Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.
Artykuł metodologiczny
Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metoda EPA 1615 mierzy enterowirusy i norowirusy obecne w środowisku i wodach pitnych. Metoda ta została opracowana w celu uzyskania znormalizowanej metody do stosowania w wielu laboratoriach analitycznych podczas okresu monitorowania 3 Reguły Monitorowania Zanieczyszczeń Nieregulowanych. W niniejszym artykule przedstawiono protokół ekstrakcji wirusowego kwasu rybonukleinowego (RNA) z koncentratów próbek wody oraz ilościowego pomiaru stężeń enterowirusów i norowirusów metodą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR (RT-qPCR). Stężenia wirusa w teście molekularnym są obliczane w postaci kopii genomowych wirusowego RNA na litr w oparciu o krzywą standardową. Metoda wykorzystuje szereg kontroli jakości w celu poprawy jakości danych oraz zmniejszenia zmienności międzylaboratoryjnej i wewnątrzlaboratoryjnej. Metoda została oceniona poprzez zbadanie odzyskiwania wirusa z wód gruntowych i odczynników obsianych wirusem polio typu 3 i mysim norowirusem jako substytutem ludzkich norowirusów. Średnia liczba wyzdrowień po zakażeniu wirusem polio wyniosła 20% w wodach gruntowych i 44% w wodzie z odczynnikami. Średni odzysk mysiego norowirusa za pomocą testu RT-qPCR wynosił 30% w wodach gruntowych i 4% w wodzie klasy odczynnikowej.
Wprowadzenie
Ilościowy PCR (qPCR; zobacz dodatkowe materiały dla definicji terminów użytych w tym manuskrypcie) i odwrotna transkrypcja-qPCR (RT-qPCR) są cennymi narzędziami do wykrywania i ilościowego oznaczania ludzkich wirusów jelitowych w środowisku i wodach pitnych, a zwłaszcza dla wielu wirusów, które nie replikują się lub replikują się słabo w systemach hodowli komórkowych. Oba narzędzia wykazały, że wiele typów wirusów jest obecnych w wodach środowiskowych i pitnych na całym świecie1-6. Ich zastosowanie w połączeniu z sekwencjonowaniem amplifikowanych fragmentów genomu podczas badań nad wybuchem choroby dostarczyło dowodów na przenoszenie wirusa przez wodę, ponieważ wykazały, że wirus znaleziony w wodzie pitnej jest identyczny z wirusem wydalanym przez pacjentów z epidemią7-10.
Zarówno qPCR, jak i RT-qPCR są użytecznymi narzędziami zdrowia publicznego. Na przykład dane z badań przeprowadzonych przez amerykańską Agencję Ochrony Środowiska (EPA) wykazały silny związek między pomiarami wskaźnikowymi za pomocą qPCR a skutkami zdrowotnymi w wodach rekreacyjnych. W rezultacie, ostateczne kryteria jakości wody rekreacyjnej EPA z 2012 r. obejmują metodę qPCR do monitorowania plaż rekreacyjnych11,12. Borchardt i współpracownicy odkryli również silny związek między ostrym zapaleniem żołądka i jelit w społecznościach korzystających z nieoczyszczonych wód gruntowych a wirusem w wodach gruntowych, mierzonym za pomocą RT-qPCR1.
Celem tego artykułu jest opisanie składnika testu molekularnego metody EPA 161513,14. W teście tym wykorzystuje się RT-qPCR w celu ilościowego oszacowania kopii genomowych enterowirusa i norowirusa (GC) na litr w oparciu o pierwotną objętość wody środowiskowej lub pitnej przepuszczonej przez filtr elektrododatni. Przegląd procedury molekularnej przedstawiono na rysunku 1. Sekcja 1 protokołu szczegółowo opisuje procedury przygotowania krzywej standardowej. Wzorce te przygotowuje się z odczynnika, który zawiera kopię RNA sekwencji docelowej dla wszystkich zestawów starter/sonda. W sekcji 2 opisano procedurę koncentracji trzeciorzędowej. Sekcja 3 przedstawia procedurę ekstrakcji RNA ze stężonej wody i próbek kontrolnych. RNA z każdej badanej próbki jest transkrybowane wstecznie przy użyciu potrójnych testów i losowych starterów w celu zapoczątkowania transkrypcji (sekcja 4). CDNA z każdej reakcji odwrotnej transkrypcji jest dzielone na pięć oddzielnych testów specyficznych dla wirusa, które są analizowane w trzech egzemplarzach za pomocą qPCR (sekcja 5; Rysunek 2). W teście wykorzystuje się startery i sondy z literatury naukowej (Tabela 1), które są przeznaczone do wykrywania wielu enterowirusów i norowirusów oraz odczynnika zawierającego RNA wirusa zapalenia wątroby typu G w celu identyfikacji próbek testowych, które hamują RT-qPCR15.
Protokół
Uwaga: Należy używać arkuszy danych do śledzenia wszystkich etapów protokołu; przykładowe arkusze danych znajdują się w materiałach uzupełniających, Tabele S2-S4.
1. Przygotowanie krzywej wzorcowej
- Przygotować roztwór roboczy odczynnika do krzywej wzorcowej (np. Armored RNA EPA-1615), rozcieńczając go z koncentracji dostarczonej przez producenta do stężenia 2.5 x 108 particles/ml (2.5 x 108 GC/ml) przy użyciu buforu TSM III. Rozdzielić roztwór roboczy na aliquoty o objętości 250 µl do probówek mikrocentryfużkowych 1.5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Instrukcje dotyczące przygotowania roztworów roboczych wirusa i plazmidów do wykorzystania jako alternatywne odczynniki do krzywej wzorcowej znajdują się w kroku S1 protokołu materiałów uzupełniających. - rozmrozić jedną lub więcej aliquot roztworu roboczego. Przygotować pięć 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych w probówkach mikrocentryfużkowych 1.5 ml, aby uzyskać stężenia 2.5 x 107, 2.5 x 106, 2.5 x 105, 2.5 x 104 oraz 2.5 x 103 GC/ml.
- Przygotować pierwsze rozcieńczenie, dodając 25 µl roztworu roboczego o stężeniu 2.5 x 108 GC/ml do 225 µl buforu TSM III. Mieszać przez 5–15 s za pomocą wstrząsarki vortex.
- Przygotować kolejne rozcieńczenie, dodając 25 µl rozcieńczenia przygotowanego w kroku 1.2.1 do 225 µl buforu TSM III. Ponownie wymieszać i kontynuować analogiczną procedurę w celu przygotowania trzech kolejnych 10-krotnych rozcieńczeń.
- Niezwłocznie wyizolować RNA z roztworu roboczego do krzywej wzorcowej oraz z pięciu rozcieńczeń, stosując procedurę opisaną w sekcji 3.
2. Koncentracja trzeciorzędowa
- Przygotować koncentrator wirowkowy (próg odcięcia masy cząsteczkowej 30 000) dla każdej pobranej próbki, dodając co najmniej 10 ml 1x PBS z 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do górnej komory na próbkę. Upewnić się, że roztwór wypełnił wąską komorę koncentracyjną, a następnie przechowywać przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.
- Odlać ciecz. Przepłukać koncentrator jednokrotnie co najmniej 10 ml sterylnej wody klasy odczynnikowej w celu usunięcia nadmiaru BSA, a następnie odlać wodę.
- Do oddzielnych koncentratorów wirowkowych dodać ilość drugiego koncentratu wodnego z każdej próbki testowej równą S, czyli objętości próbki do analizy (Assay Sample Volume).
- Obliczyć S korzystając z równania 1,
Gdzie D to objętość analizowanej oryginalnej próbki wody (Volume of Original Water Sample Assayed), TSV to całkowita objętość próbki (Total Sample Volume), a FCSV to końcowa objętość skoncentrowanej próbki (Final Concentrated Sample Volume). Przykład obliczenia S znajduje się w materiałach uzupełniających S2.
