Wytwarzanie mikrocząstek limfocytarnych i wykrywanie ich proapoptotycznego wpływu na komórki nabłonka dróg oddechowych

Podsumowanie

Mikrocząsteczki (MPs) z błoną komórkową są aktywnymi pęcherzykami biologicznymi, które można izolować, a ich patofizjologiczne efekty badać w różnych modelach. W tym miejscu opisano metodę generowania MP pochodzących z limfocytów T (LMP) i wykazywania ich proapoptotycznego działania na komórki nabłonka dróg oddechowych.

Streszczenie

Zainteresowanie biologicznymi rolami pęcherzyków pochodzących z błony komórkowej w komunikacji między komórkami wzrosło w ostatnich latach. Mikrocząstki (MP) są jednym z takich rodzajów pęcherzyków o średnicy od 0,1 μm do 1 μm i zwykle wydalane z błony plazmatycznej komórek eukariotycznych poddawanych aktywacji lub apoptozie. Tutaj opisujemy wytwarzanie mikrocząstek pochodzących z limfocytów T (LMP) z apoptotycznych limfocytów T CEM stymulowanych aktynomycyną D. LMP są izolowane w wieloetapowym procesie wirowania różnicowego i charakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten przedstawia również metodę wykrywania śmierci komórki in situ w celu wykazania proapoptotycznego wpływu LMP na komórki nabłonka oskrzeli pochodzące z pierwotnych eksplantatów tkanki oskrzelowej układu oddechowego myszy. Metody opisane w niniejszym dokumencie zapewniają powtarzalną procedurę izolowania obfitych ilości LMP z limfocytów apoptotycznych in vitro. Uzyskane w ten sposób LMP mogą być wykorzystywane do oceny charakterystyki różnych modeli chorób oraz do badań farmakologicznych i toksykologicznych. Biorąc pod uwagę, że nabłonek dróg oddechowych stanowi ochronną fizyczną i funkcjonalną barierę między środowiskiem zewnętrznym a leżącą pod nim tkanką, zastosowanie eksplantatów tkanki oskrzelowej zamiast unieśmiertelnionych linii komórkowych nabłonka stanowi skuteczny model do badań wymagających tkanki dróg oddechowych.

Wprowadzenie

Mikrocząsteczki (MPs) to biologicznie aktywne submikronowe pęcherzyki błonowe uwalniane po aktywacji lub apoptozie komórek. MP pochodzą zarówno ze zdrowych, jak i uszkodzonych komórek i biorą udział w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych. ¹ MP wykryto nie tylko w ludzkim osoczu, ale także w tkance zapalnej i apoptotycznej. Biologiczna użyteczność MP pochodzących z błony komórkowej została zademonstrowana w różnych warunkach, w tym w modelach sygnalizacji komórkowej i jako narzędzia farmakologiczne. ^2,3 Wcześniej wykazaliśmy, że LMP pochodzące z limfocytów T po stymulacji aktynomycyną D (w celu wywołania apoptozy) hamują angiogenezę i hamują przeżycie i proliferację komórek śródbłonka. ^4,5 Antyangiogenne działanie LMP może się znacznie różnić w zależności od bodźców stosowanych do aktywacji limfocytów T in vitro. ⁶

Nabłonek dróg oddechowych funkcjonuje jako ochronna fizyczna i funkcjonalna bariera. Zwiększona liczba limfocytów T w drogach oddechowych może przyczyniać się do uszkodzenia komórek i zapalenia dróg oddechowych. ⁷ Wykazaliśmy, że LMP indukują apoptozę ludzkich komórek nabłonka oskrzeli,8 co wskazuje, że LMP mogą zmieniać funkcję barierową nabłonka oskrzeli in vivo. Komórki apoptotyczne można zidentyfikować za pomocą metody TUNEL, która wykrywa fragmentację DNA in situ.

Ogólnym celem tego protokołu jest zilustrowanie produkcji in vitro LMP z linii komórkowej limfocytów T oraz zademonstrowanie ich proapoptotycznego wpływu na komórki nabłonka dróg oddechowych. Wykrywanie śmierci komórki in situ wykazało, że LMP silnie indukują śmierć komórek nabłonka oskrzeli dróg oddechowych, co sugeruje, że uszkodzenie nabłonka dróg oddechowych za pośrednictwem LMP może wpływać na funkcję barierową uszkodzonego nabłonka.

