Artykuł metodologiczny

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

35.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52586

⸱

14 kwietnia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Diabetes and Islet Biology Group, NHMRC Clinical Trials Centre, Faculty of Medicine, The University of Sydney, 2Biomarkers Laboratory, NHMRC Clinical Trials Centre, Faculty of Medicine, The University of Sydney

W tym artykule

Podsumowanie

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Streszczenie

Ilościowy PCR oparty na sondach (qPCR) jest preferowaną metodą pomiaru obfitości transkryptów, ponieważ jest to jedna z najbardziej czułych metod wykrywania, która zapewnia dokładną i powtarzalną analizę. Chemia oparta na sondzie oferuje najmniejszą fluorescencję tła w porównaniu z innymi chemikaliami (opartymi na barwnikach). Obecnie dostępnych jest kilka platform, które wykorzystują chemię opartą na sondzie do ilościowego określania obfitości transkryptów. qPCR na płytce 96-dołkowej jest najczęściej stosowaną metodą, jednak w jednym cyklu można przetestować maksymalnie 96 próbek lub miRNA. Jest to czasochłonne i żmudne, jeśli ma być analizowana duża liczba próbek/miRNA. Wysokowydajne platformy oparte na sondach, takie jak macierze mikrofluidyczne (np. TaqMan Array Card) i macierze nanofluidyczne (np. OpenArray), zapewniają łatwość powtarzalnego i wydajnego wykrywania obfitości wielu mikroRNA w dużej liczbie próbek w krótkim czasie. Tutaj demonstrujemy eksperymentalną konfigurację i protokół kwantyfikacji miRNA z próbek surowicy lub osocza-EDTA, wykorzystując chemię opartą na sondzie i trzy różne platformy (płytki 96-dołkowe, macierze mikrofluidyczne i nanofluidyczne) oferujące rosnące poziomy przepustowości.

Wprowadzenie

MikroRNA (miRNA) to ~22 nukleotydowe niekodujące (nc)RNA, funkcjonujące jako regulatory ekspresji genów1-3. Większość miRNA u zwierząt funkcjonuje poprzez specyficzne dla sekwencji parowanie zasad z mRNA, ukierunkowane na 3' UTR, co prowadzi do negatywnej regulacji ekspresji genu2-4. Zwykle dzieje się to poprzez hamowanie translacji mRNA lub spadek rybosomów. Wykazano, że miRNA w krążeniu są nowymi biomarkerami w badaniach i dziedzinach klinicznych dla różnych chorób, takich jak cukrzyca5-7, jajnik8, prostata9 i rak piersi10,11, wirusowe zapalenie wątroby typu B12 i inne choroby autoimmunologiczne13. Przeprowadzono badania w celu zidentyfikowania obfitych miRNA w różnych komórkach lub tkankach, a także w krążeniu z próbek ludzkiego osocza i surowicy, co jest bardziej dostępne i mniej inwazyjne9,11-15.

Różne metody kwantyfikacji miRNA zostały ustalone przy użyciu wielu platform, takich jak standardowa platforma 96-dołkowa 4,12,16-18, platforma kart mikrofluidycznych12,18-23 i platforma tablic nanofluidycznych17,24. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) oferuje możliwość pomiaru względnej lub bezwzględnej liczby transkryptów przy użyciu wielu (opartych na barwniku lub sondzie) substancji chemicznych. Chemia PCR w czasie rzeczywistym oparta na sondzie oferuje korzyści płynące z niskiej fluorescencji tła i wysokiej czułości wykrywania pojedynczej kopii transkryptu. Jest stosunkowo opłacalna, prosta w użyciu i wysoce odtwarzalna, co czyni ją ulubioną metodą ilościowego określania i określania ekspresji miRNA25. Metoda qPCR oparta na sondzie zazwyczaj obejmuje dwa etapy: odwrotną transkrypcję (RT) i qPCR4,26,27. RT to miejsce, w którym starter RT pętli macierzystej jest hybrydyzowany z dojrzałą lub pierwotną cząsteczką miRNA i przekształcany w komplementarne (c)DNA. Kwantyfikacja produktu cDNA jest następnie przeprowadzana przy użyciu starterów PCR specyficznych dla miRNA26-28. Zasada działania qPCR opartego na sondzie opiera się na wykrywaniu wydłużenia nici komplementarnej w czasie rzeczywistym, co wiąże się z hydrolizą sondy znakowanej fluorescencyjnie. Sondy te są zaprojektowane tak, aby zawierały fluorescencyjny reporter i wygaszacz, które są po prostu oddalone od siebie, aby umożliwić FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Detekcja emisji z reportera fluorescencji (emitera) jest maskowana przez bliskie sąsiedztwo cząsteczki wygaszającej. Kiedy polimeraza Taq (pol) rozciąga się od startera i dociera do widelca (końca 5' sondy), aktywność egzonukleazy Taq pol hydrolizuje sondę, prowadząc do fizycznej dysocjacji/oddzielenia emitera fluorescencyjnego od wygaszacza. To uwolnienie pojedynczej cząsteczki emitera fluorescencji jest rejestrowane przez detektor i przedstawiane jako przyrostowy wzrost sygnału fluorescencji z tej studni/reakcji. Wzrost fluorescencji jest proporcjonalny do ilości wygenerowanego produktu PCR, co pozwala na dokładne określenie ilościowe amplifikowanego celu26,28.

Wraz z rosnącym zapotrzebowaniem na kwantyfikację miRNA, opracowano technologie średnio- i wysokoprzepustowe, które pozwalają na przetwarzanie większej liczby próbek w krótkim czasie. TaqMan Low Density Array (TLDA) to średnioprzepustowa, innowacyjna konstrukcja mikroprzepływowa oparta na chemii qPCR opartej na sondzie, oferująca wzrost liczby analizowanych miRNA na jednej płytce. TLDA polega na użyciu predefiniowanej puli starterów RT, które są używane do syntezy cDNA. Te cDNA są następnie przędzone do dostosowanej 384-dołkowej karty mikroprzepływowej w celu określenia ekspresji wielu miRNA za pomocą qPCR22,26,29. Każda studzienka karty zawiera wysuszone startery i sondy do amplifikacji określonych miRNA, dlatego na jednej karcie TLDA26 można przetworzyć do 384 reakcji.

Tablica nanofluidyczna to platforma o wysokiej przepustowości, która jest używana do wykrywania transkryptów genów24 przy użyciu tej samej chemii opartej na sondzie. Wykorzystuje opatentowaną matrycę oferującą oddziaływania hydrofobowo-hydrofilowe, aby ułatwić łatwe ładowanie 33-nanolitrowej mieszaniny reakcyjnej do zestawu 3072 otworów przelotowych na suwaku ze stali nierdzewnej24. Ten artykuł koncentruje się na zademonstrowaniu, w jaki sposób te metody ilościowego oznaczania miRNA w surowicy/osoczu są wykonywane oraz krytycznych czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania i interpretacji takich danych. Biorąc pod uwagę, ich indywidualne zalety i ograniczenia zostaną omówione w tym artykule.

