Artykuł metodologiczny

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

DOI:

10.3791/52652

⸱

13 lipca 2015

 , 
1UMR Centre des Sciences du Goŭt et de l'Alimentation, CNRS, INRA, Université de Bourgogne

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza fizjologicznych reakcji węchowych neuronów czuciowych (OSN) stymulowanych specyficznymi ligandami jest kluczowa dla zrozumienia podstaw zachowań opartych na węchu i ich modulacji. Te właściwości kodowania zależą w dużym stopniu od początkowej interakcji między cząsteczkami zapachu a receptorem węchowym (OR) wyrażonym w OSN. Tożsamość, swoistość i spektrum ligandów wyrażonego OR mają kluczowe znaczenie. Prawdopodobieństwo znalezienia liganda OR wyrażonego w OSN wybranym losowo w obrębie nabłonka jest bardzo niskie. Aby sprostać temu wyzwaniu, protokół ten wykorzystuje genetycznie znakowane myszy wykazujące ekspresję białka fluorescencyjnego GFP pod kontrolą promotora zdefiniowanych OR. OSN znajdują się w ciasnym i zorganizowanym nabłonku wyściełającym jamę nosową, a sąsiednie komórki wpływają na ich dojrzewanie i funkcję. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania nienaruszonego nabłonka węchowego i rejestrowania za pomocą zapisów patch-clamp właściwości OSN wyrażających określone receptory zapachowe. Protokół pozwala scharakteryzować właściwości błony OSN przy zachowaniu wpływu sąsiedniej tkanki. Analiza wyników patch-clamp pozwala na precyzyjne określenie ilościowe interakcji ligand/OR, szlaków transdukcji i farmakologii, właściwości kodujących OSN i ich modulacji na poziomie błony.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Węchowe neurony czuciowe (OSN) reprezentują pierwszy etap percepcji węchowej. Zlokalizowane w nabłonku węchowym wyściełającym jamę nosową u gryzoni, przekształcają informacje chemiczne substancji zapachowych w potencjały czynnościowe wysyłane przez ich akson do mózgu. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy kodowania węchowego, konieczne jest scharakteryzowanie właściwości transdukcji i błony OSN. Do niedawna większość technik stosowanych do charakterystyki właściwości OSN ssaków przeprowadzano na zdysocjowanych OSN1-4. Proces dysocjacji wykorzystuje różne procesy mechaniczne i chemiczne (tj. enzymy) w celu uwolnienia OSN od ich środowiska. Procesy te indukują małą liczbę dostępnych komórek do nagrań. Ta niska liczba może być jeszcze bardziej krytyczna w przypadku komórek znakowanych GFP. Dysocjacja usuwa również lokalne interakcje międzykomórkowe między OSN a innymi komórkami nabłonka węchowego, co może zwiększyć przeżywalność i modulację właściwości OSN. W celu ominięcia procedury dysocjacji opracowano nienaruszony preparat5.

Każdy OSN wyraża jeden receptor węchowy (OR) wybrany z dużej rodziny wielogenowej6. Istnieje ~ 1,000 OR wyrażonych w głównym nabłonku węchowym myszy. Ze względu na dużą liczbę OR u zwierząt typu dzikiego, szanse na zarejestrowanie OSN wyrażających ten sam OR są bardzo niskie. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, dostępne są myszy ukierunkowane na geny, w których wszystkie OSN wyrażające zidentyfikowany OR są znakowane białkiem fluorescencyjnym7-9. Te oznaczone OSN wykorzystano do przeprowadzenia analizy funkcjonalnej w preparatach zdysocjowanych7,10,11 z wadami wymienionymi wcześniej. Nienaruszony preparat nabłonka5 od genetycznie znakowanych myszy pozwala zatem obejść te problemy. Pozwala na monitorowanie aktywności OSN wyrażających precyzyjnie zdefiniowane OR w środowisku jak najbardziej zbliżonym do in vivo. Poza tym, zapisy OSN typu patch-clamp umożliwiają również precyzyjną analizę właściwości błony, farmakologii szlaku transdukcji, interakcji ligand/OR. Wszystkie te tematy trudno analizować za pomocą nagrań zewnątrzkomórkowych. Użyliśmy tej techniki do monitorowania odpowiedzi OSN wyrażających receptory zapachowe SR1 i MOR2312,13. Wykonalność tej techniki została potwierdzona przez inne grupy na MOR23 z ekspresją OSN14, a także na innych OR z ekspresją neuronów15,16. Monitorowanie zdefiniowanej populacji OSN może prowadzić do analizy ich właściwości w wielu różnych kontekstach, takich jak rozwój14, starzenie się17, plastyczność wywołana odorantem18 oraz rola zmian w sekwencji receptora zapachowego w kodowaniu zapachu15. Protokół ten stanowi zatem potężne narzędzie do monitorowania właściwości funkcjonalnych zdefiniowanych OSN na poziomie membrany.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Université de Bourgogne i został zatwierdzony przez komisję etyki Université de Bourgogne.

