Artykuł metodologiczny

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

DOI:

10.3791/52602

⸱

11 marca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Civil and Environmental Engineering, Northwestern University, 2Department of Chemical and Biological Engineeering, Northwestern University, 3Department of Applied Mathematics and Engineering Sciences, Northwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilmy to powierzchniowo przyczepione społeczności mikroorganizmów, które mają złożone struktury i wytwarzają znaczne niejednorodności przestrzenne. Rozwój biofilmu jest silnie regulowany przez otaczający przepływ i środowisko odżywcze. Wzrost biofilmu zwiększa również niejednorodność lokalnego mikrośrodowiska poprzez generowanie złożonych pól przepływu i wzorców transportu substancji rozpuszczonych. Aby zbadać rozwój heterogeniczności biofilmów i interakcji między biofilmami a ich lokalnym mikrosiedliskiem, wyhodowaliśmy monogatunkowe biofilmy Pseudomonas aeruginosa i dwugatunkowe biofilmy P. aeruginosa i Escherichia coli w gradientach odżywczych w mikroprzepływowej komórce przepływowej. Zapewniamy szczegółowe protokoły tworzenia gradientów składników odżywczych w komórce przepływowej oraz wzrostu i wizualizacji rozwoju biofilmu w tych warunkach. Przedstawiamy również protokoły dla szeregu metod optycznych do ilościowego określania wzorców przestrzennych w strukturze biofilmu, rozkładu przepływu nad biofilmami oraz transportu masowego wokół i wewnątrz kolonii biofilmu. Metody te wspierają kompleksowe badania nad współtworzeniem biofilmu i heterogenicznością siedlisk.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroorganizmy przyczepiają się do powierzchni i tworzą biofilmy — agregaty komórkowe zamknięte w pozakomórkowej matrycy polimerowej1. Biofilmy zachowują się zupełnie inaczej niż pojedyncze komórki drobnoustrojów, ponieważ biofilmy mają dramatyczną niejednorodność przestrzenną wynikającą z połączenia wewnętrznych ograniczeń transportu substancji rozpuszczonej i przestrzennych zmian w metabolizmie komórkowym2,3. Stężenie tlenu i składników odżywczych drastycznie spada na granicy faz między biofilmem a otaczającym płynem i ulega dalszemu wyczerpaniu w biofilmie2. Przestrzenne różnice w oddychaniu biofilmu i syntezie białek mogą również wystąpić w odpowiedzi na miejscową dostępność tlenu i składników odżywczych2.

W środowisku wodnym i glebowym większość bakterii żyje w biofilmach. Naturalne biofilmy przeprowadzają ważne procesy biogeochemiczne, w tym obieg węgla i azotu oraz metale redukujące4,5. Klinicznie tworzenie się biofilmu jest odpowiedzialne za przedłużające się infekcje płuc i dróg moczowych6. Zakażenia związane z biofilmem są wysoce problematyczne, ponieważ komórki w biofilmach mają wyjątkowo wysoką oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe w porównaniu z ich planktonowymi odpowiednikami6. Ponieważ biofilmy są ważne w różnych środowiskach, znaczna liczba badań koncentruje się na zrozumieniu czynników środowiskowych, które kontrolują aktywność biofilmu i niejednorodności przestrzennej w biofilmach i otaczającym mikrośrodowisku.

Poprzednie badania wykazały, że rozwój biofilmu jest silnie regulowany przez szereg czynników środowiskowych: biofilmy rozwijają różne morfologie w różnych warunkach przepływu; dostępność tlenu i składników odżywczych wpływa na morfologię biofilmu; a hydrodynamiczne naprężenie ścinające wpływa na przyleganie komórek planktonowych do powierzchni i oddzielenie komórek od biofilmów7-9. Ponadto warunki przepływu zewnętrznego wpływają na dostarczanie substratów do biofilmów i w ich obrębie10. Wzrost biofilmów zmienia również otaczające warunki fizyczne i chemiczne. Na przykład wzrost biofilmu prowadzi do miejscowego wyczerpania tlenu i składników odżywczych2; biofilmy gromadzą związki nieorganiczne i organiczne z otaczającego środowiska11; a klastry biofilmu przekierowują przepływ i zwiększają tarcie powierzchniowe12,13. Ponieważ biofilmy oddziałują z otaczającym je środowiskiem w bardzo złożony sposób, kluczowe znaczenie ma jednoczesne uzyskiwanie informacji na temat właściwości biofilmu i warunków środowiskowych, a do kompleksowego scharakteryzowania interakcji biofilm a środowiskiem należy zastosować podejścia multidyscyplinarne.

