Method Article

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

DOI:

10.3791/52620

⸱

March 30th, 2015

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Rice University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno wykazano, że amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA), platforma amplifikacji izotermicznej do wykrywania patogenów, może być użyta do ilościowego określenia stężenia próbki DNA za pomocą krzywej standardowej. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono szczegółowy protokół opracowywania i wdrażania ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym (test qRPA). Na przykładzie kwantyfikacji DNA HIV-1 opisano montaż reakcji RPA w czasie rzeczywistym, projektowanie sekwencji wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC) oraz koamplifikację IPC i celu zainteresowania. Dostarczane są instrukcje i skrypty przetwarzania danych do budowy krzywej wzorcowej na podstawie danych z wielu eksperymentów, które mogą być wykorzystane do przewidywania stężenia nieznanych próbek lub oceny wydajności testu. Na koniec opisano alternatywną metodę zbierania danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopu i podgrzewacza stopniowego jako krok w kierunku opracowania testu qRPA w miejscu opieki. Dostarczony protokół i skrypty mogą być wykorzystane do opracowania testu qRPA dla dowolnego celu DNA, który jest przedmiotem zainteresowania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa amplifikacja kwasów nukleinowych jest ważną techniką wykrywania patogenów przenoszonych przez środowisko, żywność i wodę, a także do diagnostyki klinicznej. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest złotym standardem w czułym, specyficznym i ilościowym wykrywaniu kwasów nukleinowych, np. do badania wiremii HIV-1, wykrywania patogenów bakteryjnych i badań przesiewowych w kierunku wielu innych organizmów1–3. Podczas qPCR w czasie rzeczywistym startery amplifikują DNA patogenu w cyklach i generowany jest sygnał fluorescencyjny, który jest proporcjonalny do ilości amplifikowanego DNA w próbce w każdym cyklu. Próbka zawierająca nieznane stężenie DNA patogenu może być oznaczona ilościowo za pomocą krzywej wzorcowej, która wiąże początkowe stężenie DNA w próbkach wzorcowych z czasem, w którym sygnał fluorescencyjny osiąga określony próg (tj. próg cyklu lubCT).

Ponieważ qPCR w czasie rzeczywistym wymaga drogiego sprzętu do cykli termicznych i kilku godzin na otrzymanie wyników, opracowano alternatywne techniki amplifikacji izotermicznej, takie jak amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA)4. Platformy te na ogół zapewniają szybsze wyniki i amplifikują kwasy nukleinowe w niższej, pojedynczej temperaturze, co można osiągnąć za pomocą tańszego i prostszego sprzętu. RPA, który jest szczególnie atrakcyjny do zastosowań przyłóżkowych, amplifikuje DNA w ciągu kilku minut, wymaga niskiej temperatury amplifikacji (37 °C) i pozostaje aktywny w obecności zanieczyszczeń5,6. Testy RPA zostały opracowane do szerokiego zakresu zastosowań, w tym do analizy żywności, wykrywania patogenów, badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych i wykrywania czynników zagrożenia biologicznego7–12. Jednak zastosowanie RPA do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych było ograniczone13,14.

W poprzedniej pracy wykazano, że ilościowe RPA (qRPA) w czasie rzeczywistym jest wykonalne15. W tym miejscu przedstawiono bardziej szczegółowy protokół wykorzystania ilościowego RPA w czasie rzeczywistym do ilościowego oznaczania nieznanych próbek przy użyciu krzywej standardowej, metody analogicznej do kwantyfikacji za pomocą qPCR. Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić reakcję RPA na termocyklerze w celu wykrycia DNA HIV-1 jako dowodu słuszności koncepcji, a także jak opracować wewnętrzną kontrolę pozytywną (IPC), aby zapewnić prawidłowe działanie systemu. Szczegółowe jest również gromadzenie danych za pomocą termocyklera lub mikroskopu oraz analiza danych w celu skonstruowania krzywej standardowej na podstawie danych treningowych. Na koniec zademonstrowano metodę ilościowego oznaczania nieznanych próbek przy użyciu krzywej standardowej z niestandardowym skryptem. Ta technika qRPA umożliwia kwantyfikację próbek o nieznanych stężeniach i ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnym qPCR w czasie rzeczywistym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zaprogramuj termocykler dla reakcji qRPA w czasie rzeczywistym

