Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Summary

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Abstract

Podczas rozwoju serca, generowanie specyficznych dla mięśnia sercowego jednostek strukturalnych i funkcjonalnych, w tym sarkomerów, kurczliwych miofibryli, interkalowanych krążków i kostamerów, wymaga skoordynowanego montażu wielu komponentów w czasie i przestrzeni. Zakłócenia w montażu tych elementów prowadzą do rozwojowych wad serca. Techniki barwienia immunofluorescencyjnego są powszechnie stosowane w hodowanych kardiomiocytach w celu zbadania dojrzewania miofibryli, ale to podejście ex vivo jest ograniczone przez stopień, w jakim miocyty będą się w pełni różnicować w hodowli, brak normalnych danych mechanicznych in vivo i brak wskazówek wsierdziowych. Zastosowanie technik immunofluorescencyjnych do badania rozwijającego się serca myszy jest pożądane, ale stanowi większe wyzwanie techniczne, a metodom często brakuje wystarczającej czułości i rozdzielczości, aby uwidocznić sarkomery we wczesnych stadiach rozwoju serca. W tym miejscu opisujemy solidną i powtarzalną metodę wspólnego barwienia immunologicznego wielu białek lub wspólnej wizualizacji białka fluorescencyjnego z barwieniem immunofluorescencyjnym w embrionalnym sercu myszy i używamy tej metody do analizy rozwijających się miofibryli, interkalowanych krążków i kostarów. Metoda ta może być dalej stosowana do oceny zmian strukturalnych kardiomiocytów spowodowanych mutacjami prowadzącymi do rozwojowych wad serca.

Introduction

Podczas rozwoju, skurcze serca zaczynają się wkrótce po tym, jak kardiomiocyty migrują do linii środkowej i tworzą liniową rurkę serca^1,2. Sarkomer jest podstawową jednostką kurczliwą w kardiomiocycie; ta wysoce zorganizowana struktura cytoszkieletu zawiera włókna aktyny zakotwiczone w dysku Z przez sarkomeryczne α-aktyninę (s-α-aktynina) i włókna miozyny zakotwiczone w linii M (ryc. 1). W miarę dojrzewania kardiomiocytów sarkomery łączą się w szeregi, tworząc miofibryle, które rozciągają się w poprzek komórki. Miofibryle są zakotwiczone na końcach kardiomiocytów przez interkalowany dysk, strukturę połączenia komórka-komórka, która zawiera przejściowe połączenie z podzbiorem elementów Z-dysku, takich jak s-α-aktynina³, adhereny białka połączeniowe, takie jak N-kadheryna i β katenina, białka połączeń szczelinowych i desmosomy (ryc. 1)⁴. Wzdłuż błony podłużnej krążki Z miofibryli obwodowych również przyczepiają się do błony komórkowej za pośrednictwem kostamerów; te wyspecjalizowane zrosty ogniskowe zapewniają kotwicę między miofibrylem, błoną plazmatyczną i macierzą zewnątrzkomórkową, aby zapewnić dodatkowe wsparcie strukturalne kardiomiocytów (ryc. 1)⁴. Na wczesnym etapie rozwoju serca kardiomiocyty są ułożone w przypominające palce wypustki zwane beleczkami, które wystają do przestrzeni komorowej i zawierają stosunkowo dojrzałe miofibryle⁵. W miarę rozwoju serca kardiomiocyty w okolicy podnasierdziowej namnażają się, tworząc zwarty mięsień sercowy, który obejmuje ściany komór, ale montaż sarkomeru i miofibrylu jest opóźniony w porównaniu z mięśniem bocznym^{beleczkowym 5,6}.

Modele składania sarkomeru i miofibryli pochodzą głównie z badań immunofluorescencyjnych na hodowanych kardiomiocytach^7-10, które są proste, ale brakuje im trójwymiarowego środowiska, przepływu krwi i kontaktów z innymi komórkami serca obecnymi in vivo. Badania strukturalne o wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne, a niewiele badań dotyczyło pojawiania się interkalowanych dysków i kostamerów podczas rozwoju serca myszy. Wydaje się, że białko połączenia adherens β katenina lokalizuje się w interkalowanych krążkach do dnia embrionalnego (E) 17,5¹¹, N-kadheryna lokalizuje się w strukturach liniowych, które mogą reprezentować interkalowane dyski przez E18,5¹² w porównaniu z dniem pourodzeniowym 0¹³, a kostamery zostały wykryte w E18,5¹⁴, ale białka te wykazują rozproszoną i bardziej ciągłą dystrybucję błony we wcześniejszych punktach czasowych^{rozwoju 11-13}.

Tutaj opisujemy prostą i powtarzalną metodę barwienia immunologicznego i mikroskopii fluorescencyjnej pociętych na sekcje embrionalnych serc myszy, która pozwala na szczegółową analizę rozwoju miofibryli i kardiomiocytów, w tym pojawienie się interkalowanych krążków już w E12.5 i powstających kostamerów w E16.5. Protokół ten może być przydatny do badania wpływu mutacji na tworzenie sarkomerów, a także dojrzewanie miofibryli i kardiomiocytów.

