybów strzępkowych (np. Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus itp.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie P. chrysogenum do eksperymentów z głodem

  1. Jeśli szczep P. chrysogenum będący przedmiotem zainteresowania jest trzymany na ryżu ("zielony ryż"), umieść 2-3 ziarna ryżu pokryte grzybnią zarodnikującą w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Napełnij go 500 μl YGG (10 g/l KCl, 20 g/l glukozy, 10 g/l drożdżowej bazy azotowej, 5 g/l K2HPO4, 20 g/l ekstraktu drożdżowego).
    1. Obracaj probówkę przez 30 sekund, aby zarodniki mogły skutecznie oderwać się od ryżu.
    2. Inkubować probówkę przez 1 dzień w temperaturze pokojowej (np. między 20 a 25 °C).
    3. Przygotować rozcieńczenie 1:50 tej zawiesiny zarodników w sterylnej wodzie z kranu, dobrze wymieszać.
  2. Jeśli interesujący szczep P. chrysogenum jest trzymany na płytce agarowej (np. na płytce agarowej YGG), przenieś małe kawałki grzybni do 1,5 ml probówki do mikrowirówki zawierającej 400 μl sterylnej wody z kranu i około 100 mg szklanych kulek za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety.
    1. Wirować probówkę przez 2 minuty, aby grzybnia uległa rozdrobnieniu. Zawartość tubki należy natychmiast zużyć.

2. Etapy przygotowawcze do uprawy P. chrysogenum na polach głodowych

  1. Włączyć płytę grzewczą i ustawić ją na około 60 °C.
  2. Rozpuść 2 g agarozy w 100 ml wody z kranu, gotując roztwór w kuchence mikrofalowej. Zadbaj o to, aby ten roztwór był całkowicie klarowny po podgrzaniu. Jeśli tak nie jest, gotuj go ponownie, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Przed użyciem pozostawić roztwór agarozy do ostygnięcia do około 60 °C.
  3. Napełnij 1,5 ml probówek do mikrowirówek (2-4, w zależności od liczby próbek) 400 μl sterylnej wody z kranu każda (bez dodatku dodatkowych związków) lub 400 μl (dodanie x μl roztworu złożonego w kroku 2.5) i umieść je na płycie grzewczej na co najmniej 1 minutę, aby woda w środku się nagrzała.
  4. Umieść szkiełka mikroskopowe zawierające centralną wnękę na płycie grzewczej na co najmniej 1 minutę.
  5. Dodać 400 μl 2 % agarozy do roztworu w 1,5 ml probówkach do mikrowirówek i krótko przetrząsać. Po tym etapie, jeśli jest to pożądane, dodaj dodatkowe związki (np. 1 μM rapamycyny). Jeśli tak się stanie, należy krótko przetrząsnąć wir po odpipetowaniu każdej dodatkowej substancji do probówki. Umieść rurki z powrotem na stole grzewczym, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu.
    UWAGA: Całkowita objętość w probówce mikrowirówki powinna wynosić 800 μl.

3. Przygotowanie preparatów mikroskopowych zawierających podkładki głodowe

  1. Odpipetować 140 μl roztworu agarozy do wnęki szkiełka mikroskopowego (która nadal znajduje się na płycie grzewczej). Jeśli to możliwe, staraj się unikać robienia bąbelków.
  2. Natychmiast umieścić szkiełko nakrywkowe na roztworze agarozy.
    UWAGA: Spowoduje to płaską powierzchnię.
  3. Umieść szkiełko mikroskopowe na stole laboratoryjnym na około 4 minuty, aby podkładka agarozowa zastygła.
  4. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z podkładki agarozowej, zsuwając je za pomocą kciuka lub palca wskazującego (nosić rękawiczki, aby uniknąć zanieczyszczenia!).
  5. Umieść szkiełko mikroskopowe wraz z podkładką w wilgotnej komorze, aby zapobiec wysuszeniu. Zalecenie: Użyj pustego pudełka na końcówki, w którym nadal znajduje się wkładka do przytrzymywania końcówek do pipet. Dodaj sterylną wodę do pudełka tak, aby dno było przykryte. Umieść szkiełka mikroskopowe na wkładce i zamknij pudełko.