  1. Utwórz nowy protokół w oprogramowaniu termocyklera.
    1. Wprowadzić etap wstępnej inkubacji: 39 °C przez 1 min.
    2. Dodać drugi krok: 39 °C przez 20 sekund, a następnie odczytać tabliczkę.
    3. Na koniec wstaw "GO TO", który powtarza drugi krok jeszcze 59 razy.
    4. Zapisz protokół.
  2. Utwórz nową blachę w zakładce "edytor blach" w oprogramowaniu. Wybierz dołki na płytce odpowiadające lokalizacjom reakcji RPA (tutaj użyj studzienek A1, A4-A8, B1 i B4-B8).
    UWAGA: Nie jest ważne, czy określony jest typ próbki odwiertów (np. "Standard", "NTC"), ponieważ analiza danych odbywa się za pomocą niestandardowego skryptu.
    1. W przypadku eksperymentów zawierających tylko DNA HIV-1, należy wybrać fluorofor "HEX" dla wszystkich studzienek. W przypadku eksperymentów zawierających DNA HIV-1 i wewnętrzną kontrolę pozytywną, należy wybrać zarówno fluorofory "HEX", jak i "FAM" dla wszystkich studzienek. Zachowaj talerz.

2. Przygotuj się do eksperymentów z HIV-1 qRPA

  1. Zbierz reakcje RPA w wyznaczonym obszarze roboczym do wstępnego amplifikacji, zawierającym wyznaczone pipety, końcówki do pipet, wirownik i miniwirówkę, tak jak w przypadku qPCR. Ponieważ RPA może amplifikować pojedynczą kopię DNA nawet o dziesięć rzędów wielkości (dane nie pokazane), probówki zawierające produkty po amplifikacji DNA należy obchodzić się i utylizować w wyznaczonym obszarze po amplifikacji.
    1. Zapobiegaj kontaktowi wszystkich odczynników przed amplifikacją i produktami po amplifikacji. Spryskaj miejsca pracy i sprzęt do wstępnego amplifikowania 50% wybielaczem przed i po wszystkich eksperymentach. Użyj ręcznika papierowego, aby zetrzeć nadmiar wybielacza.
  2. Kup sekwencję starterów do przodu 5'-TGG, CAG TAT, TCA, TCA, AAG, G-3', i sekwencję starterów odwrotnych: 5'-CCC, GAA, AAT, TTT, GAA, TTT, TTTG, TAA, TTT, TTT, TTT, G-3' z komercyjnych syntezatorów DNA. Kup sekwencję sondy 5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3' ze źródeł komercyjnych. Przed użyciem należy przechowywać wszystkie startery i sondy w temperaturze 4 °C w podwielokrotnościach w stężeniu 10 μM.
    UWAGA: Test qRPA amplifikuje unikalną sekwencję HIV-1. Do tego testu potwierdzającego słuszność koncepcji należy użyć plazmidu pHIV-IRES-eYFPΔEnvΔVifΔVpr opisanego przez Suttona i wsp., który zawiera sekwencję docelową16. W eksperymentach qRPA plazmid przechowywano w temperaturze 4 °C w podwielokrotnościach zawierających 1, 10, 102, 103 i 104 kopie na μl w buforze zawierającym 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA przy pH 8,0 i 1 ng / μl ludzkiego nośnika genomowego DNA (360486). To stężenie DNA nosiciela jest równoważne stężeniu DNA uzyskanemu z komercyjnych zestawów do ekstrakcji DNA w surowicy stosowanych w diagnostyce HIV-117. Te rozcieńczenia HIV-1 wykorzystano jako matryce w reakcjach qRPA w celu zbudowania krzywej wzorcowej.