Protocol

UWAGA: Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UCSF.

1. Kriokonserwacja i utrwalanie embrionalnych serc myszy.

1.1) Błyskawiczne zamrażanie embrionalnych serc

1. Napełnij szalkę Petriego o średnicy 3.5 cm i krioformy o średnicy 7 mm pożywką o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (patrz tabela materiałów). W kapturze chemicznym schłodzić 2-metylobutan w ciekłym azocie.
2. Rozlej 30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 10 cm szalki Petriego, 10 ml PBS na 3,5 cm szalki Petriego i umieść wszystkie szalki Petriego na lodzie. Przygotuj jedno naczynie o średnicy 10 cm i kilka naczyń o średnicy 3,5 cm na jedną ciężarną myszkę.
3. Wyizoluj zarodki zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁵, wykonując sekcję w lodowatym PBS.
4. Krótko mówiąc, poddaj ciężarną kobietę eutanazji za pomocą narkozy CO₂ i zwichnięcia szyjki macicy.
   1. Wykonaj nacięcie w jamie brzusznej, wypreparuj macicę, przecinając naczynia wzdłuż wewnętrznej krzywizny macicy i przenieś macicę na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą lodowaty PBS.
   2. Przeciąć macicę pomiędzy każdym zarodkiem i przenieść na pojedynczą szalkę Petriego o średnicy 3,5 cm, zawierającą lodowaty PBS. Izolować każdy zarodek zgodnie z opisem¹⁵.
   3. Otwórz jamę osierdzia za pomocą cienkich kleszczy, usuń serce z płuc i naczyń krwionośnych, przecinając aortę, żyłę główną dolną i żyły płucne, a następnie przenieś na 3,5 cm szalkę Petriego zawierającą OCT.
   4. Pozwól sercu zrównoważyć się w OCT przez kilka sekund, a następnie przenieś serce do 7-milimetrowej formy zawierającej OCT. Skieruj przednią ścianę serca na dno formy.
5. Delikatnie umieść formę w 2-metylobutanie chłodzonym ciekłym azotem. Uważaj, aby ciecz 2-metylobutanu nie dotknęła OCT lub serca. Zamrozić, aż OCT stanie się jednolicie biały, a następnie przenieś formę do wiadra z lodem zawierającego suchy lód. Przejdź do następnego zarodka.
6. Zawiń krioformy w folię i przechowuj w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kriosekcji.

1.2) Alternatywa: utrwalanie paraformaldehydu (PFA), krioprotekcja i OCT osadzanie embrionalnych serc

1. Napełnij dołki 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej 4% PFA w 1x PBS.
2. Wyciąć serca embrionalne zgodnie z opisem w ppkt 1.1.3. Umieścić każde serce w studzience zawierającej 4% PFA i utrwalić w temperaturze 4 °C O/N.
3. Krioochrona: za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieść każde serce do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1,5 ml 15% sacharozy w PBS i delikatnie mieszać w temperaturze 4 °C, aż serce opadnie na dno probówki (kilka godzin do O/N). Przenieść każde serce do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1,5 ml 30% sacharozy w PBS i ponownie delikatnie mieszać w temperaturze 4 °C, aż serce opadnie na dno probówki (kilka godzin do O/N).
4. Za pomocą plastikowej pipety transferowej umieść kriochronione serce w OCT i pozwól mu się zrównoważyć przez kilka minut, aby usunąć nadmiar sacharozy, a następnie przenieś serce do formy o średnicy 7 mm zawierającej OCT. Ustaw przednią ścianę serca na dnie formy.
5. Zamroź serce w OCT, umieszczając formę w 2-metylobutanie chłodzonym ciekłym azotem lub suchym lodzie.
6. Zawiń krioformy w folię i przechowuj w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kriosekcji.

2. Kriosekcja

1. Ustawić temperaturę kriostatu na -17 °C.
2. Umieścić krioformy w komorze kriostatu i wyrównać do temperatury przez 15-20 minut.
3. Odwróć kriomold i delikatnie dociśnij, aby usunąć blok serca z formy. Zorientuj przednią ścianę serca na szczycie uformowanego bloku tkanki.
4. Umieść dużą kroplę OCT na uchwycie i zamontuj blok serca na kropli OCT, aby zamrozić się na uchwycie. Utrzymuj orientację tak, aby przednia ściana serca znajdowała się najdalej od uchwytu.
5. Załaduj uchwyt i zamontowany blok serca na uchwyt kriostatu. Wyreguluj tak, aby kąt ostrza wynosił 3-5° w stosunku do próbki.
6. Pobrać skrawki 10 μm na szkiełka mikroskopowe, które zostały wstępnie pokryte dodatnio naładowaną powłoką (patrz tabela materiałów). Pozostawić do całkowitego wyschnięcia przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.

