Zastosowanie techniki iniekcji stereotaktycznej do badania wpływu genetycznego na zachowania zwierząt

Podsumowanie

Stereotaktyczne wstrzykiwanie lentiwirusów wyrażających cDNA lub shRNA może modulować ekspresję genów w określonych obszarach mózgu myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół łączący zastrzyki stereotaktyczne z zadaniami behawioralnymi, takimi jak Test Otwartego Pola (OFT) i Test Wymuszonego Pływania (FST).

Streszczenie

Stereotaktyczne wstrzykiwanie jest użyteczną techniką dostarczania lentiwirusów o wysokim mianie do wybranych obszarów mózgu u myszy. Lentiwirusy mogą albo nadekspresja, albo zahamować ekspresję genów w stosunkowo skoncentrowanym regionie bez znaczącego uszkodzenia tkanki mózgowej. Po wyzdrowieniu wstrzyknięta mysz może zostać przetestowana pod kątem różnych zadań behawioralnych, takich jak test otwartego pola (OFT) i test wymuszonego pływania (FST). OFT jest przeznaczony do oceny lokomocji i fenotypu lękowego u myszy poprzez pomiar czasu, jaki mysz spędza w środku nowego otwartego pola. Bardziej niespokojna mysz będzie spędzać znacznie mniej czasu w centrum nowego pola w porównaniu z grupą kontrolną. FST ocenia fenotyp antydepresyjny, określając ilościowo czas, w którym myszy spędzają nieruchomo po umieszczeniu w wiadrze z wodą. Mysz z fenotypem antydepresyjnym spędzi znacznie mniej czasu w bezruchu w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Celem tego protokołu jest zastosowanie stereotaktycznego wstrzyknięcia lentiwirusa w połączeniu z testami behawioralnymi w celu oceny, w jaki sposób czynniki genetyczne modulują zachowania zwierząt.

Wprowadzenie

Mysz jest szeroko stosowana w neurobiologii, ponieważ łatwo nią manipulować genetycznie. Techniki nokautu genów pozwalają naukowcom zbadać, w jaki sposób każdy czynnik genetyczny kształtuje zachowania myszy. Co więcej, system cre-loxp stanowi cenne narzędzie do nokautowania genów specyficznych dla typu tkanek i komórek u myszy, co umożliwia naukowcom badanie funkcji genów w różnych tkankach. ¹ Jednak w praktyce wzorce ekspresji promotorów cre są trudne do kontrolowania i do tej pory wielu uznanych kierowców cre nie osiągnęło ekspresji specyficznej dla regionu. ^2,3

