Artykuł metodologiczny

Suszone plamy krwi - przygotowanie i przetwarzanie do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych

46.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52619

⸱

13 marca 2015

 ,  , 
1Institute of Virology, National Reference Centre for Hepatitis C, Essen University Hospital, University of Duisburg-Essen

W tym artykule

Podsumowanie

Przygotowanie i przetwarzanie wysuszonych plam krwi (DBS) do ich końcowej analizy jest nadal słabo ustandaryzowane dla większości zastosowań diagnostycznych. Aby przezwyciężyć to niedociągnięcie, sugeruje się kompleksowy protokół krok po kroku, a następnie ocenia się go pod kątem jego skuteczności w wykrywaniu markerów infekcji wirusowych.

Streszczenie

Pomysł zbierania krwi na papierowej kartce, a następnie używania wysuszonych plam krwi (DBS) do celów diagnostycznych powstał sto lat temu. Od tego czasu testy DBS przez dziesięciolecia koncentrowały się głównie na diagnozowaniu chorób zakaźnych, zwłaszcza w warunkach ograniczonych zasobów, lub na systematycznych badaniach przesiewowych noworodków pod kątem dziedzicznych zaburzeń metabolicznych, a dopiero niedawno zaczęło pojawiać się wiele nowych i innowacyjnych zastosowań DBS. Przez wiele lat zmienne przedanalityczne były brane pod uwagę w dziedzinie badań DBS tylko w niewłaściwy sposób i nawet dzisiaj, z wyjątkiem badań przesiewowych noworodków, cała faza przedanalityczna, która obejmuje przygotowanie i przetwarzanie DBS do ich końcowej analizy, nie została ustandaryzowana. W tym kontekście proponuje się kompleksowy protokół krok po kroku, który obejmuje wszystkie podstawowe fazy, tj. pobieranie krwi; przygotowanie plam krwi; suszenie plam krwi; magazynowanie i transport DBS; elucja DBS, a na końcu analizy eluatów DBS. Skuteczność tego protokołu została po raz pierwszy oceniona za pomocą 1 762 sprzężonych par surowica/DBS do wykrywania markerów zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu B, wirusem zapalenia wątroby typu C i ludzkim wirusem niedoboru odporności na zautomatyzowanej platformie analitycznej. W drugim etapie protokół został wykorzystany podczas badania pilotażowego, które zostało przeprowadzone na aktywnych użytkownikach narkotyków w niemieckich miastach Berlinie i Essen.

Wprowadzenie

Pomysł wykorzystania krwi zebranej na papierowej karcie wykonanej z celulozy przypisuje się Ivarowi Christianowi Bangowi (1869 - 1918), ojcu nowoczesnej mikroanalizy klinicznej1, 2. W 1913 roku Bang oznaczył glukozę z eluatów wysuszonych plam krwi (DBS)3, a później przeprowadził również pomiary azotu metodą Kjeldahla z tą techniką bibuły filtracyjnej2. Następnie kilku badaczy poinformowało o zastosowaniu DBS do testów serologicznych w celu zdiagnozowania kiły2. Już w 1924 roku Chapman podsumował zalety badania DBS, zwracając szczególną uwagę na cztery elementy, które są nadal aktualne: (1) w porównaniu z konwencjonalnym nakłuciem żyły wymagana jest mniejsza objętość krwi i fakt ten był najważniejszy w diagnostyce dziecięcej; (2) pobieranie krwi jest proste, nieinwazyjne i niedrogie; (3) ryzyko skażenia bakteryjnego lub hemolizy jest minimalne; oraz (4) DBS może być przechowywany przez długi czas prawie bez pogorszenia jakości analitów2, 4. Oprócz zastosowania w testach na kiłę, dalsze wczesne zastosowania techniki DBS obejmowały, np. wykrycie przeciwciał przeciwko odrze, śwince, wirusowi polio, wirusowi paragrypy i syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV) w 1953 r.2, identyfikację Shigella w kale wysuszonym na bibule filtracyjnej i wysłanym zwykłą pocztą z Indonezji do Lejdy w Holandii, a także wykrycie przeciwciał przeciwko Schistosoma w DBS pobranych na obszarach endemicznych i przeanalizowanych ponad Trzy miesiące później5. W 1963 roku, pięćdziesiąt lat po pierwotnym komunikacie Banga, Guthrie w końcu opublikował swoją słynną metodę diagnozowania fenyloketonurii na podstawie DBS uzyskanej przez nakłucie pięty u noworodków7, 8.

Chociaż od tego czasu DBS były uważane za powszechnie stosowaną metodę zbierania, przechowywania, transportu i analizowania różnych płynów ustrojowych5, ich użycie w diagnostyce nadal koncentrowało się głównie na diagnozowaniu infekcji, zwłaszcza w warunkach ograniczonych zasobów i systematycznym badaniu noworodków pod kątem dziedzicznych zaburzeń metabolicznych przez dziesięciolecia9, Rozdział 10. Jednak od 2005 roku zaczęło pojawiać się wiele nowych i innowacyjnych aplikacji DBS. Spowodowało to niemal wykładniczy wzrost liczby publikacji naukowych na temat DBS z około 50 do prawie 450 rocznie obecnie. Wśród pojawiających się zastosowań znajdują się tak różnorodne dziedziny, jak badania toksyko- i farmakokinetyczne, profilowanie metaboliczne, monitorowanie leków terapeutycznych, toksykologia sądowa czy kontrola skażenia środowiska10, 11.

Testy DBS w ciągu ostatnich 100 lat triumfalnie przeszły przez kliniczną diagnostykę laboratoryjną2. Jednak, podobnie jak w przypadku chemii klinicznej12, podczas tego marszu zmienne przedanalityczne nie były odpowiednio uwzględniane przez wiele lat. Rzeczywiście, nawet dzisiaj, po tak wybitnych działaniach, jak projekt oceny bibuły filtracyjnej CDC13 lub sformułowanie krajowego standardu pobierania krwi na bibule filtracyjnej w ramach badań przesiewowych noworodków14, faza przedanalityczna jest nadal w dużej mierze niedoceniana w większości innych dziedzin, w których stosuje się testy DBS5, Rozdział 10.

Biorąc pod uwagę to tło, proponowany jest kompleksowy protokółkrok po kroku 14 - 16 do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych, który obejmuje wszystkie niezbędne kroki, do przygotowania i przetwarzania DBS w następującej komunikacji: (1) pobieranie krwi; (2) przygotowanie plam krwi; (3) wysuszanie plam krwi; 4) przechowywanie i transport; 5) wymywanie DBS; i wreszcie (6) analizy eluatów DBS. Skuteczność protokołu została po raz pierwszy oceniona za pomocą 1 762 sprzężonych par surowica/DBS do wykrywania antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) (HBsAg), przeciwciał przeciwko antygenowi rdzeniowemu HBV (anty-HBc), przeciwciał przeciwko antygenowi powierzchniowemu HBV (anty-HBs), DNA HBV, przeciwciał przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (HCV) (anty-HCV), HCV RNA i ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) 1-p24-antygen/anty-HIV 1/2 przy użyciu w pełni zautomatyzowanej platformy lub czułych jakościowych testów kwasów nukleinowych. 17. W drugim etapie protokół został wykorzystany w badaniu pilotażowym "Leki i przewlekłe choroby zakaźne" (zwanym dalej "badaniem DRUCK"), które zostało przeprowadzone przez Instytut Roberta Kocha w ścisłej współpracy z Krajowym Ośrodkiem Referencyjnym ds. Wirusowego Zapalenia Wątroby typu C na aktywnych użytkownikach narkotyków w niemieckich miastach Berlinie i Essen18.