1. Zwierzęta

  1. Użyj genetycznie zmodyfikowanych myszy OR-IRES-tauGFP dostępnych w Jackson Laboratory. Myszy te zostały opracowane w laboratorium dr Petera Mombaertsa w celu analizy celowania aksonów i rozwoju układu węchowego19. Na przykład linia MOR23-IRES-tauGFP, numer katalogowy 006643, nosi oficjalną nazwę szczepu B6; 129P2-Olfr16tm2Mamo/MamJ; podobnie linia SR1-IRES-tauGFP o numerze magazynowym 6717 nosi oficjalną nazwę B6; 129P2-Olfr124tm1Mama/MamaJ.
  2. Jeśli chodzi o wiek zwierząt: w celu uzyskania lepszych wyników protokołu należy używać zwierząt w wieku od 2 do 4 tygodni. W tej grupie wiekowej rozwarstwienie jest łatwiejsze (bardziej miękkie kości, mocniejszy nabłonek węchowy), a guzki dendrytyczne są większe w porównaniu ze starszymi zwierzętami.

2. Przygotowanie elektrod i roztworów

  1. W przypadku pipet stymulujących: należy zakupić wstępnie naciągnięte pipety stymulacyjne. W przeciwnym razie przygotuj je ręcznie.
    1. Za pomocą płomienia zegnij sześć szklanych pipet o średnicy 1 mm w odległości około 1 cm od końcówki. Włóż te sześć pipet oraz prostą rurkę termokurczliwą o średnicy 7 cala o średnicy 1,5 cm, wzmocnioną oczkiem.
    2. Termokurczliwie rurkę, aby beczki były ze sobą połączone. Przymocuj dodatkową rurkę termokurczliwą do drugiego końca beczek. Pociągnij tę stymulującą pipetę za pomocą ściągacza wielobębnowego.
    3. Dodaj trochę białego płynnego kleju wokół oczka, aby wzmocnić wygięte końcówki. Pozostaw do wyschnięcia O/N.
  2. Przygotować 1 lub 2 l normalnego roztworu zewnątrzkomórkowego Ringera (w mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1,25, glukoza 15; pH 7,6 i 305 mOsm). Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  3. Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór podstawowy (w mM): KCl 70, KOH 53, kwas metanosulfonowy 30, EGTA 5, HEPES 10, sacharoza 70; pH 7,2 (KOH) i 310 mOsm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Dobre przez kilka tygodni.
  4. Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór rejestrujący z nystatyną doraźnie (w ostatniej chwili) przed eksperymentem.
    1. Odważyć 3 mg nystatyny, dodać 50 μl DMSO; wirować przez 20 sekund, a następnie sonikować przez 2-3 minuty, aż do całkowitego rozcieńczenia.
    2. Dodać 20 μl roztworu DMSO-nystatyny do 5 ml wewnątrzkomórkowego roztworu podstawowego. Wirować 20 sekund, a następnie sonikować 3 minuty. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed bezpośrednim działaniem światła, nystatyna jest wrażliwa na światło. To rozwiązanie może być używane przez kilka godzin. Wymieniaj codziennie.
    3. Gdy preparat nabłonka węchowego znajdzie się pod mikroskopem, należy pobrać część tego roztworu do strzykawki o pojemności 1 ml z wydłużoną żółtą końcówką w celu napełnienia elektrod; chronić przed bezpośrednim światłem. W RT roztwór nystatyny nie jest stabilny; Roztwór należy wymieniać w strzykawce o pojemności 1 ml co godzinę lub przechowywać w lodzie.
  5. Pociągnij elektrody rejestrujące za pomocą ściągacza, aby uzyskać długą szyjkę i małą końcówkę (~2 μm) o rezystancji 15-20 MΩ z wewnętrznym roztworem nystatyny.
  6. Przygotować roztwór nawaniacza o stężeniu 0,5 m w DMSO pod wyciągiem wyciągowym; porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Rozcieńczyć środek zapachowy w roztworze Ringera do uzyskania pożądanego stężenia. Napełnij pipetę stymulującą.

