Method Article

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

DOI:

10.3791/52643

⸱

March 25th, 2015

 ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie, większość badań komórkowych in vitro przeprowadzana jest na sztywnym polistyrenie do hodowli tkankowych (~1 GPa), podczas gdy większość komórek w ciele jest przymocowana do matrycy, która jest elastyczna i znacznie bardziej miękka (0,1 - 100 kPa). Ponieważ takie niedopasowanie sztywności ma duży wpływ na reakcje komórek, istnieje duże zainteresowanie opracowaniem materiałów hydrożelowych, które obejmują szeroki zakres sztywności, aby służyć jako substraty komórkowe. Żele poliakrylamidowe, które są niedrogie i pokrywają zakres sztywności wszystkich tkanek miękkich w ciele, są hydrożelem wybieranym przez wiele grup badawczych. Jednak przygotowanie żelu poliakrylamidowego jest długotrwałe, żmudne i nadaje się tylko do małych partii. W tym miejscu opisujemy test, który dzięki wykorzystaniu trwałej elastycznej folii z tworzywa sztucznego jako strukturalnego podłoża dla żeli, umożliwia przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie płytki wielodołkowej. Technika ta jest szybsza, bardziej wydajna i mniej kosztowna niż obecne metody i pozwala na przygotowanie żeli o niestandardowych rozmiarach, które nie są dostępne w innym przypadku. Ponieważ nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu, metoda może być łatwo przyjęta przez każde laboratorium badawcze i byłaby szczególnie przydatna w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość tkanek w ciele to miękkie, lepkosprężyste materiały o module Younga od 0,1 kPa dla mózgu do 100 kPa dla miękkiej chrząstki, jednak większość badań komórkowych in vitro jest prowadzona na polistyrenie do hodowli tkankowej (TCP), który ma moduł ~1 GPa. 1 To niedopasowanie sztywności ma ogromny wpływ na sposób, w jaki komórki reagują na środowisko. W związku z tym coraz więcej badań poświęconych jest wyjaśnieniu wpływu sztywności substratu na los różnych typów komórek, w tym komórek macierzystych, 2,3. 4 W rezultacie opracowano wiele hydrożeli, które pomagają w zrozumieniu biologii komórki zależnej od sztywności, w tym poliakrylamid (PA),5-7 glikol polietylenowy (PEG),8,9 polidimetylosiloksan (PDMS),10 i alginian. 11 Chociaż dowodów na to, że sztywność substratu ma znaczący wpływ na los komórek, jest coraz więcej, większość badań przeprowadza się na małą skalę z niewielką liczbą próbek. Systematyczne, wielowymiarowe badania wpływu sztywności podłoża na szereg typów komórek lub warunków środowiskowych są rzadkie. 12

Opracowano kilka obiecujących technologii hydrożelowych o wysokiej przepustowości, w tym mikromacierze oparte na PEG,13 urządzenia mikroprzepływowe do produkcji mikrokulek hydrożelu agarozowego,14 lub mikro i nano-pręty, gdzie sztywność jest modulowana przez średnicę i wysokość mikroprętów. 15 Technologie przygotowania takich substratów są jednak zaawansowane i dostępne dla ograniczonej liczby laboratoriów. Wiele badań dotyczących odpowiedzi komórkowych modulowanych sztywnością wykorzystuje żele poliakryloamidowe (PA), które są nie tylko niedrogie i proste w wdrożeniu, ale także wykazują fizjologicznie istotny zakres modułu Younga, a mianowicie 0,3 – 300 kPa. 16-22 Jednak istniejące metody wytwarzania żeli PA do hodowli komórkowych są pracochłonne i w związku z tym przygotowywane w małych partiach. Niektóre trudności związane z przygotowaniem żeli PA jako substratów komórkowych wynikają z wymogu, że żele muszą być przygotowane: 1) przy braku tlenu, aby umożliwić pełną polimeryzację, 2) z płaską i gładką powierzchnią, aby umożliwić równomierne przyleganie i rozprzestrzenianie się komórek, oraz 3) trwale przymocowane do dna naczynia do hodowli komórkowej, aby zapobiec unoszeniu się na wodzie.