Protokół

Ponieważ protokół został opracowany do zastosowania w diagnostyce medycznej, jego stosowanie musi być zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej19. W przypadku pierwszej części wyników przedstawionych w niniejszym komunikacie, zarówno oddzielna zgoda pacjentów, jak i zatwierdzenie przez komisję etyki wydawały się zbędne z dwóch powodów: (1) „Przy przyjęciu” do szpitala Uniwersytetu w Essen „każdy pacjent wyraża pisemną zgodę na wszystkie niezbędne badania biochemiczne, bakteriologiczne i wirusologiczne”.17 (2) „Wszystkie próbki wykorzystane podczas oceny testów DBS zostały wysłane do Instytutu Wirusologii w ramach rutynowej diagnostyki klinicznej. W związku z tym żadna z próbek nie została pobrana specjalnie na potrzeby badania, nie wykonano żadnego dodatkowego wkłucia żylnego, a żadne z materiałów nie było badane pod kątem innych parametrów niż te wymagane przez lekarzy w przebiegu standardowej diagnostyki”.17 Badanie „Leki i Przewlekłe Choroby Zakaźne” (badanie DRUCK)18, w którym testy DBS zostały ostatecznie zastosowane w niemieckich miastach Berlin i Essen do oceny osób aktywnie przyjmujących narkotyty drogą dożylną, zostało zatwierdzone przez Federalnego Komisarza ds. Ochrony Danych i Wolności Informacji (Berlin, Niemcy), a także przez komisję etyki Uniwersytetu Medycznego Charité (Berlin, Niemcy).

1. Pobieranie krwi

  1. Wenopunkcja14, 15, 20, 21
    1. Założyć jednorazowe rękawice lateksowe i oczyścić obszar planowanego miejsca nakłucia (najlepiej żyłę łokciową środkową w dole łokciowym) odpowiednim środkiem dezynfekcyjnym, np. 70% alkoholem izopropylowym.
    2. Założyć stazę 4 – 6 cali powyżej przewidywanego miejsca nakłucia, aby poszerzyć żyły. Wprowadzić igłę do żyły pacjenta i, po jej umieszczeniu, delikatnie napełnić podłączoną probówkę na krew zawierającą EDTA jako antykoagulant.
    3. Niezwłocznie po zakończeniu wenopunkcji zdjąć stazę i wycofać igłę. Następnie przycisnąć suchy gazik do miejsca nakłucia, który można później przymocować plastrem.
  2. Nakłucie skóry (Rysunek 1A)13 - 15, 20, 22, 23
    1. Założyć parę jednorazowych rękawic lateksowych.
    2. Przed nakłuciem skóry pacjent powinien rozgrzać dłonie. Palec należy masować w kierunku dystalnym, aby zwiększyć przepływ krwi w stronę miejsca nakłucia.
    3. Oczyścić skórę strony dłoniowej opuszka dalszej części paliczka trzeciego lub czwartego palca ręki niedominującej odpowiednim środkiem dezynfekcyjnym, np. 70% alkoholem izopropylowym. Nakłuć skórę za pomocą jednorazowego lancetu bezpiecznego. Palec powinien być trzymany w pozycji takiej, aby grawitacja ułatwiała zbieranie krwi na opuszku palca.
    4. Po zakończeniu pobrania krwi kapilarnej drogą nakłucia skóry, nałożyć plaster na opuszek palca.

2. Przygotowanie plamek krwi

  1. Przygotowanie z krwi pobranej drogą żylną15
    1. Jak najszybciej nanieś pobraną przeciwkrzeplącą (EDTA) pełną krew żylną na karty filtracyjne. Nie przygotowuj suchych kropli krwi więcej niż 24 h po nakłuciu żyły.
    2. Wpisz na karcie filtracyjnej wszystkie informacje niezbędne do identyfikacji pacjenta. Jedna karta powinna zawierać krew tylko jednej osoby.
    3. Załóż jednorazowe rękawice lateksowe.
    4. Delikatnie odwróć probówkę z krwią 2 – 4 razy, a następnie ostrożnie otwórz korek.
    5. Pobierz 50 µl pełnej krwi żylnej za pomocą pipety z jednorazowym końcem. Przenieś krew do centrum jednego z kółek, nie dotykając końcem pipety bezpośrednio papieru filtracyjnego. Staraj się w pełni nasycić kółko.
    6. Powtarzaj tę procedurę, aż wypełnisz wszystkie wymagane kółka na karcie.
  2. Przygotowanie z krwi pobranej przez nakłucie skóry (Rysunki 1B oraz 1C)13 - 16, 23
    1. Zetrzyj pierwszą kroplę krwi gazikiem, ponieważ może ona zawierać nadmiar płynów tkankowych. Ponownie masuj palec, aby zwiększyć przepływ krwi w miejscu nakłucia. Przenieś kolejną kroplę do jednego z kółek karty filtracyjnej, nie dotykając bezpośrednio powierzchni opuszkiem palca. Pozwól, aby krew wniknęła w strukturę filtra wyłącznie dzięki siłom kapilarnym.
    2. Pozwól, aby na opuszku palca uformowała się kolejna duża kropla krwi kapilarnej i zbierz ją w następnym kółku. Kontynuuj tę procedurę, aż wszystkie niezbędne kółka zostaną wypełnione lub dopóki przepływ krwi nie ustanie.
    3. Nie ściskaj i nie „doj” palca zbyt mocno, jeśli przepływ krwi jest niewystarczający do wypełnienia wszystkich wymaganych kółek karty filtracyjnej. Jeśli przepływ krwi ustanie, nałóż plaster na opuszek palca. W razie potrzeby pobrania większej ilości krwi do badania wykonaj drugie nakłucie skóry na innym palcu.

3. Suszenie plam krwi

  1. Aby wysuszyć plamki krwi, umieścić karty filtracyjne na czystym ręczniku papierowym w komorze bezpieczeństwa biologicznego i pozostawić do wyschnięcia, najlepiej przez noc (ale przez co najmniej 4 hrs), w RT, bez dostępu zewnętrznego źródła ciepła. Po zakończeniu procesu suszenia plamki krwi mają jednolity ciemnobrązowy kolor, a czerwone obszary nie są już widoczne (Rycyna 1D)13, 15, 16.

4. Przechowywanie i transport wysuszonych plamek krwi (DBS)

UWAGA: Przetwarzanie plamek krwi można przerwać po wysuszeniu. Karty filtracyjne można teraz przechowywać13 - 16, 23.