Protokół

UWAGA: Samce myszy C57BL/6 (w wieku 5–7 tygodni) pochodzą z Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Kanada) i były traktowane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami CHU Sainte-Justine. Eksplanty tkanki oskrzelowej myszy stanowią dobre źródło pierwotnych komórek nabłonka oskrzelowego do badania proapoptotycznego działania LMP na komórki nabłonkowe. Niniejszy protokół opisuje generowanie LMP in vitro, a także metodę wykrywania apoptotycznych komórek nabłonkowych w eksplantach tkanki oskrzelowej traktowanych LMP. Protokół składa się z 3 sekcji.

1. Produkcja i charakterystyka LMP

UWAGA: Aby zapobiec kontaminacji, należy upewnić się, że wszystkie materiały użyte w tym eksperymencie są sterylne lub poddane autoklawowaniu. Wszystkie kroki należy przeprowadzać w RT w komorze bezpieczeństwa biologicznego w warunkach sterylnych, chyba że wskazano inaczej.

1.1) Stymulacja i pobieranie MP⁹

1. Rozmrozić alikwot 10 milionów komórek T CEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć w 10 ml uprzednio ogrzanego, wolnego od surowicy medium do komórek hematopoetycznych (np. X-VIVO) w sterylnej probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 g przez 5 min. Odessać nadsącz i resuspendować komórki w 5 ml ogrzanego medium.
2. Przenieść komórki do kolby hodowlanej T75 (do komórek w zawiesinie) z 15 ml ogrzanego medium hematopoetycznego (np. X-VIVO) i inkubować przez 4 dni w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ .
3. Po 4 dniach przenieść całe medium hodowlane wraz z komórkami do kolby hodowlanej T175 zawierającej 100 ml świeżego medium. Kontynuować inkubację komórek przez około 72 h w tych samych warunkach, aż osiągną gęstość 2 milionów komórek/ml.
4. Równomiernie rozdzielić komórki pomiędzy cztery kolby T175, z których każda zawiera 150 ml świeżego medium, i kontynuować hodowlę, aż komórki urosną (około 48 h inkubacji) do gęstości 2 milionów/ml.
5. Zebrać komórki z każdej kolby poprzez wirowanie przy 200 x g przez 5 min i resuspendować 300 x 10⁶ komórek w nowej kolbie T175 zawierającej 150 ml świeżego medium, aby utrzymać gęstość komórek na poziomie 2 milionów/ml.
6. Dodać do medium aktynomycynę D (rozpuszczoną w DMSO w stężeniu 2 mg/ml) do końcowego stężenia 0,5 µg/ml i inkubować przez 24 h.
7. Przenieść całe medium hodowlane do probówek stożkowych o pojemności 50 ml i odwirować komórki przy 750 x g przez 5 min. Przenieść nadsącz do probówek stożkowych 50 ml i wirować przy 1 500 x g przez 15 min w celu usunięcia dużych fragmentów komórek.
8. Przenieść nadsącz do butelki o pojemności 250 ml i poddać ultrawirowaniu przy 12 000 x g przez 50 min. Odlać nadsącz i zebrać osady.
9. Przemyć osady wzbogacone w LMP 40 ml sterylnego PBS w probówce 50 ml poprzez wirowanie przy 12 000 x g przez 50 min. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
10. Zebrać nadsącz z ostatniego przemywania; zostanie on wykorzystany jako kontrola nośnika. Resuspendować osady LMP w 1 ml PBS i przenieść do sterylnej mikroprobówki 1,5 ml. Podzielić na alikwoty i przechowywać wyizolowane LMP w temperaturze -80 °C (aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania).