Protokół

Całkowite RNA można wyizolować z surowicy za pomocą protokołu ustalonego w naszym laboratorium 30 lub przy użyciu innych dostępnych na rynku zestawów.

UWAGA: Dostępne są dodatkowe interaktywne arkusze kalkulacyjne do obliczania objętości reakcji w każdym eksperymencie (z uwzględnieniem 5% nadwyżki objętości przypadającej na pipetowanie).

1. qPCR w czasie rzeczywistym oparty na sondzie przy użyciu standardowej platformy 96-dołkowej płytki

  1. Synteza cDNA (odwrotna transkrypcja) na próbkach RNA surowicy/osocza dla miRNA
    1. Obliczyć i pobrać 10 ng RNA dla każdej reakcji syntezy cDNA. Dodaj wodę wolną od nukleaz, aby doprowadzić końcową objętość 10 ng RNA do 1,67 μl (dla reakcji 5 μl). Próbki należy przechowywać na lodzie.
    2. Wybierz miRNA i rozmroź ich startery RT.
    3. Rozmrozić składniki mieszanki odczynników RT: bufor RT (10X), dNTPs (100 mM), inhibitor RNazy (20 U/μl). Nigdy nie przechowywać enzymu (rekombinowanego wirusa białaczki mysiej moloney (rMoMuLV)) (rekombinowanego wirusa białaczki myszy moloney (rMoMuLV) odwrotnej transkryptazy (50 U/μl) na lodzie. Przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu potrzeby lub w zamrażarce.
    4. Przygotować mieszaninę odczynników RT na lodzie, jak opisano w tabeli 1A. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
    5. Dodać po 2,33 μl odczynnika RT do probówki/płytki PCR o pojemności 0,2 ml.
    6. Zmieszaj probówki ze starterem RT w celu wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund. Dodaj 1 μl startera RT specyficznego dla miRNA do odpowiednich probówek lub płytki PCR. Dodaj 1,67 μl rozcieńczonego RNA do odpowiednich probówek lub dołków PCR na płytce. Wykonaj wszystkie dodatki na lodzie.
    7. Odwirować probówkę lub płytkę reakcyjną o stężeniu 1,950 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Ustaw program syntezy cDNA miRNA na termocyklerze w następujących warunkach ustawienia: 16 °C przez 30 minut, 42 °C przez 30 minut, 85 °C przez 5 minut i 4 °C w zawieszeniu.
    9. Ustawić objętość reakcyjną na 10 μl. Załadować probówki lub płytkę reakcyjną do termocyklera. Rozpocznij przebieg RT. Reakcje cDNA (RT) należy przechowywać w temperaturze -20 °C, jeżeli amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym nie jest natychmiast przeprowadzana.
  2. Oparty na sondzie qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania dojrzałych miRNA
    1. Rozmrozić wybrane testy qPCR oparte na sondzie (20X) dla odpowiedniego produktu RT.
    2. Wymieszaj odpowiedni roztwór PCR w czasie rzeczywistym (mieszanina odczynników qPCR), obracając butelkę.
    3. Przygotuj mieszaninę odczynników qPCR dla każdego miRNA, które ma być analizowane. Aby przygotować qPCR, należy uzyskać sterylną probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki miRNA i dodać składniki do każdej probówki, jak opisano w tabeli 1B. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
    4. Dodać 4,2 μl odpowiedniej mieszaniny odczynników qPCR do każdego dołka 96-dołkowej płytki optycznej (lub probówek). Dodaj 0,8 μl odpowiedniej reakcji cDNA (zsyntetyzowanej w kroku 1.1 dla każdego miRNA) do odpowiedniej studzienki.
    5. Uszczelnij płytkę odpowiednią osłoną optyczną. Odwirować płytkę (lub probówki) o sile 1,950 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C
    6. Włącz komputer, 96-dołkowy czytnik płytek/matryc mikrofluidycznych i na koniec uruchom oprogramowanie. Upewnij się, że maszyny są prawidłowo podłączone i że zamontowany jest prawidłowy blok i podgrzewana pokrywa (w przypadku szybkiej płytki 96-dołkowej).
    7. Wybierz eksperyment jako 96-dołkowy szybki blok (0,1 ml), krzywą standardową, odczynniki TaqMan i tryb szybki. Skonfiguruj qPCR w systemie Real Time PCR, używając następujących warunków cyklicznych programu: 95 °C przez 20 sekund, 50 cykli (95 °C przez 1 sekundę, 60 °C przez 30 sekund).
    8. Ustawić objętość reakcyjną na 10 μl. Załadować rurkę lub płytkę reakcyjną do przyrządu. Naciśnij "Rozpocznij bieg". Ukończenie programu zajmie około 1 godziny.

2. Karta macierzy mikrofluidycznej opartej na sondach (karta A i B)

UWAGA: Panel miRNA oparty na sondie jest dostarczany jako zestaw dwóch 384-dołkowych kart mikroprzepływowych (karta A i karta B). Każda karta zawiera wysuszone startery i sondy dla maksymalnie 380 miRNA i kontroli. Produkt cDNA (z lub bez amplifikacji wstępnej) specyficzny dla karty A lub karty B jest ładowany do odpowiedniej macierzy w celu przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym.

