Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie mikrocząstek limfocytarnych i wykrywanie ich proapoptotycznego wpływu na komórki nabłonka dróg oddechowych

DOI:

10.3791/52651

⸱

20 lutego 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Pediatrics and Pharmacology, University of Montréal, 2Department of Pulmonology, Chongqing Southwest Hospital, Third Military Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrocząsteczki (MPs) z błoną komórkową są aktywnymi pęcherzykami biologicznymi, które można izolować, a ich patofizjologiczne efekty badać w różnych modelach. W tym miejscu opisano metodę generowania MP pochodzących z limfocytów T (LMP) i wykazywania ich proapoptotycznego działania na komórki nabłonka dróg oddechowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zainteresowanie biologicznymi rolami pęcherzyków pochodzących z błony komórkowej w komunikacji między komórkami wzrosło w ostatnich latach. Mikrocząstki (MP) są jednym z takich rodzajów pęcherzyków o średnicy od 0,1 μm do 1 μm i zwykle wydalane z błony plazmatycznej komórek eukariotycznych poddawanych aktywacji lub apoptozie. Tutaj opisujemy wytwarzanie mikrocząstek pochodzących z limfocytów T (LMP) z apoptotycznych limfocytów T CEM stymulowanych aktynomycyną D. LMP są izolowane w wieloetapowym procesie wirowania różnicowego i charakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten przedstawia również metodę wykrywania śmierci komórki in situ w celu wykazania proapoptotycznego wpływu LMP na komórki nabłonka oskrzeli pochodzące z pierwotnych eksplantatów tkanki oskrzelowej układu oddechowego myszy. Metody opisane w niniejszym dokumencie zapewniają powtarzalną procedurę izolowania obfitych ilości LMP z limfocytów apoptotycznych in vitro. Uzyskane w ten sposób LMP mogą być wykorzystywane do oceny charakterystyki różnych modeli chorób oraz do badań farmakologicznych i toksykologicznych. Biorąc pod uwagę, że nabłonek dróg oddechowych stanowi ochronną fizyczną i funkcjonalną barierę między środowiskiem zewnętrznym a leżącą pod nim tkanką, zastosowanie eksplantatów tkanki oskrzelowej zamiast unieśmiertelnionych linii komórkowych nabłonka stanowi skuteczny model do badań wymagających tkanki dróg oddechowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrocząsteczki (MPs) to biologicznie aktywne submikronowe pęcherzyki błonowe uwalniane po aktywacji lub apoptozie komórek. MP pochodzą zarówno ze zdrowych, jak i uszkodzonych komórek i biorą udział w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych. 1 MP wykryto nie tylko w ludzkim osoczu, ale także w tkance zapalnej i apoptotycznej. Biologiczna użyteczność MP pochodzących z błony komórkowej została zademonstrowana w różnych warunkach, w tym w modelach sygnalizacji komórkowej i jako narzędzia farmakologiczne. 2,3 Wcześniej wykazaliśmy, że LMP pochodzące z limfocytów T po stymulacji aktynomycyną D (w celu wywołania apoptozy) hamują angiogenezę i ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Samce myszy C57BL/6 (w wieku 5-7 tygodni) pochodzą z Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Kanada.) i są manipulowane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Opieki nad Zwierzętami CHU Sainte-Justine. Eksplantaty tkanki oskrzelowej myszy stanowią dobre źródło pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do badania proapoptotycznego wpływu LMP na komórki nabłonka. Protokół ten opisuje wytwarzanie LMP in vitro, a także metodę wykrywania apoptotycznych komórek nabłonkowych na eksplantatach tkanki oskrzelowej poddanych działaniu LMP. Protokół ten składa się z 3 sekcji.

1. Produkcja i charakteryst....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LMP scharakteryzowano barwieniem aneksyny V10 za pomocą analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i bramkowano za pomocą kulek 1 μm, w których 97% MP (≤1 μm) było dodatnich pod względem aneksyny-V-Cy5 (Rysunek 1A i 1B). Zazwyczaj około 2,5 mg LMP uzyskiwano zgodnie z tym protokołem. Eksplantaty tkanki oskrzelowej myszy C57BL / 6 poddano leczeniu nośnikiem i LMP. Analiza histopatologiczna odcinków oskrzeli wykazała wpływ LMP na integralność strukturalną nabłonka oskrzeli. W k.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MP są aktywnymi mediatorami wzajemnych przesłuchów międzykomórkowych, a ich badania są obiecujące w wielu dziedzinach nauki. 11 W badaniu tym przedstawiono szczegółowy protokół wytwarzania in vitro na dużą skalę LMP pochodzących z apoptotycznej linii komórek T. Te MP wyrażają duży repertuar cząsteczek limfocytów i są biologicznie zaangażowane w regulację homeostazy komórkowej i tkankowej. Jednak LMP pochodzące z różnych źródeł mogą różnić się biologicznie. 4,9,12,13