- Obliczyć S korzystając z równania 1,
- Wirować każdą próbkę testową z przyspieszeniem 3 000–6 000 x g w temperaturze 4 °C w rotorze z koszyczkami w pozycji skośnej przez 20–30 min. Sprawdzić objętość w wąskiej komorze koncentracyjnej.
- Jeśli objętość przekracza 400 µl, wirować ponownie przez 20 min lub dłużej. Kontynuować wirowanie do momentu, aż objętość próbki w wąskiej komorze koncentracyjnej zostanie zredukowana do mniej niż 400 µl. Nie usuwać nadsączu.
- Przemyć ścianki koncentratora wirowkowego 1 ml sterylnego 0,15 M fosforanu sodu, pH 7–7,5, aby zwiększyć odzysk wirusa. Wirować ponownie przy 3 000–6 000 x g i 4 °C, aż objętość próbki zostanie zredukowana do mniej niż 400 µl. Powtórzyć ten etap płukania jeszcze raz.
- Za pomocą mikropipety 100-200 µl ostrożnie odmierzyć i przenieść każdą skoncentrowaną próbkę do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml (tj. przenieść 200 µl do probówki, a następnie odmierzyć pozostały koncentrat, regulując mikropipetę do momentu, aż pozostała ciecz zostanie całkowicie zaciągnięta do końcówki pipety). Dodać 0,15 M fosforan sodu, pH 7–7,5, aby dostosować końcową objętość do 400 ± 2 µl.
- Niezwłocznie wyizolować kwasy nukleinowe, przechodząc do kroku 3. W przypadku próbek skoncentrowanych, których nie można przetworzyć natychmiast, przechowywać je w temperaturze 4 °C nie dłużej niż przez 24 hr.
3. Izolacja kwasów nukleinowych
- Do oddzielnych, oznakowanych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodać 200 µl buforu do ekstrakcji przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 3.3 oraz 200 µl koncentratu trzeciorzędowego z każdej próbki testowej z kroku 2.5 lub rozcieńczenia krzywej wzorcowej z kroku 1.3. Pozostałe koncentraty trzeciorzędowe zamrozić w temperaturze -70 °C lub niższej. Wyekstrahować kwasy nukleinowe z każdej próbki zgodnie z instrukcją producenta zestawu do ekstrakcji kwasów nukleinowych dla protokołu wirowego dla próbek krwi, z następującymi wyjątkami.
- Nie dodawać proteazy do próbek wody ani nie używać buforu do ekstrakcji dostarczonego w zestawie do ekstrakcji kwasów nukleinowych.
- Przygotować bufor do ekstrakcji z RNA nośnikowym
- Do fiolki zawierającej 310 µg RNA nośnikowego dodać 310 µl buforu do rozcieńczania RNA nośnikowego. Wymieszać do rozpuszczenia, a następnie podzielić na 6 aliquotów zawierających około 50 µl każdy. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Dodać 28 µl rozmrożonego RNA nośnikowego na 1 ml buforu do ekstrakcji, aby uzyskać stężenie RNA nośnikowego 0,027 µg/µl. Użyć buforu do ekstrakcji z dodatkiem RNA nośnikowego zamiast buforu dostarczonego w zestawie do ekstrakcji.
- Przygotować roztwór główny buforu do elucji poprzez dodanie inhibitora rybonukleazy (RNase) do końcowego stężenia 400 jednostek/ml do buforu do elucji dostarczonego w zestawie do ekstrakcji.
- Eluować RNA z wirowej kolumny do wiązania kwasów nukleinowych, nanosząc na kolumnę 50 µl buforu do elucji z inhibitorem RNase. Odczekać 1 min, a następnie wirować przy 6 000 x g przez 1 min w temperaturze RT.
- Powtórzyć krok 3.4.1, a następnie wyjąć i zutylizować kolumnę.
- Przygotować aliquoty ekstraktów RNA z kroku 3.4.2. Przygotować 6 aliquotów roztworu roboczego krzywej wzorcowej oraz każdego rozcieńczenia krzywej wzorcowej, zawierających co najmniej 15 µl każdy. Przygotować 4 aliquoty wszystkich pozostałych próbek RNA, zawierających co najmniej 22 µl każdy. Przechowywać jeden aliquot każdej próbki i kontroli krzywej wzorcowej w temperaturze 4 °C, jeśli mogą one zostać poddane odwrotnej transkrypcji w ciągu 4 h; w przeciwnym razie wszystkie aliquoty przechowywać w temperaturze -70 °C lub niższej.
4. Odwrotna transkrypcja (RT)
- Przygotować 100 µM roztwory stokowe każdego startera oligonukleotydowego i sondy wymienionej w Tabeli 1, dodając do każdej fiolki objętość wody klasy PCR w mikrolitrach równą dziesięciokrotności liczby nanomoli (nmol) oligonukleotydu znajdującego się w fiolce (zgodnie z etykietą fiolki lub kartą specyfikacji producenta (np. starter zawierający 36,3 nmol rozpuścić w 363 µl)). Wymieszać do całkowitego rozpuszczenia.
- Rozcieńczyć roztwory 100 µM w stosunku 1:10 wodą klasy PCR, aby przygotować roztwory robocze 10 µM.
- Przygotować RT Master Mix 1 i 2 w pomieszczeniu czystym, korzystając z wytycznych w Tabeli 2. Do każdego dołka płytki PCR pipetować 16,5 µl RT Master Mix 1 za pomocą pipety wielokanałowej.
- Rozmrozić (jeśli były zamrożone) ekstrakty kwasów nukleinowych z każdej próbki terenowej oraz z matrycy próbek wzbogaconych laboratoryjnie (Lab Fortified Sample Matrix, LFSM; t.j. próbki matrycy wodnej zaszczepionej materiałem).
- Rozcieńczyć każdą próbkę terenową oraz LFSM w stosunku 1:5 i 1:25 w buforze eluującym zawierającym 400 jednostek/ml inhibitora RNazy.
- Rozmrozić (jeśli były zamrożone), ale nie rozcieńczać: próbki kontrolnej białej wzbogaconej laboratoryjnie (Lab Fortified Blank, LFB; t.j. pozytywna kontrola jakości z wykorzystaniem zaszczepionej wody klasy reagentowej), próbki kontrolnej białej reagentowej (Lab Reagent Blank, LRB; t.j. negatywna kontrola jakości z wykorzystaniem wody klasy reagentowej), próbki do oceny wydajności (Performance Evaluation, PE; t.j. próbki zaszczepionej wody klasy reagentowej używane do oceny wydajności laboratorium przed rozpoczęciem badania), próbki testu wydajności (Performance Test, PT; t.j. próbki zaszczepionej wody klasy reagentowej o mianie nieznanym analitykowi, używane do oceny wydajności laboratorium w trakcie badania), negatywną kontrolę ekstrakcji serii NA lub wyekstrahowane RNA z zestawu krzywej wzorcowej.
- Do oddzielnych dołków płytki PCR nanieść po 6,7 µl RNA z każdej próbki badawczej, kontroli i krzywej wzorcowej, stosując triplikaty dla próbek badawczych i kontroli oraz duplikaty dla krzywych wzorcowych (przykład płytki RT znajduje się na Rysunku S1).
- Do oddzielnych dołków płytki PCR nanieść po 6,7 µl buforu eluującego dla kontroli bez matrycy (no template controls, NTC). Uwzględnić od 2 do 8 NTC na płytkę RT, stosując dwie dla pierwszej próbki i kolejne dwie dla każdej czwartej dodatkowej próbki.
