Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Podsumowanie

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Streszczenie

Ilościowy PCR oparty na sondach (qPCR) jest preferowaną metodą pomiaru obfitości transkryptów, ponieważ jest to jedna z najbardziej czułych metod wykrywania, która zapewnia dokładną i powtarzalną analizę. Chemia oparta na sondzie oferuje najmniejszą fluorescencję tła w porównaniu z innymi chemikaliami (opartymi na barwnikach). Obecnie dostępnych jest kilka platform, które wykorzystują chemię opartą na sondzie do ilościowego określania obfitości transkryptów. qPCR na płytce 96-dołkowej jest najczęściej stosowaną metodą, jednak w jednym cyklu można przetestować maksymalnie 96 próbek lub miRNA. Jest to czasochłonne i żmudne, jeśli ma być analizowana duża liczba próbek/miRNA. Wysokowydajne platformy oparte na sondach, takie jak macierze mikrofluidyczne (np. TaqMan Array Card) i macierze nanofluidyczne (np. OpenArray), zapewniają łatwość powtarzalnego i wydajnego wykrywania obfitości wielu mikroRNA w dużej liczbie próbek w krótkim czasie. Tutaj demonstrujemy eksperymentalną konfigurację i protokół kwantyfikacji miRNA z próbek surowicy lub osocza-EDTA, wykorzystując chemię opartą na sondzie i trzy różne platformy (płytki 96-dołkowe, macierze mikrofluidyczne i nanofluidyczne) oferujące rosnące poziomy przepustowości.

Wprowadzenie

MikroRNA (miRNA) to ~22 nukleotydowe niekodujące (nc)RNA, funkcjonujące jako regulatory ekspresji genów^1-3. Większość miRNA u zwierząt funkcjonuje poprzez specyficzne dla sekwencji parowanie zasad z mRNA, ukierunkowane na 3' UTR, co prowadzi do negatywnej regulacji ekspresji genu^2-4. Zwykle dzieje się to poprzez hamowanie translacji mRNA lub spadek rybosomów. Wykazano, że miRNA w krążeniu są nowymi biomarkerami w badaniach i dziedzinach klinicznych dla różnych chorób, takich jak cukrzyca^5-7, jajnik⁸, prostata⁹ i rak piersi^10,11, wirusowe zapalenie wątroby typu B¹² i inne choroby autoimmunologiczne¹³. Przeprowadzono badania w celu zidentyfikowania obfitych miRNA w różnych komórkach lub tkankach, a także w krążeniu z próbek ludzkiego osocza i surowicy, co jest bardziej dostępne i mniej inwazyjne^9,11-15.

Różne metody kwantyfikacji miRNA zostały ustalone przy użyciu wielu platform, takich jak standardowa platforma 96-dołkowa ^4,12,16-18, platforma kart mikrofluidycznych^12,18-23 i platforma tablic nanofluidycznych^17,24. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) oferuje możliwość pomiaru względnej lub bezwzględnej liczby transkryptów przy użyciu wielu (opartych na barwniku lub sondzie) substancji chemicznych. Chemia PCR w czasie rzeczywistym oparta na sondzie oferuje korzyści płynące z niskiej fluorescencji tła i wysokiej czułości wykrywania pojedynczej kopii transkryptu. Jest stosunkowo opłacalna, prosta w użyciu i wysoce odtwarzalna, co czyni ją ulubioną metodą ilościowego określania i określania ekspresji miRNA²⁵. Metoda qPCR oparta na sondzie zazwyczaj obejmuje dwa etapy: odwrotną transkrypcję (RT) i qPCR^4,26,27. RT to miejsce, w którym starter RT pętli macierzystej jest hybrydyzowany z dojrzałą lub pierwotną cząsteczką miRNA i przekształcany w komplementarne (c)DNA. Kwantyfikacja produktu cDNA jest następnie przeprowadzana przy użyciu starterów PCR specyficznych dla miRNA^26-28. Zasada działania qPCR opartego na sondzie opiera się na wykrywaniu wydłużenia nici komplementarnej w czasie rzeczywistym, co wiąże się z hydrolizą sondy znakowanej fluorescencyjnie. Sondy te są zaprojektowane tak, aby zawierały fluorescencyjny reporter i wygaszacz, które są po prostu oddalone od siebie, aby umożliwić FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Detekcja emisji z reportera fluorescencji (emitera) jest maskowana przez bliskie sąsiedztwo cząsteczki wygaszającej. Kiedy polimeraza Taq (pol) rozciąga się od startera i dociera do widelca (końca 5' sondy), aktywność egzonukleazy Taq pol hydrolizuje sondę, prowadząc do fizycznej dysocjacji/oddzielenia emitera fluorescencyjnego od wygaszacza. To uwolnienie pojedynczej cząsteczki emitera fluorescencji jest rejestrowane przez detektor i przedstawiane jako przyrostowy wzrost sygnału fluorescencji z tej studni/reakcji. Wzrost fluorescencji jest proporcjonalny do ilości wygenerowanego produktu PCR, co pozwala na dokładne określenie ilościowe amplifikowanego celu^26,28.

Wraz z rosnącym zapotrzebowaniem na kwantyfikację miRNA, opracowano technologie średnio- i wysokoprzepustowe, które pozwalają na przetwarzanie większej liczby próbek w krótkim czasie. TaqMan Low Density Array (TLDA) to średnioprzepustowa, innowacyjna konstrukcja mikroprzepływowa oparta na chemii qPCR opartej na sondzie, oferująca wzrost liczby analizowanych miRNA na jednej płytce. TLDA polega na użyciu predefiniowanej puli starterów RT, które są używane do syntezy cDNA. Te cDNA są następnie przędzone do dostosowanej 384-dołkowej karty mikroprzepływowej w celu określenia ekspresji wielu miRNA za pomocą qPCR^22,26,29. Każda studzienka karty zawiera wysuszone startery i sondy do amplifikacji określonych miRNA, dlatego na jednej karcie TLDA²⁶ można przetworzyć do 384 reakcji.

Tablica nanofluidyczna to platforma o wysokiej przepustowości, która jest używana do wykrywania transkryptów genów²⁴ przy użyciu tej samej chemii opartej na sondzie. Wykorzystuje opatentowaną matrycę oferującą oddziaływania hydrofobowo-hydrofilowe, aby ułatwić łatwe ładowanie 33-nanolitrowej mieszaniny reakcyjnej do zestawu 3072 otworów przelotowych na suwaku ze stali nierdzewnej²⁴. Ten artykuł koncentruje się na zademonstrowaniu, w jaki sposób te metody ilościowego oznaczania miRNA w surowicy/osoczu są wykonywane oraz krytycznych czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania i interpretacji takich danych. Biorąc pod uwagę, ich indywidualne zalety i ograniczenia zostaną omówione w tym artykule.