  1. Do przechowywania włóż kartę z papieru filtracyjnego do pojedynczej, gazoszczelnej torby strunowej, zawierającej od 1 do 2 saszetek z osuszaczem, aby chronić próbki przed wilgocią (Rysunek 1E). Opcjonalnie dodaj kartę wskaźnika wilgotności.
  2. Jak najszybciej przenieś tę torbę do zamrażarki o temperaturze -20 °C lub niższej. Jeśli w warunkach terenowych zamrażarki nie są dostępne, dopuszczalne jest przechowywanie w temperaturze -4 °C lub nawet w temperaturze otoczenia przez maksymalnie 14 dni.
  3. Mrożone próbki DBS transportuj w suchym lodzie. W przypadku kart filtracyjnych przechowywanych początkowo w temperaturze otoczenia zastosuj potrójny system opakowań, składający się z torby/toreb strunowych jako pojemnika/pojemników wewnętrznych oraz koperty wewnętrznej i zewnętrznej. W przypadku wysyłki pocztą zwykłą na kopercie zewnętrznej nie są wymagane żadne oznaczenia zawartości, jednak do podstawowego pojemnika wewnętrznego należy przymocować międzynarodowy symbol zagrożenia biologicznego16.
  4. Wyklucz karty filtracyjne z dalszego przetwarzania, jeśli saszetki z osuszaczem i/lub dodatkowa karta wskaźnika wilgotności zmienią kolor na różowy.

5. Elucja z wysuszonych plam krwi13, 15, 16, 23

  1. Wypuść po jednym wycinku o średnicy 6 mm przy użyciu jednorazowego urządzenia z każdego kręgu nasączonego krwią na karcie filtracyjnej Grade 903 (Rysunek 1F). Przenieś wszystkie wycięte suche plamki krwi od jednego pacjenta do jednego dołka płytki 12-dołkowej.
  2. Wypełnij dołek solą fizjologiczną buforowaną fosforanem zawierającą 0,05% Tween 20 i 0,08% azotku sodu (Rysunek 1G). Dostosuj objętość dodanego buforu do minimalnych wymagań analizy stosowanej do późniejszego badania eluatów suchych plamek krwi.
  3. Powtórz te kroki, aby uzyskać drugą serię eluatów suchych plamek krwi w celu przeprowadzenia analiz molekularnych.
  4. Umieść płytkę do hodowli komórkowych na wytrząsacie laboratoryjnym i pozwól wyciętym suchym plamkom krwi delikatnie eluować przez minimum 4 hr lub, najlepiej, przez noc (O/N) (Rysunek 1H).
  5. Następnego dnia plamki są niemal całkowicie wolne od krwi, a w dołkach utworzyły się hemolityczne nadsączniki (Rysunek 1I). Przenieś te eluaty do probówek do mikrocentryfugi. Następnie poddaj je wirowaniu przez 2 min przy 10 500 x g (Rysunek 1J), aby oczyścić nadsączniki z wszelkich zanieczyszczeń, które powstały podczas elucji (Rysunek 1K).

6. Analiza eluatów

  1. Odwirukowane eluaty są teraz gotowe do zaplanowanych analiz. Należy przebadać eluaty pod kątem markerów wirusa zapalenia wątroby typu B, wirusa zapalenia wątroby typu C oraz zakażenia HIV, używając dostępnych komercyjnie zestawów i ściśle stosując się do instrukcji producentów (Rysunek 1L).

Schemat procesu hodowli komórkowej z płytkami wielodołkowymi, inkubacją i sprzętem skanującym w ciągu 3 dni.
Rysunek 1. Graficzne podsumowanie protokołu zaproponowanego w niniejszej komunikacji w celu przygotowania i przetwarzania suchych plamek krwi do zastosowania w testach immunoologicznych i technikach molekularnych. Całokrwista żylna oraz krew kapilarna pobrana poprzez wenipunkcję lub nakłucie skóry lancetem (A) mogą służyć jako próbki do analizy suchych plamek krwi. Po przeniesieniu krwi do kół na karcie filtracyjnej klasy 903 (B, C), próbki powinny być suszone najlepiej przez noc (O/N) w temperaturze otoczenia w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utworzyć plamki o jednolitym brązowym kolorze, bez przeplatających się obszarów czerwonych (D). Po całkowitym wysuszeniu plamek krwi, w przypadku konieczności ich przechowywania, karty filtracyjne można zapakować do gazoszczelnych worków strunowych zawierających 1 – 2 saszetki z osuszaczem (E). Dalsze przetwarzanie laboratoryjne DBS obejmuje wycinanie krążków za pomocą jednorazowego urządzenia 6 mm z centrum kół (F, G), elucję krążków w buforze na bazie PBS przez minimum 4 hr lub najlepiej przez noc (O/N) na wytrząsarce (H), odzyskiwanie eluatów (I) i na koniec wirowanie probówek laboratoryjnych (J) w celu oczyszczenia eluatów DBS z zanieczyszczeń, które mogły powstać podczas procesu elucji (K). Następnie eluaty DBS są gotowe do analiz, które zostały wykonane na w pełni zautomatyzowanej platformie (L) w celu wykrycia markerów serologicznych zakażeń HBV, HCV i HIV odpowiednio. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Skuteczność protokołu zaproponowanego do przygotowania i przetwarzania DBS oceniono w pierwszej kolejności poprzez analizę 1 762 par sprzęganych surowica/DBS pod kątem markerów zakażenia HBV, HCV i HIV17. W tym celu DBS przygotowano ze 100 µl pełnej krwi żylnej (por. pkt 2.1.1 – 2.1.6 poprzedniego protokołu) i eluowano każdy z nich przy użyciu 1 000 µl buforu na bazie PBS (por. pkt 5.1 – 5.5 wspomnianego protokołu), aby zrealizować proces dla wszystkich siedmiu parametrów w dwóch oddzielnych operacjach. Takie podejście, bez dokładnej optymalizacji warunków elucji dla każdego anality z osobna, wydawało się nieuniknione, ponieważ podczas nadchodzącego badania terenowego „Leki i Przewlekłe Choroby Zakaźne” („Badanie DRUCK”) spodziewano się stosunkowo wysokiej przepustowości próbek w krótkim czasie.

Wszystkie pomiary podczas analiz DBS były wykonywane zgodnie z zaleceniami producenta, jednak w przypadku oznaczeń HBsAg i anty-HBs musiały zostać zmodyfikowane, aby skompensować efekt hemolizy lub wynik rozcieńczenia. Przy wartości odcięcia 0,05 IU/ml badanie HBsAg w eluatach DBS doprowadziło do odsetka wyników fałszywie dodatnich na poziomie 14,7% (52 z 354) w porównaniu z próbkami surowicy (Rysunek 2A). Analiza charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC)25, 26 danych wskazała, że podniesienie progu do 0,15 IU/ml pozwoliłoby na idealne oddzielenie wyników HBsAg-dodatnich od HBsAg-ujemnych (0,986 [czułość], 0,000 [1- specyficzność], Rysunek 2B). Z drugiej strony, przy wartości odcięcia 10 IU/l dla ilościowego oznaczenia przeciwciał anty-HBs odnotowano odsetek pomiarów fałszywie ujemnych wynoszący 14,2% (47 z 331) (Rysunek 2C). W związku z tym, po ponownej analizie ROC, wartość odcięcia tę obniżono do 1,5 IU/l, aby osiągnąć optymalną dyskryminację wartości (0,917 [czułość], 0,007 [1- specyficzność], Rysunek 2D).