3. Przygotowanie nabłonka węchowego

Uwaga: myszy OR-IRES-tauGFP wyrażają tauGFP pod kontrolą promotora OR. U tych myszy wszystkie neurony wyrażające interesujący nas OR są oznaczone GFP. Protokół ten jest dostosowany do sal operacyjnych wyrażonych we wszystkich strefach. Jednak sekcje i zapisy są łatwiejsze w przypadku OR wyrażonych w strefie grzbietowej.

  1. Znieczulenie zwierzęcia należy poprzez wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 150 mg/kg i 10 mg/kg masy ciała). Dekapitację można wykonać ostrymi nożyczkami w przypadku młodych myszy lub odpowiednio konserwowaną gilotyną dla gryzoni w przypadku starszych myszy.
    1. Za pomocą nożyczek do preparowania pierścieni wykonaj podłużne nacięcie przyśrodkowe przez skórę grzbietową. Usuń skórę, rozsuwając ją. Za pomocą nożyczek przetnij dolne szczęki w stawie szczękowym. Usuń górne przednie zęby za pomocą cięcia koronalnego równoległego do zębów.
    2. Wykonaj przecięcie koronalne głowy za oczami i zachowaj tylko przednią część głowy. Zanurz go w lodowatym roztworze Ringera do sekcji pod lunetą.
  2. Wypreparuj pod lunetą: po stronie brzusznej wykonaj podłużne cięcie wzdłuż górnej szczęki/zębów. Przetnij kości grzbietowe wzdłużnie, podążając za grzbietowo-boczną stroną jamy nosowej. Usuń większość kości i podniebienia; przenieść przegrodę i przyczepiony do niej nabłonek w natlenizowanym Ringerze w RT.
  3. Do końcowej sekcji: Tuż przed rozpoczęciem sesji nagraniowej oderwij nabłonek od leżącej poniżej przegrody za pomocą kleszczy. Odłącz nabłonek za pomocą kleszczy i dwóch nacięć nożycowych 4-5 mm (użyj nożyczek microvannas) w przedniej części przegrody, gdzie zrost jest silniejszy.
    1. Ostrożnie usuń narząd lemieszowo-nosowy, wycinając go wzdłuż jego grzbietowego połączenia z nabłonkiem przegrody. Przenieś nabłonek do komory rejestracyjnej z warstwą śluzu skierowaną do góry; Trzymaj go płasko w komorze z harfą.
  4. Zainstaluj komorę pod mikroskopem pionowym wyposażonym w optykę fluorescencyjną i czułą kamerę. Wizualizuj przygotowanie na ekranie komputera w dużym powiększeniu dzięki 40-krotnemu obiektywowi zanurzeniowemu w wodzie (apertura numeryczna 0,8) i dodatkowemu powiększeniu 2X lub 4X uzyskanemu przez soczewkę powiększającą. Napełniać w sposób ciągły natlenionym Dzwonkiem przy temperaturze pokojowej (1-2 ml/min).

4. Sesja nagraniowa

  1. Poszukiwanie komórki fluorescencyjnej: wzbudzić preparat o długości fali 480 nm dla EGFP, który emituje światło w zakresie 530-550 nm; celować w jedną gałkę dendrytyczną, która jest niezawodnie widoczna we fluorescencji i w jasnym polu.
  2. Napełnij elektrodę roztworem wewnątrzkomórkowym z nystatyną; usuń pęcherzyki, delikatnie stukając w elektrodę.
  3. Włóż elektrodę do uchwytu elektrody, zastosuj nadciśnienie w pipecie; Rezystancja powinna wynosić 15-20 MΩ.
  4. Zbliż elektrodę do ogniwa; gdy rezystancja osiągnie ~40 MΩ, zwolnij nadciśnienie i zastosuj lekkie podciśnienie, aby osiągnąć gigaseal.
  5. Po osiągnięciu uszczelnienia należy ustawić potencjał membrany na około -75 mV;
  6. Po otwarciu komórki przystąp do protokołów stymulacji, leczenia farmakologicznego. Aby zmierzyć reakcję na pojedynczą stymulację odorantem, zarejestruj 200-500 ms spontanicznej aktywności, stymuluj przez 500 ms i mierz odpowiedź komórki przez maksymalnie 10 sekund 13. W przypadku zabiegów farmakologicznych należy perfuzjować środki farmakologiczne w pożądanym stężeniu20.