- Rozmieścić negatywne kontrole ekstrakcji oraz kontrole NTC na całej powierzchni płytki.
- Uszczelnić płytkę PCR termoodporną folią uszczelniającą. Mieszać próbki przez 5–10 s, a następnie krótko wirować przy ≥ 500 x g.
- Inkubować płytkę przez 4 min w temperaturze 99 °C, a następnie szybko schłodzić do 4 °C w termocyklerze. Ponownie krótko wirować przy ≥ 500 x g.
- Ostrożnie zdjąć folię uszczelniającą i dodać 16,8 µl RT Master Mix 2 do każdego dołka. Ponownie uszczelnić płytkę folią termoodporną, wymieszać i krótko wirować przy ≥ 500 x g.
- Umieścić płytkę w termocyklerze i prowadzić cykl: 15 min w 25 °C, następnie 60 min w 42 °C, 5 min w 99 °C, a na koniec cykl podtrzymania w 4 °C.
- Przetworzyć natychmiast lub w ciągu 8 h metodą qPCR (Krok 5) lub przechowywać próbki w temperaturze -70 °C lub niższej do czasu przetworzenia. Próbki, które mogą zostać przetworzone w ciągu 8 h, przechowywać w 4 °C.
5. Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)
- Przed analizą próbek testowych wyznaczyć średnią wartość Cq dla zapalenia wątroby G dla każdej partii odczynników do wykrywania zapalenia wątroby G.
- Przeprowadzić analizę RT, wykorzystując 10 powtórzeń przygotowanych zgodnie z opisem dla kontroli NTC (krok 4.1.1). Wykonać analizę qPCR dla zapalenia wątroby G zgodnie z opisem poniżej (kroki 5.2 do 5.5.3). Obliczyć średnią wartość Cq dla 10 powtórzeń.
- Jeśli jest to konieczne, dostosować ilość odczynnika do wykrywania zapalenia wątroby G w RT Master Mix 1 (Tabela 2), aby uzyskać średnią wartość Cq między 25 a 32 jednostkami. Skompensować zwiększoną lub zmniejszoną ilość, zmieniając objętość dodawanej wody, aby utrzymać końcową objętość RT Master Mix 1 na poziomie 16,5 µl na analizę.
- Potwierdzić wprowadzone korekty, powtarzając kroki 5.1.1 do 5.1.2, a następnie zaktualizować Tabelę 2, aby odzwierciedlała skorygowane ilości.
- Przygotować mieszaniny master mix do qPCR w pomieszczeniu czystym, korzystając z wytycznych zawartych w Tabeli 3 dla enterowirusów, Tabeli 4 i Tabeli 5 dla norowirusów genogrupy I, Tabeli 6 dla norowirusów genogrupy II, Tabeli 7 dla norowirusa mysiego (norowirus genogrupy V) oraz Tabeli 8 dla zapalenia wątroby G. Wymieszać każdy master mix, a następnie krótko odwirować przy ≥ 500 x g.
- Nanieść master mixy do PCR do odpowiednich dołków oznakowanej optycznej płytki reakcyjnej, stosując 14 µl na dołek i oddzielne płytki dla każdej analizy qPCR (możliwy układ analizy qPCR oparty na układzie RT z Rysunku S1 przedstawiono na Rysunku S2).
- Jeśli płytka RT z kroku 4.8 była zamrożona, rozmrozić ją w temperaturze pokojowej. Wymieszać za pomocą mieszadła do płytek, a następnie krótko odwirować przy ≥ 500 x g.
- Nanieść 6 µl odpowiedniego cDNA do właściwych dołków optycznej płytki reakcyjnej. Wymieszać próbki na optycznej płytce reakcyjnej i krótko odwirować przy ≥ 500 x g.
- Przeprowadzić analizę qPCR dla zapalenia wątroby G na nierozcieńczonych i rozcieńczonych próbkach terenowych oraz próbkach LFSM przed wykonaniem wszystkich pozostałych analiz qPCR. Użyć najniższego rozcieńczenia próbki terenowej lub LFSM, którego wartość Cq jest o <1 jednostkę wyższa niż średnia wartość Cq dla zapalenia wątroby G w analizach qPCR dla enterowirusów i norowirusów.
- Skonfigurować oprogramowanie termocyklera do ilościowej PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Zidentyfikować próbki krzywej wzorcowej jako standardy i dla każdego rozcieńczenia krzywej wzorcowej wprowadzić wartości kopii genomicznych podane w Tabeli 9.
- Inkubować płytkę w termocyklerze do ilościowej PCR przez 10 min w 95 °C, a następnie przeprowadzić 45 cykli: 15 s w 95 °C i 1 min w 60 °C.
- Ustalić, czy każda krzywa wzorcowa spełnia dopuszczalne wartości podane w Tabeli 10. Przykłady znajdują się w sekcji S3 materiałów dodatkowych.
- Obliczyć całkowite odchylenie standardowe (StdDev) dla krzywej wzorcowej, korzystając z Równania 2,
gdzie Cq jest wartością raportowaną dla każdego powtórzenia krzywej wzorcowej, Cq jest wartością średnią dla każdego zestawu powtórzeń, #Cq to całkowita liczba wartości Cq dla wszystkich powtórzeń kontroli wzorcowej, które mają wartości dodatnie (tzn. nie są niezdeterminowane), a #Stds to liczba kontroli wzorcowych, które mają wartości dodatnie. - Jeśli oprogramowanie termocyklera do ilościowej PCR nie oblicza nachylenia dla każdej krzywej wzorcowej, obliczyć nachylenie za pomocą Równania 3,
gdzie Cq jest wartością średnią dla najwyższego i najniższego użytego rozcieńczenia, a log GC jest logarytmem wartości kopii genomicznych dla najwyższego i najniższego rozcieńczenia użytego z Tabeli 9. - Obliczyć wartość R2 za pomocą Równania 4.
gdzie Cq jest średnią ze wszystkich wartości Cq, a Log GC jest średnią wartości Log GC dla każdego powtórzenia. - Obliczyć wydajność % za pomocą Równania 5:
- Obliczyć całkowite odchylenie standardowe (StdDev) dla krzywej wzorcowej, korzystając z Równania 2,
- Zarejestrować wartości GC obliczone przez oprogramowanie termocyklera dla wszystkich próbek testowych na podstawie krzywych wzorcowych spełniających kryteria określone w Tabeli 10 oraz średnie wartości GC dla każdej próbki. Powtórzyć analizę wszystkich próbek, których krzywe wzorcowe nie spełniają kryteriów w Tabeli 10 lub w których którakolwiek z kontroli negatywnych (LRB, NA Batch negative extraction control lub NTC) jest dodatnia. Ponownie przetworzyć wszystkie próbki, które nie spełniają kryteriów lub wykazują fałszywie dodatnie kontrole podczas powtórnej analizy.
- Wyznaczyć liczbę kopii genomicznych na litr (GCL) dla każdej próbki testowej za pomocą Równania 6:
gdzie GC jest średnią liczbą kopii genomicznych z kroku 5.7, czynnik „199” jest całkowitym czynnikiem rozcieńczenia dla redukcji objętości występujących podczas trzeciorzędowego zagęszczania, ekstrakcji RNA i etapów RT-qPCR, DF jest czynnikiem rozcieńczenia kompensującym inhibicję, a D jest objętością oryginalnej próbki wody poddanej analizie w litrach. Przykład obliczenia GCL znajduje się w sekcji S4 materiałów dodatkowych. - Obliczyć całkowitą liczbę GC próbek LFB i LRB, mnożąc średnią wartość GC z kroku 5.5 przez 199 i dzieląc przez 0,3.