Protokół

Całkowite RNA można wyizolować z surowicy za pomocą protokołu ustalonego w naszym laboratorium ³⁰ lub przy użyciu innych dostępnych na rynku zestawów.

UWAGA: Dostępne są dodatkowe interaktywne arkusze kalkulacyjne do obliczania objętości reakcji w każdym eksperymencie (z uwzględnieniem 5% nadwyżki objętości przypadającej na pipetowanie).

1. qPCR w czasie rzeczywistym oparty na sondzie przy użyciu standardowej platformy 96-dołkowej płytki

1. Synteza cDNA (odwrotna transkrypcja) na próbkach RNA surowicy/osocza dla miRNA
   1. Obliczyć i pobrać 10 ng RNA dla każdej reakcji syntezy cDNA. Dodaj wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić końcową objętość 10 ng RNA do 1,67 μl (dla reakcji 5 μl). Próbki należy przechowywać na lodzie.
   2. Wybierz miRNA i rozmroź ich startery RT.
   3. Rozmrozić składniki mieszanki odczynników RT: bufor RT (10X), dNTPs (100 mM), inhibitor RNazy (20 U/μl). Nigdy nie przechowywać enzymu (rekombinowanego wirusa białaczki mysiej moloney (rMoMuLV)) (rekombinowanego wirusa białaczki myszy moloney (rMoMuLV) odwrotnej transkryptazy (50 U/μl) na lodzie. Przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu potrzeby lub w zamrażarce.
   4. Przygotować mieszaninę odczynników RT na lodzie, jak opisano w tabeli 1A. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
   5. Dodać po 2,33 μl odczynnika RT do probówki/płytki PCR o pojemności 0,2 ml.
   6. Zmieszaj probówki ze starterem RT w celu wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund. Dodaj 1 μl startera RT specyficznego dla miRNA do odpowiednich probówek lub płytki PCR. Dodaj 1,67 μl rozcieńczonego RNA do odpowiednich probówek lub dołków PCR na płytce. Wykonaj wszystkie dodatki na lodzie.
   7. Odwirować probówkę lub płytkę reakcyjną o stężeniu 1,950 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   8. Ustaw program syntezy cDNA miRNA na termocyklerze w następujących warunkach ustawienia: 16 °C przez 30 minut, 42 °C przez 30 minut, 85 °C przez 5 minut i 4 °C w zawieszeniu.
   9. Ustawić objętość reakcyjną na 10 μl. Załadować probówki lub płytkę reakcyjną do termocyklera. Rozpocznij przebieg RT. Reakcje cDNA (RT) należy przechowywać w temperaturze -20 °C, jeżeli amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym nie jest natychmiast przeprowadzana.
2. Oparty na sondzie qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania dojrzałych miRNA
   1. Rozmrozić wybrane testy qPCR oparte na sondzie (20X) dla odpowiedniego produktu RT.
   2. Wymieszaj odpowiedni roztwór PCR w czasie rzeczywistym (mieszanina odczynników qPCR), obracając butelkę.
   3. Przygotuj mieszaninę odczynników qPCR dla każdego miRNA, które ma być analizowane. Aby przygotować qPCR, należy uzyskać sterylną probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki miRNA i dodać składniki do każdej probówki, jak opisano w tabeli 1B. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
   4. Dodać 4,2 μl odpowiedniej mieszaniny odczynników qPCR do każdego dołka 96-dołkowej płytki optycznej (lub probówek). Dodaj 0,8 μl odpowiedniej reakcji cDNA (zsyntetyzowanej w kroku 1.1 dla każdego miRNA) do odpowiedniej studzienki.
   5. Uszczelnij płytkę odpowiednią osłoną optyczną. Odwirować płytkę (lub probówki) o sile 1,950 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C
   6. Włącz komputer, 96-dołkowy czytnik płytek/matryc mikrofluidycznych i na koniec uruchom oprogramowanie. Upewnij się, że maszyny są prawidłowo podłączone i że zamontowany jest prawidłowy blok i podgrzewana pokrywa (w przypadku szybkiej płytki 96-dołkowej).
   7. Wybierz eksperyment jako 96-dołkowy szybki blok (0,1 ml), krzywą standardową, odczynniki TaqMan i tryb szybki. Skonfiguruj qPCR w systemie Real Time PCR, używając następujących warunków cyklicznych programu: 95 °C przez 20 sekund, 50 cykli (95 °C przez 1 sekundę, 60 °C przez 30 sekund).
   8. Ustawić objętość reakcyjną na 10 μl. Załadować rurkę lub płytkę reakcyjną do przyrządu. Naciśnij "Rozpocznij bieg". Ukończenie programu zajmie około 1 godziny.

2. Karta macierzy mikrofluidycznej opartej na sondach (karta A i B)

UWAGA: Panel miRNA oparty na sondie jest dostarczany jako zestaw dwóch 384-dołkowych kart mikroprzepływowych (karta A i karta B). Każda karta zawiera wysuszone startery i sondy dla maksymalnie 380 miRNA i kontroli. Produkt cDNA (z lub bez amplifikacji wstępnej) specyficzny dla karty A lub karty B jest ładowany do odpowiedniej macierzy w celu przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym.