5. Analiza danych

  1. Przeanalizuj prądy wywołane przez stymulację nazapachową w następujący sposób: maksymalna amplituda, czas narastania (czas niezbędny do osiągnięcia 90% maksymalnej amplitudy, w ms), całkowity prąd (obszar pod krzywą w pAs), czas przy 50% (czas między początkiem a przesunięciem odpowiedzi przy 50% maksymalnej amplitudzie, w ms).
    1. Korzystając ze szczytowych prądów transdukcji (osiągnięta maksymalna amplituda) przy różnych stężeniach, narysuj i dopasuj krzywą odpowiedzi na dawkę, korzystając z równania Hilla: I = Imax/(1 + (K1/2/C)n), gdzie I oznacza prąd szczytowy, Imax maksymalną odpowiedź przy stężeniach nasycenia, K1/2 stężenie, przy którym osiągnięto połowę maksymalnej odpowiedzi, C stężenie nawaniacza i n współczynnik Hilla.
  2. Analizuj zapisy potencjału błony w cęgach prądowych pod kątem maksymalnej depolaryzacji, całkowitego generowanego potencjału (obszar pod krzywą w mVsec); rejestruj spontaniczną aktywność skokową w ciągu 30 sekund do 1 minuty; rejestruj pobudliwość poprzez skoki wywołane wtryskiem prądu (5-10 pA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wynik tego protokołu zależy od jakości sekcji. Etapy preparacji muszą być krótkie (mniej niż 10 do 15 minut) i precyzyjne (tj. aby uniknąć uszkodzenia nabłonka). Rysunek 1 ilustruje, jak wygląda idealne przygotowanie przy różnych poziomach powiększenia. Przy małym powiększeniu w jasnym polu można rozróżnić różne typy komórek (takie jak gałki OSN, komórki podporowe) (ryc. 1A). Przy najwyższym poziomie powiększenia, zwykle od 80X do 160X, w jasnym polu, dendrytyczne gałki OSN powi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność tego protokołu do prawidłowego monitorowania właściwości zdrowych OSN zależy w dużej mierze od jakości preparatu. Dlatego etapy sekcji mają kluczowe znaczenie. Po pierwsze, należy zwrócić uwagę na jakość (pH, osmolarność), natlenienie i temperaturę (lodowata, ale nie zamrożona) podłoża preparacyjnego. Po drugie, manipulacja nabłonkiem za pomocą narzędzi preparacyjnych musi być jak najbardziej ograniczona, aby uniknąć uszkodzeń. Wreszcie, bardzo ważne jest, aby uzyskać jak najbardziej płaskie przygotowanie, aby u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Peterowi Mombaertsowi za hojny dar myszy OR-GFP; Anne Lefranc i ośrodek dla zwierząt CSGA za doskonałą opiekę nad zwierzętami. Finansowanie zostało zapewnione przez CNRS w ramach grantów ATIP i ATIP Plus, przez Conseil Régional de Bourgogne (granty FABER i PARI), przez Université de Bourgogne (program BQR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
stół wibracyjny z klatką FaradayaTMC63-500: izoluje system rejestrujący od wibracji indukowanych przez otoczenie (ruchy eksperymentatora, wibracje urządzeń takich jak wentylatory do chłodzenia komputerów itp.); może być również zakupiony z klatką Faradaya lub wyposażony w wykonaną na zamówienie klatkę Faradaya; klatka ta jest zalecana w celu uniknięcia zakłóceń elektrycznych z optyki otoczenia
mikroskopOlympusBX51WIpionowy wyposażony w epifluorescencję; stolik stały lub ruchomy w zależności od preferencji użytkownika
obiektywyOlympusLUMPLFL40XWwymagane co najmniej 2 obiektywy: 4X lub 10X do zgrubnego podejścia do komórki; oraz 40-krotne zanurzenie na duże odległości Lupa Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3,3 MM
OlympusU-TVCACBEZWZGLĘDNIE WYMAGANE: umieszczony na ścieżce światła między obiektywem a kamerą; pozwala na powiększenie obrazu na ekranie w celu precyzyjnego dotarcia do pokrętła z kamerą z elektrodą rejestrującą
OlympusDP72potrzebna jest dobra kamera, aby zobaczyć neurony we fluorescencji, jak również w jasnym polu; oprogramowanie sterujące jest proste i pozwala na robienie zdjęć i wykonywanie obrazu z kamery na żywo w celu monitorowania zbliżania się elektrody do ogniwa. Ultraczuła kamera nie jest konieczna
filtrujeOlympus/Chromaw zależności od białka fluorescencyjnego użytego u myszy; przykład dla GFP: wzbudzenie: BP460-490: emisja: wzmacniacz HQ530/50m
HEKAEPC10 USBmonitoruje prądy przepływające przez elektrodę rejestrującą, a także kontroluje zaciąganie się, wysyłając sygnał TTL do spritzera; konfiguracja EPC10 jest kontrolowana przez
oprogramowaniekomputeroweHEKAPatchmastersteruje wzmacniaczem podczas eksperymentu
mikromanipulator MikromanipulatorSutterMP225, umożliwia precyzyjne ruchy z dokładnością do 1/10 mikrometra; model ten jest bardzo stabilny; należy unikać manipulatorów hydraulicznych, które mogą dryfować