1.2) Charakterystyka MP za pomocą analizy FACS ⁴

1. Przygotuj 2 próbki buforu do aneksyny, jedną z dodatkiem $\text{CaCl}_2$ i drugą bez $\text{CaCl}_2$₂Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, plus lub minus 5 mM CaCl2₂.
2. Przefiltruj bufor do anneksyny oraz płyn osłonowy do analizy FACS za pomocą 0.22 µm filtr w celu usunięcia cząstek.
3. Rozcieńczyć 1 µl białek błony mitochondrialnej (LMP) w 44 µl buforu do aneksyny z 5 mM CaCl2₂ do probówki do FACS. Przygotować inną probówkę z 1 µl białek błony komórkowej w 44 µl buforu do aneksyny bez CaCl2₂ (kontrola negatywna).
4. Dodaj 5 µl anneksyny V-Cy5 do każdej probówki i dokładnie wymieszać. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Przerwać reakcję, rozcieńczając mieszaninę za pomocą 400 µl płynu osłonowego do FACS w każdej probówce.
5. Dodać 10 µl (200 000 kulek) 7 µm zawiesinę kulek liczonych jako standard wewnętrzny w każdej probówce w celu uzyskania bezwzględnej liczby komórek.
6. Wyznacz bramki na wykresie kropkowym wielkości względnej (FSC-H, PMT E00, skala logarytmiczna) oraz granulacji względnej (SSC-H, PMT 325, skala logarytmiczna) w cytometrze przepływowym, wykorzystując kalibrowane rozmiarowo koraliki fluorescencyjne o 1 µm (bramka 1) i bramka dla kulek liczących na poziomie 7 µm (bramka 2).
7. Przeanalizuj próbkę LMP na wykresie FSC-H / SSC-H przy użyciu ustalonych bramek oraz kanał FL-4 dla aneksyny (PMT 765, skala logarytmiczna) na wykresie kropkowym, rejestrując sygnał do momentu uzyskania 20 000 kulek zliczających w bramce 2.
8. Wyznacz liczbę zdarzeń dodatnich dla anneksyny V w przypadku LMPs w buforze do anneksyny zawierającym CaCl2₂a następnie odjąć liczbę zdarzeń LMP w buforze z anneksyną bez dodatku CaCl2₂ (kontrola negatywna).
9. Oblicz bezwzględną liczbę MP, korzystając z następującego równania:
   

1.3) Oznaczanie stężenia białka MP (metoda Bradforda)

1. Przygotować 5 rozcieńczeń seryjnych standardu białka w zakresie od 1,25 do 20 µg/ml. Do czystych probówek pipetować po 800 µl każdego roztworu standardu i próbki w dwóch powtórzeniach. Do każdej probówki dodać 200 µl odczynnika barwiącego Bradforda. Wymieszać dokładnie, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
2. Zmierzyć absorbancję przy 595 nm. Wyznaczyć stężenie białek LMPs, korzystając z regresji liniowej krzywej wzorcowej.

2. Eksplanty tkanki oskrzelowej i traktowanie LMP

UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę na sterylność środowiska pracy oraz aseptycznie przygotować roztwory i podłoża wykorzystywane w poniższych doświadczeniach. Aby przygotować Pełne Podłoże do Gojenia, należy dodać 1 ml Suplementów do Podłoża do Gojenia Tkankowego z surowicą (rozmrożonych na lodzie) do 100 ml Podłoża do Gojenia Tkankowego i dokładnie wymieszać.

2.1) Przygotowanie eksplantów tkanki oskrzelowej

1. Przed hodowlą, za pomocą ostrza skalpela wykonaj zadrapania w 6 obszarach o powierzchni 1 cm² każdy na krawędzi powierzchni każdej szalki hodowlanej do tkanek o średnicy 100 mm. Pokryj każdą zadrapaną szalkę hodowlaną 2 ml roztworu do powlekania szalek i inkubuj w wilgotnym inkubatorze CO₂ przez noc w temperaturze 37 °C. Odessij nadmiar roztworu za pomocą aspiratora próżniowego i napełnij szalkę 15 ml Medium do Płukania Tkanek.
2. Uśmierć myszy C57BL/6 (w wieku od 5 do 7 tygodni) poprzez inhalację CO₂ zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez komisję etyki ds. opieki nad zwierzętami.
3. Aseptycznie wypreparuj tkankę płucną za pomocą skalpela, superprecyzyjnej pęsety Dumont i nożyczek chirurgicznych. Ostrożnie usuń miąższ i naczynia krwionośne. W celu transportu do laboratorium umieść tkankę płucną w lodowatym Medium do Płukania Tkanek, jeśli jest to wymagane.
4. Dalej preparuj oskrzela zanurzone w Medium do Płukania Tkanek i oddziel oskrzela o średnicy od 1 do 2,5 mm od obwodowych tkanek płucnych. Za pomocą skalpela pokrój tkanki oskrzelowe na pierścienie oskrzelowe o grubości ~5 mm.
5. Używając ruchu czerpiącego sterylną zakrzywioną pęsetą mikrodissekcyjną, pobierz fragmenty oskrzeli i umieść je na zadrapanych obszarach szalek.
6. Usuń Medium do Płukania Tkanek i inkubuj fragmenty w RT przez ~5 min, aby pozwolić im przywrzeć do szalek.
7. Dodaj 10 ml Pełnego Medium do Gojenia do każdej szalki i umieść je w modułowej komorze inkubacyjnej z kontrolowaną atmosferą. Przepłucz komorę mieszaniną gazów o wysokiej zawartości O₂ (70% O₂, 25% N₂ i 5% CO₂). Umieść komorę w laboratoryjnym inkubatorze orbitalnym i wytrząsaj w temperaturze 37 °C. Wytrząsaj komorę przez 24 hr z częstotliwością 10 cykli na minutę, aby umożliwić przerywany przepływ medium nad fragmentami.
8. Po 24 hr inkubacji obejrzy eksplanty tkankowe pod odwróconym mikroskopem świetlnym w kontraście fazowym. Wybierz eksplanty oskrzelowe z pełnym, drobnym ruchem rzęsek i żywym nabłonkiem oskrzelowym do późniejszej obróbki LMP.