  1. Odwrotna transkrypcja (RT)
    1. Użyj tego protokołu, aby uzyskać całkowite wejście RNA 1-1,000 ng. Jeśli wejście mieści się w zakresie 1-350 ng, wykonaj wstępny amplifikacja (pre-amp) krok. W przypadku wejść powyżej 350 ng, załaduj cDNA bezpośrednio na karty macierzy bez pre-amp.
      UWAGA: W przypadku profilowania miRNA w surowicy zacznij od 100 ng całkowitego RNA. Aby uzyskać pełny profil miRNA, uruchom dwie predefiniowane pule zestawów starterów RT reakcji RT (Pula A i Pula B) na próbkę.
    2. Rozmrozić następujące odczynniki na lodzie. Startery RT (10x): Pool A i Pool B, dNTP z dTTP (100 mM), bufor RT (10x), MgCl2 (25 mM), inhibitor RNazy (20 U/μl). Nie przechowywać enzymu (rekombinowanego wirusa białaczki moloneowej myszy (rMoMuLV)) odwrotnej transkryptazy (50 U/μl) na lodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
    3. Delikatnie zwirować wszystkie odczynniki, z wyjątkiem enzymu, a następnie krótko odwirować probówki o sile 10 000 x g przez 10 sekund.
    4. Połączyć odczynniki, jak opisano w tabeli 2A, w dwóch probówkach; jedną probówkę dla grupy A, drugą dla grupy B. Każda probówka będzie zawierała tylko jedną predefiniowaną pulę zestawu starterów RT, z puli A lub z puli B. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
    5. Odwrócić w celu wymieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Podwielokrotność 100 ng każdej próbki RNA do nowej probówki, a następnie dodać odpowiednią objętość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać w sumie 3 μl.
    6. Podwielokrotność 4,5 μl odpowiedniego odczynnika RT wymieszać z odpowiednimi probówkami. Odwrócić do mieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
    7. Umieścić próbki w termocyklerze i uruchomić RT w następujących warunkach: 40 cykli (16 °C przez 2 min, 42 °C przez 1 min, 50 °C przez 1 sek.), 85 °C przez 5 min, przechowywać w temperaturze 4 °C. Przechowywać cDNA wytworzone przy użyciu tej predefiniowanej puli starterów RT w temperaturze od -15 do -25 °C lub zużyć natychmiast.
  2. Wstępne wzmocnienie
    1. Rozmrozić predefiniowaną pulę starterów przed ampem na lodzie. Delikatnie zwiruj startery, a następnie krótko odwiruj je przy 10 000 x g przez 10 sekund. Zawiruj mieszankę odczynników TaqMan PreAmp (2X), delikatnie stukając, aby wymieszać.
    2. Połączyć odczynniki, jak opisano w tabeli 2B, w dwóch probówkach; w jednej probówce dla grupy A, a drugiej dla grupy B.
      UWAGA: Jak opisano powyżej, startery przedwzmacniacza z puli A trafią do lampy A, a startery z puli B powinny trafić do lampy B. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
    3. Odwrócić w celu wymieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Podwielokrotność 22,5 μl odpowiedniego odczynnika PreAmp wymieszać z nowymi probówkami. Podwielokrotność 2,5 μl próbki cDNA (przygotowanej na etapie RT) do odpowiedniej probówki.
    4. Odwrócić do mieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Umieść próbki w termocyklerze i rozpocznij cykl pre-amp. Warunki cyklu: 95 °C przez 10 min, 55 °C przez 2 min, 72 °C przez 2 min, 12 cykli (95 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 4 min), 99,9 °C przez 10 min, utrzymuj w temperaturze 4 °C.
    5. Odwróć wstępnie amplifikowane cDNA w celu wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund. Dodaj 75 μl 0,1x buforu TE (pH 8,0) do wstępnie amplifikowanego cDNA (rozcieńczenie 1:4). Odwróć rozcieńczone próbki przedwzmacniacza do wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund. Rozcieńczony, wstępnie amplifikowany cDNA należy przechowywać w temperaturze od -15 do -25 °C przez okres do jednego tygodnia lub zużyć natychmiast.
  3. Ładowanie kart mikrofluidycznych i wykonywanie qPCR
    1. Trzymaj karty miRNA mikrofluidyki na zewnątrz przez co najmniej pół godziny, aby osiągnąć temperaturę pokojową. Rozcieńczyć, wstępnie amplifikowane cDNA na lodzie i wymieszać, odwracając rurki, a następnie krótko wirując. Wymieszaj mieszaninę odczynnika qPCR, obracając butelkę.
    2. W nowej probówce dodać 450 μl mieszaniny odczynników qPCR do 9 μl rozcieńczonego, wstępnie amplifikowanego cDNA. W przypadku karty A należy użyć wstępnie amplifikowanego produktu przygotowanego przy użyciu puli startera A. Dodać 441 μl wody wolnej od nukleaz, aby uzupełnić końcową objętość do 900 μl. Odwróć probówkę do wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund.
    3. Wyjmij kartę TLDA z opakowania (gdy osiągnie temperaturę pokojową) i umieść ją w czystym miejscu folią do dołu. Dodaj 100 μl mieszaniny reakcyjnej PCR do każdego z 8 portów napełniania na karcie. Na każdym ze zbiorników znajdują się 2 porty (w sumie 8 zbiorników na każdej karcie).
      UWAGA: Port napełniania to większy otwór, do którego dodawana jest mieszanina reakcyjna, podczas gdy port odpowietrzający to mniejszy otwór. Każda karta miRNA TLDA ma 8 zbiorników, z których każdy prowadzi do 48 dołków (24 dołki w jednej kolumnie x 2 kolumny), ładując w ten sposób wszystkie 384 dołki na karcie tą samą mieszanką reakcyjną PCR. Upewnij się, że pula A i pula B każdej próbki są załadowane na odpowiednie karty TLDA. Umieść kartę macierzy w specjalistycznych wiaderkach z matrycą mikrofluidyczną w wirówce.
    4. W przypadku kart z matrycą mikroprzepływową należy użyć odpowiedniej wirówki (takiej jak wirówka Heraeus Multifuge 3SR, 230 V) i specjalnych wiader (takich jak uchwyty "TaqMan Array Card"). Każde wiadro może pomieścić do 3 kart (załadowanych / pustych). Zawsze upewnij się, że wszystkie 3 szczeliny wiadra są zajęte, a wiadro jest zrównoważone, umieszczając podobne wiadro (to wiadro powinno również zawierać 3 karty, puste lub pełne) w przeciwległym gnieździe wirówki. Umieszczając kartę w uchwycie wiadra, upewnij się, że 8 zbiorników wystaje do góry, a studzienki reakcyjne są skierowane w stronę zewnętrznej ścianki wirówki.
      1. Obracaj karty w temperaturze 331 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Po pierwszym wirowaniu otwórz wirówkę i wizualnie upewnij się, że mieszanina reakcyjna została dozowana przez 384 dołki. Powtórz wirowanie z tymi samymi ustawieniami jeszcze 1 raz. Wyjmij kartę z wiadra i upewnij się, że poziom mieszaniny reakcyjnej w każdym z 8 zbiorników jest równomierny. Wszelkie niespójności w objętościach płynów pozostawionych w zbiornikach powodują, że karta nie nadaje się do dalszego użytkowania.
    5. Karty matrycowe Microfluidics wymagają specjalistycznego uszczelniacza, który ma precyzyjny zespół trzpienia pomiarowego (wózek) do uszczelniania kanałów dystrybucji płynów w matrycy i równomiernego rozprowadzania mieszaniny reakcyjnej we wszystkich studzienkach (całkowita objętość reakcji 1 μl/dołek).
    6. Ustaw karetkę w pozycji wyjściowej i włóż załadowaną kartę do zgrzewarki folią do góry i wyrównaną z kołkami rysika na zgrzewarce. Powolnym, równomiernym i pojedynczym, równomiernym ruchem popchnij karetkę w poprzek karty, aż dotrze do punktu końcowego zgrzewarki. Wyjmij zapieczętowaną kartę macierzową, a następnie odetnij zbiorniki od karty za pomocą nożyczek.
    7. Upewnij się, że w systemie/maszynie do PCR w czasie rzeczywistym zainstalowany jest właściwy blok, podgrzewana pokrywa i nośnik próbki.
    8. Włącz komputer, następnie system macierzy mikrofluidycznej i na koniec uruchom oprogramowanie. Upewnij się, że maszyny są prawidłowo podłączone. Wybierz eksperyment jako kartę tablicy, krzywą standardową, odczynniki TaqMan i tryb standardowy. Zaimportuj pliki instalacyjne dla karty A i karty B. Zapisz plik.
    9. Umieść zapieczętowaną kartę w tacy na instrumenty z dołkiem A1 w lewym górnym rogu i kodem kreskowym skierowanym z przodu instrumentu. Naciśnij "Rozpocznij bieg". Ukończenie programu zajmie około 2 godzin.