Alternatywnie, stereotaktyczne wstrzykiwanie jest metodą ukierunkowaną na określone obszary mózgu dorosłej myszy. Poprzez wstrzykiwanie genetycznie modyfikowanych wirusów wykazujących ekspresję cDNA lub shRNA można osiągnąć specyficzną dla regionu modulację ekspresji genów. Chociaż rozmiar mózgu każdej myszy jest różny, lokalizację określonych obszarów mózgu można określić za pomocą współrzędnych stereotaktycznych ustawionych na podstawie punktów orientacyjnych na czaszce mózgu myszy. Najczęściej używanymi punktami orientacyjnymi są bregma, lambda i linia międzyuszna. Korzystając ze współrzędnych uzyskanych z atlasu ^mózgu4, dokładne położenie każdego obszaru mózgu można określić na podstawie osi przednio-tylnej (A/P), przyśrodkowo-bocznej (M/L) i grzbietowo-brzusznej (D/V) od przecięcia linii bregma/międzyusznej. Zazwyczaj wirusy wstrzykiwane do mózgów myszy są znakowane czerwonym lub zielonym białkiem fluorescencyjnym (RFP lub GFP), dzięki czemu zastrzyki można potwierdzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Oceny zachowania myszy są szczególnie potrzebne do podstawowych badań nad zaburzeniami psychicznymi. Objawy zaburzeń psychicznych u pacjentów zazwyczaj wiążą się z nieprawidłowymi zachowaniami. Niektóre z tych ludzkich zachowań są ewolucyjnie konserwatywne i mogą być bezpośrednio naśladowane i obserwowane u myszy. Na przykład depresję można modelować u myszy, mierząc rozpacz behawioralną. Osoby z depresją często czują, że nic, co robią, nigdy nie pomoże, co jest objawem, który może ostatecznie doprowadzić do samobójstwa. U gryzoni można to modelować za pomocą testu wymuszonego pływania (FST), który mierzy czas, w którym mysz pływa w porównaniu z unoszącym się w basenie wodnym (postrzeganym jako poddanie się). Ten paradygmat jest potwierdzany przez ratowanie fenotypu za pomocą leków przeciwdepresyjnych. ^7,8,9 Myszy, które otrzymały leki przeciwdepresyjne, spędzą znacznie mniej czasu w bezruchu w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Inny test behawioralny, Test Otwartego Pola (OFT) jest przeznaczony do oceny lokomocji u myszy, a dodatkowo może być stosowany do analizy fenotypu lękowego u myszy. ^5,6 TGLTest ten opiera się na założeniu, że myszy czują się bezpieczniej, gdy znajdują się blisko ściany na nowym otwartym polu. Myszy typu dzikiego w końcu będą eksplorować nowe środowisko, ponieważ są ciekawskimi zwierzętami. Jednak spędzanie mniejszej ilości czasu w środku pola wskazuje na niepokój myszy, ponieważ mysz nie będzie w stanie przezwyciężyć początkowego strachu wywołanego przez nowe środowisko. Lęk myszy, mierzony ilością czasu spędzonego w środku otwartego pola, można porównać do lęku klinicznego u ludzi, który jest obecny w wielu zaburzeniach psychicznych.

Połączenie zastrzyków stereotaktycznych z paradygmatami behawioralnymi to nowatorski sposób na zmianę ekspresji określonego genu w docelowym obszarze mózgu. Następnie można określić wpływ modulowanej ekspresji genów na zachowania myszy. W przeciwieństwie do nokautu całego mózgu, ta metoda jest szczególnie przydatna, ponieważ celuje tylko w określone obszary mózgu. Ponadto zastrzyki stereotaktyczne są zwykle wykonywane u dorosłej myszy typu dzikiego, dlatego endogenna ekspresja genów została utrzymana przez wszystkie etapy rozwoju. Metoda ta pozwoli uniknąć efektu mylącego, jeśli gen jest niezbędny do przeżycia w embrionalnym lub postnatalnym etapie rozwoju. Jednym z głównych ograniczeń jest to, że myszy eksperymentalne muszą przejść inwazyjną operację, w której czaszki myszy muszą zostać otwarte. Co więcej, stopień modulacji genu zależy od miana i skuteczności wirusa. Wirus musi zostać wstrzyknięty w odpowiedni region za pomocą współrzędnych stereotaktycznych, co wymaga specjalnych instrumentów. Weryfikacja prawidłowego miejsca wstrzyknięcia może zostać przeprowadzona wyłącznie po sekcji zwłok.

Ta metoda była wcześniej używana do testowania udziału określonego genu w różnych chorobach neurologicznych. Na przykład, wirusowe RNAi ukierunkowane na gen Th (który umożliwia syntezę dopaminy) wstrzyknięto do istoty czarnej compacta i przeprowadzono analizę zachowania lokomotorycznego. ¹⁰ W innym badaniu zastosowano stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusa wyciszającego DISC1 w celu oceny zachowania myszy w odniesieniu do schizofrenii. Knockdown DISC1 doprowadził do zwiększonej lokomocji w odpowiedzi na nowość (równoległe objawy pozytywne w schizofrenii) i większego unieruchomienia FST. ¹¹ Podobnie, dodatkowe badanie wykazało, że nadekspresja 5-HT_1B doprowadziła do zwiększonego zachowania eksploracyjnego w OFT, co jest zgodne z fenotypem przeciwlękowym przy użyciu tej metody. ¹² Zastrzyki stereotaktyczne mogą dostarczyć wirusa cre w celu wywołania rekombinacji u myszy cre-loxp. Metodę tę zastosowano do selektywnego usuwania receptora Y2 w ciele migdałowatym i jądrze łożyska prążkowia końcowego. Po analizie behawioralnej stwierdzono, że myszy te mają fenotyp przeciwdepresyjny, gdy gen został usunięty w centralnym ciele migdałowatym, ale nie mają fenotypu, gdy gen został usunięty w ciele migdałowatym podstawno-bocznym lub jądrze łożyska prążkowia końcowego. ¹³ W ten sposób technika ta zapewnia unikalne narzędzie do badania wpływu genetycznego na zachowania zwierząt.