2.2) Obróbka LMP

1. Przygotować pełną pożywkę wzrostową w następujący sposób: rozmrozić suplementy do pożywki wzrostowej z surowicą oraz inhibitor fibroblastów na lodzie. Dodać 1 ml suplementów do pożywki wzrostowej z surowicą oraz 200 μl inhibitora fibroblastów do 100 ml pożywki wzrostowej; dokładnie wymieszać. Przed użyciem ogrzać pełną pożywkę wzrostową w temperaturze 37 °C przez 10 min.
2. Rozcieńczyć wyizolowane LMPs w nowej sterylnej probówce typu eppendorf za pomocą PBS, aby przygotować roztwór stok LMPs o stężeniu 800 µg/ml.
3. Dodać 0,5 ml pełnej pożywki wzrostowej do każdego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli tkanek.
4. Przenieść wybrane eksplanty oskrzela za pomocą zakrzywionej pincety mikrodysekcyjnej z poprzedniego protokołu (sekcja 2.1) do każdego dołka płytki do hodowli tkanek.
5. Odpowiednio oznakować płytkę hodowlaną, aby zidentyfikować dołki z traktowaniem LMPs oraz dołki kontrolne. Dodać 25 µl roztworu stok LMPs do każdego dołka z traktowaniem LMPs (aby uzyskać stężenie końcowe 40 μg/ml) oraz 25 µl nośnika kontrolnego (patrz produkcja LMPs) do dołków kontrolnych.
6. Kontynuować inkubację w modularnej komorze inkubacyjnej o kontrolowanej atmosferze w temperaturze 37 °C przy łagodnym wstrząsaniu.
7. Po 24 h przemyć eksplanty 3 razy PBS i przejść do następnego kroku (utrwalanie w 4% paraformaldehydzie [PFA]).

3. Badanie histopatologiczne

3.1) Przed przejściem do kolejnych etapów przygotować następujące roztwory

1. Przygotować bufor 1x PBS, mieszając 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.76 mM KH₂PO₄, pH 7.4.
2. Aby przygotować 4% PFA, rozpuścić 20 g PFA w 400 ml wody, podgrzewając do 60 °C przy ciągłym mieszaniu; dodać kilka kropli 10 M NaOH, aby klarownie zaprowadzić roztwór. Następnie dodać bufor 1x PBS i doprowadzić objętość do 500 ml oraz pH do 7.4. Przefiltrować i podzielić na alikwoty; przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Przygotować następujące odczynniki do dehydratacji lub rehydratacji: etanol 100%, 90%, 70%, 50% oraz ksylen.

3.2) Fixacja eksplantów i deparafinizacja skrawków tkankowych

1. Każdy eksplant umieścić w oznakowanej probówce do mikrocentryfugi z 1,5 ml 4% PFA i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Eksplanty przemyć dwukrotnie w 1x PBS.
2. Odwodnić eksplanty w serii alkoholi (70% etanol: 3 razy po 30 min; 90% etanol: 2 razy po 30 min; 100% etanol: 3 razy po 30 min; następnie ksylen: 3 razy po 20 min). Wszystkie etapy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (RT) w dygestorium.
3. Zatopić eksplanty tkankowe w parafinie w temperaturze 58 °C w inkubatorze/piecu. Przygotować skrawki tkanek o grubości 5 µm za pomocą mikrotomu obrotowego.
4. Skrawki wypłynąć w kąpieli wodnej o temperaturze 56 °C, a następnie nanieść je na oznakowane szkiełka histologiczne. Szkiełka umieścić w ręcznych kasetach do barwienia i suszyć w temperaturze 65 °C przez 1 h. Pozostawić szkiełka do ostygnięcia w temperaturze pokojowej (RT).
5. Zanurzyć kasety w 4 kolejnych naczyniach z ksylenem na 10 min każde w celu usunięcia parafiny. Zanurzyć kasety w serii etanolu, aby usunąć ksylen: 100%, następnie 95%, 80%, 70% i 50% etanolu (każdy etap po 5 min). Przemyć kasety wodą z kranu przez 5 min w celu usunięcia etanolu.

