Artykuł metodologiczny

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

23.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52644

⸱

26 marca 2015

 , 
1Feinberg Cardiovascular Research Institute, Northwestern University, 2Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Streszczenie

Podczas rozwoju serca, generowanie specyficznych dla mięśnia sercowego jednostek strukturalnych i funkcjonalnych, w tym sarkomerów, kurczliwych miofibryli, interkalowanych krążków i kostamerów, wymaga skoordynowanego montażu wielu komponentów w czasie i przestrzeni. Zakłócenia w montażu tych elementów prowadzą do rozwojowych wad serca. Techniki barwienia immunofluorescencyjnego są powszechnie stosowane w hodowanych kardiomiocytach w celu zbadania dojrzewania miofibryli, ale to podejście ex vivo jest ograniczone przez stopień, w jakim miocyty będą się w pełni różnicować w hodowli, brak normalnych danych mechanicznych in vivo i brak wskazówek wsierdziowych. Zastosowanie technik immunofluorescencyjnych do badania rozwijającego się serca myszy jest pożądane, ale stanowi większe wyzwanie techniczne, a metodom często brakuje wystarczającej czułości i rozdzielczości, aby uwidocznić sarkomery we wczesnych stadiach rozwoju serca. W tym miejscu opisujemy solidną i powtarzalną metodę wspólnego barwienia immunologicznego wielu białek lub wspólnej wizualizacji białka fluorescencyjnego z barwieniem immunofluorescencyjnym w embrionalnym sercu myszy i używamy tej metody do analizy rozwijających się miofibryli, interkalowanych krążków i kostarów. Metoda ta może być dalej stosowana do oceny zmian strukturalnych kardiomiocytów spowodowanych mutacjami prowadzącymi do rozwojowych wad serca.

Wprowadzenie

Podczas rozwoju, skurcze serca zaczynają się wkrótce po tym, jak kardiomiocyty migrują do linii środkowej i tworzą liniową rurkę serca1,2. Sarkomer jest podstawową jednostką kurczliwą w kardiomiocycie; ta wysoce zorganizowana struktura cytoszkieletu zawiera włókna aktyny zakotwiczone w dysku Z przez sarkomeryczne α-aktyninę (s-α-aktynina) i włókna miozyny zakotwiczone w linii M (ryc. 1). W miarę dojrzewania kardiomiocytów sarkomery łączą się w szeregi, tworząc miofibryle, które rozciągają się w poprzek komórki. Miofibryle są zakotwiczone na końcach kardiomiocytów przez interkalowany dysk, strukturę połączenia komórka-komórka, która zawiera przejściowe połączenie z podzbiorem elementów Z-dysku, takich jak s-α-aktynina3, adhereny białka połączeniowe, takie jak N-kadheryna i β katenina, białka połączeń szczelinowych i desmosomy (ryc. 1)4. Wzdłuż błony podłużnej krążki Z miofibryli obwodowych również przyczepiają się do błony komórkowej za pośrednictwem kostamerów; te wyspecjalizowane zrosty ogniskowe zapewniają kotwicę między miofibrylem, błoną plazmatyczną i macierzą zewnątrzkomórkową, aby zapewnić dodatkowe wsparcie strukturalne kardiomiocytów (ryc. 1)4. Na wczesnym etapie rozwoju serca kardiomiocyty są ułożone w przypominające palce wypustki zwane beleczkami, które wystają do przestrzeni komorowej i zawierają stosunkowo dojrzałe miofibryle5. W miarę rozwoju serca kardiomiocyty w okolicy podnasierdziowej namnażają się, tworząc zwarty mięsień sercowy, który obejmuje ściany komór, ale montaż sarkomeru i miofibrylu jest opóźniony w porównaniu z mięśniem bocznymbeleczkowym 5,6.

Modele składania sarkomeru i miofibryli pochodzą głównie z badań immunofluorescencyjnych na hodowanych kardiomiocytach7-10, które są proste, ale brakuje im trójwymiarowego środowiska, przepływu krwi i kontaktów z innymi komórkami serca obecnymi in vivo. Badania strukturalne o wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne, a niewiele badań dotyczyło pojawiania się interkalowanych dysków i kostamerów podczas rozwoju serca myszy. Wydaje się, że białko połączenia adherens β katenina lokalizuje się w interkalowanych krążkach do dnia embrionalnego (E) 17,511, N-kadheryna lokalizuje się w strukturach liniowych, które mogą reprezentować interkalowane dyski przez E18,512 w porównaniu z dniem pourodzeniowym 013, a kostamery zostały wykryte w E18,514, ale białka te wykazują rozproszoną i bardziej ciągłą dystrybucję błony we wcześniejszych punktach czasowychrozwoju 11-13.

Tutaj opisujemy prostą i powtarzalną metodę barwienia immunologicznego i mikroskopii fluorescencyjnej pociętych na sekcje embrionalnych serc myszy, która pozwala na szczegółową analizę rozwoju miofibryli i kardiomiocytów, w tym pojawienie się interkalowanych krążków już w E12.5 i powstających kostamerów w E16.5. Protokół ten może być przydatny do badania wpływu mutacji na tworzenie sarkomerów, a także dojrzewanie miofibryli i kardiomiocytów.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UCSF.