Kilka grup próbowało wyprodukować żele PA do hodowli komórkowych w dużych partiach. Semler i wsp. przygotowali grube arkusze żeli PA, które następnie zostały "pocięte" dziurkaczem i umieszczone w 96-dołkowych płytkach. 23 Metoda ta ogranicza się jednak do sztywniejszych żeli, tj. > 1 kPa w module Younga, ponieważ bardziej miękkie żele są "lepkie", trudne do cięcia i łatwo ulegają uszkodzeniu. Mih i wsp. opracowali bardziej wyrafinowaną technikę, która pozwala na bezpośrednią polimeryzację żeli w płytce wielodołkowej ze szklanym dnem. 6 Osiągnięto to poprzez wlanie roztworów żelu do funkcjonalizowanych płytek ze szklanym dnem i uformowanie żeli poprzez "przekładanie" ich za pomocą niestandardowego zestawu szkła nakrywkowego. 6 Mimo że technika ta była bardzo obiecująca, nadal obserwowano niewielkie efekty krawędzi. Ponadto technika ta wymaga specjalnie zaprojektowanej matrycy, która nie jest natychmiast dostępna dla wielu laboratoriów, a także kosztownych płytek wielodołkowych ze szklanym dnem.

Ten artykuł opisuje prosty i tani sposób montażu żeli PA w wielodołkowej płytce, który może być łatwo przyjęty przez każde laboratorium. W tym przypadku stosuje się elastyczny plastikowy wspornik, który ma dwie strony - hydrofobową, która jest odpychająca dla żeli PA, i hydrofilową, która kowalencyjnie wiąże żel PA podczas osadzania. Po osadzeniu arkuszy żelu PA i trwałym przymocowaniu ich do elastycznego wspornika z tworzywa sztucznego, umożliwia to przenoszenie żeli o dowolnej grubości i sztywności oraz cięcie ich na dowolny pożądany kształt. Takie podejście nie tylko pozwala na produkcję niestandardowych szkiełek nakrywkowych z tworzywa sztucznego w rozmiarach niedostępnych na rynku, ale także eliminuje konieczność wstępnej obróbki powierzchni szklanych, zarówno szklanych szkiełek nakrywkowych, jak i studzienek kosztownych płytek wielodołkowych ze szklanym dnem, za pomocą roztworu wiążącego PA, co jest żmudnym i czasochłonnym krokiem. Wreszcie, jednolite arkusze żeli PA można przygotowywać w dużych partiach i przechowywać w stanie odwodnionym przez kilka miesięcy.

Podsumowując, przedstawiony tutaj test jest ulepszeniem w stosunku do istniejących metod w kilku aspektach. Po pierwsze, proces montażu płyt wielodołkowych jest wydajny, a całkowity koszt wymaganych materiałów jest niski. Po drugie, hydrożele są produkowane w dużych partiach w jednej jednorodnej warstwie żelu. Wreszcie, wymagane są tylko materiały, które są dostępne na rynku. Użyteczność testu zilustrowano poprzez zbadanie wpływu sztywności substratu na morfologię komórek i obszar rozprzestrzeniania się.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów i porcji związanych z hydrożelem