1. Odwrotna transkrypcja (RT)
   1. Użyj tego protokołu, aby uzyskać całkowite wejście RNA 1-1,000 ng. Jeśli wejście mieści się w zakresie 1-350 ng, wykonaj wstępny amplifikacja (pre-amp) krok. W przypadku wejść powyżej 350 ng, załaduj cDNA bezpośrednio na karty macierzy bez pre-amp.
      UWAGA: W przypadku profilowania miRNA w surowicy zacznij od 100 ng całkowitego RNA. Aby uzyskać pełny profil miRNA, uruchom dwie predefiniowane pule zestawów starterów RT reakcji RT (Pula A i Pula B) na próbkę.
   2. Rozmrozić następujące odczynniki na lodzie. Startery RT (10x): Pool A i Pool B, dNTP z dTTP (100 mM), bufor RT (10x), MgCl₂ (25 mM), inhibitor RNazy (20 U/μl). Nie przechowywać enzymu (rekombinowanego wirusa białaczki moloneowej myszy (rMoMuLV)) odwrotnej transkryptazy (50 U/μl) na lodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
   3. Delikatnie zwirować wszystkie odczynniki, z wyjątkiem enzymu, a następnie krótko odwirować probówki o sile 10 000 x g przez 10 sekund.
   4. Połączyć odczynniki, jak opisano w tabeli 2A, w dwóch probówkach; jedną probówkę dla grupy A, drugą dla grupy B. Każda probówka będzie zawierała tylko jedną predefiniowaną pulę zestawu starterów RT, z puli A lub z puli B. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
   5. Odwrócić w celu wymieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Podwielokrotność 100 ng każdej próbki RNA do nowej probówki, a następnie dodać odpowiednią objętość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać w sumie 3 μl.
   6. Podwielokrotność 4,5 μl odpowiedniego odczynnika RT wymieszać z odpowiednimi probówkami. Odwrócić do mieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
   7. Umieścić próbki w termocyklerze i uruchomić RT w następujących warunkach: 40 cykli (16 °C przez 2 min, 42 °C przez 1 min, 50 °C przez 1 sek.), 85 °C przez 5 min, przechowywać w temperaturze 4 °C. Przechowywać cDNA wytworzone przy użyciu tej predefiniowanej puli starterów RT w temperaturze od -15 do -25 °C lub zużyć natychmiast.
2. Wstępne wzmocnienie
   1. Rozmrozić predefiniowaną pulę starterów przed ampem na lodzie. Delikatnie zwiruj startery, a następnie krótko odwiruj je przy 10 000 x g przez 10 sekund. Zawiruj mieszankę odczynników TaqMan PreAmp (2X), delikatnie stukając, aby wymieszać.
   2. Połączyć odczynniki, jak opisano w tabeli 2B, w dwóch probówkach; w jednej probówce dla grupy A, a drugiej dla grupy B.
      UWAGA: Jak opisano powyżej, startery przedwzmacniacza z puli A trafią do lampy A, a startery z puli B powinny trafić do lampy B. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
   3. Odwrócić w celu wymieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Podwielokrotność 22,5 μl odpowiedniego odczynnika PreAmp wymieszać z nowymi probówkami. Podwielokrotność 2,5 μl próbki cDNA (przygotowanej na etapie RT) do odpowiedniej probówki.
   4. Odwrócić do mieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Umieść próbki w termocyklerze i rozpocznij cykl pre-amp. Warunki cyklu: 95 °C przez 10 min, 55 °C przez 2 min, 72 °C przez 2 min, 12 cykli (95 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 4 min), 99,9 °C przez 10 min, utrzymuj w temperaturze 4 °C.
   5. Odwróć wstępnie amplifikowane cDNA w celu wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund. Dodaj 75 μl 0,1x buforu TE (pH 8,0) do wstępnie amplifikowanego cDNA (rozcieńczenie 1:4). Odwróć rozcieńczone próbki przedwzmacniacza do wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund. Rozcieńczony, wstępnie amplifikowany cDNA należy przechowywać w temperaturze od -15 do -25 °C przez okres do jednego tygodnia lub zużyć natychmiast.
3. Ładowanie kart mikrofluidycznych i wykonywanie qPCR
   1. Trzymaj karty miRNA mikrofluidyki na zewnątrz przez co najmniej pół godziny, aby osiągnąć temperaturę pokojową. Rozcieńczyć, wstępnie amplifikowane cDNA na lodzie i wymieszać, odwracając rurki, a następnie krótko wirując. Wymieszaj mieszaninę odczynnika qPCR, obracając butelkę.
   2. W nowej probówce dodać 450 μl mieszaniny odczynników qPCR do 9 μl rozcieńczonego, wstępnie amplifikowanego cDNA. W przypadku karty A należy użyć wstępnie amplifikowanego produktu przygotowanego przy użyciu puli startera A. Dodać 441 μl wody wolnej od nukleaz, aby uzupełnić końcową objętość do 900 μl. Odwróć probówkę do wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund.
   3. Wyjmij kartę TLDA z opakowania (gdy osiągnie temperaturę pokojową) i umieść ją w czystym miejscu folią do dołu. Dodaj 100 μl mieszaniny reakcyjnej PCR do każdego z 8 portów napełniania na karcie. Na każdym ze zbiorników znajdują się 2 porty (w sumie 8 zbiorników na każdej karcie).
      UWAGA: Port napełniania to większy otwór, do którego dodawana jest mieszanina reakcyjna, podczas gdy port odpowietrzający to mniejszy otwór. Każda karta miRNA TLDA ma 8 zbiorników, z których każdy prowadzi do 48 dołków (24 dołki w jednej kolumnie x 2 kolumny), ładując w ten sposób wszystkie 384 dołki na karcie tą samą mieszanką reakcyjną PCR. Upewnij się, że pula A i pula B każdej próbki są załadowane na odpowiednie karty TLDA. Umieść kartę macierzy w specjalistycznych wiaderkach z matrycą mikrofluidyczną w wirówce.
   4. W przypadku kart z matrycą mikroprzepływową należy użyć odpowiedniej wirówki (takiej jak wirówka Heraeus Multifuge 3SR, 230 V) i specjalnych wiader (takich jak uchwyty "TaqMan Array Card"). Każde wiadro może pomieścić do 3 kart (załadowanych / pustych). Zawsze upewnij się, że wszystkie 3 szczeliny wiadra są zajęte, a wiadro jest zrównoważone, umieszczając podobne wiadro (to wiadro powinno również zawierać 3 karty, puste lub pełne) w przeciwległym gnieździe wirówki. Umieszczając kartę w uchwycie wiadra, upewnij się, że 8 zbiorników wystaje do góry, a studzienki reakcyjne są skierowane w stronę zewnętrznej ścianki wirówki.
      1. Obracaj karty w temperaturze 331 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Po pierwszym wirowaniu otwórz wirówkę i wizualnie upewnij się, że mieszanina reakcyjna została dozowana przez 384 dołki. Powtórz wirowanie z tymi samymi ustawieniami jeszcze 1 raz. Wyjmij kartę z wiadra i upewnij się, że poziom mieszaniny reakcyjnej w każdym z 8 zbiorników jest równomierny. Wszelkie niespójności w objętościach płynów pozostawionych w zbiornikach powodują, że karta nie nadaje się do dalszego użytkowania.
   5. Karty matrycowe Microfluidics wymagają specjalistycznego uszczelniacza, który ma precyzyjny zespół trzpienia pomiarowego (wózek) do uszczelniania kanałów dystrybucji płynów w matrycy i równomiernego rozprowadzania mieszaniny reakcyjnej we wszystkich studzienkach (całkowita objętość reakcji 1 μl/dołek).
   6. Ustaw karetkę w pozycji wyjściowej i włóż załadowaną kartę do zgrzewarki folią do góry i wyrównaną z kołkami rysika na zgrzewarce. Powolnym, równomiernym i pojedynczym, równomiernym ruchem popchnij karetkę w poprzek karty, aż dotrze do punktu końcowego zgrzewarki. Wyjmij zapieczętowaną kartę macierzową, a następnie odetnij zbiorniki od karty za pomocą nożyczek.
   7. Upewnij się, że w systemie/maszynie do PCR w czasie rzeczywistym zainstalowany jest właściwy blok, podgrzewana pokrywa i nośnik próbki.
   8. Włącz komputer, następnie system macierzy mikrofluidycznej i na koniec uruchom oprogramowanie. Upewnij się, że maszyny są prawidłowo podłączone. Wybierz eksperyment jako kartę tablicy, krzywą standardową, odczynniki TaqMan i tryb standardowy. Zaimportuj pliki instalacyjne dla karty A i karty B. Zapisz plik.
   9. Umieść zapieczętowaną kartę w tacy na instrumenty z dołkiem A1 w lewym górnym rogu i kodem kreskowym skierowanym z przodu instrumentu. Naciśnij "Rozpocznij bieg". Ukończenie programu zajmie około 2 godzin.