1. Kriokonserwacja i utrwalanie embrionalnych serc myszy.

1.1) Błyskawiczne zamrażanie embrionalnych serc

  1. Napełnij szalkę Petriego o średnicy 3.5 cm i krioformy o średnicy 7 mm pożywką o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (patrz tabela materiałów). W kapturze chemicznym schłodzić 2-metylobutan w ciekłym azocie.
  2. Rozlej 30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 10 cm szalki Petriego, 10 ml PBS na 3,5 cm szalki Petriego i umieść wszystkie szalki Petriego na lodzie. Przygotuj jedno naczynie o średnicy 10 cm i kilka naczyń o średnicy 3,5 cm na jedną ciężarną myszkę.
  3. Wyizoluj zarodki zgodnie z wcześniejszym opisem15, wykonując sekcję w lodowatym PBS.
  4. Krótko mówiąc, poddaj ciężarną kobietę eutanazji za pomocą narkozy CO2 i zwichnięcia szyjki macicy.
    1. Wykonaj nacięcie w jamie brzusznej, wypreparuj macicę, przecinając naczynia wzdłuż wewnętrznej krzywizny macicy i przenieś macicę na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą lodowaty PBS.
    2. Przeciąć macicę pomiędzy każdym zarodkiem i przenieść na pojedynczą szalkę Petriego o średnicy 3,5 cm, zawierającą lodowaty PBS. Izolować każdy zarodek zgodnie z opisem15.
    3. Otwórz jamę osierdzia za pomocą cienkich kleszczy, usuń serce z płuc i naczyń krwionośnych, przecinając aortę, żyłę główną dolną i żyły płucne, a następnie przenieś na 3,5 cm szalkę Petriego zawierającą OCT.
    4. Pozwól sercu zrównoważyć się w OCT przez kilka sekund, a następnie przenieś serce do 7-milimetrowej formy zawierającej OCT. Skieruj przednią ścianę serca na dno formy.
  5. Delikatnie umieść formę w 2-metylobutanie chłodzonym ciekłym azotem. Uważaj, aby ciecz 2-metylobutanu nie dotknęła OCT lub serca. Zamrozić, aż OCT stanie się jednolicie biały, a następnie przenieś formę do wiadra z lodem zawierającego suchy lód. Przejdź do następnego zarodka.
  6. Zawiń krioformy w folię i przechowuj w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kriosekcji.

1.2) Alternatywa: utrwalanie paraformaldehydu (PFA), krioprotekcja i OCT osadzanie embrionalnych serc

  1. Napełnij dołki 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej 4% PFA w 1x PBS.
  2. Wyciąć serca embrionalne zgodnie z opisem w ppkt 1.1.3. Umieścić każde serce w studzience zawierającej 4% PFA i utrwalić w temperaturze 4 °C O/N.
  3. Krioochrona: za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieść każde serce do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1,5 ml 15% sacharozy w PBS i delikatnie mieszać w temperaturze 4 °C, aż serce opadnie na dno probówki (kilka godzin do O/N). Przenieść każde serce do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1,5 ml 30% sacharozy w PBS i ponownie delikatnie mieszać w temperaturze 4 °C, aż serce opadnie na dno probówki (kilka godzin do O/N).
  4. Za pomocą plastikowej pipety transferowej umieść kriochronione serce w OCT i pozwól mu się zrównoważyć przez kilka minut, aby usunąć nadmiar sacharozy, a następnie przenieś serce do formy o średnicy 7 mm zawierającej OCT. Ustaw przednią ścianę serca na dnie formy.
  5. Zamroź serce w OCT, umieszczając formę w 2-metylobutanie chłodzonym ciekłym azotem lub suchym lodzie.
  6. Zawiń krioformy w folię i przechowuj w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do kriosekcji.

2. Kriosekcja

  1. Ustawić temperaturę kriostatu na -17 °C.
  2. Umieścić krioformy w komorze kriostatu i wyrównać do temperatury przez 15-20 minut.
  3. Odwróć kriomold i delikatnie dociśnij, aby usunąć blok serca z formy. Zorientuj przednią ścianę serca na szczycie uformowanego bloku tkanki.
  4. Umieść dużą kroplę OCT na uchwycie i zamontuj blok serca na kropli OCT, aby zamrozić się na uchwycie. Utrzymuj orientację tak, aby przednia ściana serca znajdowała się najdalej od uchwytu.
  5. Załaduj uchwyt i zamontowany blok serca na uchwyt kriostatu. Wyreguluj tak, aby kąt ostrza wynosił 3-5° w stosunku do próbki.
  6. Pobrać skrawki 10 μm na szkiełka mikroskopowe, które zostały wstępnie pokryte dodatnio naładowaną powłoką (patrz tabela materiałów). Pozostawić do całkowitego wyschnięcia przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.