  1. Przygotowanie roztworu prekursora żelu poliakrylamidowego.
    1. Przygotować roztwór prekursora żelu poliakrylamidowego, mieszając akryloamid (A) (40% w/v, Mr 71,08 g/mol), sieciujący bisakryloamid (B) (2% w/v, Mr 154,17 g/mol) i wodę dejonizowaną w procentach objętościowych określonych w tabeli 1.
      UWAGA: Roztwory te można przygotowywać w dużych partiach i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do kilku miesięcy.
      1. UWAGA: Akrylamid jest toksyczny po inhalacji lub spożyciu, szczególnie w postaci proszku: dlatego najlepiej stosować 40% w/v roztworu, aby zmniejszyć ryzyko toksyczności. Używaj tylko w odzieży ochronnej, takiej jak rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny. Przechowywać w światłoszczelnie zamkniętym pojemniku w lodówce (<23 °C, dobrze wentylowane miejsce).
      2. UWAGA: Bis-akrylamid jest toksyczny po inhalacji lub spożyciu, szczególnie w postaci proszku: dlatego najlepiej stosować 2% roztwór w/v, aby zmniejszyć ryzyko toksyczności. Używaj tylko w odzieży ochronnej, takiej jak rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny. Przechowywać w światłoszczelnie zamkniętym pojemniku w lodówce (<4 °C, dobrze wentylowane miejsce).
  2. Przygotowanie i stosowanie podwielokrotności heksanianu N-sulfosuccinimidylo-6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino) (Sulfo-SANPAH, Mr 492,40 g/mol). UWAGA: Sulfo-SANPAH powoduje poważne podrażnienie oczu; Obchodź się w rękawiczkach i odpowiedniej ochronie oczu lub twarzy. Przechowywać w temperaturze -20 °C po otrzymaniu i przed porcjowaniem.
    1. Przechowywanie sulfo-SANPAH: rozpuścić Sulfo-SANPAH w dimetylosulfosanach (DMSO) w stężeniu 50 mg/ml. Podwielokrotność roztworu podstawowego rozdzielić na 50 mikroprobówek wirówkowych po 20 μl na probówkę. Błyskawiczne zamrażanie na suchym lodzie lub w ciekłym azocie (opcjonalny, ale preferowany krok w celu zachowania maksymalnej wydajności środka sieciującego) i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Podwielokrotności mogą być przechowywane przez kilka miesięcy.
    2. Aby użyć sulfo-SANPAH: krótko rozmrozić podwielokrotność i rozcieńczyć w 480 μl wody dejonizowanej. Zużyć natychmiast. Sulfo-SANPAH szybko hydrolizuje w wodzie: dlatego należy zachować ostrożność, aby szybko wykonać wszystkie powyższe kroki.
  3. Przygotowanie nadsiarczanu amonu (Mr 228,18 g/mol) podwielokrotności.
    UWAGA: Nadsiarczan amonu powoduje podrażnienie oczu, skóry i dróg oddechowych. Podczas obchodzenia się z produktem należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Z nadsiarczanem amonu w proszku należy obchodzić się z wyciągiem chemicznym. Proszek należy przechowywać w suchym, dobrze wentylowanym miejscu. Po podtrzymaniu rozcieńczony roztwór można stosować na stole roboczym.
    1. Rozpuścić nadsiarczan amonu w wodzie dejonizowanej, aby osiągnąć końcowe stężenie nadsiarczanu amonu wynoszące 10% w/v. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić bezpośrednio przed użyciem.
  4. Przygotowanie roztworu kolagenu typu I.
    1. Przygotować 0,2 mg/ml roztworu kolagenu, rozcieńczając roztwór podstawowy w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,4. Przechowywać na lodzie przez krótki czas lub zużyć natychmiast po rozcieńczeniu.

