Suszone plamy krwi - przygotowanie i przetwarzanie do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych

Podsumowanie

Przygotowanie i przetwarzanie wysuszonych plam krwi (DBS) do ich końcowej analizy jest nadal słabo ustandaryzowane dla większości zastosowań diagnostycznych. Aby przezwyciężyć to niedociągnięcie, sugeruje się kompleksowy protokół krok po kroku, a następnie ocenia się go pod kątem jego skuteczności w wykrywaniu markerów infekcji wirusowych.

Streszczenie

Pomysł zbierania krwi na papierowej kartce, a następnie używania wysuszonych plam krwi (DBS) do celów diagnostycznych powstał sto lat temu. Od tego czasu testy DBS przez dziesięciolecia koncentrowały się głównie na diagnozowaniu chorób zakaźnych, zwłaszcza w warunkach ograniczonych zasobów, lub na systematycznych badaniach przesiewowych noworodków pod kątem dziedzicznych zaburzeń metabolicznych, a dopiero niedawno zaczęło pojawiać się wiele nowych i innowacyjnych zastosowań DBS. Przez wiele lat zmienne przedanalityczne były brane pod uwagę w dziedzinie badań DBS tylko w niewłaściwy sposób i nawet dzisiaj, z wyjątkiem badań przesiewowych noworodków, cała faza przedanalityczna, która obejmuje przygotowanie i przetwarzanie DBS do ich końcowej analizy, nie została ustandaryzowana. W tym kontekście proponuje się kompleksowy protokół krok po kroku, który obejmuje wszystkie podstawowe fazy, tj. pobieranie krwi; przygotowanie plam krwi; suszenie plam krwi; magazynowanie i transport DBS; elucja DBS, a na końcu analizy eluatów DBS. Skuteczność tego protokołu została po raz pierwszy oceniona za pomocą 1 762 sprzężonych par surowica/DBS do wykrywania markerów zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu B, wirusem zapalenia wątroby typu C i ludzkim wirusem niedoboru odporności na zautomatyzowanej platformie analitycznej. W drugim etapie protokół został wykorzystany podczas badania pilotażowego, które zostało przeprowadzone na aktywnych użytkownikach narkotyków w niemieckich miastach Berlinie i Essen.

Wprowadzenie

Pomysł wykorzystania krwi zebranej na papierowej karcie wykonanej z celulozy przypisuje się Ivarowi Christianowi Bangowi (1869 - 1918), ojcu nowoczesnej mikroanalizy klinicznej^{1, 2}. W 1913 roku Bang oznaczył glukozę z eluatów wysuszonych plam krwi (DBS)³, a później przeprowadził również pomiary azotu metodą Kjeldahla z tą techniką bibuły filtracyjnej2. Następnie kilku badaczy poinformowało o zastosowaniu DBS do testów serologicznych w celu zdiagnozowania kiły². Już w 1924 roku Chapman podsumował zalety badania DBS, zwracając szczególną uwagę na cztery elementy, które są nadal aktualne: (1) w porównaniu z konwencjonalnym nakłuciem żyły wymagana jest mniejsza objętość krwi i fakt ten był najważniejszy w diagnostyce dziecięcej; (2) pobieranie krwi jest proste, nieinwazyjne i niedrogie; (3) ryzyko skażenia bakteryjnego lub hemolizy jest minimalne; oraz (4) DBS może być przechowywany przez długi czas prawie bez pogorszenia jakości analitów^{2, 4}. Oprócz zastosowania w testach na kiłę, dalsze wczesne zastosowania techniki DBS obejmowały, np. wykrycie przeciwciał przeciwko odrze, śwince, wirusowi polio, wirusowi paragrypy i syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV) w 1953 r.², identyfikację Shigella w kale wysuszonym na bibule filtracyjnej i wysłanym zwykłą pocztą z Indonezji do Lejdy w Holandii, a także wykrycie przeciwciał przeciwko Schistosoma w DBS pobranych na obszarach endemicznych i przeanalizowanych ponad Trzy miesiące później⁵. W 1963 roku, pięćdziesiąt lat po pierwotnym komunikacie Banga^, Guthrie w końcu opublikował swoją słynną metodę diagnozowania fenyloketonurii na podstawie DBS uzyskanej przez nakłucie pięty u noworodków7^{, 8}.

Chociaż od tego czasu DBS były uważane za powszechnie stosowaną metodę zbierania, przechowywania, transportu i analizowania różnych płynów ustrojowych⁵, ich użycie w diagnostyce nadal koncentrowało się głównie na diagnozowaniu infekcji, zwłaszcza w warunkach ograniczonych zasobów i systematycznym badaniu noworodków pod kątem dziedzicznych zaburzeń metabolicznych przez dziesięciolecia^{9, Rozdział 10}. Jednak od 2005 roku zaczęło pojawiać się wiele nowych i innowacyjnych aplikacji DBS. Spowodowało to niemal wykładniczy wzrost liczby publikacji naukowych na temat DBS z około 50 do prawie 450 rocznie obecnie. Wśród pojawiających się zastosowań znajdują się tak różnorodne dziedziny, jak badania toksyko- i farmakokinetyczne, profilowanie metaboliczne, monitorowanie leków terapeutycznych, toksykologia sądowa czy kontrola skażenia środowiska^{10, 11}.