3. Immunofluorescencja

  1. W przypadku skrawków zamrożonych należy utrwalić i przepuszczalnie tkankę w acetonie przez 10 minut w dygestorium w temperaturze pokojowej.
  2. W przypadku sekcji zatrzaskowych i utrwalonych PFA, inkubować w PBS-0,1% Triton X-100 przez 20 minut w celu usunięcia OCT i przepuszczalności skrawków utrwalonych PFA.
  3. Blokuj przez 45 minut w 1x bufor blokujący, rozcieńczony w PBS.
  4. Jeśli używasz pierwszorzędowego przeciwciała wytworzonego u myszy, inkubuj w ośle lub kozie anty-mysim fragmencie IgG (H + L) monowalentnym fragmencie Fab rozcieńczonym 1:100 w PBS-0,1% Tween 20 przez 45 minut w RT (patrz Dyskusja).
  5. Inkubować w pierwszorzędowym przeciwciałie lub przeciwciałach rozcieńczonych w 1x buforze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C (patrz Tabela materiałów/urządzeń dla specyficznych rozcieńczeń).
  6. Umyj sekcje w 1x PBS trzy razy przez 10 minut w RT.
  7. Inkubować w Alexa Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluorem rozcieńczone w stosunku 1:500 w buforze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, chronione przed światłem.
  8. Umyj sekcje w 1x PBS trzy razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  9. Opcjonalnie: Inkubować w barwniku Hoechst rozcieńczonym w stosunku 1:2 000 w PBS w temperaturze pokojowej (chronionej przed światłem) w celu znakowania jąder, a następnie płukać PBS.
  10. Odcinki oznaczone po utrwaleniu w 1% PFA przez 1 minutę w RT.
  11. Zamontuj szkiełka w podłożu zapobiegającym blaknięciu (z DAPI, jeśli jądra nie są jeszcze oznaczone), umieszczając dwie krople podłoża na każdym końcu szkiełka, a następnie przykrywając szkiełkiem nakrywkowym. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci. Przechowywać w bezpiecznym miejscu w temperaturze 4 °C przed światłem do momentu przygotowania do obrazu.

4. Obrazowanie konfokalne i analiza obrazu

  1. Włącz odpowiednie długości fal laserowych, kamerę i mikroskop konfokalny, w tym stage moover i silnik z. Uruchom program do obrazowania. Użyj długości fal lasera 405, 488 i 561 do obrazowania odpowiednio odcinków barwionych Hoechst, Alexa 488 i Alexa 568.
    UWAGA: Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacjami sprzętu i oprogramowania.
  2. Zamontuj szkiełko kontrolne (szkiełko nakrywkowe w dół w przypadku mikroskopu odwróconego) na stoliku szkiełkowym.
  3. Korzystając z obiektywu 4X (patrz tabela materiałów), znajdź próbkę i obszar zainteresowania. Uchwyć obraz, aby użyć go jako mapy podczas obrazowania w dużym powiększeniu.
  4. Usuń slajd, dokonując minimalnych regulacji stolika slajdu. Zmień obiektyw na 60-krotny zanurzenie w oleju (patrz tabela materiałów), umieść niewielką kroplę oleju na obiektywie i umieść szkiełko (nakrywką w dół) na szkiełko stage.
  5. Znajdź próbkę ponownie. Ustaw moc lasera, czas ekspozycji i kategoryzację na żądane poziomy dla każdego kanału.
    UWAGA: Zazwyczaj używamy mocy lasera 0,8, czasu naświetlania kamery 100 ms i kategoryzacji 2 (patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacjami sprzętu i oprogramowania); Optymalne ustawienia muszą być empirycznie określone dla każdego eksperymentu.
    1. Po określeniu optymalnych ustawień należy użyć tych samych ustawień dla wszystkich odcinków tkanki w eksperymencie. Użyj histogramu intensywności, aby zanotować optymalny zakres intensywności dla każdego kanału (informacje te zostaną wykorzystane do analizy).
  6. Wygeneruj stos z za pomocą funkcji akwizycji: wybierz odpowiednie kanały laserowe, a następnie wybierz górną i dolną granicę stosu z. Wybierz rozmiar kroku stosu z, który jest o połowę mniejszy niż wartość grubości warstwy optycznej podanej przez oprogramowanie. Kliknij "uruchom", aby zebrać obrazy.
  7. Użyj Fiji16 lub porównywalnego programu do analizy obrazu. Na Fidżi otwórz plik stosu z opcją Niestandardowy tryb kolorów, a kanały podzielą się na osobne okna. Otwórz narzędzie "Dostosuj jasność/kontrast" z menu rozwijanego Obraz; W każdym kanale ustawić optymalny zakres intensywności histogramu określony w ppkt 4.5.1. Zastosuj te zakresy kanałów do wszystkich analizowanych stosów z.
  8. Scal poszczególne kanały w jeden obraz kompozytowy za pomocą menu rozwijanego Obraz->Kolor.
  9. Utwórz spłaszczony stos z na podstawie obrazu kompozytowego za pomocą menu projektu Image->Stacks->z. Ten obraz będzie znacznie jaśniejszy niż obraz 3D; Dostosuj zakres intensywności histogramu dla próbki kontrolnej, aby uniknąć przesycenia, i zastosuj te same ustawienia do eksperymentalnego spłaszczonego stosu Z.
  10. Aby wygenerować obraz 3D, najpierw użyj menu projektu Image->Stacks->3D 17. Wybierz oś obrotu x lub oś y. Ustaw odstępy między plasterkami na taką samą liczbę mikronów, jak rozmiar kroku stosu z. Wybierz żądany całkowity obrót i ustaw przyrost kąta obrotu na 1. Następnie otwórz przeglądarkę Image J 3D z menu rozwijanego Wtyczki. Wybierz obraz kompozytowy wygenerowany w wersji 4.8, wyświetlany jako Objętość i ustaw współczynnik ponownego próbkowania na 1 lub 2.