Wykresy rozkładu HBsAg i anty-HBs; wyniki serologii; analiza punktu odcięcia; IU/ml; częstotliwość N.
Rycina 2. Oznaczanie HBsAg i anty-HBs w eluatach DBS (zmodyfikowano na podstawie17). Zwiększenie wartości punktu odcięcia dla ilościowego oznaczania HBsAg na podstawie analizy ROC z 0,05 IU/ml (A) do 0,15 IU/ml (B) zredukowało odsetek wyników fałszywie dodatnich z 14,7 % do 0 %. Podobnie analiza ROC stężeń anty-HBs zasugerowała obniżenie odpowiedniego progu z 10 IU/l (C) do 1,5 IU/l (D), co całkowicie wyeliminowało wyniki fałszywie ujemne, które początkowo stanowiły 14,2 % wszystkich oznaczeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki połączonych analiz surowicy/DBS zestawiono w Tabeli 117. W trakcie testów DBS dla każdego z siedmiu analitów nie odnotowano braku specyficzności.

Podczas badania eluatów z DBS pod kątem obecności HBsAg, czyli kluczowego parametru serologicznego zarówno dla ostrej, jak i chronicznej infekcji HBV, stwierdzono czułość analityczną na poziomie 98,6 %. Stężenia HBsAg w dwóch surowicach fałszywie ujemnych wynosiły odpowiednio 749 IU/ml i 6 IU/ml. Przeciwciała anty-HBc zostały pomyślnie wykryte w 176 z 204 (tj. 86,3 %) eluatów DBS. Dwudziestu dwóch z 28 próbek, w których nie wykryto przeciwciał, pochodziło od osób współzakażonych HIV. Zatem po wykluczeniu z obliczeń osób HIV-dodatnich osiągnięto czułość 97,1 % w odzyskiwaniu przeciwciał anty-HBc z eluatów wysuszonej pełnej krwi żylnej. Podobne obserwacje odnotowano przy oznaczaniu przeciwciał anty-HBs. Nawet po skorygowaniu wartości odcięcia w teście do 1,5 IU/l wystąpiło dziewięć rozbieżnych wyników między surowicą a DBS. U pacjentów bez współzakażenia HIV stwierdzono stężenia anty-HBs w surowicy na poziomie 11 – 26 IU/l, co było wartością zbyt niską, aby umożliwić detekcję po elucji z wysuszonej krwi.

Przeciwciała anty-HCV świadczą o infekcji ostrej, przewlekłej lub wyleczonej. Tylko cztery (tj. 2,2 %) wyniki anty-HCV fałszywie ujemne uzyskano z eluatów DBS, a dalsze analizy serologiczne i molekularne wyraźnie wykazały, że odpowiednie surowice prawdopodobnie pobrano od pacjentów, których infekcje zostały wyleczone znacznie wcześniej.

Wykrywanie przeciwciał przeciwko HIV w eluatach DBS za pomocą w pełni zautomatyzowanego systemu było procesem całkowicie sprawnym, który pozwolił na uzyskanie czułości analitycznej na poziomie 100 %.

„Średnie stężenie HBV DNA w eluatach z krwi pełnej określono w 100 próbkach (średnie stężenie DNA: 1 573 898 IU/ml, zakres: < 357 - > 17 860 000 IU/ml), co dało wartość 93,0 %. W konsekwencji siedem próbek z niskim stężeniem HBV DNA w surowicy, mieszczącym się w przedziale od 409 do 3 643 IU/ml, nie zostało wykrytych podczas badania DBS. W przypadku 100 próbek surowicy, które okazały się dodatnie pod kątem HCV RNA (średnie stężenie HCV RNA: 1 415 944 IU/ml, zakres: 2 479 - >7 692 000 IU/ml), dostępne były odpowiadające im alikwoty krwi pełnej. Badanie porównawcze wykazało analityczną czułość na poziomie 100 % dla oznaczeń HCV RNA z eluatów DBS”.17

Aby przetestować opisany protokół przygotowywania i przetwarzania DBS w warunkach terenowych, zastosowano go w ścisłej współpracy z Instytutem Roberta Kocha (Berlin, Niemcy) podczas fazy pilotażowej badania „Drugs and Chronic Infectious Diseases”, przeprowadzonego wśród aktywnych użytkowników narkotyków w niemieckich miastach Berlin i Essen18. Wszyscy 534 zakwalifikowani uczestnicy (433 mężczyzn i 101 kobiet) zostali poddani pobraniu krwi kapilarnej zgodnie ze szczegółowym opisem w sekcjach 2.2.1 – 2.2.3 poprzedniego protokołu, a DBS ponownie eluowano poprzez dodanie 1 000 µl buforu na bazie PBS.

U dwóch osób zdiagnozowano przewlekłą infekcję HBV, a u 39 stwierdzono serologiczny obraz wyleczonej infekcji HBV. Ponadto piętnastu uczestników było seropozytywnych pod kątem przeciwciał anty-HBs (status po szczepieniu), a u ośmiu osób stwierdzono obecność wyłącznie przeciwciał anty-HBc. Częstość występowania przeciwciał anty-HCV wśród uczestników wynosiła 57,3 % (N = 193) w Berlinie i 73,0 % (N = 144) w Essen. Z próbek dodatnich pod kątem przeciwciał, 65 % (N = 125) i 62 % (N = 89) wykazywało również wiremię. Dwadzieścia pięć z 534 badanych osób uzyskało wynik dodatni w testach na obecność anty-HIV. Dziewiętnaście z tych infekcji było wcześniej znanych, a 24 z tych osób miało koinfekcję z HCV.

Wyniki uzyskane w badaniu DBS starannie porównano z danymi anamnezy uczestników badania dotyczącymi samoopisanego statusu HBV i HCV. Porównanie to, w połączeniu z wynikami testowania powiązanych par surowica/DBS, doprowadziło do niewielkich modyfikacji algorytmu testowania dla głównej fazy „Badania DRUCK”, w którym udział wezmą aktywni użytkownicy narkotyków w sześciu dodatkowych dużych niemieckich miastach: „Osoby zakażone HIV zawsze będą badane pod kątem obecności HBV DNA. Uczestnicy, których eluaty DBS są dodatnie pod kątem przeciwciał anty-HBc lub anty-HBs, powinni zostać poddani wenipunkcji podczas drugiej konsultacji w celu ostatecznego wyjaśnienia ich statusu anty-HBc/anty-HBs, a na koniec wszystkie eluaty DBS zostaną przebadane w kierunku HCV RNA, niezależnie od wyników testów na anty-HCV”.17

