Guz pierwotny i izolacja komórek MEF w celu zbadania przerzutów do płuc

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest badanie nowotworów piersi. Dzięki tej technice guzy sutka myszy są usuwane, a komórki pierwotne są przygotowywane z guzów. Dołączony jest protokół ekstrakcji płuc do badania przerzutów do płuc. Ponadto dołączono inny protokół analizy fibroblastów embrionalnych myszy z zarodka myszy.

Streszczenie

W procesie nowotworu piersi, przerzutowe stadium choroby stanowi największe zagrożenie dla osoby dotkniętej chorobą. Normalne komórki piersi ze zmienionymi genotypami mają teraz zdolność do inwazji i przetrwania w innych tkankach. W tym protokole guzy sutka myszy są usuwane, a komórki pierwotne są przygotowywane z guzów. Komórki wyizolowane w wyniku tej procedury są następnie dostępne do eksperymentów z profilowaniem genów. Aby przerzuty zakończyły się sukcesem, komórki te muszą być zdolne do wewnątrznaczyniowego, przetrwania w krążeniu, wynaczynienia do odległych narządów i przetrwania w nowym układzie narządów. Płuca są typowym celem przerzutów raka piersi. Odkryto zestaw genów, które pośredniczą w selektywności przerzutów do płuc. Tutaj opisujemy metodę badania przerzutów do płuc z genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Ponadto dołączono inny protokół analizy fibroblastów embrionalnych myszy (MEF) z zarodka myszy. Komórki MEF z tego samego typu zwierząt dostarczają wskazówek dotyczących ekspresji genów komórek nienowotworowych. Razem techniki te są przydatne w badaniu nowotworzenia sutka u myszy, związanych z nim mechanizmów sygnalizacyjnych i szlaków nieprawidłowości w zarodkach.

Wprowadzenie

Przerzuty są ostatnim krokiem w postępie raka piersi ¹. Obejmuje szereg etapów, w których komórki nowotworowe są uwalniane z guza pierwotnego i rozprzestrzeniane do innych narządów ². Komórki muszą być zdolne do wewnątrznaczyniowego, przetrwania w krążeniu, wynaczynienia do odległych narządów i przetrwania w tym nowym układzie narządów ³. Każdy etap nowotworzenia jest ściśle kontrolowany przez komórki poprzez różne zmiany genetyczne i epigenetyczne ⁴. Do badania mechanizmów nowotworzenia raka piersi wykorzystano mysie systemy modelowe ze względu na ich krótką żywotność, niewielkie rozmiary i szybki czas rozmnażania. Niektóre główne zalety stosowania modeli mysich w badaniach nad rakiem to molekularne i fizjologiczne podobieństwa, które dzielą z ludźmi ⁵.

Uznane linie komórkowe myszy i ludzi były szeroko wykorzystywane w badaniach nad rakiem piersi. Chociaż możemy uzyskać pewne informacje na temat etapów przerzutów za pomocą tych komórek, genetycznie zmodyfikowane modele zwierzęce z supresorami/onkogenami nowotworów dostarczą znacznie więcej informacji na temat rozwoju guza i przerzutów, począwszy od stadium embrionalnego. W ten sposób dzięki tym mysim modelom możemy uzyskać genetyczną i rozwojową regulację wzrostu guza. Co więcej, mikrośrodowisko guza odgrywa również ważną rolę w ekspresji genów komórek nowotworowych i naśladowanie tego samego scenariusza w badaniach z wykorzystaniem ustalonych linii komórkowych może być trudne. Pierwotne ludzkie guzy sutka można również wykorzystać do badania nowotworzenia sutka u myszy. Główną wadą stosowania izolowanych guzów piersi jest to, że ten nowo zagnieżdżony guz nie ma unaczynienia myszy i tkanki limfatycznej. Natomiast systemy genetycznego modelu myszy do badania nowotworzenia sutka pozwolą nam monitorować etapy przerzutów, analizować mikrośrodowisko guza i dostęp do całego organizmu ⁵.