3.3) Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

1. Kontynuuj pracę z utrwalonymi skrawkami tkanek; umieść kasetę w kuwecie barwiącej wypełnionej hematoksyliną Mayera na 15 min. Płucz kasetę pod bieżącą wodą przez 20 min, aby usunąć hematoksylinę.
2. Umieść w wodzie destylowanej na 30 sec. Przenieś do 95% etanolu na 30 sec. Umieść w kuwecie z roztworem eozyny Y na 1 min. Odwodnij, przeprowadzając po dwie wymiany 95% etanolu, 100% etanolu oraz ksylenu, po 2 min każdorazowo.
3. Wykonaj szybką kontrolę pod mikroskopem, aby upewnić się, że nadmiar eozyny został usunięty. Nanieś 2 do 3 kropli medium montażowego (Fisher SP15-100) na każdy preparat, a następnie przykryj szkiełkiem nakrywką.

3.4) Wykrywanie śmierci komórek in situ: test TUNEL

1. Przed rozpoczęciem przygotować roztwór roboczy proteinazy K: 20 µg/ml w 10 mM Tris/HCl, pH 7.4.
2. Powtórzyć kroki od 1 do 5 z sekcji 3.2 (Fiksacja eksplantatów i deparafinizacja skrawków tkanek). Przepłukać preparaty dejonizowaną H₂O.
3. Zanurzyć preparaty w 1x PBS na 10 min. Odlać nadmiar PBS. Inkubować skrawki tkanek przez 30 min w temperaturze pokojowej z roztworem roboczym proteinazy K. Przepłukać preparaty dwukrotnie w 1x PBS.
4. Wykonać test TUNEL zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu do wykrywania śmierci komórek. Zamontować preparaty, używając medium montażowego, i przykryć ręcznie szkiełkami podstawowymi.
5. Przeanalizować próbki pod mikroskopem świetlnym. Użyć oprogramowania Image Pro 4.5 do analizy komórek apoptotycznych wybarwionych na kolor brązowy.

Wyniki

Charakterystykę LMP przeprowadzono za pomocą barwienia anneksyną V¹⁰ przy użyciu analizy FACS (fluorescence-activated cell sorting), a bramkowanie wykonano z wykorzystaniem kulek 1 µm, w której 97% MP (≤1 µm) było dodatnich pod kątem anneksyny-V-Cy5 (Rycina 1A i 1B). Zgodnie z tym protokołem uzyskiwano zazwyczaj około 2,5 mg LMP. Eksplanty tkanki oskrzelowej myszy C57BL/6 poddano działaniu nośnika oraz LMP. Analiza histopatologiczna przekrojów oskrzeli wykazała wpływ LMP na integralność strukt...

Dyskusja

MP są aktywnymi mediatorami wzajemnych przesłuchów międzykomórkowych, a ich badania są obiecujące w wielu dziedzinach nauki. ¹¹ W badaniu tym przedstawiono szczegółowy protokół wytwarzania in vitro na dużą skalę LMP pochodzących z apoptotycznej linii komórek T. Te MP wyrażają duży repertuar cząsteczek limfocytów i są biologicznie zaangażowane w regulację homeostazy komórkowej i tkankowej. Jednak LMP pochodzące z różnych źródeł mogą różnić się biologicznie. ^4,9,12,13