Testy DBS w ciągu ostatnich 100 lat triumfalnie przeszły przez kliniczną diagnostykę laboratoryjną². Jednak, podobnie jak w przypadku chemii klinicznej¹², podczas tego marszu zmienne przedanalityczne nie były odpowiednio uwzględniane przez wiele lat. Rzeczywiście, nawet dzisiaj, po tak wybitnych działaniach, jak projekt oceny bibuły filtracyjnej CDC¹³ lub sformułowanie krajowego standardu pobierania krwi na bibule filtracyjnej w ramach badań przesiewowych noworodków¹⁴, faza przedanalityczna jest nadal w dużej mierze niedoceniana w większości innych dziedzin, w których stosuje się testy DBS^{5, Rozdział 10}.

Biorąc pod uwagę to tło, proponowany jest kompleksowy protokół^{krok po kroku 14 - 16} do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych, który obejmuje wszystkie niezbędne kroki, do przygotowania i przetwarzania DBS w następującej komunikacji: (1) pobieranie krwi; (2) przygotowanie plam krwi; (3) wysuszanie plam krwi; 4) przechowywanie i transport; 5) wymywanie DBS; i wreszcie (6) analizy eluatów DBS. Skuteczność protokołu została po raz pierwszy oceniona za pomocą 1 762 sprzężonych par surowica/DBS do wykrywania antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) (HBsAg), przeciwciał przeciwko antygenowi rdzeniowemu HBV (anty-HBc), przeciwciał przeciwko antygenowi powierzchniowemu HBV (anty-HBs), DNA HBV, przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV) (anty-HCV), HCV RNA i ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) 1-p24-antygen/anty-HIV 1/2 przy użyciu w pełni zautomatyzowanej platformy lub czułych jakościowych testów kwasów nukleinowych. ¹⁷. W drugim etapie protokół został wykorzystany w badaniu pilotażowym "Leki i przewlekłe choroby zakaźne" (zwanym dalej "badaniem DRUCK"), które zostało przeprowadzone przez Instytut Roberta Kocha w ścisłej współpracy z Krajowym Ośrodkiem Referencyjnym ds. Wirusowego Zapalenia Wątroby typu C na aktywnych użytkownikach narkotyków w niemieckich miastach Berlinie i Essen¹⁸.

Protokół

Ponieważ protokół jest przeznaczony do użytku w diagnostyce medycznej, jego stosowanie musi być zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej¹⁹. W przypadku pierwszej części wyników przedstawionych w niniejszym komunikacie, zarówno oddzielna zgoda pacjentów, jak i zatwierdzenie przez komisję etyczną wydawały się być zbędne z dwóch powodów: (1) "Przy przyjęciu" do szpitala uniwersyteckiego w Essen "każdy pacjent wyraża pisemną zgodę na wszystkie niezbędne badania biochemiczne, bakteriologiczne i wirusologiczne". (2) "Wszystkie próbki użyte do oceny badań DBS zostały przesłane do Instytutu Wirusologii w procesie rutynowej diagnostyki klinicznej. W związku z tym żadna z próbek nie została pobrana specjalnie na potrzeby badania, nie wykonano ani jednego dodatkowego nakłucia żyły i żaden z materiałów nie został przebadany pod kątem jakichkolwiek parametrów poza tymi, które są wymagane przez lekarzy w trakcie normalnej diagnostyki."¹⁷ Badanie "Leki i przewlekłe choroby zakaźne" (badanie DRUCK")¹⁸, w którym testy DBS zostały ostatecznie wykorzystane w niemieckich miastach Berlinie i Essen do oceny osób, które aktywnie dożylnie przyjmują narkotyki, zostały zatwierdzone przez Federalnego Komisarza ds. Ochrony Danych i Wolności Informacji (Berlin, Niemcy) oraz przez komisję etyczną Uniwersytetu Medycznego Charité (Berlin, Niemcy).

1. Zbieranie krwi

1. Wkłucie żyły^{14, 15, 20, 21}
   1. Załóż jednorazowe rękawiczki z gumy lateksowej i oczyść obszar zamierzonego miejsca nakłucia (najlepiej środkową żyłę łokciową w dole przedłokciowym) odpowiednim środkiem dezynfekującym, np. 70% alkoholem izopropylowym.
   2. Załóż opaskę uciskową 4 – 6 cali powyżej domniemanego miejsca nakłucia, aby rozciągnąć żyły. Wsuń igłę do żyły pacjenta, a gdy znajdzie się na miejscu, delikatnie napełnij podłączoną probówkę z krwią, która zawiera EDTA jako antykoagulant.
   3. Jak tylko nakłucie dożylne zostanie zakończone, zwolnij opaskę uciskową i wyjmij igłę. Następnie przyciśnij suchą gazę do miejsca nakłucia, którą następnie można przytrzymać na miejscu za pomocą bandaża.
2. Nakłucie skóry (ryc. 1A)^{13 - 15, 20, 22, 23}
   1. Załóż parę jednorazowych rękawiczek z gumy lateksowej.
   2. Przed wykonaniem nakłucia skóry pacjent powinien ogrzać dłonie. Palec jest masowany następczo, aby wzbogacić przepływ krwi w kierunku miejsca nakłucia.
   3. Skórę dłoniowej strony wierzchołka dystalnego paliczka trzeciego lub czwartego palca ręki niepiszącej należy oczyścić odpowiednim środkiem dezynfekującym, np. 70% alkoholem izopropylowym. Nakłuć skórę jednorazowym nakłuciem bezpiecznym. Palec powinien być trzymany w takiej pozycji, aby grawitacja ułatwiała gromadzenie się krwi na opuszku palca.
   4. Po zakończeniu pobierania krwi włośniczkowej przez nakłucie skóry, umieść bandaż na opuszku palca.