ParametrySprzężone eluaty z surowic/DBS (N)Rozbieżne wyniki (N)Przyczyny rozbieżności między surowicą testową a eluatami z DBS
HBV
HBsAg2992Dwoje pacjentów z przewlekłym zakażeniem HBV. Oboje znajdowali się w trakcie leczenia przeciwwirusowego, a jeden z nich był współzakażony HIV. Stężenia HBsAg w surowicy wynosiły odpowiednio: 749 IU/ml i 6 IU/ml.
przeciwciała anty-HBc30528W surowicy u dwudziestu dwóch pacjentów stwierdzono ustąpienie zakażenia HBV. U sześciu osób odnotowano wynik serologiczny „wyłącznie przeciwciała anty-HBc”. Dwudziestu dwóch pacjentów miało koinfekcję HIV. W grupie osób z ustąpieniem zakażenia HBV u dwudziestu oceniono wynik testu DBS jako „wyłącznie dodatni wynik anty-HBs”, przez co błędnie zaklasyfikowano ich do grupy „stanu po szczepieniu”.
przeciwciała anty-HBs3109U czterech pacjentów bez koinfekcji HIV stężenia przeciwciał anty-HBs w surowicy wynosiły 11–26 IU/l, co było wartością zbyt niską, aby umożliwić wykrycie przeciwciał po elucji z suchych kropli krwi.
HBV DNA1507Odpowiednie surowice pobrano od siedmiu pacjentów z niskimi stężeniami HBV DNA w surowicy, wynoszącymi od 409 IU/ml do 3 643 IU/ml.
Wirus zapalenia wątroby C (HCV)
przeciwciała przeciwko HCV3394Te cztery próbki surowicy pobrano od pacjentów z HCV, u których infekcja została wyleczona już dawno temu.
RNA HCV1500 –
HIV
HIV 1-p24/anty-HIV 1/22090 –

Tabela 1: Wyniki uzyskane z 1 762 DBS, które przygotowano i przetworzono z krwi żylnej zgodnie z protokołem zaproponowanym w niniejszej publikacji, w porównaniu z wynikami w powiązanych próbkach surowicy jako referencji.

Dyskusja

DBS są używane od 100 lat2 Ale, co zaskakujące, nadal nie ma ogólnego konsensusu co do ich przygotowania i przetwarzania. Do tej pory wystarczająca standaryzacja tej ważnej fazy przedanalitycznej została osiągnięta jedynie w dziedzinie badań przesiewowych noworodków14, podczas gdy istnieje wiele różnych protokołów dla wszystkich innych zastosowań testów DBS5, 16, 23. Aby przezwyciężyć tę niezwykłą niejednorodność, w niniejszym komunikacie przedstawiono obszerną instrukcję krok po kroku dotyczącą przygotowania i przetwarzania DBS do wykorzystania w testach immunologicznych i technikach molekularnych oraz oceniono jej skuteczność w wykrywaniu markerów zakażeń HBV, HCV i HIV. Poniższa dyskusja skupia się przede wszystkim na różnych etapach proponowanego protokołu.

W historii testów DBS używano wielu różnych kart bibułowych z filtracją2 , ale obecnie tylko dwa komercyjne źródła są zatwierdzone przez FDA jako urządzenia medyczne klasy II do pobierania krwi5, 16. Te systemy kart filtracyjnych są wysoce jednorodne i mają bardzo podobne charakterystyki absorpcji, dzięki czemu wyniki analityczne uzyskane z krwi włośniczkowej przygotowanej na którymkolwiek z nich nie różnią się o więcej niż 4% – 5%28. Nic dziwnego, że Masciotra i współpracownicywykryli RNA HIV-1 równie dobrze za pomocą testu jakościowego po wyluceniu z kart pobierania krwi z różnych źródeł. Biorąc pod uwagę te dane, można praktycznie wykluczyć, że którakolwiek z rozbieżności zaobserwowanych podczas testowania sprzężonych par surowica/DBS pod kątem markerów zakażeń HBV, HCV i HIV17 była spowodowana wyborem samej karty filtracyjnej. Jeżeli jednak niezbędne jest dokładne oznaczanie ilościowe analitu, różnice między źródłami mogą nie być już nieistotne i konieczne może być zastosowanie bardziej wyrafinowanych technik, np. perforowanego DBS (PDBS) jako metody mikropobierania próbek30 lub przygotowania wysuszonych plamek surowicy (DSS)31 zamiast konwencjonalnego badania DBS10.

Ponieważ do badania DBS wykorzystuje się tylko niewielkie ilości krwi (jedna kropla krwi włośniczkowej składa się z około 50 μl)5, 16, różnice w objętości próbki są kluczowe i trzeba przyznać, że przynajmniej część rozbieżności między wynikami serologicznymi a zgłaszanym przez uczestników statusem HBV i HCV zarejestrowanym podczas pilotażu "Badania DRUCK" można przypisać tej zmiennej. Najważniejszym czynnikiem minimalizującym "wahania" objętości próbki jest bez wątpienia prawidłowa technika pobierania krwi włośniczkowej, którą można osiągnąć tylko dzięki starannemu i ciągłemu szkoleniu personelu technicznego22. Ponadto, w ramach kontroli jakości, wszystkie laboratoria pracujące z DBS powinny już zainicjować procedury identyfikacji, a następnie wykluczenia próbek DBS, które należy uznać za niezadowalające lub nieważne16.