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie nowotworów piersi u myszy. Wiadomo, że rak piersi zazwyczaj daje przerzuty do mózgu, płuc i kości. Protokół ten pozwala na izolację pierwotnych komórek guza sutka, a także badanie przerzutów raka piersi do płuc. Ponadto dołączono inny protokół analizy fibroblastów embrionalnych myszy (MEF) z zarodka myszy. Razem techniki te są przydatne w badaniu nowotworzenia sutka u myszy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) LSU School of Medicine. Wszystkie narzędzia muszą być autoklawowane przed preparacją.

1. Przygotowanie pierwotnych komórek z guzów piersi u myszy

1. Użyj modelu mysiego, który został genetycznie zmodyfikowany za pomocą środkowego antygenu T wirusa guza sutka myszy (mysz transgeniczna MMTV-PyMT), u których spontanicznie rozwijają się guzy, jak opisano wcześniej ⁶.
2. Uśmierc myszy izofluranem (99,9%) i spryskaj 75% etanolem, aby zapewnić sterylne środowisko (ryc. 1A).
3. Otwórz skórę od obszaru ujścia cewki moczowej do szyi nożyczkami. Przypnij skórę w dół, aby umożliwić łatwy dostęp do narządów (ryc. 1B).
4. Wyizoluj guz piersi sutka i przemyj zimnym, sterylnym, buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) (pH 7,4) (ryc. 1C).
5. Przenieś guz na sterylną 10 cm płytkę do hodowli tkankowej i posiekaj go sterylną żyletką i nożyczkami na około 1 mm³ kawałki. Kolejne kroki należy wykonywać w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
6. Inkubować posiekaną tkankę nowotworową z kolagenazą rozpuszczoną w pożywce DMEM wolnej od surowicy o końcowym stężeniu 1 mg / ml na kołysce przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Odwirować zawiesinę tkanki nowotworowej przez 3 minuty przy 200 x g.
   UWAGA: Inkubacja kolagenazy jest niezbędna do enzymatycznej dysocjacji tkanki.
7. Odrzucić sklarowany osad i przepłukać go 3 razy PBS (pH 7,4) przez odwirowanie przez 3 minuty przy 200 x g. Po ostatnim przemyciu zdekantować supernatant.
8. Zawiesić tkankę za pomocą 2 ml trypsyny EDTA na 5 minut w temperaturze 37 °C podczas nutowania. Odwirować zawiesinę przez 3 minuty przy 200 x g i powtórzyć płukanie.
9. Zawiesić osad tkankowy w normalnym podłożu wzrostowym (DMEM, 10% FBS, 2X długopis/paciorkowiec) na 10-centymetrowej płytce. Zmieniaj nośnik codziennie przez następne 3 dni. Hoduj komórki, aż do uzyskania pożądanej liczby komórek.
   UWAGA: Z tej procedury zostanie wyizolowanych około 1x10⁷ komórek. Inne modele nowotworzenia sutka u myszy, takie jak MMTV-Neu, dają niższą wydajność komórek w porównaniu z MMTV-PyMT. W przypadku korzystania z modeli, które dają niższą wydajność, korzystne jest rozpoczęcie od większego guza i dłuższego hodowania komórek.

2. Ekstrakcja płuc myszy w celu wizualizacji przerzutów do płuc

1. Przed ekstrakcją płuc należy usunąć wątrobę i przeponę. Usuń żebra bez naruszania płuc.
2. Za pomocą cienkich nożyczek otwórz górną część tchawicy, która znajduje się bliżej żyły szyjnej.
3. Za pomocą cewnika wstrzyknij środek, taki jak 1 ml Z-fix lub tuszu indyjskiego, przez tchawicę, aby wypełnić płuca (ryc. 2A). Zanurz płuca Z-fix w parafinie.
4. Odbarwić płuca wstrzyknięte tuszem indyjskim w roztworze Fekete (100 ml 70% alkoholu, 10 ml 10% buforowanej formaliny i 5 ml lodowatego kwasu octowego) przez 5 minut. Zdefiniuj guzki nowotworowe w miejscach wtórnych o średnicy ≥ 0,5 mm, określ guzki jako przerzuty.
   UWAGA: Ze względu na zablokowanie oskrzeli i oskrzelików przez guz, guzki nowotworowe nie mogą wchłonąć 15% atramentu indyjskiego, a zatem normalna tkanka płucna będzie, a guzki nowotworowe będą w kolorze białym ⁷. Umożliwi to wizualizację poszczególnych guzków nowotworowych (ryc. 2B).