Tutaj prezentujemy szereg zintegrowanych metod do charakteryzowania przestrzennych wzorców wzrostu mikroorganizmów w obrębie mono-gatunkowych i dwugatunkowych biofilmów pod narzuconym gradientem żywieniowym oraz do obserwacji wynikającej z tego modyfikacji lokalnego chemicznego i płynnego mikrośrodowiska. Najpierw opisujemy zastosowanie niedawno opracowanej mikroprzepływowej komórki przepływowej z podwójnym wlotem do obserwacji wzrostu biofilmu w dobrze zdefiniowanych gradientach chemicznych. Następnie demonstrujemy zastosowanie tej mikroprzepływowej komórki przepływowej do obserwacji wzrostu dwóch gatunków bakterii, Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli, w biofilmach w różnych warunkach żywieniowych. Pokazujemy, w jaki sposób wizualizacja in situ fluorescencyjnego znacznika rozprzestrzeniania się do kolonii biofilmu może być wykorzystana do ilościowej oceny wzorców transportu substancji rozpuszczonej w biofilmach. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać prędkość śledzenia cząstek w mikroskali, wykonywaną pod mikroskopią konfokalną, do uzyskania lokalnego pola przepływu wokół rosnących biofilmów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja i inokulacja komórek przepływowych

UWAGA: Użyj mikroprzepływowej komórki przepływowej z podwójnym wlotem opisanej w Song et al., 201414 do hodowli biofilmów. Ta komórka przepływowa jest w stanie tworzyć dobrze zdefiniowane, gładkie gradienty chemiczne. Konstrukcja komory przepływowej jest pokazana na rysunku 1, a produkcja komory przepływowej została wcześniej opisana w Song i in., 201414. Tutaj szczegółowo opisujemy nasze metody, wykorzystując P. aeruginosa i E. coli do tworzenia biofilmów, ale inne gatunki również mogą być odpowiednie. Użyliśmy P. aeruginosa PAO1-gfp, który konstytutywnie wyraża białko zielonej fluorescencji (GFP), jako organizm modelowy do rozwoju biofilmu. Dodatkowo użyliśmy E. coli DH5α do utworzenia mieszanych gatunkowych biofilmów z P. aeruginosa. Szczepy P. aeruginosa i E. coli hodowano na płytkach agarowych LB.

  1. Przygotować komorę przepływową przy użyciu polidimetylosiloksanu (PDMS) związanego ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym za pomocą plazmy tlenowej, jak opisano wpkt 14. Wymiary komory komory przepływowej wynoszą 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (długość × szerokość × głębokość).
  2. Przygotować zmodyfikowane podłoże FAB15. Aby zaobserwować wzrost biofilmu w gradiencie składników odżywczych w komórce przepływowej, należy wprowadzić zmodyfikowaną pożywkę FAB15 z 0,6 μM glukozy w jednym wlocie i wprowadzić pożywkę FAB bez żadnego źródła węgla przez drugi wlot. Przefiltrować i wysterylizować (wielkość porów = 0,2 μm) roztwór podstawowy glukozy (60 mM) przed dodaniem go do pożywki FAB. Przed użyciem należy również autoklawować pożywkę FAB w cyklu 1 (ciecz, 15 min; 121 °C, 17 psi).
  3. Wysterylizuj system przepływu. Przed inokulacją należy przelać w autoklawie całą ścieżkę przepływu (butelki z pożywką, rurki, pułapki bąbelkowe, komory przepływowe) przy użyciu cyklu 1, z wyjątkiem plastikowych zaworów trójdrogowych (jednorazowych i wstępnie wysterylizowanych) znajdujących się przed komorą przepływową. (Zawory trójdrogowe służą do wstrzykiwania hodowli komórkowych, znacznika fluorescencyjnego i mikrogranulek). Aby uniknąć zanieczyszczenia podczas montażu, przed autoklawowaniem przykryj wszystkie rurki i otwory złączy folią aluminiową lub workami do autoklawu.
  4. Podłącz system przepływu. Ostrożnie zmontuj elementy systemu komory przepływowej (patrz film przedstawiający montaż systemu przepływowego) i dostarcz pożywkę wzrostową do komory przepływowej za pomocą pompy perystaltycznej, która precyzyjnie kontroluje natężenie przepływu.
  5. Przygotować hodowlę komórkową do inokulacji, przenosząc kolonię P. aeruginosa lub E. coli z płytek LB do 3 ml bulionu LB i wstrząsnąć kulturą O/N przy 225 obr./min i 37 °C. Rozcieńczyć kultury komórkowe O/N w 1 ml wysterylizowanej wody do końcowego OD600 = 0,01 jako inokulum. (Hoduj i rozcieńczaj bakterie w okapie z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia.)
  6. W przypadku doświadczeń z biofilmami mieszanymi należy rozcieńczyć dwie kultury bakteryjne w stosunku 1:1 na 1 ml z równoważnym OD600 = 0,01 dla każdej bakterii.
  7. Zaszczepić komórkę przepływową. Wstrzyknąć 1 ml inokulum do wlotu komory przepływowej z zaworu trójdrogowego. Po wstrzyknięciu należy wstrzymać przepływ na 1 godzinę, aby umożliwić komórkom bakteryjnym przyczepienie się do szkła nakrywkowego. (Upewnij się, że komora przepływowa jest umieszczona szkiełkiem nakrywkowym do dołu, aby umożliwić osadzenie się zawieszonych komórek na szkiełku nakrywkowym.)
  8. Po 1 godzinie wznowić przepływ i pompować pożywkę wzrostową do komory przepływowej ze stałą szybkością 0,03 ml/min na każdy wlot przez 3 dni.