2. Przygotowanie hydrożelu (patrz Rysunek 1)

  1. Przygotowanie szkiełek hydrofobowych.
    1. Umieść kilka kropli roztworu hydrofobowego na szklanej płytce i za pomocą bibuły rozprowadź po powierzchni. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu i ponownie przetrzyj chusteczką, aby wyrównać powłokę hydrofobową.
      UWAGA: Roztwór hydrofobowy należy przechowywać w łatwopalnej szafce w temperaturze pokojowej. Podczas obsługi należy stosować środki ochrony osobistej. Pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
  2. Przygotowanie elastycznego podłoża z tworzywa sztucznego.
    1. Przytnij elastyczną plastikową podpórkę, aby dopasować ją do rozmiaru szklanej płyty pokrytej hydrofobem.
    2. Zaznacz hydrofobową stronę elastycznego plastikowego wspornika, lekko rysując powierzchnię ostrym narzędziem, takim jak skalpel.
      UWAGA: Gdy żel — który jest w pełni przezroczysty — wyschnie, ślady zadrapań pomogą odróżnić, która elastyczna strona z tworzywa sztucznego zawiera żel.
      UWAGA: Elastyczny wspornik z tworzywa sztucznego ma stronę hydrofobową i hydrofilową. Po osadzeniu poliakrylamid trwale przylega do hydrofilowej strony plastikowego podłoża, co ułatwia późniejszą obsługę hydrożelu.
  3. Preparat żelowy (przykładowe objętości podano dla 5 ml żelowych roztworów prekursorowych).
    UWAGA: 5 ml wystarczyłoby do wyprodukowania ~40 żeli, gdy początkowa grubość żelu wynosi 0,5 mm. Można wyprodukować więcej żeli, jeśli grubość żelu zostanie zmniejszona.
    1. Umieścić 4972,5 μl roztworu prekursora poliakryloamidu o pożądanym stężeniu końcowym (tabela 1) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umieścić w komorze odgazowującej na 30 minut z otwartą nakrętką.
      UWAGA: Tlen działa jak pułapka na wolne rodniki, a gdy jest obecny, hamuje polimeryzację.
    2. Dodać 25 μl 10% w/v nadsiarczanu amonu (patrz punkt 1.3), aby uzyskać końcowe stężenie nadsiarczanu amonu wynoszące 0,05%.
    3. Dodać 2,5 μl N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED, Mr 116,24 g/mol) do odgazowanego roztworu żelu, aby uzyskać końcowe stężenie TEMED 0,5%.
      UWAGA: Przechowuj TEMED w łatwopalnej szafce w RT. Trzymaj w okapie oparów chemicznych podczas noszenia odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej. Przechowywać szczelnie zamknięte w gazie obojętnym, ponieważ jest on bardzo wrażliwy na powietrze i wilgoć.
    4. Delikatnie wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół 3 – 5 razy. Nie należy wirować, aby uniknąć dyfuzji tlenu do roztworu prekursora żelu.
    5. Odpipetuj roztwór żelu na hydrofilową stronę elastycznego plastikowego wspornika i umieść na kanapce szkiełko z hydrofobową powłoką. Oddziel obie prowadnice silikonowymi przekładkami o żądanej grubości (np. 0,5 mm). Pozostawić niewielką ilość (~100 μl) roztworu prekursora polimerowego w stożkowej probówce o pojemności 50 ml do wykorzystania jako wskaźnik żelowania.
      UWAGA: Można użyć dowolnej podkładki dystansowej. Na przykład pojedynczy pasek Parafilmu daje końcową grubość spęczniejącego żelu 100 – 120 μm.
    6. Umieść kolejną szklaną płytkę na elastycznym plastikowym wsporniku/kanapce żelowej, aby upewnić się, że po polimeryzacji powierzchnia hydrożelu jest równa.
    7. Pozwól żelowi polimeryzować przez 45 minut, chociaż w razie potrzeby można użyć krótszego czasu w przypadku żeli o wyższej % wag. Aby upewnić się, że żel uległ polimeryzacji, należy obserwować pozostały roztwór w stożkowej probówce o pojemności 50 ml; Jeśli pozostały roztwór zżelował się, prawdopodobnie zainicjowano również żelowanie na szklanej płytce. Należy jednak pamiętać, że przedwczesne otwarcie formy zapobiegnie całkowitej polimeryzacji.
    8. Po uformowaniu żelu zdejmij elastyczną plastikową podpórkę z kowalencyjnie przymocowanym żelem poliakrylamidowym na wierzchu i ustaw żelową stroną do góry do wyschnięcia na powietrzu.
      UWAGA: Konwekcja lub suszenie termiczne mogą być również użyte do przyspieszenia tego etapu. Po wyschnięciu na elastycznym plastikowym wsporniku żel można przechowywać w nieskończoność.
      1. Zaznacz wszelkie odsłonięte miejsca elastycznego plastikowego wspornika, w których żele poliakrylamidowe nie utworzyły się z powodu pęcherzyków. Zaznacz, kiedy żel jest nadal nawilżony, ponieważ po wyschnięciu żelu wtopi się on w elastyczną plastikową podpórkę.