3. Panel ludzkiego miRNA oparty na nanofluidyce opartej na sondzie

1. Odwrotna transkrypcja (RT)
   1. Użyj tego protokołu, aby uzyskać całkowity wkład RNA 50-200 ng, jednak 100 ng jest optymalne dla większości próbek. Aby uzyskać pełny profil miRNA, uruchom dwie predefiniowane pule zestawów starterów RT reakcji RT (Pula A i Pula B) na próbkę.
   2. Rozmrażanie odczynników na lodzie: predefiniowana pula zestawów starterów RT (10X), dNTP z dTTP (100 mM), bufor RT (10x), MgCl_2, (25 mM), inhibitor RNazy (20 U/μl). Nie przechowywać enzymu (rekombinowanego wirusa białaczki mysiej moloney (rMoMuLV) odwrotnej transkryptazy (50 U/μl) na lodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny. Delikatnie zwirować wszystkie odczynniki, z wyjątkiem enzymu, i krótko je odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund.
   3. Połączyć odczynniki, jak opisano w tabeli 3A, w dwóch probówkach; jedną probówkę dla grupy A, drugą dla grupy B. Każda probówka będzie zawierała tylko jedną predefiniowaną pulę zestawu starterów RT, z puli A lub z puli B. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
   4. Odpipetować do wymieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Podwielokrotność 100 ng każdej próbki RNA do nowej probówki, a następnie dodać odpowiednią objętość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać w sumie 3 μl. Podwielokrotność 4,5 μl odpowiedniego odczynnika RT wymieszać do odpowiedniej probówki.
   5. Odwrócić do mieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Umieścić próbki w termocyklerze i uruchomić program RT. Warunki cyklu: 40 cykli (16 °C przez 2 min, 42 °C przez 1 min, 50 °C przez 1 sek.), 85 °C przez 5 min, utrzymywać w temperaturze 4 °C. Przechowywać cDNA wytworzone przy użyciu tej predefiniowanej puli starterów RT ustawionych w temperaturze od -15 do -25 °C lub natychmiast zużyć.
2. Przedwzmacniacz (przedwzmacniacz)
   1. Rozmrozić predefiniowaną pulę startera pre-amp ustawionego na lodzie. Delikatnie zwiruj startery, a następnie krótko odwiruj je przy 10 000 x g przez 10 sekund. Zawijaj mieszankę odczynników TaqMan PreAmp (2X), aby wymieszać.
   2. Połączyć odczynniki, jak opisano w tabeli 3B, w dwóch probówkach; jednej probówce dla grupy A, drugiej dla grupy B. Każda probówka będzie zawierała tylko jedną predefiniowaną pulę zestawów starterów RT, z puli A lub z puli B. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
   3. Odpipetować do wymieszania, a następnie krótko odwirować je przy 10 000 x g przez 10 sek. Porcję 22,5 μl odpowiedniego odczynnika PreAmp wymieszać z nowymi probówkami. Podwielokrotność 2,5 μl próbki cDNA do odpowiedniej probówki. Odwrócić do mieszania, a następnie krótko odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 10 sekund. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
   4. Umieść próbki w termocyklerze i uruchom przedwzmacniacz. Ustawić objętość reakcji na 25 μl. Warunki cyklu: 95 °C przez 10 min, 55 °C przez 2 min, 72 °C przez 2 min, 12 cykli (95 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 4 min), 99,9 °C przez 10 min, utrzymuj w temperaturze 4 °C.
   5. Odwróć wstępnie amplifikowane cDNA do wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund. W nowych probówkach dodać 4 μl wstępnie amplifikowanego cDNA do 156 μl 0,1x buforu TE pH 8,0 (rozcieńczenie 1:40). Odwróć rozcieńczone próbki przedwzmacniacza do wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund. Rozcieńczone i nierozcieńczone wstępnie amplifikowane cDNA należy przechowywać w temperaturze od -15 do -25 °C przez okres do jednego tygodnia lub natychmiast zużyć.
3. Wczytywanie tablic nanofluidycznych i wykonywanie qPCR
   1. Pobierz odpowiedni plik płytki (.tpf) ze strony internetowej³¹, używając numeru seryjnego szkiełka nanofluidics ray. Zawiera on informacje o przebiegu dla konkretnego slajdu z matrycą nanofluidyczną.
   2. Rozmrozić rozcieńczone, wstępnie amplifikowane cDNA i mieszankę odczynników TaqMan Real-Time qPCR (jeśli używasz po raz pierwszy) na lodzie. Wymieszaj mieszaninę odczynnika qPCR, obracając butelkę. W nowych probówkach dodać 22,5 μl mieszaniny odczynników qPCR do 22,5 μl rozcieńczonego, wstępnie amplifikowanego cDNA. Delikatnie zmieszać, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund.
   3. Porcjować 5 μl każdej próbki do 8 dołków (2 kolumny, 4 rzędy) 384-dołkowej płytki z próbką przepływu pracy nanofluidics. Upewnij się, że pula A i pula B każdej próbki znajdują się w sąsiednich blokach 8-dołkowych (patrz rysunek 1 lub dodatkowy arkusz Excela dla układu).
      1. Każda płytka z próbką może zawierać do ośmiu preparatów z próbkami. Jednak system dla macierzy nanofluidycznej może przetwarzać tylko 4 tablice nanofluidyczne w jednym przebiegu. Jeśli na jedną płytkę próbną mają zostać załadowane więcej niż cztery szkiełka próbek, należy upewnić się, że pozostałe sekcje są szczelnie zamknięte. Uszczelnij za pomocą zgrzewarki OpenArray.
         UWAGA: Zaleca się wstępne pocięcie zgrzewarki na wymagane sekcje, aby sekcje mogły być uszczelniane/rozszczelniane pojedynczo w celu zmniejszenia parowania. Alternatywnie płyta może być uszczelniona za pomocą nienaruszonego uszczelniacza, a następnie sekcje mogą być indywidualnie wycinane podczas załadunku.
   4. Płytkę wirówkową o masie 490 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Załadować szkiełka z matrycą nanofluidyczną w ciągu 1 godziny. Ze względu na ograniczony czas przeznaczony na uszczelnienie szkiełek, należy ładować tylko jedno szkiełko na raz. Wyjmij szkiełko z matrycy nanofluidycznej z zamrażarki i pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową (~15 min).
   5. Upewnij się, że w systemie macierzy nanofluidics zainstalowany jest właściwy blok, podgrzewana pokrywa i nośnik próbki. Włącz komputer i system PCR w czasie rzeczywistym oraz system ładowania. Uzyskaj dostęp do odpowiedniego oprogramowania i upewnij się, że maszyny są połączone. Wyjmij materiały eksploatacyjne systemu załadowczego (przesuwną pokrywę matrycy, korek i płyn zanurzeniowy) z opakowania.
   6. Delikatnie pociągnąć za tłok strzykawki z płynem zanurzeniowym, aby go poluzować. Zdejmij nakrętkę, załóż końcówkę i spłucz powietrze z końcówki. Umieść końcówki systemu ładowania w maszynie i zdejmij pokrywę. Umieścić płytkę z próbką w systemie PCR.
   7. Załóż rękawiczki. Upewnij się, że są szczelnie dopasowane, aby zminimalizować ryzyko przypadkowego zaznaczenia pokrywy przesuwnej. Ostrożnie otwórz opakowanie szkiełkowe. Powoli przechyl wsuwkę w dłoń. Nie dotykaj górnej części zjeżdżalni.
   8. Umieść szkiełko w systemie PCR, z kodem kreskowym po lewej stronie. Usunąć uszczelniacz z części płytki próbki przeznaczonej do załadunku. Użyj oprogramowania systemu ładowania, aby wprowadzić kod kreskowy szkiełka, pozycję szkiełka, pozycję próbki i konfigurację końcówki.
   9. Po zakończeniu wszystkich odpowiednich kontroli naciśnij suwak obciążenia. Podczas gdy system PCR ładuje szkiełko, usuń przezroczysty i czerwony plastik z dolnej części pokrywy szkiełka. Po zakończeniu załadunku ostrożnie wyjmij i uszczelnij suwak w ciągu 90 sekund.
      1. Umieść suwak w płycie clamp. Umieść pokrywę prowadnicy na szkiełku. Clamp na 30 sek. Upewnij się, że pokrywa jest ustawiona tak, aby kod kreskowy był prawidłowo wyświetlany. Zdejmij zespół z płyty clamp.
      2. Umieścić strzykawkę z płynem zanurzeniowym w szkiełku tak, aby końcówka naciskała na pokrywę. Powoli napełnij szkiełko płynem zanurzeniowym, upewniając się, że płyn spływa wzdłuż pokrywy. Po napełnieniu uszczelnij suwak korkiem, przekręcając, aż uchwyt się oderwie.
      3. Zdejmij plastikową osłonę z górnej części pokrywy szkiełka, a następnie ostrożnie umieść ją w uchwycie szkiełka systemu PCR w czasie rzeczywistym. Upewnij się, że na dole zjeżdżalni znajduje się podparcie podczas jej opuszczania, aby nie opadła nagle i nie dotykała górnej części zjeżdżalni. Można dotykać boków prowadnicy/kasety. Zainicjuj system PCR i uruchom program do qPCR w ciągu 1 godziny.
   10. Wybierz "OpenArray" w oprogramowaniu systemu PCR. Naciśnij "Znajdź identyfikatory slajdów". Zajmie to kilka minut. Jeśli oprogramowanie nie może znaleźć identyfikatora tablicy, poprosi o jego ręczne wprowadzenie.
   11. Naciśnij przycisk "Potwierdź środki płyty". Ponownie, zajmie to kilka minut. Sprawdź, czy czerwona kropka znajduje się na środku i czy na górze szkiełka nie ma odcisków palców/śladów. Załaduj odpowiedni plik .tpf dla każdego slajdu i określ nazwę pliku wynikowego oraz lokalizację. Naciśnij "Rozpocznij bieg". Ukończenie programu zajmie około 2 godzin.