2. Charakterystyka rozwoju biofilmu w odpowiedzi na gradienty składników odżywczych za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: P. aeruginosa może być obrazowany za pomocą konstytutywnie wyrażonego GFP, ale E. coli w biofilmach mieszanych gatunków musi być obrazowany przez barwienie przeciwstawne.

  1. Obserwuj 3-dniowe biofilmy za pomocą mikroskopii konfokalnej. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, obserwuj biofilmy za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 63X. Przed przystąpieniem do obrazowania należy oznaczyć celę przepływową z podwójnym wlotem siatką po stronie szkła nakrywkowego. (Celem tej siatki jest umożliwienie eksperymentatorowi zlokalizowania obszarów obrazowania w komorze komory przepływowej).
  2. Aby przeciwbarwić, rozcieńczyć 10 μl czerwonego fluorescencyjnego barwnika kwasem nukleinowym przepuszczanym przez komórkę, takiego jak zielone fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym, takim jak STYO 62, roztwór podstawowy (1 mM) w 990 μl sterylizowanej wody, a następnie powoli wstrzyknąć rozcieńczoną plamę za pomocą strzykawki do komory komory przepływowej z poprzedzającego zaworu trójdrogowego. Utrzymuj celę przepływową w stagnacji i ciemności przez 30 minut, a następnie wznów przepływ, aby wypłukać niezwiązaną plamę na 15 minut.
  3. Wykonaj obrazowanie konfokalne. Aktywuj laser argonowy 488 nm do wzbudzenia i kanałów zbierających emisję dla GFP (500-535 nm) i barwienia kwasami nukleinowymi (dla barwienia kwasami nukleinowymi na zielono fluorescencyjnymi, 650-750 nm). Dostosuj wzmocnienia i przesunięcia dla obu kanałów, aby uzyskać jasny i czysty obraz. Wybierz tryb xyz i obrazowania symultanicznego. Użyj pokrętła z-control, aby zidentyfikować dolną i górną część biofilmu na polu. Ustaw krok z na 0,5 μm, aby uzyskać stos obrazów 3-W. (Aby zapewnić wysoką jakość obrazu, do akwizycji obrazu należy użyć średniej linii czterech).
  4. Aby zmapować przestrzenne wzorce rozwoju biofilmu w komórce przepływowej, należy zobrazować biofilmy w trzech lub więcej odległościach podłużnych (x) wzdłuż wlotu komórki przepływowej oraz w trzech pozycjach poprzecznych (y) względem narzuconego gradientu składników odżywczych, jak pokazano na rysunku 1.

3. Charakterystyka wewnętrznego transportu substancji rozpuszczonej za pomocą wstrzyknięć konserwatywnego znacznika fluorescencyjnego

UWAGA: Konserwatywny znacznik fluorescencyjny, taki jak Cy5, może być użyty do scharakteryzowania wzorców transportu substancji rozpuszczonej w biofilmie.