3. Immunofluorescencja

1. W przypadku skrawków zamrożonych należy utrwalić i przepuszczalnie tkankę w acetonie przez 10 minut w dygestorium w temperaturze pokojowej.
2. W przypadku sekcji zatrzaskowych i utrwalonych PFA, inkubować w PBS-0,1% Triton X-100 przez 20 minut w celu usunięcia OCT i przepuszczalności skrawków utrwalonych PFA.
3. Blokuj przez 45 minut w 1x bufor blokujący, rozcieńczony w PBS.
4. Jeśli używasz pierwszorzędowego przeciwciała wytworzonego u myszy, inkubuj w ośle lub kozie anty-mysim fragmencie IgG (H + L) monowalentnym fragmencie Fab rozcieńczonym 1:100 w PBS-0,1% Tween 20 przez 45 minut w RT (patrz Dyskusja).
5. Inkubować w pierwszorzędowym przeciwciałie lub przeciwciałach rozcieńczonych w 1x buforze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C (patrz Tabela materiałów/urządzeń dla specyficznych rozcieńczeń).
6. Umyj sekcje w 1x PBS trzy razy przez 10 minut w RT.
7. Inkubować w Alexa Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluorem rozcieńczone w stosunku 1:500 w buforze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, chronione przed światłem.
8. Umyj sekcje w 1x PBS trzy razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
9. Opcjonalnie: Inkubować w barwniku Hoechst rozcieńczonym w stosunku 1:2 000 w PBS w temperaturze pokojowej (chronionej przed światłem) w celu znakowania jąder, a następnie płukać PBS.
10. Odcinki oznaczone po utrwaleniu w 1% PFA przez 1 minutę w RT.
11. Zamontuj szkiełka w podłożu zapobiegającym blaknięciu (z DAPI, jeśli jądra nie są jeszcze oznaczone), umieszczając dwie krople podłoża na każdym końcu szkiełka, a następnie przykrywając szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci. Przechowywać w bezpiecznym miejscu w temperaturze 4 °C przed światłem do momentu przygotowania do obrazu.

4. Obrazowanie konfokalne i analiza obrazu

1. Włącz odpowiednie długości fal laserowych, kamerę i mikroskop konfokalny, w tym stage moover i silnik z. Uruchom program do obrazowania. Użyj długości fal lasera 405, 488 i 561 do obrazowania odpowiednio odcinków barwionych Hoechst, Alexa 488 i Alexa 568.
   UWAGA: Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacjami sprzętu i oprogramowania.
2. Zamontuj szkiełko kontrolne (szkiełko nakrywkowe w dół w przypadku mikroskopu odwróconego) na stoliku szkiełkowym.
3. Korzystając z obiektywu 4X (patrz tabela materiałów), znajdź próbkę i obszar zainteresowania. Uchwyć obraz, aby użyć go jako mapy podczas obrazowania w dużym powiększeniu.
4. Usuń slajd, dokonując minimalnych regulacji stolika slajdu. Zmień obiektyw na 60-krotny zanurzenie w oleju (patrz tabela materiałów), umieść niewielką kroplę oleju na obiektywie i umieść szkiełko (nakrywką w dół) na szkiełko stage.
5. Znajdź próbkę ponownie. Ustaw moc lasera, czas ekspozycji i kategoryzację na żądane poziomy dla każdego kanału.
   UWAGA: Zazwyczaj używamy mocy lasera 0,8, czasu naświetlania kamery 100 ms i kategoryzacji 2 (patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacjami sprzętu i oprogramowania); Optymalne ustawienia muszą być empirycznie określone dla każdego eksperymentu.
   1. Po określeniu optymalnych ustawień należy użyć tych samych ustawień dla wszystkich odcinków tkanki w eksperymencie. Użyj histogramu intensywności, aby zanotować optymalny zakres intensywności dla każdego kanału (informacje te zostaną wykorzystane do analizy).
6. Wygeneruj stos z za pomocą funkcji akwizycji: wybierz odpowiednie kanały laserowe, a następnie wybierz górną i dolną granicę stosu z. Wybierz rozmiar kroku stosu z, który jest o połowę mniejszy niż wartość grubości warstwy optycznej podanej przez oprogramowanie. Kliknij "uruchom", aby zebrać obrazy.
7. Użyj Fiji¹⁶ lub porównywalnego programu do analizy obrazu. Na Fidżi otwórz plik stosu z opcją Niestandardowy tryb kolorów, a kanały podzielą się na osobne okna. Otwórz narzędzie "Dostosuj jasność/kontrast" z menu rozwijanego Obraz; W każdym kanale ustawić optymalny zakres intensywności histogramu określony w ppkt 4.5.1. Zastosuj te zakresy kanałów do wszystkich analizowanych stosów z.
8. Scal poszczególne kanały w jeden obraz kompozytowy za pomocą menu rozwijanego Obraz->Kolor.
9. Utwórz spłaszczony stos z na podstawie obrazu kompozytowego za pomocą menu projektu Image->Stacks->z. Ten obraz będzie znacznie jaśniejszy niż obraz 3D; Dostosuj zakres intensywności histogramu dla próbki kontrolnej, aby uniknąć przesycenia, i zastosuj te same ustawienia do eksperymentalnego spłaszczonego stosu Z.
10. Aby wygenerować obraz 3D, najpierw użyj menu projektu Image->Stacks->3D ¹⁷. Wybierz oś obrotu x lub oś y. Ustaw odstępy między plasterkami na taką samą liczbę mikronów, jak rozmiar kroku stosu z. Wybierz żądany całkowity obrót i ustaw przyrost kąta obrotu na 1. Następnie otwórz przeglądarkę Image J 3D z menu rozwijanego Wtyczki. Wybierz obraz kompozytowy wygenerowany w wersji 4.8, wyświetlany jako Objętość i ustaw współczynnik ponownego próbkowania na 1 lub 2.