Wyniki

Ryciny 2 do 6 przedstawiają typowe wyniki podwójnego barwienia różnych białek w sercu zamrożonym gwałtownie i utrwalonym w acetonie. Przeciwciało przeciwko s-α-actinin powtarzalnie znakowało tarcze Z i dyski przejściowe z wysoką swoistością i minimalnym tłem (ryc. 2A, 3A, 4A, 5A, 6A oraz 6C); rycina 6 wykazuje, że monowalentny fragment Fab przeciwciała anty-mysiego IgG (H+L) skutecznie blokuje wiązanie endogennego mysiego IgG przez przeciwciała wtórne anty-mysie. Przeciwciało przeciwko białku połączeń przylegających β catenin wiązało się z błoną zarówno kardiomiocytów, jak i komórek niebędących kardiomiocytami, a kolokalizacja z s-α-actinin występowała w domniemanym miejscu dysków przejściowych w stadium E16.5 (ryc. 2C i D), co jest zgodne z wzorcem barwienia β catenin w sercu dorosłym18. Immunofluorescencja β1 integrin w sercu embrionalnym jest szczególnie trudna i często nie pozwala na zidentyfikowanie adhezji ogniskowych14, jednak barwienie β1 integrin w niniejszych badaniach ujawniło sygnał o tej samej periodyczności co tarcze Z znakowane s-α-actinin, co prawdopodobnie odzwierciedla powstawanie pierwotnych kostamerów w stadium E16.5 (ryc. 3D).

W stadium E12.5 immunofluorescencja s-α-actininy oraz tropomiozyny (białka cienkich filamentów sarkomeru) ujawniła wzór barwienia o regularnej periodyczności w kardiomiocytach beleczkowych, co jest zgodne z obecnością dojrzałych miofibryli w tych komórkach (ryciny 4A i 5A dla s-α-actininy; rycina 4B dla tropomiozyny). Barwienie N-kadheryny w kardiomiocytach beleczkowych w sercach w stadium E12.5 wykazywało tendencję do kolokalizacji z obszarami intensywnego barwienia s-α-actininy (rycina 5B-D oraz rycina 6A-C), co prawdopodobnie reprezentuje dyski przejściowe. W przeciwieństwie do miocytów beleczkowych, s-α-actinin w strefie zwartej miała charakter bardziej punktowy niż liniowy, a barwienie tropomiozyny było rozproszone, a nie liniowe (rycina 4A i 4B). Zatem montaż sarkomerów może zachodzić później w mięśniu zwartym w porównaniu do mięśnia beleczkowego. Ponadto odmienne wzorce s-α-actininy i tropomiozyny w strefie zwartej sugerują, że s-α-actinin organizuje się w punkta i niedojrzałe linie Z na wczesnym etapie, podczas gdy wbudowywanie tropomiozyny w cienki filament może być późniejszym zdarzeniem w procesie montażu miofibryli.

Rysunek 7, Film 1 i Film 2 przedstawiają typowe wyniki uzyskane z utrwalonego w PFA zarodkowego serca w stadium E12.5. W tych przykładach do obrazowania wykorzystano embrion transgeniczny LifeAct-RFPruby; transgen LifeAct-RFPruby19 znakuje aktynę filamentową, ale wymaga utrwalenia w PFA. Dyski Z znakowane s-α-actininą były łatwe do wizualizacji w większości obszarów, jednak stosunek sygnału do szumu był niższy w porównaniu z przekrojami serca zamrożonymi szokowo (Rysunek 7A); taki sygnał jest typowy dla immunofluorescencji s-α-actininy w tkance utrwalonej w PFA, w której epitopy mogą być maskowane przez wiązania krzyżowe białek. Rysunek 7B pokazuje współwizualizację aktyny filamentowej i immunoznakowanej s-α-actininy w obrębie miofibryli (groty strzałek) oraz aktyny filamentowej w komórkach endokardium sąsiadujących z miocytami trabekularnymi (strzałki). Trójwymiarowa rekonstrukcja obrazu ujawniła dodatkowe szczegóły: poszczególne kardiomiocyty były łatwiejsze do rozróżnienia, miofibryle w obrębie kardiomiocytu były w przybliżeniu równoległe do siebie, natomiast poszczególne kardiomiocyty były zorientowane pod różnymi kątami względem siebie (Rysunek 7C i D, Film 1 i Film 2). W widokach trójwymiarowych lepiej widoczne było również bliskie sąsiedztwo komórek endokardium i kardiomiocytów.