3. Panel ludzkiego miRNA oparty na nanofluidyce opartej na sondzie

  1. Odwrotna transkrypcja (RT)
    1. Użyj tego protokołu, aby uzyskać całkowity wkład RNA 50-200 ng, jednak 100 ng jest optymalne dla większości próbek. Aby uzyskać pełny profil miRNA, uruchom dwie predefiniowane pule zestawów starterów RT reakcji RT (Pula A i Pula B) na próbkę.
    2. Rozmrażanie odczynników na lodzie: predefiniowana pula zestawów starterów RT (10X), dNTP z dTTP (100 mM), bufor RT (10x), MgCl2, (25 mM), inhibitor RNazy (20 U/μl). Nie przechowywać enzymu (rekombinowanego wirusa białaczki mysiej moloney (rMoMuLV) odwrotnej transkryptazy (50 U/μl) na lodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny. Delikatnie zwirować wszystkie odczynniki, z wyjątkiem enzymu, i krótko je odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund.
    3. Połączyć odczynniki, jak opisano w tabeli 3A, w dwóch probówkach; jedną probówkę dla grupy A, drugą dla grupy B. Każda probówka będzie zawierała tylko jedną predefiniowaną pulę zestawu starterów RT, z puli A lub z puli B. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
    4. Odpipetować do wymieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Podwielokrotność 100 ng każdej próbki RNA do nowej probówki, a następnie dodać odpowiednią objętość wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać w sumie 3 μl. Podwielokrotność 4,5 μl odpowiedniego odczynnika RT wymieszać do odpowiedniej probówki.
    5. Odwrócić do mieszania, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund. Inkubować na lodzie przez 5 minut. Umieścić próbki w termocyklerze i uruchomić program RT. Warunki cyklu: 40 cykli (16 °C przez 2 min, 42 °C przez 1 min, 50 °C przez 1 sek.), 85 °C przez 5 min, utrzymywać w temperaturze 4 °C. Przechowywać cDNA wytworzone przy użyciu tej predefiniowanej puli starterów RT ustawionych w temperaturze od -15 do -25 °C lub natychmiast zużyć.
  2. Przedwzmacniacz (przedwzmacniacz)
    1. Rozmrozić predefiniowaną pulę startera pre-amp ustawionego na lodzie. Delikatnie zwiruj startery, a następnie krótko odwiruj je przy 10 000 x g przez 10 sekund. Zawijaj mieszankę odczynników TaqMan PreAmp (2X), aby wymieszać.
    2. Połączyć odczynniki, jak opisano w tabeli 3B, w dwóch probówkach; jednej probówce dla grupy A, drugiej dla grupy B. Każda probówka będzie zawierała tylko jedną predefiniowaną pulę zestawów starterów RT, z puli A lub z puli B. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5% nadmiaru objętości w celu skompensowania błędu pipetowania.
    3. Odpipetować do wymieszania, a następnie krótko odwirować je przy 10 000 x g przez 10 sek. Porcję 22,5 μl odpowiedniego odczynnika PreAmp wymieszać z nowymi probówkami. Podwielokrotność 2,5 μl próbki cDNA do odpowiedniej probówki. Odwrócić do mieszania, a następnie krótko odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 10 sekund. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
    4. Umieść próbki w termocyklerze i uruchom przedwzmacniacz. Ustawić objętość reakcji na 25 μl. Warunki cyklu: 95 °C przez 10 min, 55 °C przez 2 min, 72 °C przez 2 min, 12 cykli (95 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 4 min), 99,9 °C przez 10 min, utrzymuj w temperaturze 4 °C.
    5. Odwróć wstępnie amplifikowane cDNA do wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund. W nowych probówkach dodać 4 μl wstępnie amplifikowanego cDNA do 156 μl 0,1x buforu TE pH 8,0 (rozcieńczenie 1:40). Odwróć rozcieńczone próbki przedwzmacniacza do wymieszania, a następnie krótko odwiruj przy 10 000 x g przez 10 sekund. Rozcieńczone i nierozcieńczone wstępnie amplifikowane cDNA należy przechowywać w temperaturze od -15 do -25 °C przez okres do jednego tygodnia lub natychmiast zużyć.
  3. Wczytywanie tablic nanofluidycznych i wykonywanie qPCR
    1. Pobierz odpowiedni plik płytki (.tpf) ze strony internetowej31, używając numeru seryjnego szkiełka nanofluidics ray. Zawiera on informacje o przebiegu dla konkretnego slajdu z matrycą nanofluidyczną.
    2. Rozmrozić rozcieńczone, wstępnie amplifikowane cDNA i mieszankę odczynników TaqMan Real-Time qPCR (jeśli używasz po raz pierwszy) na lodzie. Wymieszaj mieszaninę odczynnika qPCR, obracając butelkę. W nowych probówkach dodać 22,5 μl mieszaniny odczynników qPCR do 22,5 μl rozcieńczonego, wstępnie amplifikowanego cDNA. Delikatnie zmieszać, a następnie krótko odwirować przy 10 000 x g przez 10 sekund.
    3. Porcjować 5 μl każdej próbki do 8 dołków (2 kolumny, 4 rzędy) 384-dołkowej płytki z próbką przepływu pracy nanofluidics. Upewnij się, że pula A i pula B każdej próbki znajdują się w sąsiednich blokach 8-dołkowych (patrz rysunek 1 lub dodatkowy arkusz Excela dla układu).
      1. Każda płytka z próbką może zawierać do ośmiu preparatów z próbkami. Jednak system dla macierzy nanofluidycznej może przetwarzać tylko 4 tablice nanofluidyczne w jednym przebiegu. Jeśli na jedną płytkę próbną mają zostać załadowane więcej niż cztery szkiełka próbek, należy upewnić się, że pozostałe sekcje są szczelnie zamknięte. Uszczelnij za pomocą zgrzewarki OpenArray.
        UWAGA: Zaleca się wstępne pocięcie zgrzewarki na wymagane sekcje, aby sekcje mogły być uszczelniane/rozszczelniane pojedynczo w celu zmniejszenia parowania. Alternatywnie płyta może być uszczelniona za pomocą nienaruszonego uszczelniacza, a następnie sekcje mogą być indywidualnie wycinane podczas załadunku.
    4. Płytkę wirówkową o masie 490 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Załadować szkiełka z matrycą nanofluidyczną w ciągu 1 godziny. Ze względu na ograniczony czas przeznaczony na uszczelnienie szkiełek, należy ładować tylko jedno szkiełko na raz. Wyjmij szkiełko z matrycy nanofluidycznej z zamrażarki i pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową (~15 min).
    5. Upewnij się, że w systemie macierzy nanofluidics zainstalowany jest właściwy blok, podgrzewana pokrywa i nośnik próbki. Włącz komputer i system PCR w czasie rzeczywistym oraz system ładowania. Uzyskaj dostęp do odpowiedniego oprogramowania i upewnij się, że maszyny są połączone. Wyjmij materiały eksploatacyjne systemu załadowczego (przesuwną pokrywę matrycy, korek i płyn zanurzeniowy) z opakowania.
    6. Delikatnie pociągnąć za tłok strzykawki z płynem zanurzeniowym, aby go poluzować. Zdejmij nakrętkę, załóż końcówkę i spłucz powietrze z końcówki. Umieść końcówki systemu ładowania w maszynie i zdejmij pokrywę. Umieścić płytkę z próbką w systemie PCR.
    7. Załóż rękawiczki. Upewnij się, że są szczelnie dopasowane, aby zminimalizować ryzyko przypadkowego zaznaczenia pokrywy przesuwnej. Ostrożnie otwórz opakowanie szkiełkowe. Powoli przechyl wsuwkę w dłoń. Nie dotykaj górnej części zjeżdżalni.
    8. Umieść szkiełko w systemie PCR, z kodem kreskowym po lewej stronie. Usunąć uszczelniacz z części płytki próbki przeznaczonej do załadunku. Użyj oprogramowania systemu ładowania, aby wprowadzić kod kreskowy szkiełka, pozycję szkiełka, pozycję próbki i konfigurację końcówki.
    9. Po zakończeniu wszystkich odpowiednich kontroli naciśnij suwak obciążenia. Podczas gdy system PCR ładuje szkiełko, usuń przezroczysty i czerwony plastik z dolnej części pokrywy szkiełka. Po zakończeniu załadunku ostrożnie wyjmij i uszczelnij suwak w ciągu 90 sekund.
      1. Umieść suwak w płycie clamp. Umieść pokrywę prowadnicy na szkiełku. Clamp na 30 sek. Upewnij się, że pokrywa jest ustawiona tak, aby kod kreskowy był prawidłowo wyświetlany. Zdejmij zespół z płyty clamp.
      2. Umieścić strzykawkę z płynem zanurzeniowym w szkiełku tak, aby końcówka naciskała na pokrywę. Powoli napełnij szkiełko płynem zanurzeniowym, upewniając się, że płyn spływa wzdłuż pokrywy. Po napełnieniu uszczelnij suwak korkiem, przekręcając, aż uchwyt się oderwie.
      3. Zdejmij plastikową osłonę z górnej części pokrywy szkiełka, a następnie ostrożnie umieść ją w uchwycie szkiełka systemu PCR w czasie rzeczywistym. Upewnij się, że na dole zjeżdżalni znajduje się podparcie podczas jej opuszczania, aby nie opadła nagle i nie dotykała górnej części zjeżdżalni. Można dotykać boków prowadnicy/kasety. Zainicjuj system PCR i uruchom program do qPCR w ciągu 1 godziny.
    10. Wybierz "OpenArray" w oprogramowaniu systemu PCR. Naciśnij "Znajdź identyfikatory slajdów". Zajmie to kilka minut. Jeśli oprogramowanie nie może znaleźć identyfikatora tablicy, poprosi o jego ręczne wprowadzenie.
    11. Naciśnij przycisk "Potwierdź środki płyty". Ponownie, zajmie to kilka minut. Sprawdź, czy czerwona kropka znajduje się na środku i czy na górze szkiełka nie ma odcisków palców/śladów. Załaduj odpowiedni plik .tpf dla każdego slajdu i określ nazwę pliku wynikowego oraz lokalizację. Naciśnij "Rozpocznij bieg". Ukończenie programu zajmie około 2 godzin.