2. Przygotowanie plam krwi

1. Preparat z krwi pobranej przez nakłucie żyły¹⁵
   1. Pobraną antykoagulowaną (EDTA) krew żylną należy jak najszybciej wykryć na kartach filtracyjnych. Nie należy przygotowywać wysuszonych plam krwi później niż 24 godziny po nakłuciu żyły.
   2. Umieść wszystkie informacje niezbędne do identyfikacji pacjenta na karcie filtra. Na jednej karcie powinna być nakrapiana krwią tylko jednej osoby.
   3. Załóż jednorazowe rękawiczki z gumy lateksowej.
   4. Delikatnie odwrócić probówkę do pobierania krwi 2 – 4 razy, a następnie ostrożnie otworzyć korek.
   5. Odessać 50 μl pełnej krwi żylnej za pomocą pipety z jednorazową końcówką. Przenieś krew do środka jednego okręgu, nie dotykając bibuły filtracyjnej bezpośrednio końcówką pipety. Spróbuj w pełni nasycić okrąg.
   6. Powtórz tę procedurę, aby wypełnić wszystkie wymagane kółka na karcie.
2. Przygotowanie z krwi pobranej przez nakłucie skóry (ryc. 1B i 1C)^{13 - 16, 23}
   1. Zetrzyj pierwszą kroplę krwi gazikiem, ponieważ może on zawierać nadmiar płynów tkankowych. Ponownie masuj palec, aby zwiększyć przepływ krwi w miejscu nakłucia. Przenieś następującą kroplę do jednego z okręgów karty filtracyjnej, nie dotykając powierzchni bezpośrednio opuszkiem palca. Pozwól, aby krew wsiąkła w teksturę filtra tylko pod wpływem sił kapilarnych.
   2. Pozwól, aby następna duża kropla krwi włośniczkowej uformowała się na opuszku palca i zbierz ją w następnym okręgu. Kontynuuj tę procedurę, aż wszystkie niezbędne kręgi zostaną wypełnione lub przepływ krwi ustanie.
   3. Nie ściskaj ani nie "doj" palca nadmiernie, jeśli przepływ krwi nie jest wystarczający do wypełnienia wszystkich wymaganych okręgów karty filtracyjnej. Jeśli przepływ krwi ustaje, umieść bandaż na opuszku palca. Wykonaj drugie nakłucie skóry na innym palcu, jeśli do badania potrzeba więcej krwi.

3. Wysuszanie plam krwi

1. Aby wysuszyć plamy krwi, umieść karty filtracyjne na czystym ręczniku papierowym w komorze bezpieczeństwa zagrożenia biologicznego i pozwól im wyschnąć, najlepiej O/N (ale przez co najmniej 4 godziny), w temperaturze pokojowej przy braku jakiegokolwiek zewnętrznego źródła ciepła. Po zakończeniu procesu suszenia plamy krwi mają jednolicie ciemnobrązowawy kolor i nie są już widoczne czerwone obszary (ryc. 1D)^{13, 15, 16}.

4. Przechowywanie i transport zaschniętych plam krwi (DBS)

UWAGA: Przetwarzanie plam krwi może zostać przerwane po wyschnięciu. Karty filtrów można teraz przechowywać^{w godzinach 13 - 16, 23}.

1. Do przechowywania umieść kartę z bibuły filtracyjnej w pojedynczej, nieprzepuszczalnej dla gazów torbie z zamkiem błyskawicznym, zawierającej od 1 do 2 saszetek ze środkiem osuszającym w celu ochrony próbek przed wilgocią (rysunek 1E). Opcjonalnie dodaj kartę wskaźnika wilgotności.
2. Przenieś tę torbę do zamrażarki o temperaturze -20 °C lub niższej tak szybko, jak to możliwe. Jeśli zamrażarki nie są dostępne w warunkach polowych, przechowywanie w temperaturze -4 °C lub nawet w temperaturze otoczenia jest możliwe do 14 dni.
3. Transport zamrożonych próbek DBS na suchym lodzie. W przypadku kart filtracyjnych początkowo przechowywanych w temperaturze otoczenia należy stosować potrójny system pakowania, który składa się z worka (woreczków) z zamkiem błyskawicznym jako pojemnika (pojemników) wewnętrznego, a także koperty wewnętrznej i zewnętrznej. W przypadku wysyłki zwykłą pocztą na kopercie zewnętrznej nie są wymagane żadne oznaczenia zawartości, ale międzynarodowy symbol zagrożenia biologicznego musi być umieszczony na głównym pojemniku wewnętrznym¹⁶.
4. Wykluczyć karty filtracyjne z dalszego przetwarzania, jeśli opakowanie środka osuszającego i/lub karta dodatkowego wskaźnika wilgotności zmieni kolor na różowy.

5. Wymycie zaschniętych plam krwi^{13, 15, 16, 23}

1. Wybij jedno miejsce jednorazowym urządzeniem o średnicy 6 mm z każdego nasączonego krwią okręgu karty filtracyjnej klasy 903 (Rysunek 1F). Przenieś wszystkie dziurkowane, wysuszone plamki krwi od jednego pacjenta do jednego dołka na 12-dołkowej płytce.
2. Napełnij studzienkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami zawierającą 0,05% Tween 20 i 0,08% azydku sodu (ryc. 1G). Dostosuj objętość dodanego buforu do minimalnych odpowiednich wymagań testu stosowanego do późniejszej analizy wysuszonych plam krwi eluowanych.
3. Powtórz te kroki, aby uzyskać drugą serię wysuszonych eluatów plamki krwi w celu przeprowadzenia analiz molekularnych.
4. Umieść płytkę do hodowli komórkowej na wytrząsarce laboratoryjnej i pozwól, aby wybite wysuszone plamy krwi delikatnie wymywały się przez co najmniej 4 godziny lub, najlepiej, O/N (Figura 1H).
5. Następnego dnia plamy są prawie wolne od krwi i utworzyły się supernatanty hemolityczne (ryc. 1I). Przenieść te eluaty do probówek mikrowirówek. Następnie poddać je wirowaniu przez 2 minuty przy 10 500 x g (Rysunek 1J), aby uwolnić supernatanty od wszelkich zanieczyszczeń, które powstały podczas elucji (Rysunek 1K).