3. Złóż krzywą standardową HIV-1 qRPA

  1. Przed montażem reakcji qRPA należy przygotować przestrzeń roboczą przed amplifikacją zgodnie z opisem w kroku 2.1.1. Umieścić 96-dołkowy blok chłodzący w magazynie w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj odczynniki do 12 reakcji:
    1. Przenieś octan magnezu, bufor do rehydratacji i 12 granulek reakcyjnych RPA do obszaru roboczego przed amplifikacją.
    2. Rozmrozić octan magnezu i bufor nawadniający w temperaturze pokojowej.
    3. Podwielokrotność 32,5 μl octanu magnezu (2,5 μl na reakcję) do probówki mikrowirówkowej.
    4. Przygotuj 13-krotną mieszankę główną. Dodać 383,5 μl buforu do rehydratacji (29,5 μl na reakcję) do oddzielnej probówki mikrowirówkowej dla mieszanki wzorcowej. Dodać 41,6 μl wody wolnej od nukleaz (3,2 μl na reakcję) do mieszanki wzorcowej. Wiruj główną mieszankę.
    5. Przywrócić octan magnezu i bufor do rehydratacji do przechowywania w temperaturze -20 °C.
    6. Przenieś porcje startera i sondy z lodówki do obszaru wstępnego amplifikacji, unikając nadmiernej ekspozycji na światło, aby zminimalizować fotowybielanie.
    7. Dodać po 27,3 μl każdego z 10 μM starterów do przodu i do tyłu (2,1 μl na starter na reakcję) do mieszanki głównej.
    8. Dodać 7,8 μl sondy DNA HIV-1 znakowanej szesnastkowo 10 μM (0,6 μl na reakcję) do mieszaniny wzorcowej.
    9. Zwróć startery i sondę do magazynu.
  3. Dopasowując układ płytek opisany w sekcji 1.2, umieść 1 osadek enzymatyczny w każdej z skrajnie lewych probówek i 1 osad enzymatyczny w każdej z 5 skrajnie prawych probówek z 2 nisko osadzonymi 8-dołkowymi probówkami do PCR.
  4. Ostrożnie dodać 37,5 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki zawierającej osad enzymatyczny, używając nowej końcówki pipety do każdej probówki i delikatnie mieszając mieszankę wzorcową i osad końcówką, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu. Delikatnie wymieszaj, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków, i ostrożnie zdejmij końcówkę, aby zapobiec utracie objętości reakcji.
  5. Po ponownym uwodnieniu wszystkich granulek enzymatycznych za pomocą mieszanki głównej, należy pobrać 96-dołkowy zimny blok z magazynu w temperaturze 4 °C. Umieść paski probówki PCR w zimnym bloku, aby schłodzić mieszankę główną.
  6. Podczas gdy mieszanka główna stygnie, załaduj oprogramowanie termocyklera z protokołem i tabliczką opisaną w rozdziale 1.
  7. Wytnij 2 paski przezroczystego plastikowego kleju do mikrouszczelek, aby były nieco szersze niż probówki do PCR, i wyjmij 2 płaskie pokrywki pasków probówki do PCR.
  8. Pobierz 6 porcji matrycy z magazynu (zawierających 0, 1, 101, 102, 103 lub 104 kopie plazmidu HIV-1 na mikrolitr).
  9. Dodać 10 μl każdej matrycy do probówek przeznaczonych dla tego stężenia matrycy. Do każdej probówki należy użyć nowej końcówki do pipety, delikatnie mieszając roztwór końcówką, aby wymieszać mieszankę wzorcową i szablon. Upewnij się, że szablon został dodany we właściwym miejscu, aby pasował do układu płyt opisanego w sekcji 1.2.
  10. Upewnij się, że adapter paska probówki do PCR do mikrowirówki jest na swoim miejscu.
  11. Dozować 2,5 μl octanu magnezu do każdej wieczka probówki, która zostanie umieszczona na probówce zawierającej reakcję qRPA.
  12. Delikatnie umieść pokrywki na probówkach PCR, tak aby nie były całkowicie zamknięte i można je było zdjąć. Octan magnezu będzie przylegał do pokrywek i będzie dobrze widoczny z góry.
  13. Włóż każdy pasek probówki do PCR z pokrywkami z każdej strony uchwytu probówki do PCR. Zamknij pokrywkę minifuge, aby odwirować octan magnezu z pokrywek i przejść do reakcji RPA, inicjując reakcję RPA. Wirować, aż wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte, a cały płyn zbierze się na dnie każdej probówki (około 10 sekund).
  14. Szybko wyjmij paski probówki PCR i umieść je z powrotem w zimnym bloku, aby zatrzymać reakcje qRPA.
  15. Ostrożnie zdejmij pokrywki, aby zapobiec tworzeniu się aerozolu i uszczelnij każdy pasek probówki do PCR wyciętymi kawałkami przezroczystej folii mikrouszczelniającej.
  16. Szybko podejdź do termocyklera i załaduj dwa paski probówki PCR do termocyklera w miejscach pasujących do układu płytek (dołki A1-B8). Zamknij pokrywę termocyklera, kliknij "Start Run" i wyznacz nazwę pliku dla eksperymentu.
    UWAGA: Chociaż producent zaleca mieszanie próbki po 5 minutach inkubacji, ten etap nie jest konieczny w przypadku tego konkretnego testu i można go pominąć.
  17. Po zakończeniu przebiegu wybierz "Ustawienia", "Ustawienie linii bazowej", "Brak odejmowania linii bazowej", aby wyświetlić surowe dane fluorescencji. Eksportuj dane do programu arkusza kalkulacyjnego, wybierając "Eksportuj", "Eksportuj wszystkie arkusze danych do programu Excel". Zostanie utworzony plik z dodatkiem "Wyniki wzmocnienia ilościowego" zawierający surowe dane fluorescencji w czasie rzeczywistym.