3. Montaż płytek wielodołkowych, powlekanie kolagenem i sterylizacja

  1. Montaż płytek wielodołkowych.
    1. Po wysuszeniu pokrój żele PA w pożądane kształty.
      1. W przypadku płytki 96-dołkowej użyj wytrzymałego dziurkacza o średnicy ~6 mm. Użyj wytrzymałego noża do papieru, aby pokroić żele w kwadratowe lub prostokątne kształty. Alternatywnie użyj nożyczek.
    2. Przygotować około 500 μl PDMS na płytkę 96-dołkową zgodnie z instrukcjami producenta. Aby przykleić żele do dna płytki wielodołkowej, umieść małą kropelkę (~5 μl) polidimetylosiloksanu (PDMS) na środku każdej studzienki. Za pomocą kleszczy umieść jeden żel poliakryloamidowy w każdym dołku, elastyczną plastikową podporą do dołu. Aby PDMS mógł się utwardzić, należy pozostawić zmontowaną płytkę w temperaturze 37 °C na co najmniej 4 godziny.
  2. Powłoka kolagenowa żeli poliakrylamidowych.
    1. Za pomocą pipety transferowej umieścić niewielką ilość (7 – 8 μl) sulfo-SANPAH (patrz pkt 1.2.2) w każdym dołku i obracać z boku na bok, aby równomiernie pokryć powierzchnię żelu. Pracuj szybko, ponieważ sulfo-SANPAH nie jest stabilny w wodzie.
    2. Umieścić płytkę studzienkową pod lampą UV o wysokiej intensywności (intensywność = 37 mW, λ = 302 – 365 nm) na 5 minut. Spłucz żele PBS, aby usunąć nadmiar sulfo-SANPAH.
    3. Pobrać pipetą 50 μl 0,2 mg/ml roztworu kolagenu typu I (patrz punkt 1.4) do każdego dołka. Pozostawić płytkę przykrytą w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny lub O/N w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Aby przyspieszyć proces powlekania kolagenu, do dodania roztworu kolagenu można użyć pipety transferowej. Zazwyczaj 1 – 2 kropelki roztworu powinny wystarczyć, aby całkowicie pokryć powierzchnię żelu.
    4. Pozostaw płytkę studzienki w temperaturze pokojowej na co najmniej 2 godziny, aby umożliwić wiązanie kolagenu.
    5. Spłukać PBS w celu usunięcia nadmiaru roztworu kolagenu i sterylizować w promieniowaniu UV (λ = 200 nm) w kapturze do hodowli tkankowych przez 2 godziny.
    6. Namoczyć żele w kompletnym podłożu (patrz sekcja 4.1 w celu uzyskania informacji o składzie podłoża) O/N w celu uwodnienia i zrównoważenia. Stosować do wysiewu komórek od razu lub przechowywać w lodówce do 2 dni.

4. Wysiewanie komórek na próbie sztywności PA

UWAGA: Chociaż typowy dla popularnych linii komórkowych ssaków, protokół opisany w tej sekcji jest szczególnie stosowany w przypadku linii komórkowej MDA-MB-231 raka piersi (zobacz Rysunki 4 i 5).

  1. Zebrać komórki z kolby do hodowli tkankowej przez wystawienie na działanie 5% trypsyny/EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Użyć ~80 μl trypsyny/EDTA na każdycm2 powierzchni kolby hodowlanej; na przykład użyć 2 ml trypsyny/EDTA dla kolby do hodowli komórek T25. Ponownie zawiesić pobrane komórki w kompletnym pożywce uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny w pożądanym końcowym stężeniu komórek. Biorąc pod uwagę czas podwajania komórek, a także czas, w którym komórki będą wysiewane w teście, wybierz odpowiednie stężenie komórek sub-konfluentnych. Upewnij się, że dodane podłoże jest wystarczające do całkowitego zanurzenia hydrożeli.
    UWAGA: Ponieważ hydrożele zostały wstępnie zrównoważone w pożywkach (patrz krok 3.2.6), objętość 100 μl powinna być wystarczająca. Typowe objętości podłoża stosowane w przypadku płytek wielodołkowych powinny być wystarczające, ponieważ żele zostały wstępnie zrównoważone w pożywkach w poprzednim kroku.
    UWAGA: Test byłby odpowiedni dla każdego typu komórek zależnych od przyłączenia.
    1. Policz liczbę komórek pod odwróconym mikroskopem za pomocą hemacytometru. Załadować 10 μl zawiesiny komórek do każdego portu hemacytometru i uśrednić liczbę komórek z co najmniej 8 kwadrantów. Aby uzyskać końcowe stężenie komórek, pomnóż liczbę komórek przez 104.
      UWAGA: Najlepsze wyniki zliczania komórek uzyskuje się, gdy liczba komórek w każdym kwadrancie hemacytometru wynosi 20 – 50.
  2. Wyhodować komórki w teście sztywności PA w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj media co 2 – 3 dni. W razie potrzeby zebrać komórki, wystawiając je na działanie 5% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Użyć ~80 μl trypsyny/EDTA nacm2 kolby do hodowli tkankowej. Podczas wszystkich etapów manipulacji komórkami należy zachować szczególną ostrożność, aby nie naruszyć powierzchni hydrożelu: odsysać lub pipetować pożywkę, lekko przechylając płytkę wielodołkową na boki i dotykając końcówką pipety bocznej ścianki każdej studzienki, w przeciwieństwie do dotykania hydrożelu.
    UWAGA: Z wyjątkiem zachowania szczególnej ostrożności, aby nie uszkodzić powierzchni hydrożelu podczas standardowego obchodzenia się z kulturą tkankową, komórkami wysianymi na próbie sztywności można manipulować w taki sam sposób, jak gdyby zostały wysiane na zwykłej płytce wielodołkowej.