Wyniki

Zalecana objętość dla testu qPCR opartego na sondzie miRNA to 20 μl. UWAGA: Potwierdziliśmy, że objętość reakcji 5 μl jest w stanie dać wyniki podobne do tych osiągniętych przy użyciu 20 μl objętości^4,7,30. Zmniejszenie objętości reakcji do 5 μl pozwala na obniżenie kosztów odczynnika o 75% bez odczuwalnej utraty czułości. Jak pokazano na rysunku 2, objętości reakcji 20 μl i 5 μl wykazują silną korelację aż do 39 cykli (przy r² równym 0,92, p = 0,0002).

Tablica mikrofluidyczna dostarcza narzędzie do uzyskiwania danych na temat 754 miRNA wyrażonych w próbce w ciągu około 5 godzin (dla Karty A i Karty B), co jest bardziej efektywnym sposobem analizy wielu próbek w porównaniu do konwencjonalnych 96-dołkowych PCR-ów. Porównaliśmy karty macierzy mikrofluidycznej miRNA dla tej samej próbki (powtórzenie próbki A i próbki A). Rysunek 3A-B przedstawia wykres Blanda-Altmana (3A) i wykres korelacji (3B) dla wszystkich 754 miRNA badanych dla tych próbek. Istnieją 3 różne kontrolne miRNA (U6, RNU44 i RNU48) umieszczone losowo na obu kartach (karta A i B) w wielu miejscach. Gdy porównano wartości progu cyklu U6 (Ct) między 2 seriami, nie zaobserwowaliśmy istotnych różnic między wartościami (tabela 4). Należy również zauważyć, że U6 jest wyrażany w większej obfitości (niższa wartość Ct) w ocenianej próbie. Następnie porównaliśmy wszystkie miRNA, które mają wartości Ct między 0-19,99 w obu seriach (n = 150), które miały podobną ogólną ekspresję miRNA ze współczynnikiem determinacji 98% (ryc. 3C-D). Spośród wszystkich 277 miRNA, które mają wartości Ct od 20 do 29,99 w obu seriach, 16 miR różniło się znacznie między oryginalnymi i powtórzonymi seriami (Figura 3E-F). Liczba miRNA ze znaczącą różnicą między seriami wzrosła (89 z 327), gdy wartości Ct zostały wybrane między 30-40 dla obu serii (Figura 3G-H).