Wyniki
Całkowity odzysk wirusa określono przy użyciu sparowanych próbek wody gruntowej pobranych z terenu oraz z LFSM. Przeanalizowano łącznie siedem zestawów próbek, w tym dwa zestawy pobrane w różnych terminach z trzech publicznych oczyszczalni ścieków oraz jeden zestaw próbek pobrany z prywatnej studni. Poziomy posiewu dla próbek LFSM wynosiły 3 x 106 MPN szczepu 3 poliovirusa Sabina oraz 5 x 106 PFU mysiego norowirusa. Mysi norowirus został użyty jako substytut w ewaluacji metody ze względu na brak zapasów ludzkiego norowirusa o stężeniu wystarczającym dla próbek LFSM. Dla próbek wody gruntowej średni odzysk poliovirusa wyniósł 20% przy błędzie standardowym 2%, 14 natomiast średni odzysk mysiego norowirusa wyniósł 30% przy błędzie standardowym 3% (Rycina 3). W regularnych próbkach wody gruntowej pobranych z terenu dla każdego LFSM nie wykryto enterowirusów ani norowirusów.
Próbki LFB i LRB zmierzono z użyciem wody o czystości reagentowej, zaszczepionej i niezaszczepionej. Wszystkie próbki LRB były ujemne (dane nie przedstawiono). Odzysk poliovirusa wyniósł średnio 44% przy błędzie standardowym 1% (Rycina 3), natomiast odzysk norowirusa mysiego wyniósł średnio 4% przy błędzie standardowym 0,5%.
RT-qPCR wymaga zastosowania odpowiednich odczynników do krzywej wzorcowej. Rycina 4 przedstawia typową krzywą wzorcową dla enterowirusa i norowirusa GII. Krzywa dla norowirusa GII spełnia kryteria wydajności krzywej wzorcowej (Tabela 10), z wartością R2 wynoszącą 0,9987, całkowitym odchyleniem standardowym 0,14 oraz wydajnością 101%. Krzywe dla norowirusów GIA i GIB (nie przedstawiono) są niemal identyczne z krzywą dla norowirusa GII. Krzywa dla enterowirusa spełnia kryteria wydajności metody z wartością R2 wynoszącą 0,9874, całkowitym odchyleniem standardowym 0,58 i wydajnością 103%, jednak charakteryzuje się około sto razy niższą czułością, a tym samym wyższym limitem detekcji niż krzywe dla norowirusów.
Rycina 1. Przegląd procedury molekularnej. Procedura molekularna obejmuje dodatkowe zagęszczenie próbki poza zakresem wykonanym w celu pomiaru wirusa zakaźnego, ekstrakcję kwasów nukleinowych, dwuetapowy protokół odwrotnej transkrypcji (RT) oraz ilościowy PCR (qPCR). Objętość początkowa (S) reprezentuje proporcję oryginalnej próbki wody zdefiniowaną przez metodę.
Rysunek 2. Schemat ogólny RT-qPCR. RNA z każdej wyekstrahowanej próbki testowej jest poddawane odwrotnej transkrypcji w trzech powtórzeniach (RT1, RT2 i RT3). Następnie cDNA z każdego z trzech powtórzeń RT jest analizowane pod kątem obecności konkretnych wirusów przy użyciu oddzielnych testów na enterowirusy (EV PCR), norowirusy genogrupy I (NoV GIA PCR i NoV GIB PCR), norowirusy genogrupy II (NoV GII PCR) oraz wirusa zapalenia wątroby G (HGV PCR).
Rysunek 3. Średni odzysk (%) poliovirusa i mysiego norowirusa z wody gruntowej i wody czystości analitycznej. Przedstawiono średni procent odzysku dla poliovirusa z wody gruntowej (
; n = 7) i wody czystości analitycznej (
; n = 12) oraz dla mysiego norowirusa z wody gruntowej (
; n = 7) i wody czystości analitycznej (
; n=12) (1), gdzie „n” oznacza liczbę przetworzonych oddzielnych próbek wody. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy.
Rysunek 4. Krzywa wzorcowa dla enterowirusa i norowirusa GII. Przedstawiono typowe krzywe wzorcowe dla enterowirusa i norowirusa GII. Wzory określające nachylenie oraz wartości R2 dla każdej krzywej są obliczane przez termocykler.
Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
| Grupa wirusów | Nazwa startera/sondy (1) | Sekwencja (2) | Referencja | |
| Enterovirus | ||||
| EntF (EV-L) | CCTCCGGCCCCTGAATG | 20 | ||
| EntR (EV-R) | ACCGGATGGCCAATCCAA | 20 | ||
| EntP (Ev-probe) | 6FAM-CGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGT-TAMRA | 21 | ||
| Norovirus GIA | ||||
| NorGIAF (JJV1F) | GCCATGTTCCGITGGATG | 22 | ||
| NorGIAR (JJV1R) | TCCTTAGACGCCATCATCAT | 22 | ||
| NorGIAP (JJV1P) | 6FAM-TGTGGACAGGAGATCGCAATCTC-TAMRA | 22 | ||
| Norovirus GIB | ||||
| NorGIBF (QNIF4) | CGCTGGATGCGNTTCCAT | 23 | ||
| NorGIBR (NV1LCR) | CCTTAGACGCCATCATCATTTAC | 23 | ||
| NorGIBP (NV1LCpr) | 6FAM-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-TAMRA | 23 | ||
| Norovirus GII | ||||
| NorGIIF (QNIF2d) | ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA | 25 | ||
| NorGIIR (COG2R) | TCGACGCCATCTTCATTCACA | 25 | ||
| NorGIIP (QNIFS) | 6FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-TAMRA | 25 | ||
| Norovirus GV | ||||
| MuNoVF1 | AGATCAGCTTAAGCCCTATTCAGAAC | 14 | ||
| MuNoVR1 | CAAGCTCTCACAAGCCTTCTTAAA | 14 | ||
| MuNoVP1 | VIC-TGGCCAGGGCTTCTGT-MGB | 14 | ||
| Hepatitis G | ||||
| HepF (starter forward 5'-NCR) | CGGCCAAAAGGTGGTGGATG | 19 | ||
| HepR (starter reverse 5'-NCR) | CGACGAGCCTGACGTCGGG | 19 | ||
| HepP (sonda TaqMan dla wirusa zapalenia wątroby G) | 6FAM-AGGTCCCTCTGGCGCTTGTGGCGAG-TAMRA | 1 | ||
Tabela 1. Primery i sondy TaqMan do wykrywania wirusów metodą RT-qPCR.
(1) Nazwy primerów i sond w metodzie 1615 stanowią trzy pierwsze litery nazwy wirusa połączone z literą F, R lub P dla primera forward, reverse oraz sondy. Genogrupa norowirusa jest oznaczana poprzez dodanie do nazw symboli GI i GII. Dwa zestawy primerów dla norowirusa GI są ponadto rozróżnione za pomocą liter A i B. Nazwy primerów i sond z głównych referencji podano w nawiasach.
(2) Orientacja sekwencji primerów i sond przebiega od 5’ do 3’. Stosowane są następujące oznaczenia zasad zdegenerowanych: N – mieszanina wszystkich czterech nukleotydów; R – A + G; Y – T + C; W – A + T oraz I – inozyna.
| Składnik | Objętość na reakcję (μl) (2) | Stężenie końcowe | Objętość na Master Mix (μl) (3) |
| RT Master Mix 1 | |||
| Losowe primery | 0.8 | 10 ng/μl (ok. 5,6 μM) | 84 |
| Opancerzony RNA wirusa zapalenia wątroby G (4) | 1 | 105 | |
| woda klasy PCR | 14.7 | 1543.5 | |
| Suma | 16.5 | 1732.5 | |
| RT Master Mix 2 | |||
| 10x bufor do PCR II | 4 | 10 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KCl | 420 |
| 25 mM MgCl22 | 4.8 | 3 mM | 504 |
| dNTP o stężeniu 10 mM | 3.2 | 0,8 mM | 336 |
| 100-mM DTT | 4 | 10 mM | 420 |
| Inhibitor RNazy | 0.5 | 0,5 j/μl | 52.5 |
| SuperScript II RT | 0.3 | 1,6 j/μl | 31.5 |
| Suma | 16.8 | 1764 | |
Tabela 2. RT Master Mix 1 i 2 (1).