Schemat struktury sarkomeru przedstawiający tarczę Z, linię M, kostamer, błonę plazmatyczną i tarczę przerzutową.
Rysunek 1. Sarkomery kardiomiocytów, tarcze przerzutowe i kostamery. Tarcza Z kotwiczy filamenty aktynowe, natomiast linia M kotwiczy włókna miozynowe, które nakładają się na filamenty aktynowe. Sarkomer składa się z jednej jednostki tarcza Z – linia M – tarcza Z. Wiele sarkomerów ułożonych szeregowo tworzy miofibrylkę. Boczny koniec miofibrylki wstawia się w poprzeczną krawędź kardiomiocytu w wyspecjalizowanej strukturze połączenia międzykomórkowego nazywanej tarczą przerzutową. Obwodowe miofibrylki łączą się z podłużną błoną plazmatyczną kardiomiocytu za pomocą kostamerów, które tworzą adhezje ogniskowe z macierzą zewnątrzkomórkową pomiędzy kardiomiocytami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obraz z mikroskopii konfokalnej przedstawiający analizę lokalizacji s-α-aktyniny i β-kateniny w mięśniu sercowym.
Rycina 2. Immunofluorescencja s-α-aktyniny i β kateniny w 16,5 dniu embrionalnym. Serce zostało wycięte, gwałtownie zamrożone, poddane kriosekcjonowaniu, utrwalone acetonem i poddane immunobarwieniu z użyciem (A) mysiego przeciwciała monoklonalnego klonu EA53 przeciwko s-α-aktyninie, które znakowało tarczki Z kardiomiocytów oraz krążki przerzutowe, oraz (B) króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko białku złączy przylegających β kateninie. (C) Na zdjęciach z nałożeniem kanałów widoczne jest barwienie s-α-aktyniny i β kateniny. (D) Powiększony obszar zainteresowania z panelu C; gwiazdki zaznaczają domniemane krążki przerzutowe z ko-lokalizacją s-α-aktyniny i β kateniny. Obrazy uzyskano z obwodowej ściany lewej komory lub zwartego mięśnia sercowego, z warstwą epikardium w lewym górnym rogu paneli A-C. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 460-1600 (z możliwych 0-65535) dla obu kanałów laserowych: s-α-aktynina/488 nm i β katenina/561 nm. Pasek skali 10 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia immunofluorescencyjna β1 integryny i s-α-aktyniny w strukturze tkanki mięśnia sercowego.
Rycina 3. Immunofluorescencja s-α-aktyniny i β1 integryny w 16,5 dniu embrionalnym. Serce zostało wycięte, zamrożone szokowo, poddane kriosekcjonowaniu, utrwalone acetonem i poddane immunobarwieniu przy użyciu (A) mysiego monoklonalnego przeciwciała klonu EA53 przeciwko s-α-aktyninie oraz (B) koziego poliklonalnego przeciwciała przeciwko białku adhezji ogniskowej β1 integrynie. (C) Na zdjęciach z nałożeniem obrazów widoczna jest β1 integryna w kardiomiocytach, jak i w komórkach niebędących kardiomiocytami. Zwróć uwagę na rozproszony oraz punktowy sygnał β1 integryny w kardiomiocytach. (D) Powiększony obszar zainteresowania z panelu C. Widoczne jest punktowe, okresowe barwienie β1 integryny (strzałki) z okresowością podobną do sąsiedniego barwienia s-α-aktyniny w tarczkach Z; struktury te mogą reprezentować kostamery. Obrazy uzyskano z litego mięśniatka lewej komory. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 460-1200 (z możliwych 0-65535) dla kanału lasera s-α-aktyniny/488 nm oraz 460-600 dla kanału lasera β1 integryny/561 nm. Pasek skali 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia konfokalna włókien mięśniowych pokazująca rozkład α-aktyniny i tropomiozyny w kolorze zielonym i czerwonym.
Rycina 4. Immunofluorescencja s-α-aktyniny i tropomiozyny w 12,5 dniu embrionalnym: organizacja miofibryl w mięśniu sercowym beleczkowatym i zwartym. Serca embrionów z jednego miotu zostały wycięte, zamrożone szokowo, poddane kriosekcjonowaniu, utrwalone acetonem i poddane immunobarwieniu z użyciem (A) mysiego przeciwciała monoklonalnego klonu EA53 przeciwko s-α-aktyninie oraz (B) mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko białku cienkich filamentów miofibryl tropomiozynie (Developmental Studies Hybridoma Bank CH1). Wskazano mięsień sercowy beleczkowaty (strzałki) oraz zwarty (groty strzałek). Zauważalny jest liniowy obraz barwienia s-α-aktyniny o regularnej periodyczności w mięśniu sercowym beleczkowatym w porównaniu do różnych wzorów barwienia, w tym punktowych oraz liniowych, w warstwie zwartej (A). Zauważalne jest również liniowe barwienie tropomiozyny o regularnej periodyczności w mięśniu sercowym beleczkowatym, ale bardziej rozproszone barwienie w mięśniu sercowym zwartym. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 460-1,400 (z możliwych 0-65535) dla kanału s-α-aktyniny i 460-1,000 dla kanału tropomiozyny. Pasek skali 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna komórek serca wykazująca barwienie s-α-aktyniny, NCad i Hoechst; lokalizacja białek.
Rycina 5. Immunofluorescencja s-α-aktyniny i N-kadheryny w 12,5 dniu embrionalnym: miofibryle i krążki przerzutowe w kardiomiocytach beleczkowych. Serce zostało wycięte, błyskawicznie zamrożone, poddane kriosekcjonowaniu, fiksacji acetonem oraz immunostynowaniu przy użyciu (A) mysiej przeciwciała monoklonalnego klonu EA53 przeciwko s-α-aktyninie oraz (B) króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko białku adhezji ogniskowej N-kadherynie. Przekroje optyczne o grubości 0,2 µm zostały zebrane w stos z zachowaniem osi z, a następnie spłaszczone w celu wygenerowania obrazów. (C) Połączone spłaszczone stosy pokazują barwienie zarówno N-kadheryny, jak i s-α-aktyniny w kardiomiocytach beleczkowych, a także jądra komórkowe znakowane barwnikiem Hoechst. (D) Powiększony obszar zainteresowania z panelu C; gwiazdki oznaczają krążki przerzutowe z ko-lokalizacją s-α-aktyniny i N-kadheryny. Zakres wyświetlania histogramu intensywności wynosił 470-1 200 (z możliwych 0-65535) dla kanału lasera Hoechst/405 nm oraz 470-2 000 dla kanałów lasera s-α-aktynina/488 nm i N-kadheryna/561 nm. Pasek skali 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna białek adhezji komórkowej N-kadheryny i α-aktyniny, obrazowanie wielokolorowe.