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Produkcja i charakterystyka LMP
T CEM	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 średni	Cambrex, Walkersville	04-744Q
Kolba T75	Sarstedt	83.1813.502
Kolba T175	Sarstedt	83.1812.502
Actinomycin  D	Sigma Chemical Co.	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0,22 i mikro; m filtr	Sarstedt	83.1826.001
Załącznik-VCy5	BD Pharmagen
Rozwiązanie przepływowe FACS	BD Bio-sciences	342003
Mikrokulki fluorescencyjne (1 &mikro; m)	Sondy molekularne	T8880
Koraliki do liczenia z polistyrenu (7 &mikro; m)	Bangs laboratories	PS06N/6994
Probówki polipropylenowe FACS	Falcon	352058
1 ml pipeta	Fisher	13-678-11B
pipeta 5 ml	Falcon	357543
pipeta 25 ml	Ultident	DL-357551
1,5 ml stożkowa mikroprobówka polipropylenowa	Sarstedt	72.690
Stożkowa probówka polipropylenowa 15 ml	Sarstedt	62.554.205
50 ml stożkowa rurka polipropylenowa	Sarstedt	62.547.205
50 ml szybka rurka z kopolimeru polipropylenowego	Nalgene	3119-0050
Butelka polipropylenowa o dużej prędkości 250 ml	Beckman	356011
Test białka (test Bradforda)	Bio-Rad Laboratories	500-0006
Norma oznaczania białek II	Bio-Rad Laboratories	500-0007
Probówka 16 x 100	VWR	47729-576
Probówka 12 x 75	Ultident	170-14100005B
Inkubator komórek	Mandel	Heracell 150
Wirówka wolnoobrotowa	IEC	Centra8R
Wirówka szybkoobrotowa	Beckman	Avanti J8
Wirnik wysokoobrotowy do butelki 250ml	Beckman	JLA16.250
Wirnik szybkoobrotowy do probówki 50ml	Beckman	JA30.50
Cytometria Fow	BD Bio-sciences	FACS Spektrofotometr Calibur
	Beckman	Series 600
Eksplantaty i sekcje tkanki oskrzeli
Myszy C57BL/6 (5-7 tygodni)	Charles River Laboratories, Inc.
Mysie drogi oddechowe PrimaCell™ System:	CHI Scientific, Inc.	2-82001
Ostrza skalpela ze stali węglowej Becton	Dickinson AcuteCare	371310	#10
Rękojeść skalpela	Fine Science Tools Inc.	10003-12	#7
odwrócony z kontrastem fazowym	Olympus Optical CO., LTD.	CK2
mieszanina gazów o wysokiej zawartości O2	VitalAire Kanada Inc.
modułowa komora inkubatora	Billups-Rothenberg Inc.	MIC-101
MaxQ 4000 inkubowana wytrząsarka orbitalna	Barnstead Lab-Line,	SHKA4000-7
12-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Becton Dickinson and Company	353043
Plastikowe szalki do hodowli tkanek (100 mm)	Sarstedt, Inc.	83.1802
Nożyczki chirurgiczne	Fine Science Tools Inc.	14060-09	Proste, ostre, 9 cm długości
Półzakrzywione kleszcze Graefe	Fine Science Tools Inc.	11052-10
nawilżany inkubator CO2	Mandel Scientific Company Inc.	SVH-51023421
Badanie histopatologiczne
formalina formaldehyd	Sigma-Aldrich, Inc.	HT5011
parafina	Fisher scientific  Międzynarodowy, Inc.	T555
	Merck KGaA, Darmstadt	EX0278-1
Aldehyd glutarowy	Sigma-Aldrich, Inc.	G6403
Cacodylate	Sigma-Aldrich, Inc.	31533
Szkiełka mikroskopowe	VWR Scientific Inc.	48300-025	25x75 mm
Ksylen	Fisher naukowy  Międzynarodowy, Inc.	X5-4
Hematoksylina Mayera	Sigma-Aldrich, Inc.	MHS16	Lejek z bibułą filtracyjną
HCl	Fisher naukowy  Międzynarodowa, Inc.	A144s-500
eosin	Sigma-Aldrich, Inc.	HT110116	Lejek z bibułą filtracyjną
Permount i handel; Średni montaż	Thermo Fisher Scientific Inc.	SP15-100
szklane szkiełko nakrywkowe	surgipath medical industries, Inc.	84503	24 razy; 24 #1
Zestaw do wykrywania	śmierci komórek TUNEL In situ, POD	11 684 817 910
piekarnik	Despatch Industries Inc.	LEB-1-20
Mikrotom obrotowy	Leica Microsystems Inc.	RM2145
	Whatman International Ltd.	1003150	#3
Mikroskop	Nikon Imaging Japan Inc.	E800
	kompletne Wheaton Industries, Inc.	900200	wraz z naczyniem, stojakiem, pokrywą
1,5 ml probówka eppendorf	Sarstedt Inc.	72.69	39x10 mm
Orbitalna i posuwisto-zwrotna kąpiel wodna	ExpotechUSA	ORS200
sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Wyciąg GIBCO	14190-144
	Nicram RD Service	3707E

limfocytów 559933 mikroskop Alkohol etylowy Bibuła filtracyjna Naczynie do barwienia