Method Article

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

DOI:

10.3791/52620

⸱

March 30th, 2015

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Rice University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno wykazano, że amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA), platforma amplifikacji izotermicznej do wykrywania patogenów, może być użyta do ilościowego określenia stężenia próbki DNA za pomocą krzywej standardowej. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono szczegółowy protokół opracowywania i wdrażania ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym (test qRPA). Na przykładzie kwantyfikacji DNA HIV-1 opisano montaż reakcji RPA w czasie rzeczywistym, projektowanie sekwencji wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC) oraz koamplifikację IPC i celu zainteresowania. Dostarczane są instrukcje i skrypty przetwarzania danych do budowy krzywej wzorcowej na podstawie danych z wielu eksperymentów, które mogą być wykorzystane do przewidywania stężenia nieznanych próbek lub oceny wydajności testu. Na koniec opisano alternatywną metodę zbierania danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopu i podgrzewacza stopniowego jako krok w kierunku opracowania testu qRPA w miejscu opieki. Dostarczony protokół i skrypty mogą być wykorzystane do opracowania testu qRPA dla dowolnego celu DNA, który jest przedmiotem zainteresowania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa amplifikacja kwasów nukleinowych jest ważną techniką wykrywania patogenów przenoszonych przez środowisko, żywność i wodę, a także do diagnostyki klinicznej. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest złotym standardem w czułym, specyficznym i ilościowym wykrywaniu kwasów nukleinowych, np. do badania wiremii HIV-1, wykrywania patogenów bakteryjnych i badań przesiewowych w kierunku wielu innych organizmów1–3. Podczas qPCR w czasie rzeczywistym startery amplifikują DNA patogenu w cyklach i generowany jest sygnał fluorescencyjny, który jest proporcjonalny do ilości amplifikowanego DNA w pró....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zaprogramuj termocykler dla reakcji qRPA w czasie rzeczywistym