4. Rozwijaj Wewnętrzną Kontrolę Pozytywną

  1. Wybierz sekwencję DNA z gatunku, którego znalezienie w próbce docelowej jest mało prawdopodobne. Sekwencja musi być dłuższa niż docelowy amplikon, aby preferowane było generowanie sekwencji docelowej.
    UWAGA: Do tego testu wybrano Cryptosporidium parvum, pasożyta jelitowego, który miał służyć jako matryca do generowania sekwencji IPC, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby organizm ten został znaleziony we krwi i był dostępny w laboratorium w ramach innego projektu. Aby wygenerować sekwencję IPC, wyekstrahuj i oczyść DNA z oocyst C. parvum, jak opisano w innym miejscu18.
  2. Kup startery do przodu (5'-TGG, CAG, TAT, TCA, TCA, ATT, AA, AA, AAG, G/ ATC, TAA, GGA, AGG, CAG, CAG, GC-3') i wsteczne (5'- CCC, GAA, AAT, TTT, GAA, TTT, TTTG, TAA, GTT, TTT, G/ TGC, TGG, AGT, ATT, CAA, GGC, ATA, -3') ze źródeł komercyjnych. Startery IPC PCR użyte w tym teście są pokazane na rysunku 1 i zawierają jeden region, który jest komplementarny do matrycy DNA IPC (np. C. parvum, fioletowy na rysunku 1) i jeden region, który jest komplementarny w stosunku do organizmu docelowego (np. HIV-1, niebieski na rysunku 1).
  3. Wykonaj PCR przy użyciu starterów i matrycy IPC DNA.
    1. Zbierz 50 μl reakcji PCR przy użyciu odczynników Phusion High-Fidelity DNA Polymerase kit zgodnie z instrukcjami producenta, z wyłączeniem polimerazy. Użyj 2 μl matrycy DNA i buforu Phusion HF.
    2. Dodać polimerazę Phusion do każdej reakcji po gorącym rozruchu w temperaturze 98 °C, następnie 60 sekund w temperaturze 98 °C, a następnie 40 cyklach po 15 sekund w temperaturze 98 °C, 30 sekund w temperaturze 62 °C i 30 sekund w temperaturze 72 °C z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 5 minut. Po cyklach termicznych utrzymać próbki w temperaturze 4 °C.
    3. Analizuj próbki za pomocą elektroforezy żelowej na 2% żelu agarozowym TAE, a następnie ekstrahuj i oczyszczaj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick zgodnie z protokołem mikrowirówki dołączonym do zestawu.
  4. Przebadaj kandydatów IPC pod kątem ich zdolności do amplifikacji za pomocą qRPA.
    1. Przygotować reakcje qRPA zgodnie z opisem w sekcji 3, używając starterów HIV-1, sondy znakowanej FAM specyficznej dla IPC (5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3') i łącznie 0, 10, 102, 103, 104 lub 105 kopii każdego kandydata IPC na reakcję, badanie wszystkich stężeń w dwóch egzemplarzach.
    2. Wybierz kandydata IPC, który wzmacnia się najbardziej konsekwentnie i ma najniższą granicę wykrywalności.
  5. Koamplifikacja HIV-1 i IPC w celu określenia optymalnego stężenia DNA IPC.
    1. Podobnie jak w sekcji 3, w każdej reakcji 50 μl połącz następujące elementy: 29,5 μl buforu rehydratacyjnego, 2,1 μl RPA startera do przodu [10 μM], 2,1 μl startera odwrotnego RPA [10 μM], 0,6 μl sondy znakowanej HEX HIV-1 [10 μM], 10 μl DNA HIV-1 w różnych stężeniach, 2,5 μl octanu magnezu i 1 osadek enzymu. Zamiast dodawać 3,2 μl wody wolnej od nukleaz, jak to zrobiono w kroku 3.2.4, dodaj 0,6 μl sondy znakowanej IPC FAM [10 μM] i 2,6 μl IPC DNA. Należy użyć stężenia IPC, które jest granicą wykrywalności (LOD), gdy qRPA wykonuje się z samym DNA IPC (LOD zdefiniowane jako najniższe stężenie, w którym ilość generowanego sygnału fluorescencyjnego jest większa niż ilość generowana przez fluorescencję generowaną przez próbki bez docelowego DNA).
    2. Inkubować próbki, stosując protokół opisany w sekcji 1.1.
    3. Jeśli IPC nie amplifikuje się w każdej próbce, rozważ powtórzenie eksperymentu ze stężeniem IPC o jeden rząd wielkości wyższym. Optymalne stężenie DNA IPC do testu HIV-1 wynosi 10 000 kopii/μl. Podczas gdy próbki są uważane za ważne, jeśli występuje amplifikacja DNA IPC lub HIV-1, idealnie IPC wykazuje wykrywalną amplifikację dla każdej reakcji.