Wyniki

Zalecana objętość reakcji qPCR w teście opartym na sondach miRNA wynosi 20 µl. UWAGA: Potwierdziliśmy, że objętość reakcji 5 µl pozwala uzyskać wyniki zbliżone do tych osiągniętych przy objętości 20 µl4,7,30. Zmniejszenie objętości reakcji do 5 µl pozwala na redukcję kosztów odczynników o 75% bez znaczącej utraty czułości. Jak przedstawiono na Rysunku 2, objętości reakcji 20 µl i 5 µl wykazują silną korelację do 39 cykli (przy r2 wynoszącym 0,92, p = 0,0002).

Macierz mikrofluidyczna stanowi narzędzie do uzyskiwania danych na temat 754 miRNA ekspresjonowanych w próbce w czasie około 5 h (dla karty A i karty B), co jest bardziej wydajnym sposobem analizy wielu próbek w porównaniu do konwencjonalnych reakcji PCR na płytkach 96-dołkowych. Porównaliśmy karty macierzy mikrofluidycznej miRNA dla tej samej próbki (próbka A i powtórzenie próbki A). Rycina 3A-B przedstawia wykres Blanda-Altmana (3A) oraz wykres korelacji (3B) dla wszystkich 754 miRNA przetestowanych w tych próbkach. Na obu kartach (karta A i B) w wielu miejscach rozmieszczono losowo 3 różne kontrolne miRNA (U6, RNU44 i RNU48). Po porównaniu wartości progu cyklu (Ct) dla U6 pomiędzy dwoma przebiegami nie zaobserwowano istotnych różnic między wartościami (Tabela 4). Należy tutaj również zauważyć, że U6 wykazuje większą obfitość ekspresji (niższa wartość Ct) w analizowanej próbce. Następnie porównaliśmy wszystkie miRNA, których wartości Ct w obu przebiegach mieściły się w zakresie 0-19,99 (n = 150); wykazały one ogólnie podobną ekspresję miRNA z współczynnikiem determinacji wynoszącym 98% (Rycina 3C-D). Spośród wszystkich 277 miRNA, których wartości Ct w obu przebiegach mieściły się w zakresie od 20 do 29,99, 16 miRs różniło się istotnie pomiędzy przebiegiem oryginalnym a powtórzeniem (Rycina 3E-F). Liczba miRNA z istotną różnicą między przebiegami wzrosła (89 z 327), gdy wybrano wartości Ct w zakresie 30-40 dla obu przebiegów (Rycina 3G-H).

Platforma z matrycą nanofluidyczną dostarcza danych dla 754 miRNA z każdej przebadanej próbki surowicy/osocza, co przedstawiono na rysunku 4A. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów qPCR, istotna jest analiza tych krzywych amplifikacji, aby upewnić się, że wynik wskazuje na rzeczywistą amplifikację. Każda z 48 podmatryc (rysunek 1) zawiera również testy dla trzech najpopularniejszych niekodujących RNA „housekeepingowych”: U6, RNU44 i RNU48. Rysunek 4B ilustruje typową klastryzację powtórzeń U6 z jednej próbki. Powtórzenia te wykazują niskie odchylenie standardowe (SD <0,5), co stanowi wskaźnik wiarygodności. Z kolei rysunek 4C demonstruje zwiększoną zmienność powtórzeń U6 (SD >0,5) w drugiej próbce. Nie podważa to ważności pozostałych testów, choć wymaga dokładniejszej analizy krytycznej. U6, podobnie jak większość miRNA „housekeepingowych” w płynach ustrojowych, może wykazywać zmienną ekspresję. Należy zauważyć, że jedna z próbek, przedstawiona na rysunku 4C, wykazuje 4-krotnie niższą zawartość U6 niż ta zaprezentowana na rysunku 4B. Ponieważ poziom U6 w próbce przedstawionej na rysunku 4C jest początkowo o 75% niższy niż w próbce z panelu 4B, spodziewana jest większa zmienność techniczna ze względu na rozkład Poissona transkryptów, co jest potęgowane przez małą objętość reakcji17.

