Artykuł metodologiczny

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52632

⸱

11 maja 2015

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Queensland

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Streszczenie

Cukrzyca typu 2 jest chorobą przewlekłą, która dotyka 382 miliony ludzi w 2013 roku i oczekuje się, że wzrośnie do 592 milionów do 2035 roku 1. W ciągu ostatnich 2 dekad rola dysfunkcji komórek beta w cukrzycy typu 2 została wyraźnie ustalona 2. Postęp badań wymaga metod izolacji wysp trzustkowych. Przedstawiony tutaj protokół izolacji wysepek ma wiele wspólnych kroków z protokołami z innych grup, z pewnymi modyfikacjami w celu poprawy wydajności i jakości izolowanych wysepek zarówno od myszy typu dzikiego, jak i myszy z cukrzycą Leprdb (db / db). Następnie przedstawiono metodę obrazowania 2-fotonowego żywych komórek, która może być wykorzystana do zbadania kontroli wydzielania insuliny w wyspach trzustkowych.

Wprowadzenie

Rola dysfunkcji komórek beta w chorobach została powszechnie uznana 3,4. Linie komórkowe, takie jak MIN6 i INS-1, są użytecznymi narzędziami do zrozumienia biologii zachowania komórek beta. Jednak fizjologiczna kontrola wydzielania insuliny odbywa się w obrębie wysepek Langerhansa. Wysepki te zawierają tysiące ciasno upakowanych komórek beta, a także naczynia krwionośne i inne typy komórek endokrynnych. To środowisko w obrębie wyspy trzustkowej wpływa na wydzielanie insuliny i może być ważne w cukrzycy. Dlatego, aby zrozumieć fizjologiczną kontrolę wydzielania insuliny i patofizjologię choroby, konieczne jest zbadanie nienaruszonych wysp trzustkowych.

Izolacja wysepek

Żywe ludzkie wyspy trzustkowe, a w szczególności ludzkie wyspy trzustkowe od pacjentów z cukrzycą typu 2, są trudne do zdobycia. Ponadto ludzkie wyspy trzustkowe mają ograniczone możliwości eksperymentalnej manipulacji molekularnej. W związku z tym naukowcy wykorzystali wysepki pochodzące od zwierząt i zwierzęce modele cukrzycy typu 2. Jednym z takich modeli choroby jest mysz db/db. Jest to spontaniczna mutacja, która modeluje cukrzycę typu 2 z progresją fenotypu, która jest ściśle równoległa do choroby u człowieka 5,6. Przedstawiony tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych od myszy z cukrzycą db / db ma wiele wspólnych etapów z innymi grupami z pewnymi udoskonaleniami w celu lepszej wydajności, oczyszczania i zwiększonej przeżywalności wysp trzustkowych.

2 obrazowanie fotonów

Opisany tutaj test 2-fotonowy na żywych komórkach umożliwia badaczom ilościowe określenie liczby i ocenę cech pojedynczych granulek zawierających insulinę z wielu komórek wysepek typucukrzycowego 7 i dzikich 8,9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie obecne eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi procedurami etyki zwierząt Uniwersytetu Queensland (zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Nauk Anatomicznych Uniwersytetu Queensland).