Badania przeprowadzone głównie w kontekście HIV32 i badań przesiewowych noworodków33 wykazały, że wysoka wilgotność może prowadzić do degradacji analitów, ale do tej pory nie osiągnięto konsensusu co do tego, jak długo DBS powinien być suszony na powietrzu. W niniejszym komunikacie zaproponowano odstęp co najmniej 4 godzin lub najlepiej O/N, w związku z czym przyjęto warunki, które zastosowano w zdecydowanej większości wszystkich odnośnych publikacji32, 34 Dane dotyczące przechowywania DBS, które mają być następnie wykorzystywane do badań na obecność wirusa HBV i HCV, są sprzeczne. W 1981 roku Villa iwspółpracownicy, którzy zastosowali współczesne techniki analityczne, stwierdzili, że przechowywanie w RT nie wpłynęło na wyniki analiz HBV przez cały okres obserwacji wynoszący 180 dni, jeśli miano przeciwciał wynosiło > 1/1000, ale że DBS stał się graniczny dodatni lub nawet ujemny po 15 dniach, gdy miano w surowicy wynosiło tylko 1/100. Przechowywanie w temperaturze -20 °C lub 4 °C nie przyniosło znaczącej poprawy. Natomiast w badaniu przeprowadzonym trzydzieści lat później36 testowano powtórzenia próbki dodatniej pod względem HBV, a autorzy odkryli, że przeciwciała anty-HBc, jak również przeciwciała anty-HBs były stabilne do 183 dni w RT, podczas gdy HBsAg w tych samych warunkach stawały się fałszywie ujemne już po 63 dniach. Jeśli chodzi o wykrywanie DNA HBV z eluatów DBS, stężenie wirusowego kwasu nukleinowego było stabilne przez co najmniej siedem dni w temperaturze 37 °C37 lub okazało się "odporne" na przechowywanie w temperaturze pokojowej przez okres do trzech tygodni38. Testy na obecność przeciwciał anty-HCV przy użyciu dwóch dostępnych na rynku testów immunologicznych trzeciej generacji39 dostarczyły dokładnych wyników przez okres 117 dni przy użyciu próbek DBS przechowywanych odpowiednio w temperaturze -20 °C, 2 – 8 °C i 20 – 25 °C. Przechowywanie w temperaturze -20 °C skutkowało jednak najmniejszą zmiennością gęstości optycznej. Stosując test ELISA anty-HCV czwartej generacji, tj. Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, w kontekście testów DBS, Larrat i wsp.40 zaobserwowało gwałtowny spadek swoistości analitycznej po przechowywaniu próbek DBS przez ponad trzy dni w RT. Z drugiej strony, precyzyjne wyniki testów uzyskano za pomocą tego samego zestawu, wykorzystując próbki zdeponowane przez 60 dni w różnych warunkach (-20 °C, 2 – 8 °C i 22 – 26 °C) przez Brandao i współpracowników41. Obserwacje dotyczące spadku stężeń RNA HCV w DBS w różnych warunkach przechowywania wahają się od braku znaczących zmian w RT przez okres do jednego roku42 do dziesięciokrotnej zmiany po czterech tygodniach w temperaturze otoczenia43. Biorąc pod uwagę te dość sprzeczne dane dotyczące stabilności antygenów HBV i HCV, kwasów nukleinowych i przeciwciał, rozsądne wydawało się wycofanie się w proponowanym protokole do konsensusu, który został wcześniej określony w odniesieniu do przechowywania próbek DBS, które mają być wykorzystywane do testów na obecność wirusa HIV15, 30: Dla krótkotrwałego odkładania (do dwóch tygodni) antygenów, wirusowy kwas nukleinowy i przeciwciała są uważane za stabilne w RT, podczas gdy optymalne przechowywanie przez dłuższy czas odbywa się w warunkach zamrożenia.

Z reguły przy projektowaniu protokołu elucji należy wziąć pod uwagę trzy parametry: (1) bufor elucyjny; (2) czas trwania i temperaturę elucji; oraz (3) objętość elucji23. W zdecydowanej większości wszystkich istotnych publikacji do elucji DBS stosowano sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a większość autorów dodawała białko, np. albuminę surowicy bydlęcej (BSA) lub Tween 20, środek powierzchniowo czynny, w celu poprawy sygnału testu poprzez stabilizację białek w miarę ich przechodzenia do roztworu i jednoczesne blokowanie niespecyficznych miejsc wiązania23. Dostępnych jest tylko kilka raportów, które bezpośrednio porównują różne elucyjne w kontekście badań DBS. Villar i wsp.36, na przykład, zarejestrowało prawie równoważne zdolności elucyjne dla wszystkich zastosowanych, ale PBS/BSA 0,5% skutkowało najniższym poziomem reaktywności nieswoistej. Bardzo podobne spostrzeżenie zostało poczynione przez Crooma i współpracowników44 podczas stosowania rozcieńczalnika próbki rLAV EIA do elucji przeciwciał anty-HCV z DBS. Ponieważ ryzyko degradacji próbki jest niezwykle niskie w pierwszych godzinach po przygotowaniu DBS (patrz wyżej), zdecydowano się na inkubację plam O/N w temperaturze otoczenia i wspomaganie procesu elucji poprzez delikatne mieszanie od końca do końca. Takie podejście ma tę zaletę, że próbki wybite poprzedniego dnia mogą być bezpośrednio przekazane do rutynowej diagnostyki wcześnie następnego dnia rano. Objętość buforu elucyjnego powinna być dostosowana do minimalnych odpowiednich wymagań dotyczących testów stosowanych do kolejnych analiz w celu utrzymania współczynnika rozcieńczenia na możliwie najniższym poziomie. Jednak staranna optymalizacja warunków elucji dla każdego pojedynczego analitu nie była możliwa w poprzedniej ocenie, ponieważ podczas "badania DRUCK" trzeba było zagwarantować wysoką przepustowość próbki w stosunkowo krótkim czasie17. W związku z tym wykorzystano raczej niekorzystną objętość 1000 μl buforu na bazie PBS w celu zakończenia całego procesu elucji dla wszystkich parametrów w dwóch oddzielnych operacjach.

Podejście to, z jednej strony, zawodzi "całkowicie w systemie anty-HBc/anty-HBs u osób zakażonych wirusem HIV z powodu niskich stężeń przeciwciał; ... i wymagało to procedur biologii molekularnej z optymalną czułością analityczną w odniesieniu do testów DNA HBV i RNA HCV."17 Z drugiej strony, wysoka objętość elucji nie okazała się w żaden sposób niekorzystna dla oznaczania HBsAg, anty-HCV i anty-HIV przez zestawy używane podczas całej oceny. "Wykrycie materiałów HBsAg dodatnich w euatach krwi pełnej powiodło się z czułością 98,6% w podobnie wysokim stopniu, jak w poprzednich badaniach, w których częściowo wykorzystano znacznie mniejszą objętość elucji wynoszącą 100 μl, 250 μl lub 600 μl lub 500 μl"17, 36, 45, 46. Czułość 97,8% określona w badaniu 179 par surowica/DBS dla przeciwciał anty-HCV odpowiadała wynikom już istniejących doniesień24, 44, 47, 48, 49, które pracowały z objętością elucji mniejszą od 5 do 10 razy. "Ponadto protokoły wykrywania anty-HCV zostały odpowiednio zoptymalizowane ... poprzez określenie własnych punktów odcięcia"17, 24, 48, 49 "lub poprzez zwiększenie objętości próbki z 20 μl do 100 μl."17, 49 Wreszcie, swoistość analityczna i czułość (po 100% każdy) ustalone dla wykrywania anty-HIV były równe lub lepsze od charakterystyki działania innych testów immunologicznych specjalnie przystosowane do testowania DBS50, 51 "lub procedury etapowej z łącznym zastosowaniem kilku testów anty-HIV"17, 52. "Rzeczywiście, przekroczyły one również rekord wydajności testu, który został specjalnie opracowany i zoptymalizowany do wykrywania przeciwciał anty-HIV w eluatach DBS (zestaw Q-Prevent HIV 1 + 2 DBS)".

Podsumowując, kompleksowy protokół krok po kroku przedstawiony w niniejszym komunikacie okazał się wykonalnym i przyjaznym dla użytkownika narzędziem do przygotowywania i przetwarzania DBS, a tym samym może być niezawodnie stosowany w diagnostyce wirusologicznej. Pozwala on na stosowanie podejść wykorzystujących automatyzację 54 , a ze względu na swoje doskonałe właściwości użytkowe ma potencjał, aby służyć jako rodzaj kamienia węgielnego dla przyszłego, ogólnie akceptowanego protokołu konsensusu w globalnej dziedzinie testowania DBS w medycynie laboratoryjnej.

