$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
UWAGA: Samce myszy C57BL/6 (w wieku 5-7 tygodni) pochodzą z Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Kanada.) i są manipulowane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Opieki nad Zwierzętami CHU Sainte-Justine. Eksplantaty tkanki oskrzelowej myszy stanowią dobre źródło pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do badania proapoptotycznego wpływu LMP na komórki nabłonka. Protokół ten opisuje wytwarzanie LMP in vitro, a także metodę wykrywania apoptotycznych komórek nabłonkowych na eksplantatach tkanki oskrzelowej poddanych działaniu LMP. Protokół ten składa się z 3 sekcji.
1. Produkcja i charakterystyka LMP
UWAGA: Aby zapobiec skażeniu, upewnij się, że wszystkie materiały użyte w tym eksperymencie są sterylne lub autoklawowane. Wszystkie czynności należy wykonać w RT w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach, chyba że wskazano inaczej.
1.1) Stymulacja i zbieranie MP9
- Rozmrozić podwielokrotność 10 milionów limfocytów T CEM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć w 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki krwiotwórczej bez surowicy, takiej jak X-VIVO, w sterylnej probówce o pojemności 15 ml i odwirować w czasie 200 g x 5 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml wstępnie podgrzanego podłoża.
- Przenieść komórki do kolby do hodowli tkankowej T75 (do komórek zawiesinowych) z 15 ml wstępnie podgrzanej pożywki krwiotwórczej, takiej jak X-VIVO, i inkubować przez 4 dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Po 4 dniach przenieść całą pożywkę hodowlaną i komórki do kolby do hodowli tkankowej T175 zawierającej 100 ml świeżej pożywki. Kontynuuj inkubację komórek przez około 72 godziny w tych samych warunkach, aż osiągną gęstość 2 milionów komórek/ml.
- Równomiernie podzielić komórki między cztery kolby T175, z których każda zawiera 150 ml świeżej pożywki i kontynuować hodowlę komórkową, aż komórki urosną (około 48 godzin inkubacji) do gęstości 2 milionów/ml.
- Zebrać komórki z każdej kolby przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić 300 x 106 komórek w nowej kolbie T175 zawierającej 150 ml świeżej pożywki, w celu utrzymania gęstości komórek 2 miliony/ml.
- Dodać aktynomycynę D (rozpuszczoną w DMSO w stężeniu 2 mg/ml) do pożywki w końcowym stężeniu 0,5 μg/ml i inkubować przez 24 godziny.
- Przenieść całą pożywkę hodowlaną do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wirować komórki przy 750 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 500 x g przez 15 minut w celu usunięcia dużych fragmentów komórek.
- Przenieść sklarowany osad do butelki o pojemności 250 ml i ultrawirować przy 12 000 x g przez 50 minut. Odrzucić supernatant i zebrać granulki.
- Przemyć granulki wzbogacone LMP 40 ml sterylnego PBS w probówce o pojemności 50 ml przez odwirowanie przy 12 000 x g przez 50 min. Powtórz ten krok dwukrotnie.
- Zebrać ostatni supernatant do przemywania i będzie on używany jako element sterujący pojazdu. Zawiesić granulki LMP w 1 ml PBS i przenieść do sterylnej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. Podziel i przechowuj izolowane LMP w temperaturze -80 °C (aby uniknąć wielu cykli swobodnego rozmrażania).
1.2) Charakterystyka MP za pomocą analizy FACS 4
- Przygotować 2 próbki buforu aneksynowego, 1 z CaCl2 i jedną bez niego: Hepes 10 mM, NaCl 140 mM, plus lub minus 5 mM CaCl2.
- Przefiltruj bufor aneksyny i płyn w osłonie przepływowej FACS za pomocą filtra 0,22 μm w celu usunięcia cząstek.
- Rozcieńczyć 1 μl LMP w 44 μl buforu aneksyny za pomocą 5 mM CaCl2 do probówki FACS. Przygotować kolejną probówkę z 1 μl LMP w 44 μl buforu aneksyny bez CaCl2 (kontrola ujemna).
- Dodać 5 μl annexinV-Cy5 do każdej probówki i dobrze wymieszać. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Zatrzymać reakcję, rozcieńczając mieszaninę 400 μl płynu w osłonie przepływowej FACS w każdej probówce.
- Dodaj 10 μl (200 000 kulek) zawiesiny kulek liczących 7 μm jako wzorzec wewnętrzny w każdej probówce, aby uzyskać liczbę bezwzględną.
- Ustalić bramki o względnej wielkości (FSC-H, PMT E00, skala logarytmiczna) i względnej ziarnistości (SSC-H, PMT 325, skala logarytmiczna) na wykresie punktowym na cytometrze przepływowym za pomocą skalibrowanych pod względem wielkości kulek fluorescencyjnych 1 μm (bramka 1) i bramki zliczającej kulki przy 7 μm (bramka 2).