1. Izolacja wysepek

  1. Przygotowanie odczynnika
    1. Mieszanina enzymów
      1. Do trawienia trzustki użyj mieszaniny liberazy i kolagenazy typu IV. Rozcieńczyć liberazę TL (nisko osadzoną termolizynę) w 1 fiolce po 5 mg w 26 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium).
      2. Przygotować kolagenazę typu IV w buforze Hanka o stężeniu 0,5 mg / ml, uzupełnioną 5 mM HEPES, 0,5 mM CaCl2, 0,1 mg / ml DNAzy i 1 mg / ml albuminy surowicy bydlęcej.
      3. Roztwory liberazy TL i kolagenazy zmieszać w stosunku 4:1 (objętościowo), tj. 4 ml liberazy TL + 1 ml kolagenazy. Podwielokrotnić mieszaninę enzymów do objętości 2,5 ml każdy i przechowywać w temperaturze -20 °C.
        UWAGA: Czas inkubacji tkanek różni się nieco między partiami enzymu (różnica od 30 sekund do 1 minuty). W związku z tym może być wymagane przeprowadzenie badania partii.
    2. Nośniki izolacyjne RPMI
      1. Rozpuścić jedną fiolkę proszku RPMI 1640 w 1 l wody o temperaturze pokojowej i uzupełnić 2 g NaHCO3, 4,02 g HEPES.
      2. Połączyć pożywkę izolacyjną RPMI w dużej stożkowej kolbie, wymieszać z mieszadłem magnetycznym, dostosować do pH 7,4 za pomocą NaOH, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Pożywki hodowlane RPMI
    4. Stosować pożywki hodowlane RPMI zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% antybiotyków (tj. penicylina 100 j./ml, streptomycyna 100 μg/ml).
  2. Izolacja i hodowla wysepek
    1. Składanie ofiar ze zwierząt
      1. Składaj ofiary na myszy przez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenieCO2 zgodnie z procedurami etycznymi lokalnej instytucji. Spryskaj korpus myszy dokładnie 70% etanolem.
    2. Perfuzja trzustkowa
      1. Użyj 2 długich nacięć bocznych przez skórę brzucha i otrzewną, aby uzyskać płat w kształcie litery V. Pociągnij płat skóry do góry, aby odsłonić całą jamę brzuszną, odłóż na bok jelito i przytrzymaj wątrobę na miejscu za pomocą złożonej bibuły, aby odsłonić wspólny przewód żółciowy (ryc. 1 i 2). Ustaw zwierzę tak, aby głowa była skierowana w stronę chirurga, a ogon z dala od chirurga.
      2. Założyć zacisk naczyniowy na bańkę na ścianie dwunastnicy, aby zablokować wstrzykiwane enzymy przed dostaniem się do dwunastnicy (ryc. 1).
        UWAGA: Jest to ważny krok, ponieważ określa, czy wstrzyknięte enzymy wejdą do przewodu trzustkowego i przeprowadzą perfuzję trzustki, czy też cofną się do miejsca wstrzyknięcia (za klamrą) lub trafią do dwunastnicy (pod zaciskiem).
      3. Wprowadzić kaniulację przewodu żółciowego wspólnego za pomocą igły 31 G w pobliżu połączenia przewodu wątrobowego wspólnego i przewodu torbielowatego (ryc. 1) i pozostawić miejsce na drugie wstrzyknięcie, jeśli trzustka nie dojdzie do perfuzji za pierwszym razem. Powoli (ponad ~10 sekund) wstrzyknąć około 2 ml mieszaniny zimnych enzymów do przewodu żółciowego wspólnego myszy.
        UWAGA: Trzustka zostanie szybko ukrwiona, jeśli zacisk jest we właściwej pozycji.
      4. Dostosuj pozycję zacisku, jeśli igła znajduje się wewnątrz wspólnego przewodu żółciowego, ale nie może przeniknąć przez trzustkę (tj. przesuń zacisk nieco w górę od wątroby, jeśli jest nadmiernie zaciśnięty, lub przesuń go nieco w dół do wątroby, jeśli jest zaciśnięty).
        UWAGA: Igła czasami wchodzi do otaczającej kapsułki, a nie do światła kanału. Przydatnym znakiem do sprawdzenia, czy igła znajduje się wewnątrz wspólnego przewodu żółciowego, jest rozszerzenie przewodu podczas wstrzykiwania. Jeśli trzustka nie ulega perfuzji, alternatywą jest to, że mieszanina enzymów może zostać wstrzyknięta do wielu miejsc trzustki z oczekiwaną niższą wydajnością. Perfuzja lewej części trzustki (płata śledziony) jest ważna dla maksymalizacji wydajności wysp trzustkowych.
      5. Po perfuzji trzustki należy szybko usunąć trzustkę, umieścić ją w fiolce (~20 ml, szkło) i inkubować przez ~19 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
        UWAGA: Czas inkubacji może się nieco różnić w zależności od odmiany i wieku myszy.
      6. Po czasie inkubacji należy przerwać proces trawienia poprzez dodanie ~20 ml zimnej pożywki izolacyjnej. Delikatnie wstrząsnąć fiolką, aby rozerwać pracę trzustki, a następnie przelać ją przez zwykłe sitko do herbaty (średnica porów 1 mm) do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Uzupełnić probówkę pożywką izolacyjną i wirować przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C z wyłączonym hamulcem.
      7. Ponownie rozpuścić osad w pożywce izolacyjnej i przenieść do dwóch probówek o pojemności 15 ml, a następnie odwirować przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4°C z wyłączonym hamulcem. Po aspiracji supernatantu dobrze wymieszać dwa granulki z 6 ml pożywki do separacji komórek o gradionym gradiencie gęstości (roztwór histopaque 1077) na probówkę, wirując lub pipetując w górę iw dół. Następnie delikatnie dodać ~6 ml pożywki izolacyjnej na bok probówki na wierzchu pożywki do separacji o gradiacji gęstości i odwirować przy 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C z wyłączonym hamulcem.
      8. Zebrać supernatant w górnej (pożywka izolacyjna), środkowej i dolnej (pożywka do separacji komórek z gradientem gęstości) w 3 oddzielnych naczyniach. Ręcznie wybierz wysepki w tych 3 naczyniach za pomocą pipety pod mikroskopem preparacyjnym.
        UWAGA: Środkowa warstwa zawiera większość wysepek. Wysepki są rozpoznawane jako zwarte struktury o wielkości od ~ 50 do 500 μm (ryc. 3). Otrzymujemy ~200 wysepek u myszy WT i 300-<100 wysepek u myszy db/db.
    3. Hodowla wysepek
      1. Aby pomóc wyspom trzustkowym w regeneracji po trawieniu enzymatycznym, należy wyhodować grupy 40 wysepek na 25-centymetrowej szalce Petriego z 6 ml pożywki hodowlanej RPMI (10 mM glukozy) w temperaturze 37 °C, 5% /95% CO2/O2 przez 2 dni przed obrazowaniem 2-fotonów żywych komórek. Codziennie zmieniaj pożywki hodowlane.