(1) RT Master Mixy należy przygotować w pomieszczeniu czystym, t.j. w pomieszczeniu, w którym nie przeprowadza się procedur molekularnych i mikrobiologicznych.
(2) Końcowa objętość analizy RT wynosi 40-µl.
(3) Przedstawione objętości są obliczone dla 105 analiz. Jest to ilość wystarczająca dla płytki PCR z 96 dołkami, z uwzględnieniem dodatkowych analiz w celu zrekompensowania strat. Ilość tę można zwiększyć lub zmniejszyć w zależności od liczby analizowanych próbek i kontroli.
(4) Ilość odczynnika zapalenia wątroby G do dodania do RT Master Mix 1 należy określić zgodnie z opisem w kroku S4 materiałów uzupełniających.
| Składnik | Objętość na reakcję (μl) (2) | Stężenie końcowe | Objętość na Master Mix (μl) (3) |
| 2x LightCycler 480 Probes Master Mix | 10 | Zastrzeżone | 1050 |
| Barwnik referencyjny ROX(4) | 0.4 | 0.5 mM | 42 |
| Woda klasy PCR | 1 | 105 | |
| 10 μM EntF | 0.6 | 300 nM | 63 |
| 10 μM EntR | 1.8 | 900 nM | 189 |
| 10 μM EntP | 0.2 | 100 nM | 21 |
| Suma | 14 | 1470 |
Tabela 3. Mieszanina PCR (Master Mix) do badania enterowirusów (EV)(1).
(1) Wszystkie mieszaniny PCR należy przygotować w pomieszczeniu czystym.
(2) Końcowa objętość testu qPCR wynosi 20 µl.
(3) Przedstawione objętości są obliczone dla 105 testów. Jest to ilość wystarczająca dla płytki PCR z 96 dołkami, z uwzględnieniem dodatkowych testów w celu zrekompensowania strat. Ilość tę można zwiększyć lub zmniejszyć w zależności od liczby analizowanych próbek i kontroli.
(4) W przypadku korzystania z urządzeń, które tego nie wymagają, należy zastąpić ten odczynnik wodą klasy PCR.
| Składnik | Objętość na reakcję (μl) (2) | Stężenie końcowe | Objętość na Master Mix (μl) (3) |
| 2x LightCycler 480 Probes Master Mix | 10 | Własnościowe | 1050 |
| barwnik referencyjny ROX (4) | 0.4 | 0,5 mM | 42 |
| woda klasy PCR | 1.4 | 147 | |
| 10 μM NorGIAF | 1 | 500 nM | 105 |
| 10 μM NorGIAR | 1 | 500 nM | 105 |
| 10 μM NorGIAP | 0.2 | 100 nM | 21 |
| Suma | 14 | 1470 |
Tabela 4. Master Mix PCR do analizy Norowirusa GIA (NoV GIA)(1).
Patrz Tabela 3 w celu zapoznania się z przypisami (1)–(4).
| Składnik | Objętość na reakcję (μl) (2) | Stężenie końcowe | Objętość na Master Mix (μl) (3) |
| 2x LightCycler 480 Probes Master Mix | 10 | Własność producenta | 1050 |
| Barwnik referencyjny ROX (4) | 0.4 | 0.5 mM | 42 |
| Woda klasy PCR | 0.3 | 31.5 | |
| 10 μM NorGIBF | 1 | 500 nM | 105 |
| 10 μM NorGIBR | 1.8 | 900 nM | 189 |
| 10 μM NorGIBP | 0.5 | 250 nM | 52.5 |
| Suma | 14 | 1470 |
Tabela 5. PCR Master Mix do analizy Norowirusa GIB (NoV GIB)(1).
Patrz Tabela 3 w celu zapoznania się z przypisami (1)–(4).
| Składnik | Objętość na reakcję (μl) (2) | Stężenie końcowe | Objętość na Master Mix (μl) (3) |
| 2x LightCycler 480 Probes Master Mix | 10 | Własnościowy | 1050 |
| barwnik referencyjny ROX (4) | 0.4 | 0,5 mM | 42 |
| woda klasy PCR | 0.3 | 31.5 | |
| 10 μM NorGIIF | 1 | 500 nM | 105 |
| 10 μM NorGIIR | 1.8 | 900 nM | 189 |
| 10 μM NorGIIP | 0.5 | 250 nM | 52.5 |
| Suma | 14 | 1470 |
Tabela 6. Mieszanina PCR Master Mix do testu w kierunku Norowirusa GII (NoV GII)(1).
Komentarze (1)–(4) znajdują się w Tabeli 3.
| Składnik | Objętość na reakcję (μl) (2) | Stężenie końcowe | Objętość na Master Mix (μl) (3) |
| 2x LightCycler 480 Probes Master Mix | 10 | Własnościowe | 1050 |
| Barwnik referencyjny ROX (4) | 0.4 | 0.5 mM | 42 |
| Woda klasy PCR | 0.3 | 31.5 | |
| 10 μM MuNoVF1 | 1 | 500 nM | 105 |
| 10 μM MuNoVR1 | 1.8 | 900 nM | 189 |
| 10 μM MuNoVP1 | 0.5 | 250 nM | 52.5 |
| Suma | 14 | 1470 |
Tabela 7. Mieszanina PCR (Master Mix) do analizy norowirusa mysiego(1).
Patrz Tabela 3 w celu zapoznania się z przypisami (1)–(4).
| Składnik | Objętość na reakcję (μl) (2) | Stężenie końcowe | Objętość na Master Mix (μl)(3) |
| 2x LightCycler 480 Probes Master Mix | 10 | Własnościowy | 1050 |
| barwnik referencyjny ROX (4) | 0.4 | 0,5 mM | 42 |
| woda klasy PCR | 1.4 | 147 | |
| 10 μM HepF | 1 | 500 nM | 105 |
| 10 μM HepR | 1 | 500 nM | 105 |
| 10 μM HepP | 0.2 | 100 nM | 21 |
| Suma | 14 | 1470 |
Tabela 8. Master Mix PCR do analizy wirusa zapalenia wątroby G (HGV)(1).
Patrz Tabela 3 w celu zapoznania się z przypisami (1)–(4).
| Stężenie krzywej wzorcowej | Liczba kopii genomowych na test RT-qPCR (1, 2) |
| 2.5 x 108 | 502,500 |
| 2.5 x 107 | 50,250 |
| 2.5 x 106 | 5,025 |
| 2.5 x 105 | 502.5 |
| 2.5 x 104 | 50.25 |
| 2.5 x 103 | 5.025 |
Tabela 9. Krzywa standardowa kopii genomowych.
(1) Oznacz dołki krzywej standardowej jako standardy i wprowadź wartości kopii genomowych na analizę RT-qPCR w odpowiednim miejscu w oprogramowaniu termocyklera.
(2) Akceptowalna krzywa standardowa powinna charakteryzować się wydajnością 70%–110%, wartością R2 >0,97 oraz całkowitym odchyleniem standardowym <0,5 dla norowirusów i <1,0 dla enterowirusów.
| Kryteria | Wartość akceptowalna | |
| Norowirus | Enterowirus | |
| Całkowite odchylenie standardowe | <0.5 | <1.0 |
| R2 | >0.97 | >0.97 |
| Wydajność | 70% do 115% | 70% do 115% |
Tabela 10. Kryteria akceptacji krzywej standardowej(1).