3. Przygotowanie mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) z embrionów myszy

1. Poświęć ciężarne myszy izofluranem (99,9%) i spryskaj 75% etanolem, aby zapewnić sterylne środowisko.
2. Otwórz skórę od obszaru ujścia cewki moczowej do szyi nożyczkami i odizoluj zarodki od macicy.
3. Uważaj, aby nie przeszkadzać zarodkom podczas otwierania skóry.
4. Usuń rogi macicy i opłucz je w zimnym, sterylnym PBS (pH 7,4).
5. Bardzo ostrożnie oddziel zarodek od łożyska i umieść zarodki na 10-centymetrowej płytce zawierającej lodowaty PBS (pH 7,4).
6. Usunąć głowę, wątrobę i jelito z zarodka i umieścić pozostałą część na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej zawierającej PBS (pH 7,4).
7. Przenieść ciało zarodka na inną 12-dołkową płytkę zawierającą trypsynę EDTA i pokroić na małe kawałki (~ 1 mm³) za pomocą sterylnej żyletki i nożyczek. Inkubować posiekany materiał z 5 ml trypsyny EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
8. Dezaktywuj trypsynę, dodając 1 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do posiekanych zarodków. Odwirować zawiesinę z prędkością 200 x g przez 10 minut, ostrożnie usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad z 1 ml ciepłej pożywki DMEM i przenieść całą zawartość do 10 cm naczynia zawierającego 10 ml DMEM (z 20% FBS i 2X Penicylina/Streptomycyna).
9. Zmieniaj podłoże codziennie przez dwa dni. Hoduj komórki, aż do osiągnięcia pożądanej liczby komórek.

Wyniki

Stopień progresji guza, przy którym następuje uśpienie zwierzęcia, zależy od konkretnego badania oraz wytycznych IACUC. Na Rysunku 1A przedstawiono 100-dniową mysz szczepu C57BL/6 z wirusem nowotworu gruczołu mlekowego myszy z antygenem T środkowym polyoma (MMTV-PyMT), która została uśpiona w trzecim miesiącu. Skórę rozcięto nożyczkami od obszaru ujścia cewki moczowej do szyi i przypięto szpilkami, aby umożliwić łatwy dostęp do organów, jak pokazano na Rysunku 1B. Umożliwiło to łatwy dos...

Dyskusja

Ten protokół służy do izolowania komórek pierwotnych ze świeżego guza myszy. Lizaty przygotowane tą metodą są przydatne do analizy białek, DNA i RNA. Komórki rakowe z pierwotnego guza piersi często dają przerzuty do mózgu, płuc i kości ¹. W zestawie znajduje się technika ekstrakcji płuc w celu wykrycia przerzutów. Zabarwienie płuc plamą atramentową pozwoli na wizualizację guzków nowotworowych, jak pokazano na rycinie 2B. Unieruchomienie płuc w roztworze Z-fix pozwoli nam na wykonanie odcinków ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	HyClone	SH30243.01	Przechowywać pod kątem 4 stopni; C
0,05% Trypsyna-EDTA	Życie  technologie	25300-062	Przechowywać w – 20 & deg; C
Kolagenaza typu IV	Sigma-Aldrich	C5138	Przechowywać pod adresem – 20 ° C
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H3506	Przechowywać pod adresem – 20° C
Pen Strep	Life  technologie	15140-122	Przechowywać pod adresem 4 ° C
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106	Przechowywać pod adresem – 80 & deg; C
Z-fix		ANATECH#174	Sklep w RT
India Ink	Yasutomo		Sklep w RT
AERRANE (Isoflurane)	Baxter	NDC 10019-773-60	Sklep w RT
Etanol	EMD	AX0441-3	Sklep w RT