5. Obrazowanie komórek wysianych na próbie sztywności PA

  1. Obrazy komórek bezpośrednio w teście sztywności PA.
    UWAGA: Do obrazowania komórek można użyć dowolnego mikroskopu — odwróconego, fluorescencyjnego lub konfokalnego.
    UWAGA: Elastyczny plastikowy wspornik użyty do skonstruowania testu sztywności jest w pełni przezroczysty i nie ulega autofluorescencji ani nie zakłóca obrazowania komórek. Jednak nawet jeśli samo elastyczne podłoże z tworzywa sztucznego jest przezroczyste, możliwości obrazowania będą ograniczone przez odległość roboczą obiektywu. Elastyczny wspornik z tworzywa sztucznego ma grubość 0,23 mm, a typowa odległość robocza obiektywu 10X wynosi ~4 mm, gwałtownie zmniejszając się w przypadku większych powiększeń.
    1. W przypadku obrazowania żywych komórek umieść test sztywności PA w uchwycie płytki mikroskopu i obrazie. Utrzymuj sesje obrazowania poniżej 2 godzin lub użyj mikroskopu wyposażonego w komorę środowiskową, aby wydłużyć czas obrazowania.
    2. Gdy obrazowanie żywych komórek nie jest celem, utrwal komórki w 4% roztworze formaldehydu uzupełnionym 0,1% detergentem. Namocz komórki w utrwalaczu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny. Dwukrotnie spłukać PBS. Odpady utrwalające należy wyrzucać do wyznaczonego pojemnika na odpady.
      UWAGA: Komórki mogą być natychmiast obrazowane lub przechowywane zanurzone w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny przy wdychaniu i kontakcie. Obsługiwać w rękawicach w dygestoriach chemicznych.
      UWAGA: Protokół utrwalania komórek musi być wybrany na podstawie kolejnych protokołów barwienia i obchodzenia się z komórkami, ponieważ niektóre utrwalacze uszkadzają niektóre białka komórkowe.
    3. W przypadku obrazowania fluorescencyjnego należy wybarwić utrwalone komórki pożądanym barwnikiem komórkowym bezpośrednio w płytce wielodołkowej. Obraz natychmiast.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hydrożele poliakryloamidowe (PA) są szeroko stosowane do testowania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności. 17,24 Mieszając różne stężenia akrylamidu (A) i bis-akrylamidu (B), można uzyskać żele PA, które obejmują zakres sztywności większości tkanek miękkich w ciele — 0,3 – 300 kPa modułu Younga. 1 Przygotowanie żeli poliakrylamidowych jest jednak żmudne i czasochłonne, co często ogranicza ich przydatność w zastosowaniach "wysokoprzepustowych", takich jak np. badania przesiewowe leków. 12