  1. Rozpuścić Cy5 (monoreaktywny ester NHS) w wodzie do końcowego stężenia 10 mg/ml w postaci roztworu podstawowego. Roztwór podstawowy Cy5 należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Ponieważ Cy5 jest wrażliwy na światło, należy przechowywać, rozcieńczać i wstrzykiwać roztwory Cy5 w ciemności.
  2. Przed wstrzyknięciem znacznika fluorescencyjnego należy wykonać obraz 3D 3-dniowego biofilmu za pomocą mikroskopii konfokalnej (z obiektywem 63X). (Szerokie obszary kolonii biofilmu są idealne do obserwacji transportu barwnika w szeregach czasowych). Należy również wybrać płaszczyznę Z z z dobrze oddzielonymi koloniami do obrazowania (jak pokazano na rysunku 5A).
  3. Dla każdego eksperymentu z wstrzykiwaniem Cy5 rozcieńczyć 2 μl roztworu podstawowego Cy5 w 998 μl wysterylizowanej wody, aby otrzymać roztwór do wstrzykiwań o stężeniu Cy5 20 μg/ml.
  4. Zatrzymać pompę, aby wstrzymać przepływ i wstrzyknąć roztwór Cy5 do górnej części komory przepływowej za pomocą strzykawki za pomocą zaworu 3-drogowego. (Ważne jest, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza na ścieżkę przepływu podczas wstrzykiwania. Pułapki bąbelkowe powinny być otwarte podczas wstrzyknięcia wstecznego.)
  5. Po wstrzyknięciu roztworu Cy5 zamknij pułapki bąbelkowe, wyreguluj zawór 3-drogowy i uruchom ponownie pompę, aby dostarczyć wstrzyknięty roztwór Cy5 do komory przepływowej.
  6. Przełącz tryb obrazowania konfokalnego na xyt. Aktywuj kanały Cy5 i GFP w trybie jednoczesnego obrazowania. Dostosuj ustawienia konfokalne intensywności Cy5 (intensywność lasera, wzmocnienie i przesunięcie), aby uniknąć nasycenia sygnałów, co ma kluczowe znaczenie dla kwantyfikacji. (Wysoka rozdzielczość czasowa jest preferowana do wizualizacji penetracji barwnika. Jednak szybkie skanowanie pogarsza jakość obrazu.) Wybierz odpowiednią szybkość skanowania i średnią liniową, aby zrównoważyć rozdzielczość czasową obrazowania i jakość obrazu. W przypadku tego protokołu użyj średniej liniowej wynoszącej cztery i częstotliwości odświeżania 0,15 Hz.
  7. Wznów przepływ, aby dostarczyć Cy5 do komory przepływowej (nadal przy natężeniu przepływu 0,03 ml/min). Równocześnie rozpocznij obrazowanie konfokalne szeregów czasowych.
  8. Określ ilościowo penetrację Cy5 poprzez promieniste uśrednienie intensywności Cy5 w okrągłej kolonii biofilmu 2D. Aby uśrednić, najpierw zidentyfikuj krawędź klastra biofilmu, następnie wygeneruj mapę odległości dla dwuwymiarowego odcinka gromady, a na końcu uśrednij wzorce radialne o intensywności Cy5, aby wygenerować krzywą penetracji (patrz rysunek 6).
    1. Aby obliczeniowo zrealizować krok 3.8, należy użyć pakietu oprogramowania BioSPA (Biofilm Spatial Pattern Analysis) (niepublikowanego, pakiet oprogramowania i instrukcja dostępne na żądanie) lub innych programów do analizy obrazu.
    2. Aby korzystać z BioSPA, najpierw zaimportuj zestaw obrazów do BioSPA. Następnie wybierz odpowiedni próg dla kanałów GFP i Cy5 do tworzenia obrazów binarnych. W menu analiza/obliczenia wybierz opcję Analiza zaawansowana, a następnie Analiza dyfuzyjna. Użyj kanału GFP, aby zdefiniować krawędź klastra i użyj narzędzia wielokąta, aby wybrać jeden klaster jako obszar zainteresowania (ROI).
    3. Kliknij dwukrotnie wybrane skupisko biofilmu, aby przeprowadzić analizę dyfuzji. Zapisz wyniki analizy dyfuzji i skalibruj intensywność Cy5 do stężenia Cy5 za pomocą krzywej kalibracyjnej.
      1. Aby wygenerować krzywą kalibracyjną stężenia Cy5, zmierz intensywności Cy5 w gradiencie stężenia Cy5 pod mikroskopią konfokalną. (Intensywność i stężenie Cy5 mają liniową zależność.)