5. Budowanie krzywej standardowej na podstawie wielu eksperymentów

  1. Upewnij się, że dane z każdego eksperymentu zostały wyeksportowane do arkusza kalkulacyjnego zgodnie z opisem w sekcji 3.13.
  2. Otwórz i uruchom skrypt "JoVE_qRPA_standard_curve.m". Wszystkie dane wejściowe są automatycznie monitowane w oknie poleceń. Po zainicjowaniu skryptu użytkownik jest automatycznie proszony o wyznaczenie "liczby plików danych" używanych do zbudowania krzywej standardowej.
  3. W oknie poleceń wpisz liczbę plików, które mają zostać użyte do zbudowania krzywej standardowej, a następnie naciśnij Enter.
  4. Wpisz w oknie poleceń liczbę próbek i liczbę powtórzeń w każdym pliku treningowym (naciskając Enter po każdym wpisie).
    UWAGA: W układzie płytek opisanym w sekcji 1.2 znajdowało się 6 próbek o różnych stężeniach i 2 powtórzenia każdej próbki).
  5. Wpisz w oknie poleceń najniższe stężenie DNA użyte do zbudowania krzywej wzorcowej (w log10 kopiach) i naciśnij enter (dla układu płytki opisanego w sekcji 1.2 najniższe stężenie matrycy to '1' log10 kopii).
  6. Wpisz w oknie poleceń różnicę w stężeniu między każdym wzorcem (w log10 kopach), a następnie naciśnij enter (dla układu tabliczek opisanego w sekcji 1.2 przedział stężeń wynosi "1" log10 kopii).
  7. Po wyświetleniu monitu wpisz "Próg nachylenia" w oknie poleceń i naciśnij enter.
  8. W oknie poleceń wpisz "Liczba (z) odchyleń standardowych powyżej tła dla progu dodatniego", a następnie naciśnij Enter. Typowe wartości dla z mieszczą się w zakresie od 1 do 5.
  9. Określ, czy dane zostały zebrane za pomocą termocyklera ("1"), obrazów mikroskopowych *.tiff ("2") czy obrazów mikroskopowych *.jpg ("3"), wpisując liczbę "1", "2" lub "3" i naciskając Enter.
  10. Wybierz, czy chcesz ustawić nowy próg IPC, czy użyć wartości domyślnej dla progu, wpisując odpowiednio "y" lub "n" po wyświetleniu monitu.
  11. Następnie wybierz każdy z plików arkusza kalkulacyjnego użytego do zbudowania krzywej standardowej.
    UWAGA: Skrypt automatycznie zaimportuje dane fluorescencji HEX i FAM; określić, czy każda reakcja była prawidłowa (tj. czy sygnały fluorescencyjne przekroczyły progi dla kanałów HEX lub FAM); Określ współczynnik r2 dla dopasowania wielomianowego wykładniczego, liniowego i wielomianowego drugiego rzędu; wykreślić "log10 kopii w funkcji progu cyklu" dla każdej próbki użytej do zbudowania krzywej wzorcowej; i utwórz plik arkusza kalkulacyjnego zawierający niezbędne zmienne, aby odbudować krzywą standardową na potrzeby eksperymentów walidacyjnych bez konieczności ponownego wprowadzania wszystkich parametrów wejściowych przez użytkownika.

6. Walidacja testu i kwantyfikacja nieznanych próbek przy użyciu krzywej standardowej

  1. Użyj skryptu "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m", aby oszacować precyzję i dokładność testu przy użyciu próbek o znanych stężeniach lub użyj go do ilościowego oznaczania próbek o nieznanych stężeniach.
    UWAGA: Ponieważ wcześniej opublikowane badania wykazały, że dopasowanie wykładnicze daje najlepszy współczynnik r-kwadrat18, ten skrypt wykorzystuje dopasowanie wykładnicze dla krzywej standardowej. Jeśli pożądany jest inny rodzaj dopasowania, skrypt może zostać odpowiednio zmodyfikowany.
    1. Otwórz i uruchom skrypt "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". Po zainicjowaniu skryptu użytkownik jest automatycznie monitowany o wprowadzenie wszystkich danych wejściowych w oknie polecenia.
    2. Wprowadzić wartość "1", aby zwalidować test przy użyciu krzywej wzorcowej ze znanymi stężeniami próbki, lub wprowadzić wartość "2", aby określić ilościowo nieznane próbki.
    3. Po wyświetleniu monitu wybierz zapisaną krzywą standardową lub zbuduj nową, wprowadzając informacje, które są automatycznie wymagane w oknie poleceń (te same informacje, które są wymagane dla skryptu "JoVE_qRPA_standard_curve.m" z sekcji 5).
    4. Wpisz liczbę eksperymentów (np. plików arkuszy kalkulacyjnych) do przeanalizowania w celu walidacji/kwantyfikacji.