Platforma macierzy nanofluidycznej dostarcza danych dla 754 miRNA z każdej badanej próbki surowicy/osocza, jak pokazano na rysunku 4A. Ważne jest, aby zbadać te krzywe amplifikacji – tak jak w przypadku wszystkich qPCR – aby upewnić się, że wynik wskazuje na prawdziwą amplifikację. Każda z 48 podmacierzy (ryc. 1) zawiera również test dla trzech najpopularniejszych "porządkowych" ncRNA: U6, RNU44 i RNU48. Rysunek 4B ilustruje typowe grupowanie powtórzeń U6 z pojedynczej próbki. Repliki te charakteryzują się niskim odchyleniem standardowym (SD <0,5), a zatem są wskaźnikiem wiarygodności. Alternatywnie, rysunek 4C pokazuje zwiększoną zmienność kontrprób U6 (SD >0,5) w drugiej próbce. Nie neguje to ważności pozostałych testów, chociaż wymaga bardziej dogłębnej krytyki. U6, podobnie jak większość "porządkujących" miRNA w płynach biologicznych, może mieć zmienną ekspresję. Należy zauważyć, że jedna z próbek, przedstawiona na rysunku 4C, wykazuje 4-krotnie mniejszą zawartość U6 niż przedstawiona na rysunku 4B. Ponieważ poziom U6 w próbce przedstawionej w 4C jest na początku o 75% niższy niż ten przedstawiony w panelu 4B, oczekuje się większej zmienności technicznej ze względu na rozkład Poissona transkryptów, który jest pogarszany przez małą objętość reakcji¹⁷.

Innym użytecznym narzędziem są obrazy kontroli jakości (QC), które są dostępne do eksportu po zakończeniu przebiegu. Niektóre z nich wykorzystują fluorescencję ROX, pasywnego barwnika znajdującego się w mieszaninie odczynników qPCR, aby potwierdzić, że każdy otwór przelotowy został prawidłowo załadowany (ryc. 5). Otwór przelotowy, a nawet cała podmatryca, może nie zostać załadowana z powodu niewystarczającej objętości próbki, parowania, pęcherzyków obecnych w studzienkach 384-dołkowej płytki próbki, niemożności całkowitego usunięcia uszczelki płytki próbki lub wad w systemie Accufill lub jego końcówkach. Wszelkie niezaładowane otwory przelotowe muszą być zidentyfikowane, aby uniknąć oznaczania miRNA jako "niewykrywalne", podczas gdy w rzeczywistości test nigdy nie został załadowany. W przypadku wystąpienia tego problemu należy upewnić się, że co najmniej 5 μl próbki/mieszanki wzorcowej zostało załadowane do każdego dołka płytki z próbką 384-dołkową, płytka z próbką jest prawidłowo odwirowywana przed załadowaniem, uszczelnienie foliowe jest całkowicie usuwane, a załadowany szkiełko OpenArray jest uszczelnione i uruchamiane w wyznaczonym czasie dla wszystkich kolejnych serii. Jeśli problemy z ładowaniem nadal występują, może to być bardziej prawdopodobne, że dotyczą one określonej partii lub partii macierzy lub powiązanych materiałów eksploatacyjnych i należy zwrócić się o dalszą pomoc do producenta.

Rysunek 1: Układ próbek dla przepływu pracy Nanofluidics Array: (A) Każda 384-dołkowa płytka z próbkami może pomieścić próbki z maksymalnie 8 macierzy nanofluidycznych. (B) Rozcieńczony, wstępnie amplifikowany cDNA umieszcza się w 8 dołkach (2 kolumny na 4 rzędy), z pulą A i B w sąsiednich grupach 8-dołkowych. Każdy okrąg reprezentuje jedną studnię. (C) Każda studzienka płytki próbki zostanie załadowana do jednej podtablicy tablicy nanofluidycznej. Każdy mały kwadrat reprezentuje jedną podtablicę.

Rysunek 2: Analiza korelacji dla konwencjonalnych 96-dołkowych platform PCR: Korelacja między objętościami reakcji od 20 μl do 5 μl na TaqMan Real-time qPCR przy użyciu standardowej platformy 96-dołkowej płytki w wartościach CT (39 cykli). Porównaliśmy 4 różne mikroRNA (miR-375, miR-30c, miR-30d i miR-7) w 4 różnych próbkach ludzkiej surowicy i osocza. Wykreślanych jest tylko 11 punktów danych, ponieważ pozostałe były niewykrywalne. R² = 0,92, p = 0,0002.

Rysunek 3: Profilowanie krążącego miRNA przy użyciu kart macierzowych mikrofluidycznych. Za pomocą 2 kart mikrofluidycznych (karta-A i karta-B) generowany jest profil 754 miRNA (A-B). Jak pokazano tutaj, użyliśmy tej samej próbki dla 2 przebiegów macierzy mikrofluidycznej, aby sprawdzić odtwarzalność wyników karty mikrofluidycznej. Zaobserwowaliśmy podobną ekspresję miRNA ogółem, z wartościami Ct w zakresie 0-19,99 (C-D). Istnieje kilka miRNA (16 z 277) o wartościach Ct między 20-29,99 i istotnych różnicach między powtórzeniami (E-F). Osiemdziesiąt dziewięć z 327 mikroRNA o wyższych wartościach Ct (30-40) wykazywało znaczące różnice między obiema seriami (G-H).  Dane są analizowane za pomocą sparowanego testu T. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywny profilkrzywych amplifikacji produktu PCR: Jest reprezentatywną liczbą połączonych krzywych amplifikacji (A) wszystkich celów miRNA dla próbki ludzkiego osocza. Test na U6 (powszechny kontrolny ncRNA) umieszcza się w każdym podukładzie. Próbka w (B) wykazuje niską zmienność (SD <0,5), podczas gdy (C) wykazuje wysokie odchylenie standardowe (SD >0,5) w obrębie powtórzeń U6. Obie próbki to całkowite RNA wyizolowane z ludzkiego osocza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Analiza jakości macierzy nanofluidycznych: obrazy kontroli jakości (QC) prawidłowo załadowanej macierzy nanofluidycznej (po lewej) i nieprawidłowo załadowanej macierzy nanofluidycznej (po prawej). Pasywny barwnik, ROX (obecny w mieszaninie odczynników qPCR), fluoryzuje, wskazując na prawidłowo załadowany otwór przelotowy. Tablica po prawej stronie ma kilka podtablic/otworów przelotowych, które nie są załadowane mieszanką odczynników qPCR i należy je zidentyfikować jako fałszywie ujemne reakcje PCR.

pkt.