(1) Krzywe standardowe z wydajnością (% Efficiencies) w zakresie 70%–110% są dopuszczalne, jednak wartości w zakresie 90%–115% są idealne. Wartości poniżej 90% mogą wskazywać na błędy pipetowania lub rozcieńczania.
| Komponent QA | Średni zakres odzysku (%) | Współczynnik zmienności (%) |
| Laboratoryjna ślepa próba odczynnikowa; negatywne próbki PT lub PE | 0 | N/A(1) |
| Laboratoryjna wzbogacona ślepa próba; laboratoryjnie wzbogacona macierz próbki | 5-200 | N/A |
| Pozytywne próbki PT i PE | 15-175 | ≤130 |
Tabela 11. Kryteria wydajności metody 1615.
(1) Nie dotyczy.
| Pożywka/Roztwór | Skład |
| 0.15 M fosforan sodu, pH 7.0–7.5 | Roztwór 0.15 M fosforanu sodu przygotować poprzez rozpuszczenie 40.2 g fosforanu sodu dwuzasadowego (Na2HPO4 · 7H2O) w końcowej objętości 1 L dH2O. pH dostosować do wartości 7.0–7.5 za pomocą HCl. Autoklawować w temperaturze 121 °C, pod ciśnieniem 15 psi przez 15 min. Roztwór fosforanu sodu przechowywać w RT do 12 miesięcy. |
| 5% BSA | Przygotować poprzez rozpuszczenie 5 g BSA w 100 ml dH2O. Sterylizować poprzez przefiltrowanie roztworu przez filtr sterylizujący o rozmiarze porów 0.2-μm. |
| PBS, 0.2% BSA | Przygotować poprzez dodanie 4 ml 5% BSA do 96 ml PBS. Sterylizować poprzez przefiltrowanie roztworu przez filtr sterylizujący o rozmiarze porów 0.2-μm. |
| Bufor TSM III | Rozpuścić 1.21 g Trisma base, 5.84 g NaCl, 0.203 g MgCl2, 1 ml żelatyny Prionex oraz 3 ml Microcide III w 950 ml wody czystości reagentowej. pH dostosować do wartości 7.0, a następnie dopełnić do końcowej objętości 1 L. Sterylizować poprzez przefiltrowanie roztworu przez filtr sterylizujący o rozmiarze porów 0.2-μm. |
| 0.525% podchloryn sodu (NaClO) | Roztwór 0.525% NaClO przygotować poprzez rozcieńczenie domowego wybielacza w dH2O w stosunku 1:10. Roztwory 0.525% NaClO przechowywać w RT do 1 tygodnia. |
| 1-M tiosiarczan sodu (Na2S2O3) pięciowodny | Roztwór 1 M przygotować poprzez rozpuszczenie 248.2 g Na2S2O3 w 1 L dH2O. Tiosiarczan sodu przechowywać w RT do 6 miesięcy. |
Tabela 12. Tabela pożywek.
Dyskusja
Zakrojone na szeroką skalę krajowe badania nad zanieczyszczeniem wirusowym wód źródłowych i pitnych wymagają wykorzystania wielu laboratoriów analitycznych. W tych warunkach potrzebna jest standardowa metoda w celu zapewnienia porównywalności danych uzyskanych przez wiele laboratoriów. Istnieje wiele opublikowanych metod molekularnych wykrywania wirusów, ale bardzo niewiele jest znormalizowanych metod molekularnych. Metoda EPA 1615 jest znormalizowaną metodą zaprojektowaną specjalnie do wykrywania enterowirusów i norowirusów w matrycach wodnych metodą RT-qPCR. Dostępne są znormalizowane metody molekularne do wykrywania wirusów w żywności (CEN/ISO TS 15216-1 i CEN/ISO TS 15216-2; 7 kwietnia 2013 r.)16,17 i zostały zastosowane do wykrywania wirusa zapalenia wątroby typu A i norowirusa w wodzie źródlanej16. Wszystkie standardowe metody muszą obejmować kontrole i kryteria jakości, aby zminimalizować różnice między- i wewnątrzlaboratoryjne oraz wyniki fałszywie dodatnie spowodowane zanieczyszczeniem laboratoryjnym. Aby jeszcze bardziej zmniejszyć liczbę fałszywych danych, metoda EPA 1615 jest zgodna z wytycznymi EPA dotyczącymi metod molekularnych,18 które przewidują rozdzielenie pracy podczas przetwarzania i jednokierunkowy przepływ pracy. Obejmuje kontrolę wewnętrzną przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu G1,19 oraz procedury mające na celu zminimalizowanie wyników fałszywie ujemnych spowodowanych inhibitorami RT-qPCR15. Wykorzystuje testy ilościowe wraz ze znormalizowanymi objętościami zarówno pobranej wody, jak i wody analizowanej, tak aby wszystkie dane terenowe były wyrażone w kopiach genomowych na litr próbki pola lub wody pitnej. Chociaż skuteczne testy RT-PCR z pojedynczą probówką (jednoetapowe) są dostępne na rynku, metoda celowo wykorzystuje oddzielne testy. Ma to tę wadę, że minimalizuje ilość próbki, którą można oznaczyć w każdej reakcji, ale daje większą elastyczność w stosowaniu wielu zestawów starterów. Testy RT-qPCR są ograniczone i tylko tak dobre, jak użyte startery i sondy, i prawdopodobnie żaden zestaw starterów nie wykryje wszystkich wariantów wirusa w grupie. Zestaw starterów enterowirusów został wybrany, ponieważ jest ukierunkowany na konserwatywny region 5'-non kodujący,20,21 wykrywa szeroką gamę serotypów enterowirusów, a wykryte przez niego wirusy są związane ze skutkami zdrowotnymi wynikającymi ze spożycia nieoczyszczonych wód gruntowych1. Do wykrywania norowirusów genogrupy I stosuje się dwa zestawy starterów22,23. Pierwszy z nich został wybrany ze względu na silną korelację między skutkami zdrowotnymi u małych dzieci a wykrytym wirusem1. Wybrano drugi zestaw starterów genogrupy I oraz zestaw starterów stosowanych dla norowirusów genogrupy II, ponieważ wykrywają one najszerszą różnorodność szczepów24,25.
Pomimo głównych zalet procedur qPCR i RT-qPCR w wykrywaniu wirusowego RNA w wodzie, istnieje kilka ograniczeń. Po pierwsze, zarówno zakaźne, jak i niezakaźne cząsteczki wirusa, w tym te inaktywowane przez środki dezynfekujące, mogą zostać wzmocnione przez te procedury. Wyniki badania Borchardta sugerują, że stanowi to mniejszy problem w przypadku nieoczyszczonych wód podziemnych pochodzących z warstw wodonośnych podobnych do tych w badanych zbiorowiskach niż w przypadku zdezynfekowanych wód powierzchniowych1. W przypadku wirusów hodowlanych problem ten można przezwyciężyć za pomocą PCR w połączeniu z hodowlą26,27. Problem ten został również rozwiązany w przypadku niektórych wirusów poprzez zastosowanie środków sieciujących kwasy nukleinowe28-30. To ostatnie podejście jest bardziej skuteczne w przypadku wirusów inaktywowanych przez podchloryn i nieskuteczne w przypadku wirusów inaktywowanych przez promieniowanie UV.