6. Analiza eluatów

1. Odwirowane eluaty są teraz gotowe do użycia w zamierzonych analizach. Zbadaj eluaty pod kątem markerów wirusa zapalenia wątroby typu B, wirusa zapalenia wątroby typu C i zakażenia HIV za pomocą dostępnych na rynku zestawów i postępuj zgodnie z instrukcjami odpowiednich producentów (ryc. 1L).

Rysunek 1. Graficzne podsumowanie protokołu zaproponowanego w niniejszym komunikacie w odniesieniu do przygotowania i przetwarzania wysuszonych plamek krwi do wykorzystania w testach immunologicznych i technikach molekularnych. Krew żylna pełna i krew włośnikowa uzyskana przez nakłucie dożylne lub nakłucie skóry lancetem (A) może służyć jako próbki do analizy suchej kropli krwi. Po przeniesieniu krwi do okręgów karty filtracyjnej klasy 903 (B, C), próbki powinny być suszone, najlepiej O/N w temperaturze otoczenia w komorze bezpieczeństwa zagrożenia biologicznego, aby utworzyć plamy o równomiernie brązowawym kolorze bez żadnych przeplatania się czerwonych obszarów (D). Gdy suszenie plam krwi jest zakończone i konieczne jest przechowywanie, karty filtracyjne można zapakować w nieprzepuszczalne dla gazów woreczki strunowe zawierające 1-2 saszetki ze środkiem osuszającym (E). Dalsze przetwarzanie laboratoryjne DBS obejmuje wytwarzanie stempli za pomocą urządzenia jednorazowego użytku o średnicy 6 mm ze środka okręgów (F, G), elucję stempli w buforze opartym na PBS przez co najmniej 4 godziny lub, najlepiej, O/N na wytrząsarce (H), odzyskiwanie eluatów (I), i na koniec odwirowanie kubków laboratoryjnych (J) w celu uwolnienia eluatów DBS od wszelkich zanieczyszczeń, które mogły powstać podczas procesu elucji (K). Następnie eluaty DBS są gotowe do analiz, które zostały przeprowadzone przez w pełni zautomatyzowaną platformę (L) w celu wykrycia markerów serologicznych zakażeń odpowiednio HBV, HCV i HIV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Skuteczność protokołu sugerowanego do przygotowania i przetwarzania DBS została najpierw oceniona poprzez analizę 1,762 sprzężonych par surowica/DBS dla markerów zakażenia HBV, HCV i HIV. ¹⁷. W tym celu DBS przygotowano ze 100 μl pełnej krwi żylnej (por. pkt 2.1.1 – 2.1.6 poprzedniego protokołu) i wymyto 1 000 μl buforu na bazie PBS, każdy (por. pkt 5.1 – 5.5 wyżej wymienionego protokołu), aby zakończyć proces dla wszystkich siedmiu parametrów w dwóch oddzielnych operacjach. Takie podejście bez starannej optymalizacji warunków elucji dla każdego pojedynczego analitu wydawało się nieuniknione, ponieważ spodziewano się dość dużej przepustowości próbki w stosunkowo krótkim czasie podczas zbliżającego się badania terenowego "Leki i przewlekłe choroby zakaźne" ("Badanie DRUCK").

Wszystkie pomiary były zgodne z zaleceniami producenta w trakcie analiz DBS, ale musiały zostać zmodyfikowane w odniesieniu do oznaczeń HBsAg i anty-HBs, aby skompensować albo efekt hemolizy, albo wynik rozcieńczenia. Przy wartości odcięcia wynoszącej 0,05 IU / ml, badanie HBsAg eluatów DBS prowadzi do odsetka wyników fałszywie dodatnich wynoszących 14,7% (52 z 354) w porównaniu z próbkami surowicy (Figura 2A). Analiza charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC)^{25, 26 danych wykazała,} że wzrost progu do 0,15 IU/ml skutkowałby idealnym oddzieleniem HBsAg-dodatnich od HBsAg-ujemnych (0,986 [czułość], 0,000 [1- swoistość], Figura 2B). Z drugiej strony, przy wartości odcięcia wynoszącej 10 j.m./l dla oznaczania ilościowego przeciwciał anty-HBs, odnotowano odsetek wyników fałszywie ujemnych wynoszący 14,2% (47 z 331) (ryc. 2C). W związku z tym, po ponownej analizie ROC, ta granica została obniżona do 1,5 IU/l, aby uzyskać optymalną dyskryminację wartości (0,917 [czułość], 0,007 [1- swoistość], rysunek 2D).