Składniki	Objętość na 5 μl reakcji (μl)
Bufor RT (10x)	0,5
dNTP (100 mM)	0,05
Inhibitor RNazy	0,6
Woda wolna od nukleaz	Pytanie 1,39
Odwrotna transkryptaza	0,33
Całkowita objętość	Godzina 2,33

Tabela 1A: Składniki odczynnika RT mieszają się w przygotowaniu do reakcji 5 μl RT dla TaqMan Real-time qPCR przy użyciu standardowej platformy 96-dołkowej.

pkt.

Składniki	Objętość na 5 μl reakcji (μl)	Objętość na 20 μl reakcji (μl)
Szybki mastermix do PCR (2x)	Rozdział 2.5	10
Test TaqMan qPCR (20x) *	0,25	1
Woda wolna od nukleaz	Godzina 1,45	5,8
Całkowita objętość:	Rozdział 4.2	Rozdział 16,8

*składnik testu oparty na wybranym testowanym miRNA.

Tabela 1B: Składniki odczynnika qPCR mieszają się w przygotowaniu do reakcji qPCR na 5 lub 20 μl dla TaqMan Real-time qPCR przy użyciu standardowej platformy 96-dołkowej.

pkt. pkt.

Składniki	Objętość na reakcję (μl)
Podkłady Megaplex RT (10x)	0,8
dNTP z dTTp (100 mM)	0,2
Multiscribe odwrotna transkryptaza (50 U/μl)	1,5
Bufor 10X RT	0,8
MgCl2 (25 mM)	0,9
Inhibitor RNazy (20 U/μl)	0,1
Woda wolna od nukleaz	0,2
łączny	Rozdział 4.5

Tabela 2A: Składniki odczynnika RT w 5 μl preparatu do reakcji RT dla panelu miRNA TLDA.

pkt.

Składniki	Objętość na reakcję (μl)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x)	Rozdział 12,5
Podkłady przedwzmacniacza Megaplex (10x)	Rozdział 2.5
Woda wolna od nukleaz	7,5
łączny	22,5

Tabela 2B: Składniki odczynnika PreAmp w przygotowaniu do reakcji przed amplikacją 25 μl dla panelu miRNA TLDA.

pkt. pkt. pkt. pkt.

Składniki	Objętość na reakcję (μl)
Podkłady Megaplex RT (10x)	0,75
dNTP z dTTp (100 mM)	0,15
Multiscribe odwrotna transkryptaza (50 U/μl)	1,5
Bufor 10X RT	0,75
MgCl2 (25 mM)	0,9
Inhibitor RNazy (20 U/μl)	0,09
Woda wolna od nukleaz	0,35
łączny	Rozdział 4.5

Tabela 3A: Składniki odczynnika RT mieszają się w przygotowaniu do reakcji 5 μl RT dla panelu miRNA opartego na nanofluidyce.

pkt.

Składniki	Objętość na reakcję (μl)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x)	Rozdział 12,5
Podkłady przedwzmacniacza Megaplex (10x)	Rozdział 2.5
Woda wolna od nukleaz	7,5
łączny	22,5

Tabela 3B: Składniki odczynnika PreAmp mieszają składniki w przygotowaniu do reakcji przed amplikacją 25 μl dla panelu miRNA opartego na nanofluidyce opartego na sondzie. UWAGA: Interaktywne dodatkowe arkusze kalkulacyjne programu Excel dostępne dla trzech platform uwzględniają już dodatek o 5% w celu zrekompensowania błędu pipetowania.

szt. szt. TGL TGL TGL TGL TGL TGL zł TGL Rozdział Rozdział TGL Rozdział Rozdział TGL

Próbka A	Powtórzenie próbki A
15 535	16 156
15.471	15 652
15 623	16 063
15 963	15.889
Z dnia 14 006	13 993
14.502	14.623
14.907	14 384
13.732	14.946

Tabela 4: Profilowanie krążącego miRNA U6 przy użyciu karty mikrofluidycznej. Za pomocą dwóch kart macierzy mikrofluidycznych (A i B). Wartości ct miRNA kontrolnego U6 z próbki A (łącznie = 8). Konsekwentna liczebność miRNA kontrolna U6 obserwowana między seriami.

Dyskusja

Krytycznymi krokami w protokołach qPCR opartych na sondzie w celu uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników jest upewnienie się, że 1) ta sama objętość i stężenie produktu RT jest ładowane w każdej reakcji qPCR, 2) właściwe proporcje i objętości składników potrzebnych do reakcji qPCR są przygotowywane i dobrze mieszane, 3) do każdej reakcji qPCR dodaje się właściwe i stałe objętości, oraz 4) przygotowanie i ładowanie każdej próbki i mieszaniny reakcyjnej odbywa się w możliwie najkrótszym czasie, przy jednoczesnym zachowaniu wyżej wymienionych krytycznych etapów.

Karty matrycowe mikrofluidyki wymagają odpowiedniej wirówki i specjalnych wiader. Każde wiadro może pomieścić do 3 kart (załadowanych / pustych). Zawsze upewnij się, że wszystkie 3 szczeliny wiadra są zajęte, a wiadro jest zrównoważone, umieszczając podobne wiadro (to wiadro powinno również zawierać 3 karty, puste lub pełne) w przeciwległym gnieździe wirówki. Umieszczając kartę w uchwycie wiadra, upewnij się, że 8 zbiorników wystaje do góry, a studzienki reakcyjne są skierowane w stronę zewnętrznej ścianki wirówki. Obracaj karty w temperaturze 331 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Po pierwszym wirowaniu otwórz wirówkę i wizualnie upewnij się, że mieszanina reakcyjna została dozowana przez 384 dołki. Powtórz wirowanie z tymi samymi ustawieniami jeszcze 1 raz. Wyjmij kartę z wiadra i upewnij się, że poziom mieszaniny reakcyjnej w każdym z 8 zbiorników jest równomierny. Wszelkie niespójności w objętościach płynów pozostawionych w zbiornikach powodują, że karta nie nadaje się do dalszego użytkowania.

Aby uzyskać takie samo stężenie produktu RT, do każdej reakcji RT dodaje się to samo stężenie wejściowe RNA. Całkowite stężenie RNA mierzy się za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Obserwowany stosunek 260/280 może wynosić zaledwie 1,3 dla RNA wyizolowanego z osocza/surowicy; Wydaje się, że nie ma to wpływu na dalszy proces związany z qPCR ani na generowane dane³⁰. Podobnie, stosunek 260/280 badanych w próbkach RNA wynosił 1,3-1,7 bez zaobserwowanych nieprawidłowych efektów w qPCR.