Drugim ograniczeniem tych procedur molekularnych jest to, że objętość zagęszczonej próbki, którą można oznaczyć, jest zazwyczaj znacznie mniejsza niż ta stosowana w procedurach hodowli6,31. Problem ten jest często rozwiązywany albo przez zastąpienie standardowego stężenia wtórnego procedurą opartą na glikolu polietylenowym za pomocą flokulacji organicznej, która pozwala na ponowne zawieszenie próbki w mniejszej objętości, albo przez dodanie trzeciorzędowego kroku stężenia próbki6,32,33. Metoda 1615 wykorzystuje ultrafiltrację odśrodkową w celu zapewnienia stężenia trzeciorzędowego. Ultrafiltracja odśrodkowa usuwa wodę i składniki o masie mniejszej niż 30 000 daltonów, co skutkuje zarówno koncentracją dowolnego wirusa w próbkach testowych, jak i zmniejszeniem inhibitorów o małej masie cząsteczkowej w testach molekularnych. Ten trzeciorzędowy krok stężenia daje ogólny współczynnik stężenia >10,5 dla każdego wirusa, który był obecny w badanej wodzie.
Trzecim ograniczeniem jest obecność inhibitorów procedur molekularnych w próbkach środowiskowych. Chociaż opracowano wiele metod usuwania inhibitorów, żadne z nich nie jest skuteczne dla wszystkich matryc wodnych i typów wirusów6,34,35, co sprawia, że niezbędne jest stosowanie wewnętrznych kontroli mających na celu oszacowanie poziomu hamowania. Odczynnik przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu G stosowany w tej metodzie spełnia ten wymóg, zapewniając stały poziom wirusowego RNA we wszystkich reakcjach oraz test RT-qPCR do oceny zahamowania. W przypadku gdy najlepsze metody usuwania inhibitorów nie są w stanie usunąć inhibicji, koncentraty próbek można rozcieńczać, o ile stężenia wirusa są wyższe niż stężenia inhibitorów14,15.
Opisana w niniejszym dokumencie procedura krzywej standardowej ma zarówno zalety, jak i poważne ograniczenia. Zaletą jest to, że zastosowany odczynnik dostarcza wszystkie niezbędne składniki w jednym odczynniku, co pozwala na użycie jednej kontroli do wszystkich testów. Ten odczynnik jest szczególnie korzystny w testach norowirusowych. Cząsteczki norowirusa można uzyskać tylko od zakażonych osób, co bardzo utrudnia uzyskanie cząstek wirusa do stosowania jako standardy. Ważniejszą zaletą jest to, że zapewnia standard RNA dla wszystkich docelowych wirusów RNA w jednym odczynniku, ponieważ posiadanie wzorca RNA jest niezbędne do dokładnej kwantyfikacji RNA36. Jednak jego zdolność do dokładnego ilościowego określenia wirusa jest ograniczona przez fakt, że efekty matrycy nie są brane pod uwagę. Oznacza to, że wartości liczby kopii genomu nie mogą być uważane za bezwzględne i powinny być rozpatrywane jedynie w kategoriach względnych. Zaleca się przygotowanie wystarczającej liczby podwielokrotności zapasu roboczego krzywej standardowej (krok 1.2) w celu pokrycia pełnych badań. Na przykład każda podwielokrotność o pojemności 250 μl dostarcza odczynnika wystarczającego na 6 płytek RT. Jeżeli wiadomo, że badanie będzie wymagało analizy 500 próbek, potrzebnych jest co najmniej 12 podwielokrotności (500 próbek/7 próbek na płytkę RT/6 płytek RT na podwielokrotność).
Metoda EPA 1615 to metoda oparta na wydajności. Wielu producentów produkuje odczynniki równoważne z tymi określonymi w niniejszym dokumencie i odczynniki te mogą być zastępowane, o ile spełnione są kryteria wydajności. Krzywa standardowa, która służy również jako dodatnia kontrola RT-qPCR, jest przydatna w rozwiązywaniu problemów z wydajnością. Wydajność może ulec pogorszeniu z powodu degradacji RNA, okresu trwałości odczynników, awarii zamrażarek, kalibracji przyrządu i błędu technicznego. Problemy z wydajnością należy podejrzewać, jeśli krzywe standardowe różnią się od krzywych pokazanych na rysunku 4 lub jeśli nie spełniają specyfikacji wydajności dla krzywych standardowych. Test RT-qPCR jest dość solidny; całkowita awaria jest prawdopodobnie spowodowana niewłaściwym obchodzeniem się z RNA lub błędem technicznym (np. brakującym odczynnikiem). Należy zachować szczególną ostrożność przy obchodzeniu się z próbkami RNA między ekstrakcją a etapem RT, aby ograniczyć degradację RNA przez rybonukleazy.
Odzysk wirusa polio z wód gruntowych i odczynników oraz odzysk mysiego norowirusa z wód gruntowych spełniły kryteria akceptacji wydajności metody EPA 1615 (Tabela 11) i są podobne do tych zgłoszonych przez innych33,37,38. Wyzdrowienia mysiego norowirusa z próbek LFB były znacznie niższe niż w przypadku wirusa polio i nie spełniałyby kryteriów akceptacji specyficznych dla wirusa polio. Przyczyny odzysku dolnego mysiego norowirusa z wody klasy odczynnikowej są nieznane. Podobnie jak w przypadku tych wyników, Karim i współpracownicy poinformowali o wyzdrowieniu z norowirusa GI.1 na poziomie 4% z wody z kranu39. Lee i wsp.37 zgłosiło średnie wyzdrowienia dla mysiego norowirusa i ludzkiego norowirusa GII.4 wynoszące odpowiednio 18% i 26% z wody destylowanej przy użyciu filtrów dyskowych. Stosując podobne warunki do Lee i współpracowników, Kim i Ko zaobserwowali wyzdrowienia na poziomie 46% i 43% odpowiednio dla tych wirusów,38. Gibbons i wsp.40 uzyskało około 100% odzysku ludzkiego norowirusa GII.4 z wody morskiej, ale Kim i Ko38 odkryli, że dodanie soli do wody destylowanej w stężeniach podobnych lub wyższych niż woda morska znacznie zmniejszyło odzysk mysiego wirusa i spowodowało około dwukrotne zmniejszenie odzysku GII.4.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Dr. Ericowi Rhodesowi za przygotowanie klonów użytych do opracowania odczynnika o krzywej standardowej, Brianowi McMinnowi za pomoc w przetwarzaniu próbek, Larry'emu Wymerowi za analizę statystyczną, Dr. Markowi Borchardtowi, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, za dostarczenie serotypu 3 wirusa polio Sabin użytego w tym badaniu oraz Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, na mysiego norowirusa. Autorzy dziękują również Gretchen Sullivan za pomoc w przygotowaniu podstawowych odczynników laboratoryjnych, dr Mohammadowi Karimowi za rozmnażanie zapasów mysiego norowirusa oraz lokalnym prywatnym właścicielom studni i zakładom użyteczności publicznej za umożliwienie nam pobrania próbek wody. Mimo że praca ta została zrecenzowana przez EPA i zatwierdzona do publikacji, niekoniecznie musi odzwierciedlać oficjalną politykę Agencji. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do użycia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komora na probówkę 1,5 ml | Diversified Biotech | -3000 | |
| 1 ° C chłodna cegła | Zróżnicowana biotechnologia | BRIK-2501 | |
| 10x bufor PCR II i 25-mM MgCl2 | Life Technologies | N8080130-20 | |
| ° C zamrażarka | VWR | 97043-346 | Musi to być ręczna zamrażarka do rozmrażania-70 |
| & deg; C lub chłodniejsza zamrażarka | Thermo Scientific | MBF700LSAO-E | |
| komora | Zróżnicowana Biotechnologia | -1000 | |
| Absolutny etanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Opancerzone RNA EPA-1615 | Asuragen | Zamówienie niestandardowe | Służy do ilościowego oznaczania testu RT-qPCR |
| Opancerzony wirus zapalenia wątroby typu G RNA | Asuragen | 42024 | |
| Autoklaw | Steris | Amsco Lab | |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego | Zaopatrzenie w sprzęt laboratoryjny NuAir | Labgard 437 ES | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Affymetrix | 10856 | Bufor krystaliczny lub lepszy |
| AVE | Qiagen | 1026956 | Bufor do rozcieńczania nośnego RNA |
| Bufor AVL | Qiagen | 19073 | Ekstrakcja bufor |
| Nośnik RNA | Qiagen | Nie dotyczy | Użyj nośnika RNA dostarczany z buforem AVL |
| Butelki wirówki | Fisher Scientific | 05-562-23 lub 05-562-26 | |
| Wirniki wirówek | Beckman Coulter | 339080, 336380 | |
| Fajny sejf | Zróżnicowana biotechnologia | CSF-BOX | |