4. Zaszczepianie poduszek głodowych P. chrysogenum i inkubacja

  1. Odmierzyć pipetą 5 μl rozcieńczonych zarodników w stosunku 1:50 (jeżeli kultury były hodowane na ryżu) lub 5 μl nierozcieńczonego roztworu zawierającego fragmenty grzybni (jeśli kultury były hodowane na płytce agarowej) na środek podkładki głodowej.
  2. Zamknij mokrą komorę i zawiń ją w plastikową torbę (służy to jako dodatkowe zabezpieczenie przed wysuszeniem padów głodowych). Uważaj, aby nie przesuwać pudełka zbyt mocno, ponieważ w przeciwnym razie krople inokulacji zostaną zakłócone.
  3. Przechowywać owinięte pudełko w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 godzin przed analizą próbek.

5. Analiza mikroskopowa próbek

  1. Po 20 godzinach inkubacji próbki są gotowe do analizy mikroskopowej; umieścić szkiełko mikroskopowe na suchej bibułce (dno ma tendencję do zamoczenia).
  2. Odpipetować niewielką ilość wody (ok. 50 μl) na podkładkę głodową. Nałóż szkiełko nakrywkowe na podkładkę i wyciśnij nadmiar wody. Usuń nadmiar wody za pomocą bibuły.
  3. Umieść szkiełko mikroskopowe na stole obserwacyjnym mikroskopu fluorescencyjnego. Aby uzyskać przegląd wzrostu grzybni, użyj obiektywu 20X. Użyj obiektywów 63X lub 100X do badania lokalizacji GFP w strzępkach. Aby zapobiec stopniowemu wysuszaniu próbki, nie należy analizować próbek dłużej niż 15 minut przed ponownym włożeniem ich do mokrej komory.
  4. Powtarzać 5,3 w regularnych odstępach czasu (np. po 40 godzinach i 60 godzinach wzrostu).
    UWAGA: Próbkę można umieścić z powrotem w komorze mokrej. Nie jest konieczne usuwanie szkiełka nakrywkowego, ponieważ nie wpływa to na wzrost grzybni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować użyteczność opisanego powyżej protokołu, przeanalizowano degradację peroksysomów w szczepie P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL). W tym szczepie GFP-SKL jest zazwyczaj importowany do peroksysomów 9. W efekcie podczas analizy próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojawiają się liczne kształty sferyczne. W przypadku zachodzenia autofagii wakuole powiększają się. GFP-SKL zostaje włączony do wakuol w procesie autofagii (peksofagii). Ze względu na to, że GFP jest odporny na degrada...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda pozwala na wygodne i powtarzalne badanie autofagii u P. chrysogenum. Na przykład może być stosowany do badań przesiewowych skuteczności różnych związków, niezależnie od tego, czy są one w stanie modulować odpowiedź autofagii tego grzyba, czy nie. Wyniki z rapamycyną pokazują, że hamowanie sygnalizacji TOR prowadzi do wyraźnej indukcji autofagii u P. chrysogenum , co wykazano również w przypadku innych organizmów 11.

Możliwe jest użycie gr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

CQS otrzymuje stypendium od LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). Autor pragnie podziękować Idzie J. van der Klei za szczepy P. chrysogenum użyte w tej pracy oraz Andreasowi S. Reichertowi za dar rapamycyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka mikroskopowe z centralną wnękąCarl Roth GmbH, Karlsruhe, NiemcyH884.1Po oczyszczeniu można ich używać wielokrotnie.
Koraliki szklaneCarl Roth GmbH, Karlsruhe, NiemcyA553.1Średnica: 0,25 - 0,50 mm

Bibliografia

  1. Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
  2. Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. Autophagy in filamentous fungi. Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).
  3. Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
  4. Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. Podospora anserina target of rapamycin. Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).
  5. Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
  6. Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
  7. Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
  8. Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
  9. Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
  10. Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
  11. Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. mTOR regulation of autophagy. FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).
  12. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza autofagiitranslokacja do wakuolibia ka markerowe GFPtraktowanie rapamycynmutant Delta 80 G1degradacja peroksysom wgrzyby nitkowate

Powiązane artykuły