2. Obrazowanie 2-fotonowe na żywo komórek

  1. Przygotowanie odczynnika
    1. Bufor zewnątrzkomórkowy
      1. Przygotować bogaty w sód bufor zewnątrzkomórkowy do testu 2-fotonowego ze 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM NaHCO3 i 10 mM HEPES.
    2. Barwnik zewnątrzkomórkowy
      1. Do testu 2-fotonowego przygotować podstawowy SRB 8 mM w buforze zewnątrzkomórkowym, podzielić na porcje do małych probówek i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć podstawowy SRB w stosunku 1:10 w świeżym buforze zewnątrzkomórkowym, aby uzyskać stężenie robocze 0,8 mM.
  2. Obrazowanie fotonowe
    1. Najpierw należy wstępnie inkubować 2-dniowe hodowane wyspy trzustkowe w zewnątrzkomórkowym buforze 3 mM glukozy przez 30 min.
      UWAGA: Używamy wysepek od 2 do 5 dni w hodowli.
    2. Następnie umieść szkiełko szkiełkowe w komorze termoregulacyjnej zamontowanej na stoliku mikroskopu. Użyj smaru, aby zapobiec wyciekaniu roztworu.
    3. Przykryj komorę 500 μl buforu zewnątrzkomórkowego zawierającego 0,8 mM SRB o różnych stężeniach glukozy (3 mM, 6 mM, 15 mM i 20 mM glukozy).
    4. Następnie umieść wstępnie inkubowaną wyspę trzustkową na środku komory i skup się na 3-4 warstwach komórek w wysepce, gdzie u wysepek gryzoni barwienie immunologiczne insuliny pokazuje, że większość komórek to komórki beta.
      UWAGA: SRB szybko obrysuje całą błonę komórkową wyspy trzustkowej, a wyspa jest gotowa do obrazowania.
    5. Użyj mikroskopu 2-fotonowego z obiektywem zanurzeniowym z olejkiem 60X (NA 1.42) i oprogramowaniem do obrazowania (np. ScanImage 11). Rysunek 4 ilustruje typowy układ mikroskopowy. Obrazowanie zdarzeń egzocytarnych przy użyciu SRB jako nieprzepuszczalnego dla błony fluorescencyjnego markera zewnątrzkomórkowego wzbudzonego femtosekundowymi impulsami laserowymi przy 880 nm, z fluorescencją wykrytą przy 550-650 nm. Rejestruj reakcje wysp trzustkowych na stymulację.
    6. Zidentyfikuj pojedyncze zdarzenia egzocytarne na podstawie nagłego pojawienia się małej plamki fluorescencyjnej (rozdzielczość 10 pikseli/μm) i potwierdź przez szybko narastającą fazę sygnału fluorescencyjnego w obszarze zainteresowania (~0,78 μm2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wydajność i oczyszczanie wysp