| Ditiothreitol (DTT) | Promega | P1171 | |
| Sondy LightCycler® 480 Zestaw Master | Roche Diagnostics | 4707494001 | |
| Probówki do mikrowirówek | Fisher Scientific | 02-682-550 | Używaj probówek bez rybonukleazy i dezoksyrybonukleazy z zatrzaskami |
| Microcide III | Fitzgerald | 99R-103 | |
| Folia Microseal "A" | Bio-Rad Laboratories | HSA5001 | Heat odporna |
| folia "F" | Microseal Bio-Rad | Laboratories MSA1001 | Odporny na zamrażanie |
| Mini talerzyk | Labnet International | MPS1000 | |
| Pipeta wielokanałowa | Rainin | L8-20 | |
| Komora wielorurkowa | Zróżnicowana biotechnologia | -5000 | |
| Optyczna płytka reakcyjna | Technologie życia | ||
| Mieszanka nukleotydów PCR | Płytka PCR Promega | U1515 | |
| Bio-Rad Laboratories | HSS9601 | ||
| Woda klasy PCR | Roche | 3315932001 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) | U.S. Biological | D9820 | |
| Mieszalnik płytkowy | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Prionex żelatyna | Sigma Aldrich | G0411 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Zawiera AW1 (bufor do pierwszego płukania), AW2 (bufor do drugiego płukania), AE (bufor elucyjny); przed użyciem do AW1 i AW2 należy dodać etanol; Nie używać buforu AL dostarczonego z zestawem |
| Ilościowy termocykler PCR | Life Technologies | 4351405 | |
| Losowy starter | Promega | C1181 | |
| Odczynnik Reservoir | Fisher Scientific | 21-381-27E | |
| Wirówka z chłodzeniem | Beckman Coulter | 367501 | |
| Inhibitor RNazy | Promega | N2515 lub N2615 | |
| Barwnik referencyjny ROX | Life Technologies | 12223 | |
| SuperScript II lub III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-022 lub 18080044 | |
| Rękawice chirurgiczne | Fisher Scientific | 19-058-800 | |
| Termocykler | Life Technologies | 4314879 | |
| Baza Trisma | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Koncentratory odśrodkowe Vivaspin 20 | Sartorius-Stedim | VS2022 |
Bibliografia
- Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness. Environ. Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).
- Ye, X. Y., et al. Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and treated drinking water in Wuhan, China. Curr. Microbiol. 65 (3), 244-253 (2012).
- Williamson, W. M., et al. Enteric viruses in New Zealand drinking-water sources. Water Sci. Technol. 63 (8), 1744-1751 (2011).
- Lambertini, E., Borchardt, M. A., Kieke, B. A., Spencer, S. K., Loge, F. J. Risk of viral acute gastrointestinal illness from nondisinfected drinking water distribution systems. Environ. Sci. Technol. 46 (17), 9299-9307 (2012).
- Chigor, V. N., Okoh, A. I. Quantitative RT-PCR detection of hepatitis A virus, rotaviruses and enteroviruses in the Buffalo River and source water dams in the Eastern Cape Province of South Africa. Int. J. Environ. Res. Public Health. 9 (11), 4017-4032 (2012).
- Fout, G. S., Martinson, B. C., Moyer, M. W., Dahling, D. R. A multiplex reverse transcription-PCR method for detection of human enteric viruses in groundwater. Appl. Environ. Microbiol. 69 (6), 3158-3164 (2003).
- Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort. Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).
- Jack, S., Bell, D., Hewitt, J. Norovirus contamination of a drinking water supply at a hotel resort. New Zealand Med. J. 126 (1387), 98-107 (2013).
- Anderson, A. D., et al. A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001. J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).
- Parshionikar, S. U., et al. Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus. Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).
- U.S. Environmental Protection Agency Office of Water. 820-F-12-058: Recreational Water Quality Criteria. , 1-63 (2012).
- Wade, T. J., et al. Rapidly measured indicators of recreational water quality and swimming-associated illness at marine beaches: a prospective cohort study. Environ. Health. 9, 66(2010).
- Fout, G. S., et al. Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR (EPA/600/R-10/181). , U. S. Environmental Protection Agency. 1-91 (2012).
- Cashdollar, J. L., et al. Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water. Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).
- Gibson, K. E., Schwab, K. J., Spencer, S. K., Borchardt, M. A. Measuring and mitigating inhibition during quantitative real time PCR analysis of viral nucleic acid extracts from large-volume environmental water samples. Water Res. 46 (13), 4281-4291 (2012).
- Fuentes, C., et al. Standardized multiplex one-step qRT-PCR for hepatitis A virus, norovirus GI and GII quantification in bivalve mollusks and water. Food Microbiol. 40, 55-63 (2014).
- Coudray, C., Merle, G., Martin-Latil, S., Guillier, L., Perelle, S. Comparison of two extraction methods for the detection of hepatitis A virus in lettuces using the murine norovirus as a process control. J. Virol. Methods. 193 (1), 96-102 (2013).
- Sen, K., et al. EPA 815-B-04-001: Quality assurance/quality control guidance for laboratories performing PCR analyses on environmental samples. , U.S. Environmental Protection Agency. 1-56 (2004).
- Schlueter, V., Schmolke, S., Stark, K., Hess, G., Ofenloch-Haehnle, B., Engel, A. M. Reverse transcription-PCR detection of hepatitis G virus. J. Clin. Microbiol. 34 (11), 2660-2664 (1996).
- De Leon, R., Shieh, C., Baric, R. S., Sobsey, M. D. Detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples by gene probes and polymerase chain reaction. Proc. Water Qual. Technol. Conf. 1990 Nov 11-15, , 833-853 (1990).
- Monpoeho, S., et al. Quantification of enterovirus RNA in sludge samples using single tube real-time RT-PCR. BioTechniques. 29 (1), 88-93 (2000).
- Jothikumar, N., et al. Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples. Appl. Environ. Microbiol. 71 (4), 1870-1875 (2005).
- da Silva, A. K., et al. Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II. Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).
- Butot, S., et al. Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus. J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).
- Loisy, F., et al. Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish. J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).
- Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).
- Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR. Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).
- Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples. Appl. Environ. Microbiol. 76 (13), 4318-4326 (2010).
- Sanchez, G., Elizaquivel, P., Aznar, R. Discrimination of infectious hepatitis A viruses by propidium monoazide real-time RT-PCR. Food Environ. Virol. 4 (1), 21-25 (2012).
- Kim, S. Y., Ko, G. Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria, MS2 and murine norovirus. Lett. Appl. Microbiol. 55 (3), 182-188 (2012).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178: ICR Microbial Laboratory Manual, I.1-ApD-23. , U.S. Environmental Protection Agency. (1996).
- Abbaszadegan, M., Stewart, P., LeChevallier, M. A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 444-449 (1999).
- Lambertini, E., et al. Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters. Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).
- Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters. J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).
- Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples. J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).
- Fey, A., et al. Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).
- Kim, M., Ko, G. Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters. J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).
Przedruki i uprawnienia