Rysunek 2.Badanie HBsAg i anty-HBs w eluatach DBS (zmodyfikowane z¹⁷). Sterowany przez ROC wzrost wartości odcięcia dla oznaczania ilościowego HBsAg z 0,05 IU/ml (A) do 0,15 IU/ml (B) zmniejszył odsetek wyników fałszywie dodatnich z 14,7% do 0%. Podobnie, analiza ROC stężeń anty-HBs sugerowała obniżenie odpowiedniego progu z 10 IU/l (C) do 1,5 IU/l (D), co całkowicie wyeliminowało wyniki fałszywie ujemne, które początkowo stanowiły 14,2 % wszystkich oznaczeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki analiz sprzężonej surowicy/DBS są podsumowane w Tabeli 1¹⁷. W trakcie badań DBS nie stwierdzono nieswoistości dla żadnego z siedmiu analitów.

Gdy eluaty DBS były badane pod kątem obecności HBsAg, tj. kluczowego parametru serologicznego zarówno ostrego, jak i przewlekłego zakażenia HBV, określono czułość analityczną na poziomie 98,6%. Stężenia HBsAg w dwóch fałszywie ujemnych surowicach wynosiły odpowiednio 749 j.m./ml i 6 j.m./ml. Przeciwciała anty-HBc wykryto w 176 z 204 (tj. 86,3%) eluzatów DBS. Dwadzieścia dwie z 28 próbek, które nie zostały wykryte przez pomiary, pochodziło od osób jednocześnie zakażonych wirusem HIV. Tak więc, jeśli osoby zakażone wirusem HIV zostały wyłączone z obliczeń, osiągnięto czułość 97,1% na pobieranie przeciwciał anty-HBc z eluowanej wysuszonej krwi żylnej. Podobne obserwacje dotyczyły oznaczania przeciwciał anty-HBs. Nawet po dostosowaniu wartości odcięcia testu do 1,5 j.m./l, wystąpiło dziewięć rozbieżnych wyników DBS w surowicy. U pacjentów, u których nie stwierdzono jednoczesnego zakażenia wirusem HIV, stwierdzono stężenia anty-HBs w surowicy wynoszące 11 – 26 j.m./l, które były zbyt niskie, aby można było je wykryć po wypłukaniu wysuszonej krwi.

Przeciwciała anty-HCV wskazują na ostrą, przewlekłą lub ustąpioną infekcję. Tylko cztery (tj. 2,2 %) fałszywie ujemne wyniki anty-HCV uzyskano z eluatów DBS, a dalsze analizy serologiczne i molekularne wyraźnie wykazały, że odpowiednie surowice zostały najprawdopodobniej pobrane od pacjentów, których infekcje już dawno ustąpiły.

Wykrycie przeciwciał anty-HIV w etuacjach DBS za pomocą w pełni zautomatyzowanego systemu było całkowicie płynnym procesem, który przyniósł czułość analityczną na poziomie 100 %.

"Średnie stężenie DNA HBV z eguatów krwi pełnej zostało przeprowadzone na 100 próbkach (średnie stężenie DNA: 1 573 898 IU/ml, zakres: < 357 - > 17 860 000 IU/ml) i uzyskało wartość 93,0 %. W związku z tym siedem próbek o niskim stężeniu DNA HBV w surowicy między 409 a 3 643 j.m./ml nie zostało wykrytych przez testy DBS. Spośród 100 surowic, które okazały się być HCV RNA dodatnie (średnie stężenie RNA HCV: 1 415 944 IU/ml, zakres: 2 479 - >7 692 000 IU/ml), dostępne były odpowiednie porcje krwi pełnej. Badanie porównawcze wykazało 100 % czułość analityczną dla oznaczania RNA HCV z eluatów DBS."¹⁷

Aby przetestować opisany protokół przygotowania i przetwarzania DBS w warunkach polowych, został on wykorzystany w ścisłej współpracy z Instytutem Roberta Kocha (Berlin, Niemcy) podczas pilotażowej fazy badania "Leki i przewlekłe choroby zakaźne", które zostało przeprowadzone na aktywnych użytkownikach narkotyków w niemieckich miastach Berlin i Essen¹⁸. Wszystkich 534 uczestników (433 mężczyzn i 101 kobiet) poddano pobraniu próbek krwi włośniczkowej, jak opisano szczegółowo w sekcjach 2.2.1 – 2.2.3 poprzedniego protokołu, a DBS ponownie eluowano przez dodanie 1000 μl buforu na bazie PBS.

Dwie osoby zostały zdiagnozowane jako przewlekle zakażone HBV, a 39 wykazało serologiczny wzór rozwiązanego zakażenia HBV. Co więcej, piętnastu uczestników miało pozytywny wynik na obecność anty-HBc (status po szczepieniu), a ośmiu okazało się dodatnich na obecność samego anty-HBc. Rozpowszechnienie przeciwciał przeciwko HCV wśród uczestników wynosiło 57,3% (N = 193) w Berlinie i 73,0% (N = 144) w Essen. Z próbek dodatnich na obecność przeciwciał 65 % (N = 125) i 62 % (N = 89) było również wiremicznych. Dwadzieścia pięć z 534 osób uzyskało pozytywny wynik testu na obecność wirusa HIV. Dziewiętnaście infekcji było już znanych, a 24 z tych osób były jednocześnie zakażone HCV.

Wyniki uzyskane przez testy DBS zostały starannie porównane z danymi anamnestycznym uczestników badania dotyczącymi zgłaszanego przez nich statusu HBV i HCV. To porównanie, w połączeniu z wynikami testów sprzężonych par surowica/DBS, doprowadziło do niewielkich modyfikacji algorytmu testowego w głównej fazie "badania DRUCK", w którym wezmą udział aktywni użytkownicy narkotyków w sześciu dodatkowych dużych miastach niemieckich: "Osoby zakażone wirusem HIV będą zawsze badane na obecność DNA HBV. Uczestnicy, u których eluaty DBS są dodatnie na obecność anty-HBc lub anty-HBs, powinni zostać poddani nakłuciu żyły podczas drugiej konsultacji, aby definitywnie wyjaśnić ich status anty-HBc/anty-HBs, a na koniec wszystkie eluaty DBS zostaną przebadane pod kątem RNA HCV, niezależnie od wyników testów anty-HCV.