W przypadku normalnej myszy typu dzikiego oczekuje się uzyskania około 200 wysp. Zdrowe wyspy są jasne, mają okrągły kształt i gładką krawędź. Partia izolacji poddana zbyt silnej trawieniu zwykle zawiera małe i rozmyte wyspy, natomiast partia niedostatecznie strawiona charakteryzuje się mniejszą liczbą wysp oraz obecnością wysp z przytwierdzonymi komórkami acinarnymi (Rycina 3). W przypadku cukrzycowych myszy db/db wydajność i wygląd wysp zależą o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najbardziej krytycznym czynnikiem w izolacji wysp trzustkowych jest początkowa perfuzja trzustki; Niedokrwiona trzustka powoduje znacznie niższy plon wysp trzustkowych. Na jakość izolacji wpływają również inne czynniki, takie jak czas trawienia i poziom wstrząsania, które mogą częściowo zrekompensować poziom perfuzji. Na przykład w pełni perfundowana trzustka będzie musiała być inkubowana w temperaturze 37 °C przez ~18 minut 30 sekund, delikatnie potrząsając, natomiast niedotrawiona trzustka może wymagać ~20 minut trawie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych DP110100642 (dla PT) oraz Granty Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych APP1002520 i APP1059426 (dla PT i HYG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Liberase TL 5 mgRoche-5401020001
Kolagenaza typ IV-1gGibco-Life Technologies17104-019
Histopaque 1077 500 mlSigma Aldrich10771
RPMI 1640 Medium (10x) 1LSigma AldrichR1383do przygotowania podłoża izolacyjnego
RPMI 1640 (1x) 500 mlGibco-Life Technologies21870-076do przygotowania pożywek hodowlanych
Penicylina-Streptomycyna 100 mlGibco-Life Technologies15140-122do przygotowania pożywek hodowlanych 
Surowica bydlęca płodu 500 mlGibco-Life Technologies10099-141do przygotowania pożywki hodowlanej
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco-Life Technologies11966-025do rozcieńczenia liberazy
Program MetamorphDevices, USAdo analizy obrazów 2-fotonowych

Bibliografia

  1. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
  2. Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53, S16-S21 (2004).
  4. Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes. Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).
  5. Wang, Y. W., et al. Spontaneous type 2 diabetic rodent models. Journal of Diabetes Research. , (2013).
  6. Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. Diabetes a new mutation in mouse. Science. 153, 1127-1128 (1966).
  7. Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells. Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).
  8. Low, J. T., et al. Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell. Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).
  9. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297, 1349-1352 (2002).
  10. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).
  11. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model mysi Lepr dbprzygotowanie mieszaniny enzym wwirowanie w gradiencie g sto cimikroskopia dwufotonowatest wydzielania insulinyznakowanie barwnikiem SRBodpowied na stymulacj glukoz

Powiązane artykuły