W przypadku korzystania z próbek o niskiej zawartości RNA, takich jak te z płynów biologicznych, określenie ilościowe RNA przed przetwarzaniem może być trudne. Zalecamy stosowanie syntetycznego spike-in na etapie izolacji RNA, a także na etapach odwrotnej transkrypcji. Z naszego doświadczenia wynika, że kandydaci na miRNA Arabidopsis thaliana (ath-miR-159a i ath-miR-172a) są preferowani w stosunku do miRNA Caenorhabditis elegans (takich jak cel-miR-39 lub cel-miR-54), które z naszego doświadczenia mogą mieć wyższą homologię niż te z A. thaliana. Zastosowanie takiego specyficznego dla etapu skoku może wyjaśnić normalizację danych miRNA w wielu próbkach testowanych w różnym czasie. Zaleca się również stosowanie stałej objętości wejściowej RNA do reakcji syntezy cDNA^32,33.

Opisane tutaj trzy protokoły kwantyfikacji miRNA oparte na sondzie wymagają różnych ilości całkowitego wkładu RNA, różnych przepływów pracy i kosztów. Każdy z przepływów pracy jest zaprojektowany tak, aby zapewnić różne przepustowości w zależności od liczby celów miRNA i liczby próbek do analizy. Wraz ze wzrostem przepustowości (96 rxn 384 rxn 3072 rxn) koszt reakcji zmniejsza się wraz ze wzrostem ilości danych uzyskiwanych w jednostce czasu. Ponieważ wszystkie te platformy wykorzystują chemię TaqMan, można oczekiwać, że jakość uzyskanych danych będzie podobna. TaqMan qPCR jest dobrze znaną metodą identyfikacji obfitości miRNA w próbkach surowicy/osocza^9,11,27. Chociaż trzy omawiane tutaj platformy mają ten sam skład chemiczny, zmniejszenie objętości reakcji prowadzi do zmniejszenia zakresu dynamicznego wykrywania transkryptów (Farr RJ i wsp., dane niepublikowane). 96-dołkowa platforma qPCR jest platformą o niższej przepustowości, ale wysokiej czułości i naszym zdaniem "złotym standardem" dla wszystkich platform PCR opartych na sondzie (lub barwniku). Jednak może to nie być najbardziej ekonomiczna lub wydajna platforma, jeśli testuje się kilkaset lub tysiące próbek i dla wielu mikroRNA. Platformy mikrofluidyki (TLDA) i nanofluidyki (OA) to platformy o wysokiej przepustowości / treści, zaprojektowane tak, aby umożliwić pozyskiwanie większych danych w krótszym czasie. Chociaż zaobserwowano różnice w partiach kart TLDA, można je zminimalizować, żądając kart TLDA z tej samej partii. Obserwujemy, że platforma TLDA (ryc. 3) wykazała znaczną zmienność w 17% miRNA o średniej i niskiej liczebności podczas testowania przy użyciu tej samej próbki na różnych partiach kart TLDA. Dlatego zalecamy używanie tych samych numerów partii do analizy za pomocą kart TLDA. Różnice te mogą być również spowodowane zmiennością techniczną, w tym potencjalnymi błędami ładowania i pipetowania. Zalecamy jednak zamówienie/poproszenie o tę samą partię kart TLDA. Na platformie OA nie zaobserwowano istotnych różnic w partiach. Mimo to eksperymentalne metody qPCR oparte na TaqMan ułatwiają pomiar obfitości miRNA w próbkach osocza/surowicy. Omówione tutaj podejścia o niskiej, średniej i wysokiej przepustowości oferują elastyczność w analizie szeregu próbek i miRNA przy użyciu wysoce wydajnej, powtarzalnej i czystej (o niskim poziomie szumów tła) chemii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96 platforma studzienkowa
do odwrotnej transkrypcji
TaqMan Testy mikroRNA INV SM 	Biosystemy stosowane	4427975	https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 Testy są dostarczane jako zestaw starterów RT i starterów PCR.
Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan	Applied Biosystems	4366597 lub 4366596	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 lub http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 Zestaw do odwrotnej transkrypcji TaqMan MicroRNA to ten sam zestaw, który jest używany do odwrotnej transkrypcji we wszystkich trzechTaqMan platformach - 96-dołkowej, TLDA i OpenArray.
Do qPCR uruchomić na platformie
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, bez AmpErase UNG	Biosystemy stosowane	4367846	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix służy do qPCR na  dwie platformy TaqMan - platforma 96-studniowa i TLDA.
MicroAmp Optyczna folia samoprzylepna	Applied Biosystems	4311971	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna, 0,1 ml	Applied Biosystems	4346907	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
Platforma mikroprzepływowa (TLDA)
Do odwrotnej transkrypcji
Zapoznaj się z zestawem 96-dołkowej platformy TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (4366597 lub 4366596) (jak pokazano powyżej).
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1	Applied Biosystems	4399966	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 służy do RT na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0	Applied Biosystems	4444281	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 służy do RT na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
LUB			LUB
Megaplex Primer Pools, zestaw basenów dla ludzi v3.0	Applied Biosystems	4444750	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 służy do RT na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
Do pre-amplifikacji
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems	4391128 lub 4488593	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 lub http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 TaqMan PreAmp Master Mix służy do wstępnego wzmacniania qPCR na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
Megaplex PreAmp Primer, Human Pool B v3.0	Biosystemy stosowane	4444303	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 służy do wstępnego wzmacniania qPCR na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1	Applied Biosystems	4399233	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 służy do wstępnego wzmacniania qPCR na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
1x Bufor TE (100 ml)	Invitrogen	12090-015	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product Bufor 1x TE służy do wstępnej amplifikacji qPCR on  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
Aby załadować i uruchomić 384-dołkową kartę
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0	Applied Biosystems	4444913	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
Nanofluidics (OpenArray)
Do odwrotnej transkrypcji
Zapoznaj się z zestawem do odwrotnej transkrypcji TaqMan MicroRNA z 96 dołkami (4366597 lub 4366596) (jak pokazano powyżej).
Aby uzyskać informacje na temat wstępnego amplifikacji
zapoznaj się z odczynnikami do wstępnej amplifikacji TLDA (jak pokazano powyżej)
Aby załadować i uruchomić slajdy
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)	Applied Biosystems	4470187	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
Zestaw akcesoriów do QuantStudio 12K Flex OpenArray	Biosystemy stosowane	4469576
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 384-dołkowe płytki próbne OpenArray	Biosystemy stosowane	4406947	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix	Applied Biosystems	4462159	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159
Wskazówki dotyczące systemu OpenArray AccuFill	Biosystemy stosowane	4457246	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246
inne
Woda wolna od nukleaz	Qiagen	129117	http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water