Results

Rysunki od 2 do 6 pokazują typowe wyniki współbarwienia różnych białek w sercu zamrożonym i utrwalonym acetonem. Przeciwciało przeciwko s-α-aktininie powtarzalnie znakowane dyski Z i interkalowane krążki o wysokiej swoistości i minimalnym tle (ryc. 2A, 3A, 4A, 5A, 6A i 6C); Figura 6 pokazuje, że monowalentny fragment Fab anty-mysi IgG (H + L) skutecznie blokuje endogenne wiązanie IgG myszy przez przeciwciała wtórne anty-myszy. Przeciwciało przeciwko białku połączenia adherenów β kateniną wiązało błonę zarówno kardiomiocytów, jak i komórek niekardiomiocytów, a kolokalizacja z s-α-aktyniną wystąpiła w przypuszczalnych interkalowanych krążkach przy E16,5 (Figura 2C i D), zgodnie z oczekiwaniami na podstawie wzoru barwienia kateniny β w dorosłym sercu¹⁸. Immunofluorescencja integryny β1 w sercu zarodkowym jest szczególnie trudna i często nie pozwala zidentyfikować zrostów ogniskowych¹⁴, ale barwienie integryny β1 w tych badaniach wykazało sygnał o tej samej okresowości, co dyski Z znakowane s-α-aktyniną, prawdopodobnie odzwierciedlając powstające kostamery tworzące się w E16,5 (Figura 3D).

W E12.5 immunofluorescencja s-α-aktyniny i tropomiozyny (białka cienkich włókien sarkomeru) ujawniła wzór barwienia z regularną okresowością w kardiomiocytach beleczkowych zgodny z dojrzałymi miofibrylami w tych komórkach (Rysunki 4A i 5A dla s-α-aktyniny; Rycina 4B dla tropomiozyny). Barwienie N-kadheryną w kardiomiocytach beleczkowych w sercach E12,5 miało tendencję do kolokalizacji z obszarami intensywnego barwienia s-α-aktyniną (ryc. 5B-D i ryc. 6A-C), które mogą reprezentować interkalowane krążki. W przeciwieństwie do miocytów beleczkowych, s-α-aktynina w strefie zwartej była bardziej punktowa niż liniowa, a barwienie tropomiozyną było raczej rozproszone niż liniowe (Figura 4A i 4B). Tak więc złożenie sarkomeru może nastąpić później w zwartej lub beleczkowej mięśniu sercowym. Co więcej, zróżnicowane wzorce s-α-aktyniny i tropomiozyny w strefie zwartej sugerują, że s-α-aktynina wcześnie organizuje się w puncta i niedojrzałe krążki Z, podczas gdy włączenie tropomiozyny do cienkiego włókna może być późniejszym zdarzeniem w składaniu miofibryli.

Rysunek 7, Film 1 i Film 2 pokazują typowe wyniki z utrwalonego serca E12.5 z PFA. W tych przykładach do obrazowania wykorzystano transgeniczny zarodek LifeAct-RFPruby; Transgen¹⁹ LifeAct-RFPruby oznacza aktynę nitkowatą, ale wymaga utrwalenia PFA. Dyski Z znakowane s-α-aktyniną były łatwe do wizualizacji w większości obszarów, ale stosunek sygnału do szumu był zmniejszony w porównaniu z zatrzaskowo zamrożonymi sekcjami serca (Figura 7A); sygnał ten był typowy dla immunofluorescencji s-α-aktyniny w tkance utrwalonej przez PFA, w której epitopy mogą być maskowane przez wiązania krzyżowe białek. Rycina 7B przedstawia jednoczesną wizualizację aktyny nitkowatej i znakowanej immunologicznie s-α-aktyniny w miofibrylach (groty strzałek) oraz aktyny nitkowatej w komórkach wsierdzia sąsiadujących z miocytami beleczkowymi (strzałki). Trójwymiarowa rekonstrukcja obrazu ujawniła dodatkowe szczegóły: poszczególne kardiomiocyty były łatwiejsze do rozpoznania, miofibryle w kardiomiocytach były mniej więcej równoległe do siebie, ale poszczególne kardiomiocyty były zorientowane pod różnymi kątami względem siebie (ryc. 7C i D, film 1 i film 2). Ścisłe zbliżenie między komórkami wsierdzia a kardiomiocytami zostało również lepiej docenione w widokach trójwymiarowych.