7. Przygotowanie do zbierania danych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i podgrzewanego chipa

  1. Upewnij się, że mikroskop fluorescencyjny ma stage grzałka i 1-kanałowy precyzyjny regulator temperatury o wysokiej stabilności na miejscu.
  2. Upewnij się, że mikroskop fluorescencyjny ma kostkę filtrującą do wzbudzania i zbierania fluorescencji z każdego fluoroforu. Wzbudzić i zebrać fluorescencję FAM powstającą podczas amplifikacji DNA IPC przez filtr GFP (wzbudzenie BP 470/40 nm, emisja BP 520/50 nm). Wzbudzić i zebrać fluorescencję HEX powstającą podczas amplifikacji DNA HIV-1 przez filtr HEX (wzbudzenie BP 530/30 nm, emisja BP 575/40 nm).
  3. Użyj oprogramowania do edycji skryptów mikroskopu, aby utworzyć zautomatyzowany algorytm do replikowania zbierania danych na termocyklerze.
    1. Najpierw wstaw krok "Ustawienia", aby zamknąć migawkę. Następnie dodaj krok "Ekspozycja", aby ustawić ekspozycję na 60 sekund. Wstaw "Snap", aby wykonać 60-sekundowe opóźnienie, które implementuje 1-minutowy okres wstępnej inkubacji. Dodaj krok "Ustawienie", aby zmienić grupę roboczą na filtr GFP. Wstaw kolejny krok "Ekspozycja", aby dostosować ekspozycję do 200 ms. Wszystkie ekspozycje przy użyciu GFP lub kostek filtra HEX zostaną ustawione na 200 ms.
    2. Po kroku "Ekspozycja" dodaj "Snap" i określ aparat, którym zostanie zrobione zdjęcie. Użyj innego kroku "Ustawienia", aby zamknąć migawkę i kroku "Zapisz obraz", aby zapisać obraz w folderze tymczasowym zdefiniowanym przez użytkownika.
    3. Następnie przełącz się na kostkę filtra szesnastkowego, wykonując kolejny krok "Ustawienia", a następnie dodaj "Ekspozycję" przy 200 ms, krok "Snap" i krok "Zapisz obraz".
    4. Powtórz ten proces 59 razy z początkowym opóźnieniem 20 sekund zamiast 60 (zamknij migawkę, odczekaj 20 sekund, przełącz na kostkę filtra GFP, ustaw ekspozycję na 200 ms, pstryknij, zamknij migawkę, zapisz, przełącz na kostkę filtra HEX, ustaw ekspozycję na 200 ms, pstryk).
  4. Stwórz chip, który będzie zawierał reakcje qRPA.
    1. Do eksperymentów z użyciem mikroskopu użyj pliku JoVE_qRPA_base.ai, aby wyciąć prostokątną podstawę o wymiarach 40 x 15 mm z arkusza czarnego akrylu o grubości 1/8 cala za pomocą wycinarki laserowej ustawionej na 100% mocy, 10% prędkości.
    2. Użyj pilnika JoVE_qRPA_well.ai, aby wyciąć studnię reakcyjną składającą się z kwadratu o wymiarach 10 x 10 mm z okrągłym otworem o średnicy 5 mm wyciętym z arkusza przezroczystego akrylu o grubości 1,5 mm.
    3. Przymocuj do trzech dołków do jednej podstawy za pomocą żelu superglue.
    4. Suszyć przez noc.