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez granty z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (178918), Fonds de recherche en santé du Québec - Vision Health Research Network.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Produkcja i charakterystyka LMP
T CEM ATCC CCL-119
X-VIVO 15 średni Cambrex, Walkersville04-744Q
Kolba T75Sarstedt83.1813.502
Kolba T175Sarstedt83.1812.502
Actinomycin  D Sigma Chemical Co.A9415-2mg
PBSLifetechnologies14190-144
0,22 i mikro; m filtrSarstedt83.1826.001
Załącznik-VCy5BD Pharmagen 
Rozwiązanie przepływowe FACSBD Bio-sciences342003
Mikrokulki fluorescencyjne (1 &mikro; m)Sondy molekularne T8880
Koraliki do liczenia z polistyrenu (7 &mikro; m)Bangs laboratoriesPS06N/6994
Probówki polipropylenowe FACSFalcon352058
1 ml pipetaFisher13-678-11B
pipeta 5 mlFalcon357543
pipeta 25 mlUltidentDL-357551
1,5 ml stożkowa mikroprobówka polipropylenowaSarstedt72.690
Stożkowa probówka polipropylenowa 15 mlSarstedt62.554.205
50 ml stożkowa rurka polipropylenowaSarstedt62.547.205
50 ml szybka rurka z kopolimeru polipropylenowegoNalgene3119-0050
Butelka polipropylenowa o dużej prędkości 250 mlBeckman356011
Test białka (test Bradforda)Bio-Rad Laboratories500-0006
Norma oznaczania białek IIBio-Rad Laboratories500-0007
Probówka 16 x 100VWR47729-576
Probówka 12 x 75Ultident170-14100005B
Inkubator komórek MandelHeracell 150
Wirówka wolnoobrotowaIECCentra8R
Wirówka szybkoobrotowaBeckmanAvanti J8
Wirnik wysokoobrotowy do butelki 250mlBeckmanJLA16.250
Wirnik szybkoobrotowy do probówki 50mlBeckmanJA30.50
Cytometria Fow BD Bio-sciencesFACS Spektrofotometr Calibur
BeckmanSeries 600
Eksplantaty i sekcje tkanki oskrzeli 
Myszy C57BL/6 (5-7 tygodni)   Charles River Laboratories, Inc. 
Mysie drogi oddechowe PrimaCell™ System:CHI Scientific, Inc.2-82001
  Ostrza skalpela ze stali węglowej BectonDickinson AcuteCare371310#10
Rękojeść skalpelaFine Science Tools Inc. 10003-12#7
odwrócony z kontrastem fazowymOlympus Optical CO., LTD.     CK2
mieszanina gazów o wysokiej zawartości O2 VitalAire Kanada Inc.
modułowa komora inkubatoraBillups-Rothenberg Inc.MIC-101
MaxQ 4000 inkubowana wytrząsarka orbitalnaBarnstead Lab-Line, SHKA4000-7
12-dołkowa płytka do hodowli tkankowejBecton Dickinson and Company353043
Plastikowe szalki do hodowli tkanek (100 mm)Sarstedt, Inc.83.1802
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools Inc. 14060-09Proste, ostre, 9 cm długości
Półzakrzywione kleszcze GraefeFine Science Tools Inc. 11052-10
nawilżany inkubator CO2Mandel Scientific Company Inc. SVH-51023421
  Badanie histopatologiczne 
formalina formaldehydSigma-Aldrich, Inc. HT5011
parafinaFisher scientific  Międzynarodowy, Inc.T555
Merck KGaA, DarmstadtEX0278-1
  Aldehyd glutarowy Sigma-Aldrich, Inc. G6403
CacodylateSigma-Aldrich, Inc. 31533
Szkiełka mikroskopoweVWR Scientific Inc. 48300-02525x75 mm
KsylenFisher naukowy  Międzynarodowy, Inc.X5-4
Hematoksylina MayeraSigma-Aldrich, Inc. MHS16Lejek z bibułą filtracyjną   
HCl Fisher naukowy  Międzynarodowa, Inc.   A144s-500
eosin Sigma-Aldrich, Inc. HT110116Lejek z bibułą filtracyjną   
Permount i handel; Średni montażThermo Fisher Scientific Inc. SP15-100
szklane szkiełko nakrywkowesurgipath medical industries, Inc.8450324 razy; 24 #1 
Zestaw do wykrywaniaśmierci komórek TUNEL In situ, POD11 684 817 910
piekarnikDespatch Industries Inc.LEB-1-20
Mikrotom obrotowyLeica Microsystems Inc.RM2145
Whatman International Ltd.1003150#3
MikroskopNikon Imaging Japan Inc.E800
kompletne Wheaton Industries, Inc.900200wraz z naczyniem, stojakiem, pokrywą
1,5 ml probówka eppendorfSarstedt Inc. 72.6939x10 mm
Orbitalna i posuwisto-zwrotna kąpiel wodnaExpotechUSAORS200
sól fizjologiczna buforowana fosforanem   Wyciąg GIBCO14190-144
Nicram RD Service3707E
limfocytów 559933 mikroskop Alkohol etylowy Bibuła filtracyjna Naczynie do barwienia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).
  2. Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Generowanie mikrocz stekcytometria przep ywowabarwienie aneksyn Veksplanty tkanki oskrzelowejwirowanie r nicowewykrywanie mierci kom reklimfocyty T

Powiązane artykuły