Kolejnym przydatnym narzędziem są obrazy kontroli jakości (QC), które są dostępne do eksportu po zakończeniu przebiegu. Wybrane z nich wykorzystują fluorescencję ROX, pasywnego barwnika zawartego w mieszaninie odczynników qPCR, aby potwierdzić, że każdy otwór przelotowy został prawidłowo napełniony (Rysunek 5). Otwór przelotowy, a nawet cała podmacierz, mogą nie zostać napełnione z powodu niewystarczającej objętości próbki, odparowania, pęcherzyków powietrza w dołkach płytki z próbkami 384-dołkowej, niecałkowitego usunięcia folii uszczelniającej płytkę z próbkami lub wad w systemie Accufill lub jego końcówkach. Należy zidentyfikować wszystkie nienapełnione otwory przelotowe, aby uniknąć klasyfikowania miRNA jako „niewykrywalne”, podczas gdy w rzeczywistości test w ogóle nie został napełniony. W przypadku wystąpienia tego problemu należy potwierdzić, że do każdego dołka płytki 384-dołkowej wprowadzono co najmniej 5 µl próbki/mastermixu, płytka z próbkami została prawidłowo odwirowana przed napełnieniem, folia uszczelniająca została całkowicie usunięta, a załadowana płytka OpenArray została uszczelniona i uruchomiona w wyznaczonym czasie dla wszystkich kolejnych przebiegów. Jeśli problemy z napełnianiem nadal występują, mogą one wynikać z konkretnej partii lub serii macierzy lub powiązanych materiałów eksploatacyjnych; w takim przypadku należy skontaktować się z producentą w celu uzyskania dalszej pomocy.

Schemat płyty 384-dołkowej OpenArray z układem próbek dla załadunku systemu AccuFill i slajdu OpenArray.
Rysunek 1: Układ próbek dla procedury z wykorzystaniem matryc nanofluidycznych: (A) Każda płyta 384-dołkowa z próbkami może pomieścić próbki dla maksymalnie 8 matryc nanofluidycznych. (B) Rozcieńczone, wstępnie namnożone cDNA jest umieszczane w 8 dołkach (2 kolumny na 4 rzędy), przy czym Pool A i Pool B znajdują się w sąsiednich grupach 8-dołkowych. Każde koło reprezentuje jeden dołek. (C) Każdy dołek płyty z próbkami zostanie załadowany do jednej podmatrycy matrycy nanofluidycznej. Każdy mały kwadrat reprezentuje jedną podmatrycę.

Wykres regresji liniowej dla objętości reakcji 5-20 µl, ilustrujący korelację danych w wynikach eksperymentu.
Rycina 2: Analiza korelacji dla konwencjonalnych platform PCR 96-dołkowych: Korelacja między objętościami reakcji 20 µl i 5 µl w badaniu TaqMan Real-time qPCR z wykorzystaniem standardowej platformy z płytką 96-dołkową w odniesieniu do wartości CT (39 cykli). Porównano 4 różne mikroRNA (miR-375, miR-30c, miR-30d i miR-7) w 4 różnych próbkach ludzkiego surowicy i osocza. Wykreślono tylko 11 punktów danych, ponieważ pozostałe były niewykrywalne. R2 = 0,92, p = 0,0002.

Analiza miRNA; wykresy powtarzalności wartości Ct, analiza regresji, badanie korelacji, wykres statystyczny
Rysunek 3: Profilowanie krążących miRNA z wykorzystaniem mikroprzepływowych kart matrycowych. Z wykorzystaniem 2 kart mikroprzepływowych (karta-A i karta-B) wygenerowano profil 754 miRNA (A-B). Jak pokazano tutaj, do dwóch uruchomień matrycy mikroprzepływowej wykorzystano tę samą próbkę, aby sprawdzić powtarzalność wyników z karty mikroprzepływowej. Zaobserwowano podobną ogólną ekspresję miRNA z wartościami Ct w zakresie 0-19,99 (C-D). Nieliczne miRNA (16 z 277) wykazały wartości Ct między 20 a 29,99 oraz istotne różnice między powtórzeniami serii (E-F). Osiemdziesiąt dziewięć z 327 mikroRNA o wyższych wartościach Ct (30-40) wykazało istotne różnice między obydwoma uruchomieniami (G-H). Dane przeanalizowano za pomocą testu t dla prób zależnych. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Amplifikacja PCR, ΔRn vs Cykl, seria wykresów liniowych pokazująca zmianę fluorescencji w kolejnych cyklach.
Rycina 4: Reprezentatywny profil produktu PCR Krzywe amplifikacji: Reprezentatywny wykres połączonych (A) krzywych amplifikacji dla wszystkich docelowych miRNA w próbce ludzkiej osocza. Analiza U6 (powszechny kontrolny ncRNA) jest umieszczona w każdym podmodule. Próbka w (B) wykazuje niską zmienność (SD <0,5), podczas gdy (C) wykazuje wysokie odchylenie standardowe (SD >0,5) w powtórzeniach U6. Obie próbki stanowią całkowite RNA wyizolowane z ludzkiego osocza. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza mikromacierzy; wyniki hybrydyzacji DNA; detekcja fluorescencji w układzie siatki; zastosowanie badawcze.
Rycina 5: Analiza QC macierzy nanofluidycznych: Obrazy kontroli jakości (QC) prawidłowo załadowanej macierzy nanofluidycznej (po lewej) oraz nieprawidłowo załadowanej macierzy nanofluidycznej (po prawej). Pasywny barwnik ROX (obecny w mieszaninie odczynników do qPCR) fluoreskuje, wskazując na prawidłowo załadowany otwór przelotowy. Macierz po prawej stronie posiada kilka podmacierzy/otworów przelotowych, które nie zostały załadowane mieszaniną odczynników do qPCR, co powinno zostać zidentyfikowane jako fałszywie ujemne reakcje PCR.

KomponentyObjętość na 5 µl reakcja (µl)
bufor RT (10x)0.5
dNTP (100 mM)0.05
inhibitor RNazy0.6
Woda wolna od nukleaz1.39
odwrotna transkryptaza0.33
Objętość całkowita2.33

Tabela 1A: Składniki mieszaniny odczynników do RT w preparacji 5 µl reakcji RT dla TaqMan Real-time qPCR przy użyciu standardowej platformy z płytką 96-dołkową.

SkładnikiObjętość na reakcję 5 µl (µl)Objętość na reakcję 20 µl (µl)
Fast PCR mastermix (2x)2.510
TaqMan qPCR assay (20x) *0.251
Woda wolna od nukleaz1.455.8
Objętość całkowita:4.216.8

*składnik analizy zależny od wybranego testowanego miRNA.

Tabela 1B: Składniki mieszaniny reagentów qPCR w przygotowaniu reakcji qPCR o objętości 5 lub 20 µl dla metody TaqMan Real-time qPCR z wykorzystaniem standardowej platformy z płytką 96-dołkową.

KomponentyObjętość na reakcję (µl)
Primery Megaplex RT (10x)0.8
dNTP z dTTp (100 mM)0.2
Odwrotna transkryptaza Multiscribe (50 U/µl)1.5
10X bufor do odwrotnej transkrypcji (RT)0.8
MgCl₂2 (25 mM)0.9
inhibitor RNazy (20 j./µl)0.1
Woda wolna od nukleaz0.2
Suma4.5

Tabela 2A: Składniki mieszaniny odczynników do RT w przygotowaniu 5 µl reakcji RT dla panelu miRNA TLDA.