) szt. Rozdział szt. szt. szt.

Parametry	Surowice sprzężone/eluaty DBS (N)	Rozbieżne wyniki (N)	Przyczyna rozbieżności między badaną surowicą a eluatami DBS
Wirus HBV (wirus
HBsAg (Magazyn HBsAg	299	cyfra arabska	Dwóch pacjentów z przewlekłym zakażeniem HBV. Oboje byli leczeni przeciwwirusowo, a jeden z nich był jednocześnie zakażony wirusem HIV. Stężenia HBsAg w surowicy: odpowiednio 749 j.m./ml i 6 j.m./ml.
Anty-HBc	Rozdział 305	28	W surowicy u dwudziestu dwóch pacjentów ustąpiło zakażenie HBV. Sześć osób wykazało wynik serologiczny "sam anty-HBc". Dwudziestu dwóch pacjentów było jednocześnie zakażonych wirusem HIV. Spośród "leków resolwerujących HBV" dwadzieścia zostało ocenionych jako "same przeciwciała anty-HBs" za pomocą testów DBS, a zatem zostały fałszywie sklasyfikowane jako "stan po szczepieniu".
Anty-HBs	Rozdział 310	9	U czterech pacjentów, którzy nie byli jednocześnie zakażeni wirusem HIV, stężenie anty-HBs w surowicy wynosiło 11 - 26 j.m./l, które było zbyt niskie, aby umożliwić wykrycie przeciwciał po wymyciu wysuszonych plamek krwi.
DNA wirusa HBV	150	7	Odpowiednie surowice uzyskano od siedmiu pacjentów z niskimi stężeniami DNA HBV w surowicy w zakresie od 409 j.m./ml do 3643 j.m./ml.
Wirus HCV
Anty-HCV	339	4	Te cztery surowice zostały pobrane od pacjentów, u których już dawno ustąpiły zakażenia HCV.
RNA HCV	150	0	–
HIV
HIV 1-p24/anty-HIV 1/2	Rozdział 209	0	–

Tabela 1: Wyniki uzyskane z 1,762 DBS, które zostały przygotowane i przetworzone z pełnej krwi żylnej zgodnie z protokołem zaproponowanym w tym komunikacie, w porównaniu z wynikami w sprzężonych próbkach surowicy jako odniesienie.

Dyskusja

DBS są używane od 100 lat² Ale, co zaskakujące, nadal nie ma ogólnego konsensusu co do ich przygotowania i przetwarzania. Do tej pory wystarczająca standaryzacja tej ważnej fazy przedanalitycznej została osiągnięta jedynie w dziedzinie badań przesiewowych noworodków¹⁴, podczas gdy istnieje wiele różnych protokołów dla wszystkich innych zastosowań testów DBS^{5, 16, 23}. Aby przezwyciężyć tę niezwykłą niejednorodność, w niniejszym komunikacie przedstawiono obszerną instrukcję krok po kroku dotyczącą przygotowania i przetwarzania DBS do wykorzystania w testach immunologicznych i technikach molekularnych oraz oceniono jej skuteczność w wykrywaniu markerów zakażeń HBV, HCV i HIV. Poniższa dyskusja skupia się przede wszystkim na różnych etapach proponowanego protokołu.

W historii testów DBS używano wielu różnych kart bibułowych z filtracją² , ale obecnie tylko dwa komercyjne źródła są zatwierdzone przez FDA jako urządzenia medyczne klasy II do pobierania krwi^{5, 16}. Te systemy kart filtracyjnych są wysoce jednorodne i mają bardzo podobne charakterystyki absorpcji, dzięki czemu wyniki analityczne uzyskane z krwi włośniczkowej przygotowanej na którymkolwiek z nich nie różnią się o więcej niż 4% – 5%²⁸. Nic dziwnego, że Masciotra i współpracownicy^wykryli RNA HIV-1 równie dobrze za pomocą testu jakościowego po wyluceniu z kart pobierania krwi z różnych źródeł. Biorąc pod uwagę te dane, można praktycznie wykluczyć, że którakolwiek z rozbieżności zaobserwowanych podczas testowania sprzężonych par surowica/DBS pod kątem markerów zakażeń HBV, HCV i HIV¹⁷ była spowodowana wyborem samej karty filtracyjnej. Jeżeli jednak niezbędne jest dokładne oznaczanie ilościowe analitu, różnice między źródłami mogą nie być już nieistotne i konieczne może być zastosowanie bardziej wyrafinowanych technik, np. perforowanego DBS (PDBS) jako metody mikropobierania próbek³⁰ lub przygotowania wysuszonych plamek surowicy (DSS)³¹ zamiast konwencjonalnego badania DBS¹⁰.

Ponieważ do badania DBS wykorzystuje się tylko niewielkie ilości krwi (jedna kropla krwi włośniczkowej składa się z około 50 μl)^{5, 16}, różnice w objętości próbki są kluczowe i trzeba przyznać, że przynajmniej część rozbieżności między wynikami serologicznymi a zgłaszanym przez uczestników statusem HBV i HCV zarejestrowanym podczas pilotażu "Badania DRUCK" można przypisać tej zmiennej. Najważniejszym czynnikiem minimalizującym "wahania" objętości próbki jest bez wątpienia prawidłowa technika pobierania krwi włośniczkowej, którą można osiągnąć tylko dzięki starannemu i ciągłemu szkoleniu personelu technicznego²². Ponadto, w ramach kontroli jakości, wszystkie laboratoria pracujące z DBS powinny już zainicjować procedury identyfikacji, a następnie wykluczenia próbek DBS, które należy uznać za niezadowalające lub nieważne¹⁶.