Oświadczenia

W przeszłości RSR otrzymał honorarium za wygłaszanie wykładów i wsparcie finansowe dla swojej pracy naukowej od Abbott Diagnostics. NG i OM oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta komunikacja jest oparta na wynikach wcześniej opublikowanych w Virology Journal17 w trybie otwartego dostępu na warunkach licencji Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) z BioMed Central jako licencjobiorcą. Autorzy wyrażają wdzięczność za owocną współpracę w ramach pilotażu badania "Drugs and Chronic Infectious Diseases" ("DRUCK Study") z U. Marcusem, W. Cai, W. Zhangiem i R. Zimmermannem z Instytutu Roberta Kocha (Berlin, Niemcy) i są wdzięczni S. Moyrerowi za wykonanie zdjęć zebranych na rysunku 1 a także dr D. F. Whybrewowi (Getynga, Niemcy) za poprawienie manuskryptu. Wyrażają również wdzięczność za umiejętną pomoc techniczną J. Ackermannowi, E. Bayrambasiemu, U. Büttnerowi, S. Dziubkowi, I. Jakobschemu, B. Krellenbergowi, H. Krohnowi, P. Kusimskiemu, A. Metcalfowi, J. Piejkowi, S. Saarowi, M. Schröterowi i K. Seidelowi. Badanie to zostało częściowo wsparte dotacją niemieckiego Ministerstwa Zdrowia dla Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Wirusowego Zapalenia Wątroby typu C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rękawice lateksowe gumoweHartmann#4049500041515
70% alkohol izopropylowyBode Chemie#9768050
Kaniula bezpieczeństwa MuliflySarstedt#85.1638
Probówka do pobierania krwi EDTASarstedt#02.1066.001
Bandaż samoprzylepnyHartmann#2994163
Sucha gazaHartmann#143213
Bezpieczny lancet do użytku w SingeluOwen Mumford#3802421
Karta z bibuły filtracyjnejWhatman/sigmaaldrich#10534612Karta z bibuły filtracyjnej klasa 903
Jednorazowe końcówki do pipetStarlab#S1126-7810, #S1120-8810
Torba na zamek błyskawicznyFlexico#20219
Mini torba ze środkiem osuszającymTropack#-
Jednorazowy dziurkaczpfmmedical#486016,0 mm Jednorazowy dziurkacz do biopsji
Jednorazowe kleszczeServoprax#H7301
12-dołkowa płytka do hodowli komórkowychGreiner#665180
Bufor PBSGibco#14190-136
Tween 20Applichem#A1389.0500
Azydek soduMerck#66880250
Probówki Safe-Lock, 1,5 mlEppendorf#30120086
ARCHITECT HBsAg (ilościowe)Abbott#6C3642
ARCHITECT anty-HBc IIAbbott#8L4425
ARCHITECT anty-HCVAbbott#6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab ComboAbbott#4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume KitRoche#6374891001
artus HBV LC PCR KitQiagen#4506063 (24 testy), #4506065 (96 testów)
Test VERSANT HCV TMA IVDSiemens Healthcare#2554311
ARCHITECT anty-HBs Abbott#7C1825