KomponentyObjętość na jedną reakcję (µl)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x)12.5
Primery do przedwzmacniania Megaplex (10x)2.5
Woda wolna od nukleaz7.5
Suma22.5

Tabela 2B: Składniki mieszaniny odczynników PreAmp w 25 µl reakcji preamplifikacji dla panelu miRNA TLDA.

KomponentyObjętość na reakcję (µl)
Startery Megaplex RT (10x)0.75
dNTP z dTTP (100 mM)0.15
Multiscribe Reverse Transcriptase (50 U/µl)1.5
10X bufor RT0.75
MgCl₂2 (25 mM)0.9
inhibitor RNazy (20 U/µl)0.09
Woda wolna od nukleaz0.35
Suma4.5

Tabela 3A: Składniki mieszaniny odczynników do RT w przygotowaniu 5 µl reakcji RT dla panelu nanofluidycznych miRNA opartych na sondach.

SkładnikiObjętość na reakcję (µl)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x)12.5
Primery Megaplex PreAmp (10x)2.5
Woda wolna od nukleaz7.5
Suma22.5

Tabela 3B: Składniki mieszaniny odczynników PreAmp w 25 µl przygotowania reakcji preamplifikacji dla nanofluidycznego panelu miRNA opartego na sondach. UWAGA: Interaktywne uzupełniające arkusze Excel dostarczone dla trzech platform uwzględniają już 5% dodatku w celu zrekompensowania błędu pipetowania.

Próbka APowtórzenie próby A
15.53516.156
15.47115.652
15.62316.063
15.96315.889
14.00613.993
14.50214.623
14.90714.384
13.73214.946

Tabela 4: Profilowanie krążącego miRNA U6 z wykorzystaniem mikroprzepływowej karty matrycowej. Wykorzystano dwie mikroprzepływowe karty matrycowe (A i B). Wartości Ct kontrolnego miRNA U6 z próbki A (łącznie = 8). Zaobserwowano spójną zawartość kontrolnego miRNA U6 pomiędzy poszczególnymi seriami pomiarowymi.

Dyskusja

Krytycznymi krokami w protokołach qPCR opartych na sondzie w celu uzyskania dokładnych i powtarzalnych wyników jest upewnienie się, że 1) ta sama objętość i stężenie produktu RT jest ładowane w każdej reakcji qPCR, 2) właściwe proporcje i objętości składników potrzebnych do reakcji qPCR są przygotowywane i dobrze mieszane, 3) do każdej reakcji qPCR dodaje się właściwe i stałe objętości, oraz 4) przygotowanie i ładowanie każdej próbki i mieszaniny reakcyjnej odbywa się w możliwie najkrótszym czasie, przy jednoczesnym zachowaniu wyżej wymienionych krytycznych etapów.

Karty matrycowe mikrofluidyki wymagają odpowiedniej wirówki i specjalnych wiader. Każde wiadro może pomieścić do 3 kart (załadowanych / pustych). Zawsze upewnij się, że wszystkie 3 szczeliny wiadra są zajęte, a wiadro jest zrównoważone, umieszczając podobne wiadro (to wiadro powinno również zawierać 3 karty, puste lub pełne) w przeciwległym gnieździe wirówki. Umieszczając kartę w uchwycie wiadra, upewnij się, że 8 zbiorników wystaje do góry, a studzienki reakcyjne są skierowane w stronę zewnętrznej ścianki wirówki. Obracaj karty w temperaturze 331 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Po pierwszym wirowaniu otwórz wirówkę i wizualnie upewnij się, że mieszanina reakcyjna została dozowana przez 384 dołki. Powtórz wirowanie z tymi samymi ustawieniami jeszcze 1 raz. Wyjmij kartę z wiadra i upewnij się, że poziom mieszaniny reakcyjnej w każdym z 8 zbiorników jest równomierny. Wszelkie niespójności w objętościach płynów pozostawionych w zbiornikach powodują, że karta nie nadaje się do dalszego użytkowania.

Aby uzyskać takie samo stężenie produktu RT, do każdej reakcji RT dodaje się to samo stężenie wejściowe RNA. Całkowite stężenie RNA mierzy się za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Obserwowany stosunek 260/280 może wynosić zaledwie 1,3 dla RNA wyizolowanego z osocza/surowicy; Wydaje się, że nie ma to wpływu na dalszy proces związany z qPCR ani na generowane dane30. Podobnie, stosunek 260/280 badanych w próbkach RNA wynosił 1,3-1,7 bez zaobserwowanych nieprawidłowych efektów w qPCR.

W przypadku korzystania z próbek o niskiej zawartości RNA, takich jak te z płynów biologicznych, określenie ilościowe RNA przed przetwarzaniem może być trudne. Zalecamy stosowanie syntetycznego spike-in na etapie izolacji RNA, a także na etapach odwrotnej transkrypcji. Z naszego doświadczenia wynika, że kandydaci na miRNA Arabidopsis thaliana (ath-miR-159a i ath-miR-172a) są preferowani w stosunku do miRNA Caenorhabditis elegans (takich jak cel-miR-39 lub cel-miR-54), które z naszego doświadczenia mogą mieć wyższą homologię niż te z A. thaliana. Zastosowanie takiego specyficznego dla etapu skoku może wyjaśnić normalizację danych miRNA w wielu próbkach testowanych w różnym czasie. Zaleca się również stosowanie stałej objętości wejściowej RNA do reakcji syntezy cDNA32,33.

Opisane tutaj trzy protokoły kwantyfikacji miRNA oparte na sondzie wymagają różnych ilości całkowitego wkładu RNA, różnych przepływów pracy i kosztów. Każdy z przepływów pracy jest zaprojektowany tak, aby zapewnić różne przepustowości w zależności od liczby celów miRNA i liczby próbek do analizy. Wraz ze wzrostem przepustowości (96 rxn 384 rxn 3072 rxn) koszt reakcji zmniejsza się wraz ze wzrostem ilości danych uzyskiwanych w jednostce czasu. Ponieważ wszystkie te platformy wykorzystują chemię TaqMan, można oczekiwać, że jakość uzyskanych danych będzie podobna. TaqMan qPCR jest dobrze znaną metodą identyfikacji obfitości miRNA w próbkach surowicy/osocza9,11,27. Chociaż trzy omawiane tutaj platformy mają ten sam skład chemiczny, zmniejszenie objętości reakcji prowadzi do zmniejszenia zakresu dynamicznego wykrywania transkryptów (Farr RJ i wsp., dane niepublikowane). 96-dołkowa platforma qPCR jest platformą o niższej przepustowości, ale wysokiej czułości i naszym zdaniem "złotym standardem" dla wszystkich platform PCR opartych na sondzie (lub barwniku). Jednak może to nie być najbardziej ekonomiczna lub wydajna platforma, jeśli testuje się kilkaset lub tysiące próbek i dla wielu mikroRNA. Platformy mikrofluidyki (TLDA) i nanofluidyki (OA) to platformy o wysokiej przepustowości / treści, zaprojektowane tak, aby umożliwić pozyskiwanie większych danych w krótszym czasie. Chociaż zaobserwowano różnice w partiach kart TLDA, można je zminimalizować, żądając kart TLDA z tej samej partii. Obserwujemy, że platforma TLDA (ryc. 3) wykazała znaczną zmienność w 17% miRNA o średniej i niskiej liczebności podczas testowania przy użyciu tej samej próbki na różnych partiach kart TLDA. Dlatego zalecamy używanie tych samych numerów partii do analizy za pomocą kart TLDA. Różnice te mogą być również spowodowane zmiennością techniczną, w tym potencjalnymi błędami ładowania i pipetowania. Zalecamy jednak zamówienie/poproszenie o tę samą partię kart TLDA. Na platformie OA nie zaobserwowano istotnych różnic w partiach. Mimo to eksperymentalne metody qPCR oparte na TaqMan ułatwiają pomiar obfitości miRNA w próbkach osocza/surowicy. Omówione tutaj podejścia o niskiej, średniej i wysokiej przepustowości oferują elastyczność w analizie szeregu próbek i miRNA przy użyciu wysoce wydajnej, powtarzalnej i czystej (o niskim poziomie szumów tła) chemii.