Badania przeprowadzone głównie w kontekście HIV³² i badań przesiewowych noworodków³³ wykazały, że wysoka wilgotność może prowadzić do degradacji analitów, ale do tej pory nie osiągnięto konsensusu co do tego, jak długo DBS powinien być suszony na powietrzu. W niniejszym komunikacie zaproponowano odstęp co najmniej 4 godzin lub najlepiej O/N, w związku z czym przyjęto warunki, które zastosowano w zdecydowanej większości wszystkich odnośnych publikacji^{32, 34} Dane dotyczące przechowywania DBS, które mają być następnie wykorzystywane do badań na obecność wirusa HBV i HCV, są sprzeczne. W 1981 roku Villa i^{współpracownicy,} którzy zastosowali współczesne techniki analityczne, stwierdzili, że przechowywanie w RT nie wpłynęło na wyniki analiz HBV przez cały okres obserwacji wynoszący 180 dni, jeśli miano przeciwciał wynosiło > 1/1000, ale że DBS stał się graniczny dodatni lub nawet ujemny po 15 dniach, gdy miano w surowicy wynosiło tylko 1/100. Przechowywanie w temperaturze -20 °C lub 4 °C nie przyniosło znaczącej poprawy. Natomiast w badaniu przeprowadzonym trzydzieści lat później³⁶ testowano powtórzenia próbki dodatniej pod względem HBV, a autorzy odkryli, że przeciwciała anty-HBc, jak również przeciwciała anty-HBs były stabilne do 183 dni w RT, podczas gdy HBsAg w tych samych warunkach stawały się fałszywie ujemne już po 63 dniach. Jeśli chodzi o wykrywanie DNA HBV z eluatów DBS, stężenie wirusowego kwasu nukleinowego było stabilne przez co najmniej siedem dni w temperaturze 37 °C³⁷ lub okazało się "odporne" na przechowywanie w temperaturze pokojowej przez okres do trzech tygodni³⁸. Testy na obecność przeciwciał anty-HCV przy użyciu dwóch dostępnych na rynku testów immunologicznych trzeciej generacji³⁹ dostarczyły dokładnych wyników przez okres 117 dni przy użyciu próbek DBS przechowywanych odpowiednio w temperaturze -20 °C, 2 – 8 °C i 20 – 25 °C. Przechowywanie w temperaturze -20 °C skutkowało jednak najmniejszą zmiennością gęstości optycznej. Stosując test ELISA anty-HCV czwartej generacji, tj. Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, w kontekście testów DBS, Larrat i wsp.⁴⁰ zaobserwowało gwałtowny spadek swoistości analitycznej po przechowywaniu próbek DBS przez ponad trzy dni w RT. Z drugiej strony, precyzyjne wyniki testów uzyskano za pomocą tego samego zestawu, wykorzystując próbki zdeponowane przez 60 dni w różnych warunkach (-20 °C, 2 – 8 °C i 22 – 26 °C) przez Brandao i współpracowników⁴¹. Obserwacje dotyczące spadku stężeń RNA HCV w DBS w różnych warunkach przechowywania wahają się od braku znaczących zmian w RT przez okres do jednego roku⁴² do dziesięciokrotnej zmiany po czterech tygodniach w temperaturze otoczenia⁴³. Biorąc pod uwagę te dość sprzeczne dane dotyczące stabilności antygenów HBV i HCV, kwasów nukleinowych i przeciwciał, rozsądne wydawało się wycofanie się w proponowanym protokole do konsensusu, który został wcześniej określony w odniesieniu do przechowywania próbek DBS, które mają być wykorzystywane do testów na obecność wirusa HIV^{15, 30}: Dla krótkotrwałego odkładania (do dwóch tygodni) antygenów, wirusowy kwas nukleinowy i przeciwciała są uważane za stabilne w RT, podczas gdy optymalne przechowywanie przez dłuższy czas odbywa się w warunkach zamrożenia.

Z reguły przy projektowaniu protokołu elucji należy wziąć pod uwagę trzy parametry: (1) bufor elucyjny; (2) czas trwania i temperaturę elucji; oraz (3) objętość elucji²³. W zdecydowanej większości wszystkich istotnych publikacji do elucji DBS stosowano sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a większość autorów dodawała białko, np. albuminę surowicy bydlęcej (BSA) lub Tween 20, środek powierzchniowo czynny, w celu poprawy sygnału testu poprzez stabilizację białek w miarę ich przechodzenia do roztworu i jednoczesne blokowanie niespecyficznych miejsc wiązania²³. Dostępnych jest tylko kilka raportów, które bezpośrednio porównują różne elucyjne w kontekście badań DBS. Villar i wsp.³⁶, na przykład, zarejestrowało prawie równoważne zdolności elucyjne dla wszystkich zastosowanych, ale PBS/BSA 0,5% skutkowało najniższym poziomem reaktywności nieswoistej. Bardzo podobne spostrzeżenie zostało poczynione przez Crooma i współpracowników⁴⁴ podczas stosowania rozcieńczalnika próbki rLAV EIA do elucji przeciwciał anty-HCV z DBS. Ponieważ ryzyko degradacji próbki jest niezwykle niskie w pierwszych godzinach po przygotowaniu DBS (patrz wyżej), zdecydowano się na inkubację plam O/N w temperaturze otoczenia i wspomaganie procesu elucji poprzez delikatne mieszanie od końca do końca. Takie podejście ma tę zaletę, że próbki wybite poprzedniego dnia mogą być bezpośrednio przekazane do rutynowej diagnostyki wcześnie następnego dnia rano^. Objętość buforu elucyjnego powinna być dostosowana do minimalnych odpowiednich wymagań dotyczących testów stosowanych do kolejnych analiz w celu utrzymania współczynnika rozcieńczenia na możliwie najniższym poziomie. Jednak staranna optymalizacja warunków elucji dla każdego pojedynczego analitu nie była możliwa w poprzedniej ocenie, ponieważ podczas "badania DRUCK" trzeba było zagwarantować wysoką przepustowość próbki w stosunkowo krótkim ^czasie17. W związku z tym wykorzystano raczej niekorzystną objętość 1000 μl buforu na bazie PBS w celu zakończenia całego procesu elucji dla wszystkich parametrów w dwóch oddzielnych operacjach.