Ryc. 1. Sarkomery kardiomiocytów, krążki interkalowane i żebramy. Dysk Z zakotwicza włókna aktynowe, podczas gdy linia M zakotwicza włókna miozyny, które zachodzą na włókna aktynowe. Sarkomer składa się z jednej jednostki Z-disc – M line – Z-disc. Wiele sarkomerów połączonych szeregowo tworzy miofibryl. Boczny koniec miofibrylu wstawia się w poprzeczną granicę kardiomiocytu w wyspecjalizowanej strukturze połączenia komórka-komórka zwanej interkalowanym dyskiem. Miofibryle obwodowe łączą się z błoną plazmatyczną podłużnych kardiomiocytów za pośrednictwem kostamerów, które tworzą ogniskowe zrosty z macierzą zewnątrzkomórkową między kardiomiocytami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2. immunofluorescencja s-α-aktyniny i kateniny β w dniu embrionalnym 16,5. Serce zostało wycięte, zamrożone, poddane kriosekcji, utrwalone acetonem i wybarwione immunologicznie przy użyciu (A) mysiego klonu monoklonalnego przeciwciała EA53 przeciwko s-α-aktyninie, które znakowane było krążkiem Z kardiomiocytów i interkalowanymi dyskami, oraz (B) poliklonalnego przeciwciała królika przeciwko białku połączenia adherens β kateninie. (C) Połączone obrazy pokazują barwienie s-α-aktyniną i β kateniną. (D) Powiększony obszar zainteresowania z panelu C; Gwiazdki oznaczają przypuszczalne interkalowane krążki z kolokalizacją S-α-aktyniny i β kateniny. Obrazy uzyskano z obwodowej ściany lewej komory lub zwartego mięśnia sercowego, z warstwą nasierdzia w lewym górnym rogu paneli A-C. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 460-1600 (z możliwych 0-65535) zarówno dla kanałów laserowych s-α-aktynina/488 nm, jak i β katenina/561 nm. Podziałka 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3. immunofluorescencja s-α-aktyniny i integryny β 1 w dniu embrionalnym 16,5. Serce wycięto, zamrożono, poddano kriosekcji, utrwaleniu acetonem i barwieniu immunologicznemu przy użyciu (A) mysiego klonu monoklonalnego EA53 przeciwciała przeciwko s-α-aktininie i (B) koziego przeciwciała poliklonalnego przeciwko ogniskowemu białku adhezyjnemu β1 integrynie. (C) Połączone obrazy pokazują integrynę β1 w kardiomiocytach, a także w komórkach niekardiomiocytów. Zauważ zarówno rozproszony, jak i punktowy sygnał integryny β1 w kardiomiocytach. (D) Powiększony obszar zainteresowania z panelu C. Zwróć uwagę na punktowe, okresowe barwienie integryną β1 (strzałki) o okresowości podobnej do pobliskiego barwienia s-α-aktyniną w dyskach Z; Struktury te mogą reprezentować kostamery. Obrazy uzyskano z lewej komory zwartego mięśnia sercowego. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 460-1200 (z możliwych 0-65535) dla kanału laserowego s-α-aktynina/488 nm i 460-600 dla kanału lasera β1 integryna/561 nm. Podziałka 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4. immunofluorescencja s-α-aktyniny i tropomiozyny w 12,5 dniu embrionalnym: organizacja miofibryli w beleczkowym i zwartym mięśniu sercowym. Serca z zarodków rodzeństwa z miotu wycięto, zamrożono błyskawicznie, poddano kriosekcji, utrwaleniu acetonem i barwieniu immunologicznemu przy użyciu (A) mysiego klonu monoklonalnego przeciwciała EA53 przeciwko s-α-aktyninie i (B) mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko tropomiozynie białka o cienkich włóknach miofibrylowych (Developmental Studies Hybridoma Bank CH1). Wskazywana jest beleczkość (strzałki) i zwarty mięsień sercowy (groty strzałek). Zwróć uwagę na liniowe barwienie s-α-aktyniną z regularną okresowością w mięśniu sercowym beleczki, w porównaniu z szeregiem wzorów barwienia, w tym puncta, a także barwieniem liniowym w warstwie zwartej (A). Należy również zauważyć liniowe barwienie tropomiozyną z regularną okresowością w mięśniu sercowym beleczkowym, ale bardziej rozproszone barwienie w zwartym mięśniu sercowym. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 460-1,400 (z możliwych 0-65535) dla kanału s-α-aktyniny i 460-1,000 dla kanału tropomiozyny. Podziałka 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5. immunofluorescencja s-α-aktyniny i N-kadheryny w 12,5 dniu embrionalnym: miofibryle i interkalowane krążki w kardiomiocytach beleczkowych. Serce zostało wycięte, zamrożone, poddane kriosekcji, utrwalone acetonem i wybarwione immunologicznie przy użyciu (A) mysiego klonu monoklonalnego przeciwciała EA53 przeciwko s-α-aktyninie i (B) poliklonalnego przeciwciała królika przeciwko ogniskowemu białku adhezyjnemu N-kadherynie. Warstwy optyczne 0,2 μm zebrano jako stos z, a stosy z spłaszczono w celu wygenerowania obrazów. (C) Połączone spłaszczone stosy wykazują zarówno barwienie N-kadheryną, jak i s-α-aktyniną w kardiomiocytach beleczkowych, a także w jądrach znakowanych barwnikiem Hoechsta. (D) Powiększony obszar zainteresowania z panelu C; gwiazdki oznaczają interkalowane krążki z kolokalizacją s-α-aktyniny i N-kadheryny. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 470-1 200 (z możliwych 0-65535) dla kanału laserowego Hoechst/405 nm i 470-2 000 dla obu kanałów laserowych s-α-aktynina/488 nm i N-kadheryna/561 nm. Podziałka 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 6. Monowalentny fragment Fab anty-mysi IgG (H + L) skutecznie blokuje endogenne wiązanie mysich IgG przez anty-mysie przeciwciała drugorzędowe. Serce embrionalne E12.5 zostało wycięte, zamrożone, poddane kriosekcji, utrwalone acetonem i wybarwione immunologicznie. (A-C) Skrawki zablokowano buforem blokującym 1x, a następnie monowalentnym fragmentem Fab anty-mysim IgG, wystawiono na działanie mysiego klonu monoklonalnego EA53 przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko s-α-aktyninie i króliczego poliklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko N-kadherynie, przemyto i wystawiono na działanie anty-mysich przeciwciał anty-mysich i Alexa Fluor 586 anty-królików. (A) Scalony obraz przy użyciu zakresu wyświetlania histogramu intensywności 480-2500 (z możliwych 0-65535). Gwiazdki wskazują na obszary, w których sygnał N-kadheryny jest ograniczony do poprzecznego końca kardiomiocytów beleczkowych, co prawdopodobnie reprezentuje powstające interkalowane dyski. (B) Kanał tylko N-kadheryna przy użyciu zakresu wyświetlania histogramu intensywności 480-2,500. (C) kanał tylko s-α-aktyniny przy użyciu histogramu intensywności w zakresie wyświetlania 480-2,500. (D-G) Sekcje zablokowano tylko 1x buforem blokującym (bez etapu blokowania monowalentnego fragmentu Fab przeciwko mysiej IgG), wystawiono na działanie króliczego poliklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego tylko przeciwko N-kadherynie (bez mysiego monoklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego), przemyto i wystawiono na działanie anty-mysich przeciwciał drugorzędowych Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 586 przeciwko królikowi. (D) Scalony obraz przy użyciu zakresu wyświetlania histogramu intensywności 480-2500. (E) Kanał tylko N-kadheryny przy użyciu zakresu wyświetlania histogramu intensywności 480-2500. (F) kanał tylko s-α-aktyniny przy użyciu zakresu wyświetlania histogramu intensywności 480-2,500. (G) kanał tylko s-α-aktyniny przy użyciu zakresu wyświetlania histogramu o wysokiej czułości intensywności 480-530, który ujawnia wykrywanie tła endogennej mysiej IgG przy braku etapu blokowania monowalentnego fragmentu Fab anty-mysiego IgG. (H-K) Skrawki zablokowano 1x buforem blokującym, a następnie monowalentnym fragmentem Fab anty-mysim IgG, wystawiono na działanie króliczego poliklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko N-kadherynie (bez mysiego monoklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego), przemyto i wystawiono na działanie anty-mysich przeciwciał anty-mysich Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 586 anty-królików. (H) Scalony obraz przy użyciu zakresu wyświetlania histogramu intensywności 480-2,500. (I) Kanał tylko N-kadheryny przy użyciu zakresu wyświetlania histogramu intensywności 480-2,500. (J) kanał tylko s-α-aktyniny przy użyciu zakresu wyświetlania histogramu intensywności 480-2,500. (K) Kanał tylko s-α-aktyniny przy użyciu zakresu wyświetlania histogramu o wysokiej czułości intensywności 480-530, co wykazuje brak wykrywania endogennej mysiej IgG tła, gdy stosuje się etap blokowania monowalentnego fragmentu Fab przeciwko myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 7. Organizacja s-α-aktyniny i aktyny w kardiomiocytach beleczkowych w 12,5 dniu embrionalnym. Transgeniczna linia myszy LifeAct-RFPruby została wykorzystana do wizualizacji nitkowatej aktyny¹⁹, podczas gdy mysi monoklonalny klon przeciwciała EA53 przeciwko s-α-aktyninie wykorzystano do znakowania krążków Z i dysków interkalowanych. Zarodki zostały utrwalone PFA. Warstwy optyczne o grubości 0,2 μm zebrano jako stos Z. (A) Spłaszczony stos z pokazuje, że barwienie s-α-aktyniny było bardziej rozproszone w tkance utrwalonej PFA niż w sekcjach zatrzaskowo mrożonych i utrwalonych acetonem (ryc. 2-5). (B) Spłaszczony stos z pokazuje zarówno nitkowatą aktynę, jak i s-α-aktyninę. Nitkowata fluorescencja aktyny zlokalizowana między dyskami Z w miofibrylach (grotach strzałek). Nitkowatą fluorescencję aktyny zaobserwowano również w komórkach wsierdzia wyściełających miocyty beleczkowe (strzałki). (C) Trójwymiarowy widok kardiomiocytów beleczkowych, widziany z góry stosu. (D) Trójwymiarowy widok kardiomiocytów beleczkowych, widziany od dołu stosu. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 470-900 (z możliwych 0-65535) zarówno dla kanału laserowego 488 nm, jak i dla kanału laserowego 561 nm w A i B; zakres wyświetlania 460-800 dla obu kanałów w C i D. Podziałka 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film 1. 360° rotacyjny widok 3D organizacji s-α-aktyniny i aktyny w kardiomiocytach beleczkowych w 12,5 dniu embrionalnym. Stos obrazów z rysunku 6 został wyrenderowany w trzech wymiarach przy użyciu wtyczki Image J 3D Viewer w programie do analizy obrazów Fidżi. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 470-800 (z możliwych 0-65535) zarówno dla kanałów laserowych 488 nm, jak i 561 nm.