  1. Utwórz nowy protokół w oprogramowaniu termocyklera.
    1. Wprowadzić etap wstępnej inkubacji: 39 °C przez 1 min.
    2. Dodać drugi krok: 39 °C przez 20 sekund, a następnie odczytać tabliczkę.
    3. Na koniec wstaw "GO TO", który powtarza drugi krok jeszcze 59 razy.
    4. Zapisz protokół.
  2. Utwórz nową blachę w zakładce "edytor blach" w oprogramowaniu. Wybierz dołki na płytce odpowiadające lokalizacjom reakcji RPA (tutaj użyj studzienek A1, A4-A8, B1 i B4-B8).
    UWAGA: Nie jest ważne, czy określony jest typ próbki odwiertów (np. "Standa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed wyborem sekwencji, która ma służyć jako IPC w eksperymentach qRPA z docelowym DNA (HIV-1), generowani są kandydaci do wewnętrznej kontroli pozytywnej (IPC) i badani pod kątem ich zdolności do amplifikacji w reakcjach qRPA bez obecności DNA HIV-1. Kandydaci na IPC są dłuższe niż docelowe DNA (HIV-1), aby zapobiec tworzeniu się IPC w wyniku konkurującego tworzenia amplikonu HIV-1. Jak pokazano na rysunku 2A, wytwarzanie dwóch kandydatów na IPC C. parvum zweryfikowano przez obecność pasm 415 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać miarodajne dane kwantyfikacyjne za pomocą algorytmu MATLAB, użytkownik musi wybrać odpowiednie wartości wejściowe, gdy zostanie o to poproszony. Po zainicjowaniu każdego skryptu w sekcjach 5 i 6, wszystkie zmienne wejściowe są automatycznie pobierane w oknie poleceń, a dane wyjściowe są generowane automatycznie. W sekcji 5.7 użytkownik jest proszony o wybranie progu nachylenia. Wartość progu nachylenia wpływa na kwadrat współczynnika korelacji (r2) pasowania. W przypadku korzystania z surowych dany.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane z grantu Fundacji Billa i Melindy Gatesów w ramach Grand Challenges in Global Health Initiative.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
qRPA Test
HIV-1 do przodustarter Zintegrowane technologie DNAniestandardowe oligonukleotydy DNA5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3'  
Odwrócony starter HIV-1Zintegrowane technologie DNAniestandardowe oligonukleotydy DNA5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT TTT TTT G-3 '  
Sonda HIV-1BioSearch Technologies niestandardowe oligonukleotydy DNA5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3'  
Sonda IPCBioSearch Technologies niestandardowe oligonukleotydy DNA5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'
Odczynniki do egzoterapii RPA (granulki, bufor hydratacyjny, octan magnezuTwistDxTwistAmp exo
PCR paski do probówekBioRadTLS0801
PCR z płaską nakrętkąBioRadTCS0803
Klej do mikrouszczelekBioRad558/MJ 
Cel HIV-1 (pHIV-IRES- eYFPΔ EnvΔ VifΔ Vpr)niestandardowy plazmid, patrz: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, RE Charakterystyka i wykrywanie lentiwirusa kompetentnego do sztucznej replikacji o zmienionym zakresie gospodarza. Terapia molekularna 8, 118– 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Ludzki męski genomiczny DNAApplied Biosystems360486
96-dołkowy zimny blokCole ParmerEW-36700-48
TermocyklerBioRadCFX96
MiniFugeVWR93000-196
VortexVWR58816-121
Bufor Tris 1,0 M, pH 8,0EMD Milipore648314
EDTA 0,5 M, pH 8,0PromegaV4321
Woda wolna od nukleazAmbionAM9937
Rozwój
Cryptosporidium parvum Szablon IPCWaterborne IncP102CMożliwe jest również zamówienie dwuniciowego celu syntetycznego w IDT, jeśli użytkownik nie jest wyposażony do pracy z C. parvum (czynnikiem zakaźnym BSL-2). Startery PCR i RPA dla C. parvum zostały zaprojektowane przy użyciu startera o numerze dostępu GenBank AF115377.1
PCR long forwardIntegrated DNA Technologiescustom DNA oligos5'-TGG CAG TAT TCA, TTC, ACA, ATT TTA, AAA, GAA, G/ ATC, TAA, GGA, AGG, CAG, CAG, CAG, GC-3'
PCR długi odwrócony starterZintegrowane technologie DNAniestandardowe oligonukleotydy DNA5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT TTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3
Phusion High-Fidelty DNA PolymerazaNew England BiolabsM0530S Zestaw do ekstrakcji
żeluQiaquick Qiagen28704
TAE 10X buforEMD Millipore574797
AgarozaSigmaAldrich A9539
Eksperymenty mikroskopowe
Pionowy mikroskop fluorescencyjnyZeissZeiss Imager.J1
Podgrzewacz scenicznyNarzędzia biologiczneTC-GSH
1-kanałowy precyzyjny regulator temperatury o wysokiej stabilności NarzędziabiologiczneTC-1100S
FAM/GFP kostkafiltracyjna Zeisszestaw filtrów 38 (000000-1031-346)wzbudzenie BP 470/40 nm, emisja BP 520/50 nm
Kostka filtra HEXChroma49014wzbudzenie BP 530/30 nm, emisja BP 575/40 nm
Wycinarkalaserowa Grawer NetworkVLS3.60
1/8" akrylMcMaster Carr8505K113
1,5 mm przezroczysty akrylMcMaster CarrPD-72268940 
Super klejOffice DepotDuro super klej 
Olej mineralny klasy PCRSigma AldrichM8662-5VL
Analiza
Microsoft ExcelMicrosoft
MATLABMATLAB
Skrypt MATLAB: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"Zawarte w
MATLAB: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"Zawarte w
MATLAB: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"Zawarte w SI
Adobe IllustratorAdobe
JoVE_qRPA_well.aiZawarte w SI
JoVE_qRPA_base.aiZawarte w oprogramowaniu SI
AxioVisionZeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscriptZawarte w SI
IPC'danych skrypcie SI skrypcie SI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoon, J. -Y., Kim, B. Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety. Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).
  2. Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of labo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Quantitative Recombinase Polymerase AmplificationRecombinase Polymerase AmplificationInternal Positive ControlReal time PCR MachineStandard Curve ConstructionHIV 1 DNA QuantificationFluorescence Data AnalysisThermal Cycler ProtocolPoint of care Assay DevelopmentMagnesium Acetate Activation

Related Articles