Bibliografia

  1. Schmidt, V. Ivar Christian Bang (1869 - 1918), founder of modern clinical microchemistry. Clin Chem. 32 (1), 213-215 (1986).
  2. Hannon, W. H., Therell, B. L. Overview of the history and applications of dried blood spot samples. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. 3, Wiley. Hoboken. 3-15 (2014).
  3. Bang, I., Bergmann, J. F. Der Blutzucker. , Wiesbaden. Available from: https://archive.org/details/derblutzucker00bang (1913).
  4. Chapman, O. D. The complement-fixation test for syphilis. Use of patient's whole blood dried on filter paper. Arch Derm Syphilol. 9 (5), Available from: http://archderm.jamanetwork.com/article.aspx?articleid=495323 607-611 (1924).
  5. Smit, P. W., Elliott, I., Peeling, R. W., Mabey, D., Newton, P. N. An overview of the clinical use of filter paper in the diagnosis of tropical diseases. Am J Trop Med Hyg. 90 (2), 195-210 (2014).
  6. Kuehn, B. M. After 50 years, newborn screening continues to yield public health gains. JAMA. 309 (12), 1215-1217 (2013).
  7. Guthrie, R. Blood Screening for Phenylketonuria. JAMA. 178 (8), Available from: http://jama.jamanetwork.com/article.aspx?articleid=332184 863(1961).
  8. Guthrie, R., Susi, A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).
  9. Snijdewind, I. J., van Kampen, J. J., Fraaij, P. L., vander Ende, M. E., Osterhaus, A. D., Gruters, R. A. Current and future applications of dried blood spots in viral disease management. Antiviral Res. 93 (3), 309-321 (2012).
  10. Demirev, P. A. Dried blood spots: analysis and applications. Anal Chem. 85 (2), 779-789 (2013).
  11. Li, W., Lee, M. S. Preface. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. VIII-IX (2014).
  12. Guder, W. G., Narayanan, S., Wisser, H., Zawta, B. Diagnostic Samples: From the Patient to the Laboratory. The Impact of Preanalytical Variables on the Quality of Laboratory Results. , 4th edition, Wiley-VHC. Weinheim. (2009).
  13. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1632S-1636S (2001).
  14. NBS01-A6. Blood Collection on Filter Paper for Newborn Screening Programs; Approved Standard-Sixth Edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Wayne, PA. Available at: http://shop.clsi.org/c.1253739/site/Sample_pdf/NBS01A6_sample.pdf (2013).
  15. WHO manual for HIV drug resistance testing using dried blood spot specimens. , World Health Organisation (WHO). Available at: http://www.who.int/hiv/pub/drugresistance/dried_blood_spots/en/ (2012).
  16. Mei, J., Lee, M. S. Dried blood spots sample collection, storage, and transportation. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. 21-31 (2014).
  17. Ross, R. S., et al. Detection of infections with hepatitis B virus, hepatitis C virus, and human immunodeficiency virus by analyses of dried blood spots. Performance characteristics of the ARCHITECT system and two commercial assays for nucleic acid amplification. Virol J. 10 (72), (2013).
  18. Zimmermann, R. DRUCK-Studie – Drogen und chronische Infektionskrankheiten in Deutschland. Ergebnisse der Pilotierung eines Sero- und Verhaltenssurveys bei i. v. Drogengebrauchern. Epidemiol Bull. 33, Available from: http://www.rki.de/DE/Content/Infekt/EpidBull/Archiv/2012/Ausgaben/33_12.pdf?__blob=publicationFile 335-339 (2012).
  19. World Medical Association, Declaration of Helsinki. Ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  20. Young, D. S., Bermes, E. W., et al. Specimen collection and processing; sources of biological variation. Tietz textbook of clinical chemistry. Burtis, C. A., Ashwood, E. R. 58, 2nd edition, W. B. Saunders Company. Philadelphia. 58-101 (1994).
  21. H3-A6. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture. , Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Wayne, PA. Available from: http://shop.clsi.org/site/Sample_pdf/H3A6_sample.pdf (2007).
  22. H04-A6. Procedures and devices for the collection of diagnostic capillary blood specimens. , Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Wayne, PA. Available from: http://shop.clsi.org/site/Sample_pdf/H04-A6.pdf (2008).
  23. McDade, T. W. Development and validation of assay protocols for use with dried blood spot samples. Am J Hum Biol. 26 (1), 1-9 (2014).
  24. Judd, A., et al. Evaluation of a modified commercial assay in detecting antibody to hepatitis C virus in oral fluids and dried blood spots. J Med Virol. 71 (1), 49-55 (2003).
  25. Zweig, M. H., Campbell, G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: A fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clin Chem. 39 (4), 561-577 (1993).
  26. Greiner, M., Pfeiffer, D., Smith, R. D. Principles and practical application of the receiver-operating characteristic analysis for diagnostic tests. Prev Vet Med. 45 (1-2), 23-24 (2000).
  27. Clopper, C. J., Pearson, E. S. The use of confidence or fiducial limits illustrated in the case of the binominal. Biometrika. 26 (4), Available from: http://www.bios.unc.edu/~mhudgens/bios/662/2007fall/clopper.pdf 404-413 (1934).
  28. Mei, J. V., Zobel, S. D., Hall, E. M., De Jesús, V. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Performance properties of filter paper devices for whole blood collection. Bioanalysis. 2 (8), 1403-1410 (2010).
  29. Masciotra, S., et al. Evaluation of blood collection filter papers for HIV-1 DNA PCR. J Clin Virol. 55 (2), 101-106 (2012).
  30. Li, F., Zulkoski, J., Fast, D., Michael, S. Perforated dried blood spots: a novel format for accurate microsampling. Bioanalysis. 3 (20), 2321-2333 (2011).
  31. Li, Y., Henion, J., Abbott, R., Wang, P. The use of a membrane filtration device to form dried plasma spots for the quantitative determination of guanfacine in whole blood. Rapid Commun Mass Spectrom. 26 (10), 1208-1212 (2012).
  32. Basavaraju, S. V., Pitman, J. P. Dried blood spots for use in HIV-related epidemiological studies in resource-limited settings. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. 76-94 (2014).
  33. Chace, D. H., Spitzer, A. R., De Jesus, V. R. Applications of dried blood spots in newborn and metabolic screening. Dried blood spots for use in HIV-related epidemiological studies in resource-limited settings. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. 3, Wiley. Hoboken. 53-75 (2014).
  34. Gakhar, H., Holodniy, M. Use of dried blood spot samples in HCV-, HBV-, and influenza-related epidemiological studies. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. 3, Wiley. Hoboken. 95-113 (2014).
  35. Villa, E., Cartolari, R., Bellentani, S., Rivasi, P., Casolo, G., Manenti, F. Hepatitis B virus markers on dried blood spots. A new tool for epidemiological research. J Clin Pathol. 34 (7), 809-812 (1981).
  36. Villar, L. M., de Oliveira, J. C., Cruz, H. M., Yoshida, C. F. T., Lampe, E., Lewis-Ximenez, L. L. Assessment of dried blood spot samples as a simple method for detection of hepatitis B virus markers. J Med Virol. 83 (9), 1529-1510 (2011).
  37. Lira, R., et al. Use of dried blood samples for monitoring hepatitis B virus infection. Virol J. 6 (1), 153(2009).
  38. Jardi, R., et al. Usefulness of dried blood samples for quantification and molecular characterization of HBV-DNA. Hepatology. 40 (1), 133-139 (2004).
  39. Marques, B. L., et al. Dried blood spot samples: optimization of commercial EIAs for hepatitis C antibody detection and stability under different storage conditions. J Med Virol. 84 (10), 1600-1607 (2012).
  40. Larrat, S., et al. Performance of an antigen–antibody combined assay for hepatitis C virus testing without venipuncture. J Clin Virol. 55 (3), 220-225 (2012).
  41. Brandao, C. P., et al. Simultaneous detection of hepatitis C virus antigen and antibodies in dried blood spots. J Clin Virol. 57 (2), 98-102 (2013).
  42. Bennett, S., et al. Detection of hepatitis C virus RNA in dried blood spots. J Clin Virol. 54 (2), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22418454 106-109 (2012).
  43. Abe, K., Konomi, N. Hepatitis C virus RNA in dried serum spotted onto filter paper is stable at room temperature. J Clin Microbiol. 36 (10), 3070-3072 (1998).
  44. Croom, H. A., et al. Commercial enzyme immunoassay adapted for the detection of antibodies to hepatitis C virus in dried blood spots. J Clin Virol. 36 (1), 68-71 (2006).
  45. Mendy, M., et al. Hepatitis B surface antigenaemia and alpha-foetoprotein detection from dried blood spots: applications to field-based studies and to clinical care in hepatitis B virus endemic areas. J Viral Hepat. 12 (6), 642-647 (2005).
  46. Komas, N. P., Baï-Sepou, S., Manirakiza, A., Léal, J., Béré, A., Le Faou, A. The prevalence of hepatitis B virus markers in a cohort of students in Bangui, Central African Republic. BMC Infect Dis. 10, 226(2010).
  47. Parker, S. P., Cubitt, W. D., Ades, A. E. A method for the detection and confirmation of antibodies to hepatitis C virus in dried blood spots. J Virol Methods. 68 (2), 199-205 (1997).
  48. McCarron, B., et al. Hepatitis C antibody detection in dried blood spots. J Viral Hepat. 6 (6), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10607263 453-456 (1999).
  49. Tuaillon, E., et al. Dried blood spot for hepatitis C virus serology and molecular testing. Hepatolog. 51 (3), 752-758 (2010).
  50. Solomon, S. S., et al. Dried blood spots (DBS): a valuable tool for HIV surveillance in developing/tropical countries. Int J STD AIDS. 13 (1), 25-28 (2002).
  51. Lakshmi, V., Sudha, T., Bhanurekha, M., Dandona, L. Evaluation of the Murex HIV Ag/Ab Combination assay when used with dried blood spots. Clin Microbiol Infect. 13 (11), 1136-1110 (2007).
  52. Sarge-Njie, R., et al. Evaluation of the dried blood spot filter paper technology and five testing strategies of HIV-1 and HIV-2 infections in West Africa. Scand J Infect Dis. 38 (11-12), 1050-1056 (2006).
  53. de Castro, A. C., Borges, L. G. dosA., de Souza, R. daS., Grudzinski, M., D’Azevedo, P. A. Evaluation of the human immunodeficiency virus type 1 and 2 antibodies detection in dried whole blood spots (DBS) samples. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 50 (3), 151-156 (2006).
  54. Fan, L., Wan, K., Kavetskaia, O., Wu, H. Automation in dried blood spot sample collection, processing, and analysis for quantitative bioanalysis in pharmaceutical industry. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. 229-234 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie plamki krwiprzetwarzanie kart filtracyjnychpobieranie krwi kapilarnejsuszenie przez nocwycinanie kr k w o rednicy sze ciu milimetr welucja buforemusuwanie zanieczyszcze przez wirowanieanaliza immunochemicznadetekcja technik molekularn
Suszone plamy krwi - przygotowanie i przetwarzanie do stosowania w testach immunologicznych i technikach molekularnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.