Film 2. Wybrane widoki 3D organizacji s-α-aktyniny i aktyny w kardiomiocytach beleczkowych w dniu embrionalnym 12.5. Stos obrazów z rysunku 6 został wyrenderowany w trzech wymiarach przy użyciu wtyczki Image J 3D Viewer w programie do analizy obrazów Fidżi. Małe rotacje wokół osi x, y i z wykazały stosunkowo wyrównane miofibryle w kardiomiocytach, ale słabe wyrównanie między większością kardiomiocytów. Małe rotacje wykazały również bliskie zbliżenie komórek wsierdzia pozbawionych s-α-aktyniny wokół kardiomiocytów. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 470-800 (z możliwych 0-65535) zarówno dla kanałów laserowych 488 nm, jak i 561 nm.

Discussion

Optymalna technika utrwalania tkanek i rozcieńczenia musi być empirycznie określona dla każdego przeciwciała. W naszych rękach szybkie zamrażanie jest lepsze niż wiązanie PFA dla kilku antygenów kardiomiocytów, w tym s-α-aktyniny, β-kateniny, β1-integryny, tropomiozyny, taliny (nie pokazano) i N-kadheryny; w przeciwieństwie do tego, wiązanie PFA daje lepsze wyniki dla ogniskowej kinazy adhezyjnej (nie pokazano). Wiązania krzyżowe białek tworzone przez PFA mogą maskować epitopy i ograniczać wiązanie przeciwciał; W takich przypadkach może być wymagane pobranie antygenu, a metody pobierania antygenu można znaleźć gdzie indziej²⁰. Stężenie PFA lub długość wiązania można zmniejszyć, aby zmniejszyć maskowanie epitopów, przy czym optymalne warunki zostaną empirycznie określone dla każdego przeciwciała i na każdym etapie rozwoju. Przy charakteryzowaniu nowego przeciwciała lub mutanta sercowego należy stosować odpowiednie kontrole ujemne, w tym surowicę przedimmunologiczną jako pierwszorzędową kontrolę przeciwciał i kontrolę "bez przeciwciał pierwotnych". Wykorzystanie myszy z nokautem jest idealną kontrolą negatywną, ale wczesna śmiertelność uniemożliwia ich wykorzystanie w wielu badanych tutaj produktach genowych.

Ważne było użycie odpowiednich objętości do całkowitego zanurzenia szkiełek doświadczalnych i kontrolnych w tych samych roztworach blokujących immunofluorescencję, przeciwciałach i roztworach do płukania, a także delikatne kołysanie szkiełkami podczas inkubacji, aby zapewnić równomierną ekspozycję skrawków na roztwory. Takie podejście zminimalizowało techniczną zmienność barwienia między sekcjami i szkiełkami w eksperymencie. Gdy koszt ogranicza objętość roztworu przeciwciała, należy użyć wstrzykiwacza Pap, aby ograniczyć przepływ roztworów poza skrawki tkanki i przechowywać szkiełka w wilgotnej komorze podczas długich inkubacji. Jeśli stosuje się monoklonalne mysie przeciwciało pierwszorzędowe - a zatem przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom - konieczne będzie wykonanie drugiego etapu blokującego w celu pokrycia endogennych mysich immunoglobulin (krok 3.4) w celu zmniejszenia niespecyficznego sygnału tła.

Odpowiednie techniki mikroskopii i przetwarzania obrazu mają kluczowe znaczenie dla uzyskania biologicznie dokładnych informacji²¹. Histogram intensywności wskazuje rozkład pikseli na każdym poziomie intensywności (od 0 do 65535 poziomów dla obrazu 16-bitowego) dla każdego koloru. Tło, jasność i kontrast można regulować, ustawiając zakres wyświetlania intensywności, który otacza szczyt histogramu; Aby dokonać prawidłowych porównań między warunkami, należy użyć tych samych ustawień między warunkami kontrolnymi i doświadczalnymi.