8. Zbieranie i analiza danych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego

  1. Przygotuj mikroskop do zbierania danych, wczytując skrypt automatycznego zbierania danych JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
    1. Ustawić grzałkę stage na 48 °C i podgrzewać chip reakcyjny na grzałce stage przez około 20 minut. Ustawienie temperatury na 48 °C utrzymuje temperaturę 39 °C w studzience reakcyjnej (dane nie pokazane).
    2. Używając obiektywu 10X, 0,45 NA, skup się na górnej części wewnętrznej krawędzi dołka reakcyjnego z założonym filtrem GFP. Krawędzie akrylu są autofluorescencyjne po cięciu laserowym i można je łatwo zobrazować. Po ustawieniu ostrości nie należy regulować wysokości stolika mikroskopu, dopóki wszystkie dane nie zostaną zebrane.
  2. Zmontuj miks główny qRPA w wyznaczonym obszarze roboczym do wstępnego amplifikacji, jak opisano w kroku 4.5.1. Dla każdej próbki wymieszaj osad enzymatyczny, mieszankę wzorcową i matrycę DNA HIV-1 w probówce do mikrowirówki. Dodać 2,5 μl octanu magnezu do pierwszej reakcji i krótko wirować.
  3. Szybko przetransportuj probówkę mikrowirówkową zawierającą próbkę qRPA do mikroskopu fluorescencyjnego.
    1. Ostrożnie odpipetować 30 μl reakcji RPA do studzienki reakcyjnej, nie tworząc pęcherzyków. Umieść kroplę oleju mineralnego klasy PCR nad reakcją RPA, aby zapobiec parowaniu.
    2. Umieść studzienkę bezpośrednio pod obiektywem mikroskopu, uważając, aby obrazować tylko środek studzienki, a nie żadną z autofluorescencyjnych krawędzi akrylowych. Po ustawieniu studni uruchom automatyczny skrypt 7. Skrypt generuje jeden obraz JPEG za pomocą kostki filtra FAM i jeden obraz JPEG za pomocą kostki filtra HEX co 20 sekund.
  4. Po zakończeniu skryptu przenieś te obrazy z folderu przechowywania tymczasowego przed uruchomieniem dodatkowych próbek.
    1. Utwórz 2 foldery: po 1 dla każdego fluoroforu (np. "HEX" i "FAM"). Przechowuj oba foldery w tym samym folderze nadrzędnym. W każdym folderze fluoroforowym utwórz folder oznaczony liczbą kopii DNA obecnych w próbce (np. 0, 10 itd.).
    2. Przenieś wszystkie pliki z prefiksem "HEX" do odpowiedniego podfolderu w folderze "HEX". Przenieś wszystkie pliki z prefiksem "GFP" do odpowiedniego podfolderu w folderze "FAM".
  5. Powtórzyć sekcje 8.2-8.4 dla reakcji qRPA z 0, 10, 102, 103, 104 i 105 kopiami DNA HIV-1.
  6. Po zebraniu danych dla wszystkich próbek qRPA w eksperymencie, załaduj skrypt "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." Po wyświetleniu monitu przez skrypt wybierz folder nadrzędny zawierający 2 foldery fluoroforowe, które z kolei zawierają obrazy dla każdego stężenia w podfolderach.
    UWAGA: Skrypt automatycznie wygeneruje plik arkusza kalkulacyjnego w katalogu nadrzędnym, w którym dane fluorescencji HEX zostaną zapisane w arkuszu o nazwie "HEX", a dane fluorescencji FAM zostaną zapisane w arkuszu o nazwie "FAM". W każdym arkuszu numer cyklu jest podany w kolumnie B, a dane dotyczące fluorescencji w czasie rzeczywistym dla rosnących stężeń matrycy są podane w kolumnach C, D itd. Każdy punkt odniesienia fluorescencji w czasie rzeczywistym to średnia intensywność fluorescencji obrazu zarejestrowanego w tym punkcie czasowym.
  7. Użyj domyślnej funkcji wykresu punktowego w programie arkusza kalkulacyjnego, aby wykreślić komórki B2:H61 arkuszy "HEX" i "FAM" w celu wizualizacji fluorescencji w czasie rzeczywistym i wygenerowania wykresów podobnych do tych na rysunkach 2A, 2B, 3A i 3B.
    UWAGA: Arkusz kalkulacyjny wygenerowany w kroku 8.6 może być również używany w skryptach "JoVE_qRPA_standard_curve.m" i "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed wyborem sekwencji, która ma służyć jako IPC w eksperymentach qRPA z docelowym DNA (HIV-1), generowani są kandydaci do wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC) i badani pod kątem ich zdolności do amplifikacji w reakcjach qRPA bez obecności DNA HIV-1. Kandydaci na IPC są dłuższe niż docelowe DNA (HIV-1), aby zapobiec tworzeniu się IPC w wyniku konkurującego tworzenia amplikonu HIV-1. Jak pokazano na rysunku 2A, wytwarzanie dwóch kandydatów na IPC C. parvum zweryfikowano przez obecność pasm 415 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać miarodajne dane kwantyfikacyjne za pomocą algorytmu MATLAB, użytkownik musi wybrać odpowiednie wartości wejściowe, gdy zostanie o to poproszony. Po zainicjowaniu każdego skryptu w sekcjach 5 i 6, wszystkie zmienne wejściowe są automatycznie pobierane w oknie poleceń, a dane wyjściowe są generowane automatycznie. W sekcji 5.7 użytkownik jest proszony o wybranie progu nachylenia. Wartość progu nachylenia wpływa na kwadrat współczynnika korelacji (r2) pasowania. W przypadku korzystania z surowych dany...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane z grantu Fundacji Billa i Melindy Gatesów w ramach Grand Challenges in Global Health Initiative.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
qRPA Test
HIV-1 do przodustarter Zintegrowane technologie DNAniestandardowe oligonukleotydy DNA5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3'  
Odwrócony starter HIV-1Zintegrowane technologie DNAniestandardowe oligonukleotydy DNA5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT TTT TTT G-3 '  