Rysunek 6. Monowalentny fragment Fab przeciwciała IgG anty-mysiego (H+L) skutecznie blokuje wiązanie endogennych mysich IgG przez przeciwciała wtórne anty-mysie. Zarodek serca w stadium E12.5 został wycięty, zamrożony w ciekłym azocie, poddany kriosiekcjonowaniu, utrwalony acetonem i poddany immunobarwieniu. (A-C) Przekroje zablokowano 1x buforem blokującym, a następnie zastosowano monowalentny fragment Fab przeciwciała IgG anty-mysiego; następnie inkubowano z mysim monoklonalnym przeciwciałem pierwszorzędowym klonu EA53 przeciwko s-α-aktyninie oraz króliczym poliklonalnym przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko N-kadherynie, przemyto i inkubowano z przeciwciałami wtórnymi Alexa Fluor 488 anty-mysim oraz Alexa Fluor 586 anty-króliczym. (A) Obraz scalony z zakresem wyświetlania histogramu intensywności 480-2500 (z możliwych 0-65535). Gwiazdki oznaczają obszary, w których sygnał N-kadheryny jest ograniczony do poprzecznego końca kardiomiocytów beleczkowych, co prawdopodobnie reprezentuje powstające dyski przejściowe. (B) Kanał tylko dla N-kadheryny z zakresem wyświetlania histogramu intensywności 480-2,500. (C) Kanał tylko dla s-α-aktyniny z zakresem wyświetlania histogramu intensywności 480-2,500. (D-G) Przekroje zablokowano wyłącznie 1x buforem blokującym (bez etapu blokowania monowalentnym fragmentem Fab IgG anty-mysiego), inkubowano tylko z króliczym poliklonalnym przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko N-kadherynie (bez mysiego monoklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego), przemyto i inkubowano z przeciwciałami wtórnymi Alexa Fluor 488 anty-mysim oraz Alexa Fluor 586 anty-króliczym. (D) Obraz scalony z zakresem wyświetlania histogramu intensywności 480-2500. (E) Kanał tylko dla N-kadheryny z zakresem wyświetlania histogramu intensywności 480-2500. (F) Kanał tylko dla s-α-aktyniny z zakresem wyświetlania histogramu intensywności 480-2,500. (G) Kanał tylko dla s-α-aktyniny z wysokoczułym zakresem wyświetlania histogramu intensywności 480-530, który ujawnia detekcję tła endogennych mysich IgG w przypadku pominięcia etapu blokowania monowalentnym fragmentem Fab IgG anty-mysiego. (H-K) Przekroje zablokowano 1x buforem blokującym, a następnie zastosowano monowalentny fragment Fab przeciwciała IgG anty-mysiego, inkubowano z króliczym poliklonalnym przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko N-kadherynie (bez mysiego monoklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego), przemyto i inkubowano z przeciwciałami wtórnymi Alexa Fluor 488 anty-mysim oraz Alexa Fluor 586 anty-króliczym. (H) Obraz scalony z zakresem wyświetlania histogramu intensywności 480-2,500. (I) Kanał tylko dla N-kadheryny z zakresem wyświetlania histogramu intensywności 480-2,500. (J) Kanał tylko dla s-α-aktyniny z zakresem wyświetlania histogramu intensywności 480-2,500. (K) Kanał tylko dla s-α-aktyniny z wysokoczułym zakresem wyświetlania histogramu intensywności 480-530, co demonstruje brak detekcji tła endogennych mysich IgG przy zastosowaniu etapu blokowania monowalentnym fragmentem Fab IgG anty-mysiego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna aktyny i s-α-aktyniny; analiza struktury białek; schemat.
Rycina 7. Organizacja s-α-aktyniny i aktyny w kardiomiocytach beleczkowych w 12,5 dniu embrionalnym. Do wizualizacji aktyny filamentowej wykorzystano linię myszy transgenicznej LifeAct-RFPruby19, natomiast do znakowania linii Z i dysków przejściowych użyto mysiej przeciwciała monoklonalnego klonu EA53 przeciwko s-α-aktyninie. Embriony utrwalono w PFA. Przekroje optyczne o grubości 0,2 µm zebrano w postaci stosu z (z stack). (A) Spłaszczony stos z pokazuje, że barwienie s-α-aktyniny było bardziej rozproszone w tkance utrwalonej w PFA niż w przekrojach zamrożonych gwałtownie i utrwalonych w acetonie (Ryciny 2-5). (B) Spłaszczony stos z pokazuje zarówno aktynę filamentową, jak i s-α-aktyninę. Fluorescencja aktyny filamentowej zlokalizowana była pomiędzy liniami Z w obrębie miofibryli (groty strzałek). Fluorescencja aktyny filamentowej była widoczna również w komórkach endokardium wyścielających miocyty beleczkowe (strzałki). (C) Widok trójwymiarowy kardiomiocytów beleczkowych, widziany od góry stosu. (D) Widok trójwymiarowy kardiomiocytów beleczkowych, widziany od dołu stosu. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 470-900 (z możliwych 0-65535) dla kanału lasera 488 nm oraz kanału lasera 561 nm na rycinach A i B; zakres wyświetlania 460-800 dla obu kanałów na rycinach C i D. Pasek skali 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Film 1. Rotacyjny widok 3D 360° organizacji s-α-aktyniny i aktyny w kardiomiocytach beleczkowych w 12,5 dniu embrionalnym. Stos obrazów z Rysunku 6 został odwzorowany w trzech wymiarach przy użyciu wtyczki Image J 3D Viewer w programie do analizy obrazów Fiji. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 470-800 (z możliwych 0-65535) dla kanałów laserowych 488 nm i 561 nm.