4. Charakterystyka otaczającego pola przepływu poprzez śledzenie cząstek fluorescencyjnych

UWAGA: Cząstki fluorescencyjne, takie jak mikrogranulki fluorescencyjne, mogą być używane do charakteryzowania pola przepływu wokół biofilmów. Pole przepływu wokół biofilmów można obliczyć na podstawie obserwacji szeregów czasowych pozycji cząstek za pomocą oprogramowania do śledzenia prędkości cząstek. Przedstawione tutaj wyniki uzyskano za pomocą pakietu oprogramowania Streams 2.0216 (oprogramowanie do pobrania i podręcznik użytkownika są dostępne pod adresem http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml).

  1. Rozcieńczyć mikrogranulki fluorescencyjne (średnica ~1 μm) w wysterylizowanej wodzie do końcowego stężenia stałego 0,2% i końcowej objętości 0,5 ml. Wirować, aby upewnić się, że mikrogranulki są dobrze rozproszone.
  2. Wstrzyknąć i dostarczyć rozcieńczone mikrokulki fluorescencyjne do celi przepływowej, postępując zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 3.3 do 3.5. Aby umożliwić dokładne śledzenie ścieżki cząstek, należy użyć stosunkowo niskiego natężenia przepływu (0,01 ml/godz. dla wyników śledzenia cząstek w tym artykule).
  3. Przełącz ustawienia konfokalne na tryb xyt, aby śledzić ruch cząstek w jednym wycinku z i wykonywać obrazy szeregów czasowych. (Dla reprezentatywnych wyników przedstawionych w tym artykule użyto częstotliwości odświeżania 1 Hz). Powtórz wstrzykiwanie cząstek i obraz w różnych miejscach z, aby wygenerować pole przepływu 3D.
  4. Wstępnie przetwórz obrazy konfokalne szeregów czasowych, odejmując sygnał fluorescencji tła (sygnał z pierwszego uzyskanego obrazu zestawu obrazów) za pomocą ImageJ (oprogramowanie do pobrania i instrukcja dostępne na stronie http://imagej.nih.gov/ij/) lub innych programów.
  5. W ImageJ otwórz pierwszy obraz zestawu obrazów, a następnie zaimportuj zestaw obrazów. W obszarze Process / Image Calculator (Kalkulator procesu/obrazu) odejmij pierwszy obraz od zestawu obrazów. Zapisz wstępnie przetworzony zestaw obrazów.
  6. Aby obliczyć wektory przepływu, zaimportuj obrazy konfokalne szeregów czasowych w programie Streams 2.02. W sekcji "Otwórz widok procesu" wybierz i wykonaj "Zidentyfikuj cząstki". Użyj odpowiedniego progu, aby zidentyfikować cząstki. Dla cząstek o wielkości 1 μm należy stosować 0,5 i 5 μm jako minimalne i maksymalne progi średnicy.
  7. Następnie w sekcji "Otwórz widok procesu" wybierz i wykonaj "Potok analizy PTV", aby wygenerować ścieżki cząstek. Sprawdź ścieżki cząstek, aby zobaczyć, czy reprezentują ruch cząstek. Na koniec wybierz i wykonaj polecenie "Utwórz pole prędkości", aby wygenerować mapę wektorów przepływu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroprzepływowa komórka przepływowa z podwójnym wlotem umożliwia obserwację wzrostu biofilmu pod dobrze zdefiniowanym gradientem chemicznym utworzonym przez zmieszanie dwóch roztworów w komorze przepływowej. Powstały gradient chemiczny był wcześniej obserwowany przez wstrzykiwanie barwnika i szczegółowo opisany przez Song i wsp.14. Gładkie gradienty stężeń utworzono w kierunku poprzecznym, jak pokazano na rysunku 1. Profil koncentracji był stromy w pobliżu wlotu i uległ rozluźnieniu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zademonstrowaliśmy zestaw metod charakteryzujących trzy ważne interakcje biofilm ze środowiskiem: odpowiedź biofilmu na gradienty chemiczne, wpływ wzrostu biofilmu na otaczające mikrośrodowisko przepływu oraz niejednorodność biofilmu wynikającą z ograniczeń transportu wewnętrznego.