Sonda HIV-1BioSearch Technologies niestandardowe oligonukleotydy DNA5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3'  
Sonda IPCBioSearch Technologies niestandardowe oligonukleotydy DNA5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'
Odczynniki do egzoterapii RPA (granulki, bufor hydratacyjny, octan magnezuTwistDxTwistAmp exo
PCR paski do probówekBioRadTLS0801
PCR z płaską nakrętkąBioRadTCS0803
Klej do mikrouszczelekBioRad558/MJ 
Cel HIV-1 (pHIV-IRES- eYFPΔ EnvΔ VifΔ Vpr)niestandardowy plazmid, patrz: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, RE Charakterystyka i wykrywanie lentiwirusa kompetentnego do sztucznej replikacji o zmienionym zakresie gospodarza. Terapia molekularna 8, 118– 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Ludzki męski genomiczny DNAApplied Biosystems360486
96-dołkowy zimny blokCole ParmerEW-36700-48
TermocyklerBioRadCFX96
MiniFugeVWR93000-196
VortexVWR58816-121
Bufor Tris 1,0 M, pH 8,0EMD Milipore648314
EDTA 0,5 M, pH 8,0PromegaV4321
Woda wolna od nukleazAmbionAM9937
Rozwój
Cryptosporidium parvum Szablon IPCWaterborne IncP102CMożliwe jest również zamówienie dwuniciowego celu syntetycznego w IDT, jeśli użytkownik nie jest wyposażony do pracy z C. parvum (czynnikiem zakaźnym BSL-2). Startery PCR i RPA dla C. parvum zostały zaprojektowane przy użyciu startera o numerze dostępu GenBank AF115377.1
PCR long forwardIntegrated DNA Technologiescustom DNA oligos5'-TGG CAG TAT TCA, TTC, ACA, ATT TTA, AAA, GAA, G/ ATC, TAA, GGA, AGG, CAG, CAG, CAG, GC-3'
PCR długi odwrócony starterZintegrowane technologie DNAniestandardowe oligonukleotydy DNA5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT TTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3
Phusion High-Fidelty DNA PolymerazaNew England BiolabsM0530S Zestaw do ekstrakcji
żeluQiaquick Qiagen28704
TAE 10X buforEMD Millipore574797
AgarozaSigmaAldrich A9539
Eksperymenty mikroskopowe
Pionowy mikroskop fluorescencyjnyZeissZeiss Imager.J1
Podgrzewacz scenicznyNarzędzia biologiczneTC-GSH
1-kanałowy precyzyjny regulator temperatury o wysokiej stabilności NarzędziabiologiczneTC-1100S
FAM/GFP kostkafiltracyjna Zeisszestaw filtrów 38 (000000-1031-346)wzbudzenie BP 470/40 nm, emisja BP 520/50 nm
Kostka filtra HEXChroma49014wzbudzenie BP 530/30 nm, emisja BP 575/40 nm
Wycinarkalaserowa Grawer NetworkVLS3.60
1/8" akrylMcMaster Carr8505K113
1,5 mm przezroczysty akrylMcMaster CarrPD-72268940 
Super klejOffice DepotDuro super klej 
Olej mineralny klasy PCRSigma AldrichM8662-5VL
Analiza
Microsoft ExcelMicrosoft
MATLABMATLAB
Skrypt MATLAB: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"Zawarte w
MATLAB: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"Zawarte w
MATLAB: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"Zawarte w SI
Adobe IllustratorAdobe
JoVE_qRPA_well.aiZawarte w SI
JoVE_qRPA_base.aiZawarte w oprogramowaniu SI
AxioVisionZeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscriptZawarte w SI
IPC'danych skrypcie SI skrypcie SI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoon, J. -Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).
  2. Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites. Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).
  3. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  4. Asiello, P. J., Baeumner, A. J. Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).
  5. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
  6. Krõlov, K., Frolova, J., et al. Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples. The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).
  7. Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis. Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).
  8. Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malaria Journal. 13 (1), 99(2014).
  9. Crannell, Z. A., et al. Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens. Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).
  10. Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA. Lab on a Chip. 12 (17), 3082(2012).
  11. Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening. Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).
  12. Euler, M., et al. Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).
  13. Abd El Wahed, A., et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. PloS One. 8 (8), e71642(2013).
  14. Escadafal, C., et al. Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730(2014).
  15. Hutson, S. L., et al. T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest. PLoS ONE. 5 (11), 15(2010).
  16. Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).
  17. DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html (2014).
  18. Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification. Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).
  19. Sollis, K. a, et al. Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples. PloS one. 9 (2), e85869(2014).
  20. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Quantitative Recombinase Polymerase AmplificationRecombinase Polymerase AmplificationInternal Positive ControlReal time PCR MachineStandard Curve ConstructionHIV 1 DNA QuantificationFluorescence Data AnalysisThermal Cycler ProtocolPoint of care Assay DevelopmentMagnesium Acetate Activation

Related Articles