Film 2. Wybrane widoki 3D organizacji s-α-aktyniny i aktyny w kardiomiocytach beleczkowych w 12,5 dniu embrionalnym. Stos obrazów z Rysunku 6 został zrenderowany w trzech wymiarach przy użyciu wtyczki Image J 3D Viewer w programie do analizy obrazów Fiji. Niewielkie obroty wokół osi x, y i z wykazały względnie równoległe ułożenie miofibryli w obrębie kardiomiocytów, ale słabe uporządkowanie między większością kardiomiocytów. Niewielkie obroty wykazały również bliskie sąsiedztwo komórek endokardium pozbawionych s-α-aktyniny wokół kardiomiocytów. Zakres wyświetlania histogramu intensywności 470-800 (z możliwych 0-65535) dla kanałów laserowych 488 nm i 561 nm.

Dyskusja

Optymalna technika utrwalania tkanek i rozcieńczenia musi być empirycznie określona dla każdego przeciwciała. W naszych rękach szybkie zamrażanie jest lepsze niż wiązanie PFA dla kilku antygenów kardiomiocytów, w tym s-α-aktyniny, β-kateniny, β1-integryny, tropomiozyny, taliny (nie pokazano) i N-kadheryny; w przeciwieństwie do tego, wiązanie PFA daje lepsze wyniki dla ogniskowej kinazy adhezyjnej (nie pokazano). Wiązania krzyżowe białek tworzone przez PFA mogą maskować epitopy i ograniczać wiązanie przeciwciał; W takich przypadkach może być wymagane pobranie antygenu, a metody pobierania antygenu można znaleźć gdzie indziej20. Stężenie PFA lub długość wiązania można zmniejszyć, aby zmniejszyć maskowanie epitopów, przy czym optymalne warunki zostaną empirycznie określone dla każdego przeciwciała i na każdym etapie rozwoju. Przy charakteryzowaniu nowego przeciwciała lub mutanta sercowego należy stosować odpowiednie kontrole ujemne, w tym surowicę przedimmunologiczną jako pierwszorzędową kontrolę przeciwciał i kontrolę "bez przeciwciał pierwotnych". Wykorzystanie myszy z nokautem jest idealną kontrolą negatywną, ale wczesna śmiertelność uniemożliwia ich wykorzystanie w wielu badanych tutaj produktach genowych.

Ważne było użycie odpowiednich objętości do całkowitego zanurzenia szkiełek doświadczalnych i kontrolnych w tych samych roztworach blokujących immunofluorescencję, przeciwciałach i roztworach do płukania, a także delikatne kołysanie szkiełkami podczas inkubacji, aby zapewnić równomierną ekspozycję skrawków na roztwory. Takie podejście zminimalizowało techniczną zmienność barwienia między sekcjami i szkiełkami w eksperymencie. Gdy koszt ogranicza objętość roztworu przeciwciała, należy użyć wstrzykiwacza Pap, aby ograniczyć przepływ roztworów poza skrawki tkanki i przechowywać szkiełka w wilgotnej komorze podczas długich inkubacji. Jeśli stosuje się monoklonalne mysie przeciwciało pierwszorzędowe - a zatem przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom - konieczne będzie wykonanie drugiego etapu blokującego w celu pokrycia endogennych mysich immunoglobulin (krok 3.4) w celu zmniejszenia niespecyficznego sygnału tła.

Odpowiednie techniki mikroskopii i przetwarzania obrazu mają kluczowe znaczenie dla uzyskania biologicznie dokładnych informacji21. Histogram intensywności wskazuje rozkład pikseli na każdym poziomie intensywności (od 0 do 65535 poziomów dla obrazu 16-bitowego) dla każdego koloru. Tło, jasność i kontrast można regulować, ustawiając zakres wyświetlania intensywności, który otacza szczyt histogramu; Aby dokonać prawidłowych porównań między warunkami, należy użyć tych samych ustawień między warunkami kontrolnymi i doświadczalnymi.