Oświadczenia

Koszty opracowania artykułu/publikacji zostały pokryte przez firmę Life Technologies, po przyjęciu tego manuskryptu do publikacji.

Podziękowania

Wszyscy autorzy dziękują za wsparcie infrastrukturalne ze strony NHMRC CTC, University of Sydney, Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australia i Rebecca Cooper Foundation, Australia. Badania te zostały sfinansowane z grantów Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (FT110100254) i JDRF, Australia (CRN201314) na AAH WW, RJF i MVJ przeprowadziły wszystkie eksperymenty w mokrym laboratorium, ASJ przeprowadziło analizę danych. WW napisał pierwszy szkic. AAH zaplanowało badanie i przeanalizowało dane. Wszyscy autorzy zapoznali się i zgodzili się na ostateczną wersję manuskryptu, ryciny i karty pracy zgłoszone do publikacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96 platforma studzienkowa
do odwrotnej transkrypcji
TaqMan Testy mikroRNA INV SM&NBSP;Biosystemy stosowane
 		4427975https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975
Testy są dostarczane jako zestaw starterów RT i starterów PCR.
Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqManApplied Biosystems
 		4366597 lub 4366596https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 lub http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596
Zestaw do odwrotnej transkrypcji TaqMan MicroRNA to ten sam zestaw, który jest używany do odwrotnej transkrypcji we wszystkich trzechTaqMan platformach - 96-dołkowej, TLDA i OpenArray.
Do qPCR uruchomić na platformie
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, bez AmpErase UNG Biosystemy stosowane
 		4367846https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix służy do qPCR na  dwie platformy TaqMan - platforma 96-studniowa i TLDA.
MicroAmp Optyczna folia samoprzylepnaApplied Biosystems4311971https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna, 0,1 ml Applied Biosystems4346907https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
Platforma mikroprzepływowa (TLDA)
Do odwrotnej transkrypcji
Zapoznaj się z zestawem 96-dołkowej platformy TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (4366597 lub 4366596) (jak pokazano powyżej).
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1Applied Biosystems
 		4399966https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 służy do RT na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0Applied Biosystems
 		4444281https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 służy do RT na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
LUBLUB
Megaplex Primer Pools, zestaw basenów dla ludzi v3.0Applied Biosystems
 		4444750http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 służy do RT na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
Do pre-amplifikacji
TaqMan PreAmp Master MixApplied Biosystems
 		4391128 lub 4488593https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 lub http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593
TaqMan PreAmp Master Mix służy do wstępnego wzmacniania qPCR na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
Megaplex PreAmp Primer, Human Pool B v3.0 Biosystemy stosowane
 		4444303https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 służy do wstępnego wzmacniania qPCR na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1Applied Biosystems
 		4399233https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 służy do wstępnego wzmacniania qPCR na  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
1x Bufor TE (100 ml)Invitrogen12090-015https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product
Bufor 1x TE służy do wstępnej amplifikacji qPCR on  dwie platformy TaqMan - TLDA i OpenArray.
Aby załadować i uruchomić 384-dołkową kartę
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 Applied Biosystems4444913https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
Nanofluidics (OpenArray)
Do odwrotnej transkrypcji
Zapoznaj się z zestawem do odwrotnej transkrypcji TaqMan MicroRNA z 96 dołkami (4366597 lub 4366596) (jak pokazano powyżej).
Aby uzyskać informacje na temat wstępnego amplifikacji
zapoznaj się z odczynnikami do wstępnej amplifikacji TLDA (jak pokazano powyżej)
Aby załadować i uruchomić slajdy
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)Applied Biosystems
 		4470187https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
Zestaw akcesoriów do QuantStudio 12K Flex OpenArray Biosystemy stosowane
 		4469576
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 384-dołkowe płytki próbne OpenArray   Biosystemy stosowane
 		4406947https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master MixApplied Biosystems
 		4462159https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159
Wskazówki dotyczące systemu OpenArray AccuFill Biosystemy stosowane
 		4457246https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246
inne
Woda wolna od nukleazQiagen129117http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water
96-dołkowejmikrofluidyczną (TLDA) platforma ,

Bibliografia

  1. Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
  2. Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 132, 4653-4662 (2005).
  3. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  4. Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell. Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478(2010).
  5. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes. Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).
  6. Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes. Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).
  7. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development. Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).
  8. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA profiling in ovarian cancer. Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).
  9. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).
  10. Mattie, M. D., et al. Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies. Mol Cancer. 5, 24(2006).
  11. Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects. BMC Res Notes. 2, 89(2009).
  12. Zhu, H. T., et al. Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients. Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).
  13. Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases. Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).
  14. Liu, R., et al. Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer. Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).
  15. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS One. 3, e3148(2008).
  16. Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3. Dev Biol. 311, 603-612 (2007).
  17. Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR. J Am Heart Assoc. 3, e000792(2014).
  18. Wu, C., et al. Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma. PLoS One. 9, e92292(2014).
  19. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media. J Vis Exp. , e50294(2013).
  20. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  21. Genda, Y., et al. microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study. Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).
  22. Wang, B., et al. Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array. PLoS One. 6, e17167(2011).
  23. Cuk, K., et al. Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer. Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).
  24. Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34, e123(2006).
  25. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, 991-1006 (2010).
  26. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50, 244-249 (2010).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
  28. Schmittgen, T. D., et al. Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA. Methods. 44, 31-38 (2008).
  29. Kodani, M., et al. Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens. J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).
  30. Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Exp Diabetes Res. 2012, 168368(2012).
  31. TPF & SPF File Download Options [Internet]. , Available from: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html (2014).
  32. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).
  33. Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oznaczanie ilościowe mikroRNApłytka 96-dołkowamacierz mikrofluidycznamacierz nanofluidycznapróbki surowicy i osoczaodwrotna transkrypcjapreamplifikacjadetekcja za pomocą sond fluorescencyjnychwysokoprzepustowe PCR
Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.