Podejście to, z jednej strony, zawodzi "całkowicie w systemie anty-HBc/anty-HBs u osób zakażonych wirusem HIV z powodu niskich stężeń przeciwciał; ... i wymagało to procedur biologii molekularnej z optymalną czułością analityczną w odniesieniu do testów DNA HBV i RNA HCV."¹⁷ Z drugiej strony, wysoka objętość elucji nie okazała się w żaden sposób niekorzystna dla oznaczania HBsAg, anty-HCV i anty-HIV przez zestawy używane podczas całej oceny. "Wykrycie materiałów HBsAg dodatnich w euatach krwi pełnej powiodło się z czułością 98,6% w podobnie wysokim stopniu, jak w poprzednich badaniach, w których częściowo wykorzystano znacznie mniejszą objętość elucji wynoszącą 100 μl, 250 μl lub 600 μl lub 500 μl"^{17, 36, 45, 46}. Czułość 97,8% określona w badaniu 179 par surowica/DBS dla przeciwciał anty-HCV odpowiadała wynikom już istniejących doniesień^{24, 44, 47, 48, 49}, które pracowały z objętością elucji mniejszą od 5 do 10 razy. "Ponadto protokoły wykrywania anty-HCV zostały odpowiednio zoptymalizowane ... poprzez określenie własnych punktów odcięcia"^{17, 24, 48, 49} "lub poprzez zwiększenie objętości próbki z 20 μl do 100 μl."^{17, 49} Wreszcie, swoistość analityczna i czułość (po 100% każdy) ustalone dla wykrywania anty-HIV były równe lub lepsze od charakterystyki działania innych testów immunologicznych specjalnie przystosowane do testowania DBS^{50, 51} "lub procedury etapowej z łącznym zastosowaniem kilku testów anty-HIV"^{17, 52}. "Rzeczywiście, przekroczyły one również rekord wydajności testu, który został specjalnie opracowany i zoptymalizowany do wykrywania przeciwciał anty-HIV w eluatach DBS (zestaw Q-Prevent HIV 1 + 2 DBS^)".

Podsumowując, kompleksowy protokół krok po kroku przedstawiony w niniejszym komunikacie okazał się wykonalnym i przyjaznym dla użytkownika narzędziem do przygotowywania i przetwarzania DBS, a tym samym może być niezawodnie stosowany w diagnostyce wirusologicznej. Pozwala on na stosowanie podejść wykorzystujących automatyzację ⁵⁴ , a ze względu na swoje doskonałe właściwości użytkowe ma potencjał, aby służyć jako rodzaj kamienia węgielnego dla przyszłego, ogólnie akceptowanego protokołu konsensusu w globalnej dziedzinie testowania DBS w medycynie laboratoryjnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rękawice lateksowe gumowe	Hartmann	#4049500041515
70% alkohol izopropylowy	Bode Chemie	#9768050
Kaniula bezpieczeństwa Mulifly	Sarstedt	#85.1638
Probówka do pobierania krwi EDTA	Sarstedt	#02.1066.001
Bandaż samoprzylepny	Hartmann	#2994163
Sucha gaza	Hartmann	#143213
Bezpieczny lancet do użytku w Singelu	Owen Mumford	#3802421
Karta z bibuły filtracyjnej	Whatman/sigmaaldrich	#10534612	Karta z bibuły filtracyjnej klasa 903
Jednorazowe końcówki do pipet	Starlab	#S1126-7810, #S1120-8810
Torba na zamek błyskawiczny	Flexico	#20219
Mini torba ze środkiem osuszającym	Tropack	#-
Jednorazowy dziurkacz	pfmmedical	#48601	6,0 mm Jednorazowy dziurkacz do biopsji
Jednorazowe kleszcze	Servoprax	#H7301
12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	Greiner	#665180
Bufor PBS	Gibco	#14190-136
Tween 20	Applichem	#A1389.0500
Azydek sodu	Merck	#66880250
Probówki Safe-Lock, 1,5 ml	Eppendorf	#30120086
ARCHITECT HBsAg (ilościowe)	Abbott	#6C3642
ARCHITECT anty-HBc II	Abbott	#8L4425
ARCHITECT anty-HCV	Abbott	#6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo	Abbott	#4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit	Roche	#6374891001
artus HBV LC PCR Kit	Qiagen	#4506063 (24 testy), #4506065 (96 testów)
Test VERSANT HCV TMA IVD	Siemens Healthcare	#2554311