Po raz pierwszy pokazaliśmy zastosowanie nowatorskiej mikroprzepływowej komórki przepływowej do nałożenia dobrze zdefiniowanego gradientu chemicznego do rozwoju biofilmu. Aby wygenerować dobrze zdefiniowany gradient...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Mattowi Parsekowi z Uniwersytetu Waszyngtońskiego (Seattle, WA) za udostępnienie szczepów P. aeruginosa i E. coli oraz Rogerowi Nokesowi z Uniwersytetu Canterbury (Nowa Zelandia) za udostępnienie oprogramowania Streams. Prace te były wspierane przez R01AI081983 grantowe z National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Obrazowanie konfokalne wykonano w Northwestern Biological Imaging Facility (BIF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa perystaltycznaGilsonMiniplus 3Konfiguracja komory przepływowej i rurka pompy inokulacyjnej
0,50  mm OVC, pomarańczowo-żółteGilsonF117934Konfiguracja i inokulacja komórek przepływowych
Trójdrożny kran z obrotowym męskim zamkiem LuerSmiths Medical MX9311LKonfiguracja i inokulacja komórek przepływowych
Sylgard 184 Enkapsulacja ogniw słonecznych do produkcji paneli słonecznychML Solar LLCKonfiguracja i inokulacja komórek przepływowych
Butelka Pyrex Medium, 1  L, GL45VWR16157-191Konfiguracja i inokulacja komory przepływowej
C-FLEX RurkaCole-Parmer06422-02Konfiguracja i inokulacja komory przepływowej
1 ml TB StrzykawkaBD309659Konfiguracja i inokulacja komórek przepływowych
Rurka polimerowaIDEX1520GKonfiguracja i inokulacja komory przepływowej
Sterylny adapter Intramedic Luer StubClay Adams427564Konfiguracja i inokulacja komory przepływowej
PrecisionGlide NeedleBD305195Konfiguracja i inokulacja komory przepływowej
SpektrofotometrHACHKonfiguracja i inokulacja komory przepływowej Filtry
strzykawkowe - sterylne (0,2 μ m)Fisherbrand09-719AKonfiguracja i inokulacja komórek przepływowych
MAXQ ShakerThermo ScientificKonfiguracja i inokulacja komórek przepływowych
Siarczan amonuSigma AldrichA4418Pożywka wzrostowa
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnySigma AldrichRES20908-A7Pożywka wzrostowa
Jednozasadowy fosforan potasuSigma AldrichP5655Pożywka wzrostowa
Chlorek soduSigma AldrichS7653Pożywka wzrostowa
Chlorek magnisiumSigma AldrichM8266Pożywka wzrostowa
Chlorek wapniaSigma AldrichC5670Pożywka wzrostowa
Dwuwodny siarczan wapniaSigma AldrichC3771Pożywka wzrostowa
Siarczan żelaza(II) siedmiowodnySigma Aldrich215422Pożywki wzrostowe
Siarczan manganu(II) jednowodnySigma AldrichM7634Pożywki
wzrostowe Siarczan miedzi(II)Sigma Aldrich451657Pożywki wzrostowe
Siarczan siedmiowodnySigma AldrichZ0251Pożywka wzrostowa
Siarczan kobaltu(II) siedmiowodnySigma AldrichC6768Pożywka wzrostowa
Molibdenian soduSigma Aldrich243655Pożywka wzrostowa
Kwas borowySigmaAldrich B6768Pożywka wzrostowa
DekstrozaSigma AldrichD9434Pożywka wzrostowa
Luria Bertani BulionSigma AldrichL3022Pożywka wzrostowa
TCS SP2 Mikroskopia konfokalnaLeicaObrazowanie fluorescencyjne
SYTO 62Life TechnologyS11344Obrazowanie fluorescencyjne
Cy5GE Healthcare Nauki przyrodniczePA15100Obrazowanie fluorescencyjne
Czerwona fluorescencyjna (580/605) FluoSphereLife TechnologyF-8801Obrazowanie fluorescencyjne
BioSPAPackman LabPrzetwarzanie obrazu
ImageJNIHPrzetwarzanie obrazu
MocStrumienie przetwarzania obrazu PerkinElmer
2.02Przetwarzanie obrazuUniwersytetu Cantebury

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
  2. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
  3. Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
  4. Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  5. Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
  6. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  7. Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, Suppl 1. 19S-28S (1999).
  8. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
  9. Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
  10. Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
  11. Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
  12. Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
  13. Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
  14. Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
  15. Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
  16. Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
  17. Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
  18. Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
  19. Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
  20. Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
  21. Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
  22. Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
  23. Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
  24. Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Powstawanie biofilmumikrofluidyczna komora przep ywowagradient glukozymikroskopia konfokalnaznaczniki fluorescencyjneledzenie cz stekbiofilmy dwugatunkowePseudomonas aeruginosaEscherichia coliheterogeniczno przestrzenna

Powiązane artykuły