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żele poliakrylamidowe, pierwotnie opracowane do elektroforezy,28 są obecnie rutynowo stosowane jako substraty do hodowli komórkowych do badania wpływu sztywności substratu na morfologię, ruchliwość i komunikację komórek3,24,29 wśród innych cech komórek. Poliakryloamid umożliwia manipulowanie sztywnością podłoża w celu objęcia sztywności wszystkich tkanek miękkich w ciele (0,3 – 300 kPa)1 przy prostej zmianie stężenia prekursora polimeru (Rysunek 2, Tabela 1, patrz również...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z funduszy startowych dostarczonych dr Silviya Zustiak przez Saint Louis University, jak również z grantu President's Research Fund (PRF) przyznanego dr Silviya Zustiak przez Saint Louis University. Dziękujemy Naveedowi Ahmedowi i Kevalowi Shahowi za pomoc techniczną.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reodczynniki
40% AkrylamidBio-Rad161-0140
2% Bis-akrylamidBio-Rad161-0142
Nadsiarczan amonuBio-Rad161-07000
TEMEDSigma AldrichT9281
Sulfo-SANPAHThermo Scientific22589
Kolagen typu 1, z ogona szczura, 3,68 mg/mlBD Biosciences354236
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher ScientificBP231-100
Roztwór hydrofobowy — Odpychaj silanGE Healthcare Bio-Sciences17-1332-01
PBS (1x), pH 7,4HyCloneSH30256,01
Polidimehylsiloxane (PDMS) [Zestaw elastomerów Slygard 182]Kleje Elsworth3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)Sigma Aldrich44174
RPMI-1640 Średni (1x)HyCloneSH30027-02
Płodowa surowica bydlęcaHyklonSH30073-03
Penicylina StreptomycynaMP Biomedicals1670046
Detergent: Triton-XSigma AldrichT8787
Formaldehyd 37% roztwórSigma AldrichF1635
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA2153
Zestaw blokujący adhezję komórek na bazie BSA — Zestaw macierzy adhezyjnej komórek ECMChemicon InternationalECM540
Jednorazowy sprzęt laboratoryjny
elastyczny plastikowy wspornik — Folia GelBond PAG do żeli poliakrylamidowychGE Healthcare Bio-Sciences309819
Płytki szklaneSlumpysGBS4100SFSL
50 ml Probówki stożkoweFisher Scientific 3181345107
15 ml Probówki stożkoweFALCON352097
Mikro wirówkiFisher Scientific2 ml: 02681258
płytka 96-dołkowa (płaskie dno)Pipety jednorazowe Fisher Scientific12565501
(1  ml, 2  ml, 5  ml, 10  ml, 25  ml, 50  ml)Fisher Scientific1 ml: 13-678-11B, 2  ml: 05214038, 5  ml (FALCON): 357529, 10  ml: 13-678-11E, 25  Ml : 13-678-11, 50  ml: 13-678-11F
Szklane pipety transferoweFisher Scientific5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Końcówki do pipet (1-200  μ L, 101-1000  μ l)Fisher Scientific 2707509
Plastikowe standardowe jednorazowe pipety transferoweFisher Scientific13-711-9D
ParafilmPARAFILM PM992
Bezpudrowe rękawice diagnostyczneQuest92897
Silikonowe przekładki — Arkusz silikonowy o grubości 0,5 mm / 13 cm x 18 cmGrace Bio-LabsJTR-S-0,5
duży/niejednorazowy sprzęt laboratoryjny
Mikroskop świetlny i fluorescencyjny (Axiovert 200M)Oprogramowanie do mikroskopów Zeiss3820005619
Piec UV ZeissAxioVision Rel. 4.8.2
UVITRONUV1080
Komora próżniowa/odgazowywaczBelArt999320237
Pompa próżniowa do odgazowywaczaKNF Lab5097482
Okap do hodowli tkankowychNUAIRENU-425-600
Wyciąg chemicznyKEWAUNEE99151
Mikroskop odwrócony (Axiovert 25)Inkubator Zeiss663526
NUAIRENU-8500
Pomoc do pipetDrummond Scientific Co.P-76864
HemacytometrJasna Linia383684

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
  2. Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  5. Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
  6. Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929(2011).
  7. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107(2012).
  8. Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
  9. Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
  10. Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
  11. Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
  12. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905(2010).
  13. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  14. Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
  15. Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
  16. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  17. Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
  18. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  19. Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  20. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  21. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  22. Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
  23. Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
  24. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  25. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
  26. Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
  27. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  28. Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918(2010).
  30. Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
  31. Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
  32. Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
  33. Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
  34. Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
  35. Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
  36. Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).
  37. Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polyacrylamide Gel PreparationMultiwell Plate FormatStiffness dependent Cell ResponsesHydrogel Substrate PreparationFlexible Plastic SupportGel Polymerization ProcessCollagen Coating ApplicationCell Morphology AnalysisYoung s Modulus MeasurementMicroscopy Imaging Techniques

Related Articles