Protokół ten zapewnia wiarygodną metodę analizy dojrzewania i rozwoju kardiomiocytów w natywnym embrionalnym sercu myszy. Podczas gdy immunofluorescencja białek specyficznych dla kardiomiocytów jest często stosowana do oznaczania kardiomiocytów podczas rozwoju, niewiele badań wykorzystuje techniki, które umożliwiają analizę struktury miofibryli w wysokiej rozdzielczości i pojawienie się interkalowanych krążków i żeber^12-14,22,23. Technika ta może być wykorzystana do oceny in vivo mutacji powodujących rozwojowe wady serca, jako sposób identyfikacji zmian w dojrzewaniu kardiomiocytów, które mogą rzucić światło na mechanizmy nieprawidłowości strukturalnych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryomold, Jednorazowa forma bazowa, 7x 7 mm	Richard-Allen Scientific	58949	Ten rozmiar niedostępny w Fisher Scientific
Cryomold, Jednorazowa forma bazowa, 15 x 15 mm	Fisher Scientific	22-050-159	Dostępne również w Richard-Allen Scientific, numer katalogowy 58950
Tissue-Tek Optymalna temperatura cięcia (OCT) medium 4583	VWR	25608-930
2-metyl butan	Sigma	M32631
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	T353-500	Użyj świeżego 4% roztworu w 1x PBS, pH 7,2-7,4.
Sacharoza		Sigma S0389	Użyj 15% i 30% roztworów w 1X PBS.
Jednorazowa pipeta transferowa	Fisher Scientific	S30467-1
Prowadnice Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	"Plus" wskazuje na dodatnio naładowaną powłokę i ma kluczowe znaczenie dla utrzymania przylegania tkanki do szkiełka.
Aceton	Sigma	179124
Triton X-100	Sigma	X100
Zachodni środek blokujący	Roche	11921673001	Bufor blokujący do immunofluorescencji, gdy przeciwciała drugorzędowe pochodzą z różnych gatunków. Rozcieńczyć do 1x w PBS.
Tween 20	Sigma	P9416
Donkey Anty-mysi IgG (H+L) monowalentny fragment Fab	Jackson ImmunoResearch	715-007-003	Goat Anti-mouse IgG (H+L) również dostępny. Do blokowania endogennych immunoglobulin.
Przeciwciało anty-s-α-aktyniny	Sigma	A7811	Mysz monoklonalna, klon EA53. Rozcieńczyć w stosunku 1:400 dla sekcji mrożonych/utrwalanych acetonem, rozcieńczyć w stosunku 1:300 dla sekcji utrwalanych PFA. Przed inkubacją na tkance myszy zablokuj endogenne immunoglobuliny myszy monowalentnym fragmentem Fab anty-mysim IgG (H + L).
Anty-β Przeciwciało kateninowe	Sygnalizacja komórkowa	9587s	Królik poliklonalny. Wymaga szybkiego zamrażania/utrwalania acetonem. Rozcieńczyć w stosunku 1:400.
Anty-β 1 przeciwciało integrynowe	R& D	AF2405	Koza poliklonalna. Rozcieńczyć w stosunku 1:200. Barwienie tkanek mrożone zatrzaskowo/utrwalane acetonem jest lepsze niż tkanki utrwalane PFA.
rozwojowe przeciwciał anty-tropomiozyny	Hybridoma Bank, University of Iowa	CH1	Mysz monoklonalna. Wymaga szybkiego zamrażania/utrwalania acetonem. Rozcieńczyć w stosunku 1:200. Przed inkubacją na tkance myszy zablokuj endogenne immunoglobuliny myszy monowalentnym fragmentem Fab anty-mysim IgG (H + L).
Przeciwciało anty-N-kadheryny	Santa Cruz	sc-7939	Królik poliklonalny. Rozcieńczyć w stosunku 1:200. Barwienie tkanek mrożone zatrzaskowo/utrwalane acetonem jest lepsze niż tkanki utrwalane PFA.
Przeciwciało anty-talin	Sigma	T3287	Mysz monoklonalna, klon 8d4. Wymaga szybkiego zamrażania/utrwalania acetonem. Rozcieńczyć w stosunku 1:200. Przed inkubacją na tkance myszy zablokuj endogenne immunoglobuliny myszy monowalentnym fragmentem Fab anty-mysim IgG (H + L).
Przeciwciało przeciwko ogniskowej kinazie adhezyjnej antyfosfotyrozyny 397	Invitrogen	700255	królika. Wymaga utrwalenia PFA. Rozcieńczyć w stosunku 1:500.
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Antibody Life Technologies	A-21202
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Anti-Rabbit Antibody	Technologies	A10042
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Anti-Mouse	Technologies	A-11001
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Technologie	życia	A-11011
Hoechst 33342 barwnik	Life Technologies	H3570	Bejca jądrowa
Vectashield	Vector labs	H-1000
Szkiełka nakrywkowe	Fisher Scientific	12-548-5M
MLC 400B Monolityczny łącznik laserowy Skrzynka laserowa	Keysight (dawniej Agilent)
Kamera CCD Clara Interline	Andor
Eclipse Ti odwrócona mikroskop	Nikon
CSU-X1 Skaner konfokalny z wirującym dyskiem	Yokogawa
CFI Plan Apochromat 4X obiektyw powietrzny	Nikon	Przysłona numeryczna (NA) 0,2, Odległość robocza (WD) 15,7 mm
Obiektyw CFI Plan Apochromat VC 60x z immesionem olejowym (MRD01602)	Nikon	NA 1.4, WD 0.13 mm
NIS Elements Oprogramowanie do obrazowania	Nikon	http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm
Oprogramowanie do analizy obrazu	Fidżi	http://fiji.sc/Fiji