ściągacz elektrodySutterP97z żarnikiem FT345-B o szerokim korycie;   do przygotowania pipet nagrywających o wielkości około 2&mikro; m średnicy z długą końcówką, aby dotrzeć do komórek; rezystancja powinna wynosić od 15 do 20Mohm z perforowanym szkłem do montażu krosowego
SutterBF120-69-10w naszych warunkach nagrywania, szkło to jest idealne do nagrywania pipet
komora nagrywającaWarner InstrumentsRC-26Gkomora jest potrzebna do ustawienia preparatu pod mikroskopem. Aby utrzymać preparat w środku komory, należy użyć siatki/kotwy.
stymulacyjne
WPITW100F-4mocowane w grupach po 7 sztuk, pipety te służą do przygotowania wstępnie naciągniętych pipet stymulujących
ściągacz wielolufowyMDIPMP-107-Zpoprzez połączenie ciągnięcia i przekręcenia, ściągacz ten pozwala nam przygotować elektrody do zaciągania z 7 beczkami
precyzyjny wtryskiwacz ciśnieniowy Toohey CompanyP/N T25-1-900 Pojedynczy kanał     ten precyzyjny wtryskiwacz ciśnieniowy steruje ciśnieniem wyrzucanym w ściągaczu wielolufowym; jest sterowany ręcznie lub przez wzmacniacz za pomocą 5V 
MikromanipulatorNarishigeYOU-1Manipulator zgrubny wystarczy, aby zbliżyć elektrodę zaciągającą się do
miejsca nagrywania rurkiN/Arurki tygonowe, aby doprowadzić ciśnienie z rozdymki do pompowania pipet do pomp do zaciągania
roztwory/perfuzja/chemikalia
Pompa próżniowaGardner Denver300 Serieswibracyjna pompa membranowa jest cichsza i wydajniejsza niż inne typy pomp
system perfuzyjnyN/AN/Agrawitacyjny system perfuzyjny z rurkami polietylenowymi do wprowadzania i wyprowadzania roztworu zewnętrznego z komory rejestracyjnej
nystatynaSigma-AldrichN3503obowiązkowa do perperforowanego zacisku krosowego
SULFOTLENEK DIMETYLUSigma-AldrichD5879Służy do rozpuszczania nystatyny do roztworu wewnętrznego do łat perforowanych 
Chlorek soduSigma-AldrichS9625roztwór zewnątrzkomórkowy
Chlorek potasuSigma-AldrichP4504roztwór wewnątrzkomórkowy/zewnątrzkomórkowy
Chlorek wapnia dwuwodnySigma-AldrichC7902roztwór zewnątrzkomórkowy
Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny (NaH2PO4)Sigma-AldrichS9638roztwór zewnątrzkomórkowy
Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4 7H2O)Roztwór zewnątrzkomórkowySigma-Aldrich63140
GlukozaSigma-AldrichG8270roztwór zewnątrzkomórkowy
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS6297roztwór
zewnątrzkomórkowyEGTA (Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy)Sigma-AldrichE3889roztwór wewnętrzny
Hydroksyd potasuRoztwór wewnętrznySigma-AldrichP1767
Methyl SulfoxideSigma-AldrichW387509roztwór wewnątrzkomórkowy
Hepes-NaSigma-AldrichH7006roztwór wewnątrzkomórkowy
SacharozaSigma-AldrichS0389roztwór wewnątrzkomórkowy
Wymagana seria mikroskop precyzyjny szkło TTLs

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
  2. Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862(2012).
  3. Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
  4. Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
  5. Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
  6. Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  7. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  8. Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
  9. Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
  10. Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
  11. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  12. Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
  13. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  14. Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
  15. Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
  16. Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
  17. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
  18. Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
  19. Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
  20. Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
  21. Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
  22. Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
  23. Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
  24. Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
  25. Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
  26. Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
  27. Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja receptor w zapachowychmyszy z GFPsekcja nab onka w chowegoanaliza w a ciwo ci b onyprzygotowanie roztworu nystatynymonta pipety stymuluj cejrejestracja elektrofizjologicznaoddzia ywanie ligand OR

Powiązane artykuły