- Przeanalizuj próbkę LMPs na wykresie FSC-H / SSC-H przy użyciu ustalonych bramek i kanału FL-4 dla wykresu punktowego aneksyny (PMT 765, skala logarytmiczna), uzyskując sygnał, aż do osiągnięcia 20 000 kulek zliczających w bramce 2.
- Określić dodatnie zdarzenia aneksyny V LMP w buforze aneksyny zawierającym CaCl2, a następnie odjąć zdarzenia LMP w buforze aneksyny bez CaCl2 (kontrola ujemna).
- Oblicz bezwzględną liczbę MP na podstawie następującego równania:
1.3) Oznaczanie stężenia białka MP (test Bradforda)
- Przygotować 5 seryjnych rozcieńczeń wzorca białka od 1,25 do 20 μg/ml. Odpipetować 800 μl każdego wzorca i roztworu próbki do czystej probówki w dwóch egzemplarzach. Do każdej probówki dodać 200 μl odczynnika Bradford Dye. Dobrze wymieszaj, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Zmierzyć absorbancję przy 595 nm. Określ stężenie białka w LMP za pomocą regresji liniowej krzywej standardowej.
2. Eksplantaty tkanek oskrzelowych i leczenie LMP
UWAGA: Zwróć szczególną uwagę na sterylne środowisko pracy i asepcie przygotuj roztwory i pożywkę używane w kolejnych eksperymentach. Aby przygotować Complete Healing Medium, dodaj 1 ml Tissue Healing Medium Supplements with Serum (rozmrożonego na lodzie) do 100 ml Tissue Healing Medium i dobrze wymieszaj.
2.1) Przygotowanie eksplantatów tkanki oskrzelowej
- Przed hodowlą należy wydrapać ostrzem skalpela 6 obszarów o długości 1cm2 każdy na krawędzi powierzchni każdego 100-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej. Pokryć każde porysowane naczynie do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm 2 ml roztworu do powlekania szalki hodowlanej i inkubować naczynie w wilgotnym inkubatorze CO2 O/N w temperaturze 37 °C. Odessać próżniowo nadmiar roztworu i napełnić naczynie 15 ml pożywki do mycia tkanek.
- Poddaj eutanazji myszy C57BL/6 (w wieku od 5 do 7 tygodni) przez wdychanie CO2 zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez komisję etyczną ds. opieki nad zwierzętami.
- Aseptyczne wypreparowanie tkanki płucnej za pomocą skalpela, super cienkiej pęsety Dumont i nożyczek chirurgicznych. Ostrożnie usuń miąższ i naczynia krwionośne. Umieścić tkankę płucną w lodowatym podłożu do mycia tkanek w celu transportu do laboratorium, jeśli ma to zastosowanie.
- Następnie należy rozciąć oskrzela zanurzone w podłożu do przemywania tkanek i oddzielić oskrzela o średnicy od 1 do 2,5 mm od obwodowych tkanek płuc. Pokrój tkanki oskrzelowe na pierścienie oskrzelowe o grubości ~5 mm za pomocą skalpela.
- Użyj ruchu nabierania sterylnymi, zakrzywionymi kleszczami do mikropreparacji, aby podnieść fragmenty oskrzeli i umieścić je na porysowanych obszarach naczyń.
- Usuń pożywkę do mycia tkanek i inkubuj fragmenty w temperaturze pokojowej przez ~5 minut, aby mogły przylgnąć do naczyń.
- Do każdego naczynia dodać 10 ml Kompletnego Podłoża Leczniczego i umieścić je w modułowej komorze inkubatora z kontrolowaną atmosferą. Przepłukać komorę mieszaniną gazów o wysokiej zawartościO2 (70%O2, 25% N2 i 5% CO2 ). Umieścić komorę w stacjonarnym inkubatorze orbitalnym i wstrząsnąć nią w temperaturze 37 °C. Potrząsać komorą przez 24 godziny z prędkością 10 cykli na minutę, aby umożliwić okresowy przepływ pożywki nad fragmentami.
- Po 24 godzinach inkubacji obserwuj eksplantaty tkanek pod mikroskopem światła odwróconego z kontrastem fazowym. Wybierz eksplantaty oskrzeli z pełnym, delikatnym ruchem włosów i żywym nabłonkiem oskrzeli do późniejszego leczenia LMP.
2.2) Leczenie LMP
- Przygotuj kompletną pożywkę wzrostową w następujący sposób: rozmrozić suplementy pożywki wzrostowej z surowicą i inhibitorem fibroblastów na lodzie. Dodać 1 ml pożywki wzrostowej, suplementów z surowicą i 200 μl inhibitora fibroblastów do 100 ml pożywki wzrostowej; Dokładnie wymieszaj. Przed użyciem podgrzać całe podłoże w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
- Rozcieńczyć wyizolowane LMP w nowej sterylnej probówce eppendorfa z PBS, aby przygotować materiał wyjściowy LMPs o stężeniu 800 μg/ml.
- Dodać 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej do każdego dołka na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
- Przenieść wybrane eksplantaty oskrzelowe za pomocą zakrzywionych kleszczy do mikropreparowania z poprzedniego protokołu (sekcja 2.1) do każdej studzienki płytki do hodowli tkankowej.