Protokół ten zapewnia wiarygodną metodę analizy dojrzewania i rozwoju kardiomiocytów w natywnym embrionalnym sercu myszy. Podczas gdy immunofluorescencja białek specyficznych dla kardiomiocytów jest często stosowana do oznaczania kardiomiocytów podczas rozwoju, niewiele badań wykorzystuje techniki, które umożliwiają analizę struktury miofibryli w wysokiej rozdzielczości i pojawienie się interkalowanych krążków i żeber12-14,22,23. Technika ta może być wykorzystana do oceny in vivo mutacji powodujących rozwojowe wady serca, jako sposób identyfikacji zmian w dojrzewaniu kardiomiocytów, które mogą rzucić światło na mechanizmy nieprawidłowości strukturalnych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Hilary Clay, Stephenowi Wilsonowi, Annie Payne-Tobin i Jamesowi Smythowi za pomocne dyskusje. Mikroskopię wykonano w Cardiovascular Research Institute Imaging Core na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Prace te były wspierane przez NIH K08 HL105657 (LDW) i NIH HL65590 (SRC).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cryomold, Jednorazowa forma bazowa, 7x 7 mmRichard-Allen Scientific58949Ten rozmiar niedostępny w Fisher Scientific
Cryomold, Jednorazowa forma bazowa, 15 x 15 mmFisher Scientific22-050-159Dostępne również w Richard-Allen Scientific, numer katalogowy 58950
Tissue-Tek Optymalna temperatura cięcia (OCT) medium 4583VWR25608-930
2-metyl butanSigmaM32631
ParaformaldehydFisher ScientificT353-500Użyj świeżego 4% roztworu w 1x PBS, pH 7,2-7,4.
SacharozaSigma S0389Użyj 15% i 30% roztworów w 1X PBS.
Jednorazowa pipeta transferowaFisher ScientificS30467-1
Prowadnice Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15"Plus" wskazuje na dodatnio naładowaną powłokę i ma kluczowe znaczenie dla utrzymania przylegania tkanki do szkiełka.
AcetonSigma179124
Triton X-100SigmaX100
Zachodni środek blokującyRoche11921673001Bufor blokujący do immunofluorescencji, gdy przeciwciała drugorzędowe pochodzą z różnych gatunków. Rozcieńczyć do 1x w PBS. 
Tween 20SigmaP9416
Donkey Anty-mysi IgG (H+L) monowalentny fragment FabJackson ImmunoResearch715-007-003Goat Anti-mouse IgG (H+L) również dostępny. Do blokowania endogennych immunoglobulin.
Przeciwciało anty-s-α-aktyninySigmaA7811Mysz monoklonalna, klon EA53. Rozcieńczyć w stosunku 1:400 dla sekcji mrożonych/utrwalanych acetonem, rozcieńczyć w stosunku 1:300 dla sekcji utrwalanych PFA. Przed inkubacją na tkance myszy zablokuj endogenne immunoglobuliny myszy monowalentnym fragmentem Fab anty-mysim IgG (H + L).
Anty-β Przeciwciało kateninoweSygnalizacja komórkowa9587sKrólik poliklonalny. Wymaga szybkiego zamrażania/utrwalania acetonem. Rozcieńczyć w stosunku 1:400.
Anty-β 1 przeciwciało integrynoweR& DAF2405Koza poliklonalna. Rozcieńczyć w stosunku 1:200. Barwienie tkanek mrożone zatrzaskowo/utrwalane acetonem jest lepsze niż tkanki utrwalane PFA.
rozwojowe przeciwciał anty-tropomiozynyHybridoma Bank, University of IowaCH1Mysz monoklonalna. Wymaga szybkiego zamrażania/utrwalania acetonem. Rozcieńczyć w stosunku 1:200. Przed inkubacją na tkance myszy zablokuj endogenne immunoglobuliny myszy monowalentnym fragmentem Fab anty-mysim IgG (H + L).
Przeciwciało anty-N-kadherynySanta Cruzsc-7939Królik poliklonalny. Rozcieńczyć w stosunku 1:200. Barwienie tkanek mrożone zatrzaskowo/utrwalane acetonem jest lepsze niż tkanki utrwalane PFA.
Przeciwciało anty-talinSigmaT3287Mysz monoklonalna, klon 8d4. Wymaga szybkiego zamrażania/utrwalania acetonem. Rozcieńczyć w stosunku 1:200. Przed inkubacją na tkance myszy zablokuj endogenne immunoglobuliny myszy monowalentnym fragmentem Fab anty-mysim IgG (H + L).
Przeciwciało przeciwko ogniskowej kinazie adhezyjnej antyfosfotyrozyny 397Invitrogen700255królika. Wymaga utrwalenia PFA. Rozcieńczyć w stosunku 1:500.
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Antibody Life TechnologiesA-21202
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Anti-Rabbit AntibodyTechnologiesA10042
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Anti-MouseTechnologiesA-11001
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)TechnologieżyciaA-11011
Hoechst 33342 barwnikLife TechnologiesH3570Bejca jądrowa
VectashieldVector labsH-1000
Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-548-5M
MLC 400B Monolityczny łącznik laserowy Skrzynka laserowaKeysight (dawniej Agilent)
Kamera CCD Clara InterlineAndor
Eclipse Ti odwrócona mikroskopNikon
CSU-X1 Skaner konfokalny z wirującym dyskiemYokogawa
CFI Plan Apochromat 4X obiektyw powietrznyNikon Przysłona numeryczna (NA) 0,2, Odległość robocza (WD) 15,7 mm
Obiektyw CFI Plan Apochromat VC 60x z immesionem olejowym (MRD01602)Nikon   NA 1.4, WD 0.13 mm
NIS Elements Oprogramowanie do obrazowaniaNikonhttp://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm
Oprogramowanie do analizy obrazuFidżihttp://fiji.sc/Fiji
Badania Przeciwciało monoklonalne Life przeciwciał

Bibliografia

  1. Risebro, C. A., Riley, P. R. Formation of the ventricles. The Scientific World Journal. 6, 1862-1880 (2006).
  2. Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circulation research. 92, 133-135 (2003).
  3. Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc. Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).
  4. Sparrow, J. C., Schock, F. The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).
  5. Kastner, P., et al. Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes. Development. 124, 4749-4758 (1997).
  6. Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC). American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).
  7. Kim, Y. Y., et al. Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture. Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).
  8. Lu, M. H., et al. The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes. The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).
  9. Schultheiss, T., et al. Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils. The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).
  10. Samarel, A. M. Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).
  11. Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).
  12. Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. N-RAP expression during mouse heart development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).
  13. Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart. Developmental biology. 289, 430-441 (2006).
  14. Whitman, S. A., et al. Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle. Circulation research. 109, 262-271 (2011).
  15. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  17. Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC. 11, 274(2010).
  18. Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis. Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).
  19. Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nature. 7, 168-169 (2010).
  20. Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).
  21. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).
  22. Risebro, C. A., et al. Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart. Development. 136, 495-505 (2009).
  23. Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments. Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Barwienie immunofluorescencyjnemikroskopia konfokalnaanaliza miofibrylikr ki przerostowewizualizacja kostamer wtechnika kriosekcjonowaniaobrazowanie Z stack3D rekonstrukcja obrazu

Powiązane artykuły