- Odpowiednio oznaczyć płytkę hodowlaną, aby zidentyfikować dołki uzdatniające LMP i studzienki kontrolne. Dodać 25 μl LMP do każdej studzienki do oczyszczania LMP (dla końcowego stężenia 40 μg/ml) i 25 μl nośnika kontrolnego (patrz produkcja LMP) do studzienek kontrolnych.
- Kontynuować inkubację w modułowej komorze inkubatora w kontrolowanej atmosferze w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.
- Po 24 godzinach przemyj eksplantaty 3 razy PBS i przejdź do następnego kroku (utrwalanie 4% paraformaldehydu [PFA]).
3. Badanie histopatologiczne
3.1) Przygotuj następujące rozwiązania przed przejściem do następnych kroków
- Przygotować 1x bufor PBS mieszając 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,76 mM KH2PO4, pH 7,4.
- Aby przygotować 4% PFA, rozpuścić 20 g PFA w 400 ml wody, podgrzanej do 60 °C z mieszaniem; dodać kilka kropli 10 M NaOH w celu usunięcia roztworu. Następnie dodaj 1x bufor PBS i dostosuj objętość do 500 ml i pH do 7,4. Filtr i podwielokrotność; przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przygotuj następujące odczynniki do odwadniania lub ponownego nawadniania: 100%, 90%, 70%, 50% etanol i ksylen.
3.2) Utrwalanie eksplantacji i deparafinizacja sekcji tkanek
- Umieścić każdy eksplant w oznakowanej probówce mikrowirówkowej z 1,5 ml 4% PFA i inkubować O/N w temperaturze 4 °C. Przepłukać eksplantaty dwukrotnie 1x PBS.
- Odwodnić eksplantaty za pomocą serii alkoholowej (70% etanolu: 3 razy po 30 minut; 90% etanolu: 2 razy po 30 minut; 100% etanolu: 3 razy po 30 minut; następnie ksylen: 3 razy po 20 minut). Wykonaj wszystkie czynności w RT w dygestorium.
- Eksplantaty tkanek zatopić w parafinie w temperaturze 58 °C w piecu. Przygotować skrawki tkanek o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu obrotowego.
- Zanurzyć skrawki w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C, a następnie zamontować je na oznakowanych szkiełkach histologicznych. Umieść szkiełka w ręcznych stojakach do barwienia i susz w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę. Poczekaj, aż szkiełka ostygną w temperaturze pokojowej.
- Zanurz ruszty w 4 kolejnych naczyniach do barwienia zawierających ksylen na 10 minut każde, aby usunąć parafinę. Zanurz stojaki w serii etanolu, aby usunąć ksylen: 100%, następnie 95%, następnie 80%, następnie 70%, a następnie 50% etanolu (5 minut na każdy krok). Opłucz stojaki wodą z kranu przez 5 minut, aby usunąć etanol.
3.3) Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
- Kontynuuj pracę z nieruchomymi sekcjami tkanki; umieść ruszt w naczyniu barwiącym wypełnionym Hematoksyliną Mayera na 15 minut. Opłucz ruszt wodą z kranu, aby usunąć Hematoxylinę przez 20 minut.
- Umieścić w wodzie destylowanej na 30 sekund. Umieść w 95% etanolu na 30 sekund. Umieścić w naczyniu barwiącym z roztworem Eozyny Y na 1 minutę. Odwadniaj przez 2 przemiany 95% etanolu, 100% etanolu i ksylenu przez 2 minuty każda.
- Wykonaj szybką kontrolę pod mikroskopem, aby upewnić się, że nadmiar eozyny został usunięty. Umieść 2 do 3 kropli podłoża montażowego (Fisher SP15-100) na każdym szkiełku, a następnie przykryj szkłem nakrywkowym.
3.4) Wykrywanie śmierci komórki in situ: Test TUNEL
- Przed rozpoczęciem należy przygotować roztwór roboczy proteinazy K: 20 μg/ml w 10 mM Tris/HCl, pH 7,4.
- Powtórzyć kroki od 1 do 5 w sekcji 3.2 (Utrwalanie eksplantacji i deparafinizacja sekcji tkankowej). Przepłukać szkiełka dejonizowanymH2O.
- Zanurz szkiełka w 1x PBS na 10 minut. Odcedź nadmiar PBS. Inkubować skrawki tkanek przez 30 minut w temperaturze pokojowej z roztworem roboczym proteinazy K. Przepłukać szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x PBS.
- Wykonaj test TUNEL zgodnie z opisem w instrukcji obsługi zestawu do wykrywania śmierci komórki. Zamontować za pomocą medium montażowego, a szkiełko nakrywkowe ręcznie za pomocą szkiełek nakrywkowych.
- Analizuj próbki pod mikroskopem świetlnym. Użyj Image Pro 4.5, aby przeanalizować komórki apoptotyczne w kolorze brązowym.