Protokół

UWAGA: Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt były przestrzegane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Stanowego Pensylwanii, IACUC #44057

1. Produkcja lentiwirusów

UWAGA: Dzień przed transfekcją, komórki LentiX-293 powinny mieć 80% konfluencji.

1. Przepłukać komórki DMEM tuż przed transfekcją i inkubować w 10 ml DMEM/10% FBS z penicyliną (100 j.m./ml) i streptomycyną (100 μg/ml) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
2. Rozcieńczyć DNA i polietyleniminę (PEI) (1 mg/ml) w stosunku 1:3 (1 μg DNA: 3 μl PEI) w 1 ml DMEM i wirować przez 1 min. Objętość dodanego DNA zależy od stężenia DNA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   1. Na przykład użyj 20 μg plazmidu DNA, składającego się z 10 μg plazmidu wektorowego, 5 μg plazmidu psPax2¹⁴, 5 μg wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) z 60 μl PEI na talerz.
3. Ponownie wymieszać roztwór DNA i PEI, wirując przez 1 minutę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
4. Dodać 1/10 objętości całkowitej pożywki hodowlanej DMEM (tj. 1 ml na 10 ml pożywki hodowlanej w naczyniu o średnicy 100 mm). Dodawać kropla po kropli 1 ml mieszaniny DNA-PEI do naczynia i obracać naczynie, aż pożywka będzie dobrze wymieszana z DNA.
5. Inkubować przez 6 godzin w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodać 5 ml pożywki hodowlanej.
6. 48 godzin po transfekcji zebrać supernatant wirusa i wirować w temperaturze 627 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w probówce o pojemności 50 ml. Przefiltrować 30 ml supernatantu wirusa przez filtr strzykawkowy 0,45 μm do probówki ultrawirówkowej.
7. Dodaj sterylną wodę, aby zrównoważyć probówki i przykryj probówki małym kawałkiem parafilmu. Wirować probówki o wymiarach 11 249 x g przez 120 min w temperaturze 4 °C. Usunąć płyn za pomocą końcówki próżniowej.
8. Dodać do probówki 100 μl zimnego PBS. Delikatnie kołysz rurką w temperaturze 4 °C O/N.
9. Aby ponownie zawiesić wirusa, należy 10 razy nałożyć pipetą PBS dodaną w kroku 1.8 na osad, uważając, aby nie dotknąć granulki końcówką. Śrut nie zostanie ponownie zawieszony, dopóki nie zostanie to zakończone.
10. Podzielić wirusa na porcje w ilości 10-20 μl na probówkę, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Stereotaktyczne wstrzykiwanie

2.1) Przygotowanie instrumentów

1. Przed zabiegiem umieść nożyczki, kleszcze z końcem, uchwyt na igłę, skalpel, waciki i szmatkę w szczelnie zamkniętym opakowaniu ze wskaźnikiem sterylizacji i autoklawie. Dodatkowo zaopatrz się w 10% jodu powidonu, 70% alkoholu etylowego, szwy wchłanialne, poduszkę rozgrzewającą, sztuczne łzy, sterylizator do kulek szklanych, wiertarkę, wiertło, 2 jednorazowe strzykawki, strzykawkę do wstrzykiwań, maszynkę do golenia, środek przeciwbólowy (ketoprofen), znieczulający (avertin), rękawiczki oraz aparat stereotaktyczny z pompą iniekcyjną.
2. Przygotuj tego dnia świeży roztwór 1,25% avertin, przefiltruj do sterylnego kaptura za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,2 μm i umieść w sterylnej fiolce z surowicą. Zmieszać 2,5 g alkoholu 2,2,2-tribromoetylowego z 5 ml alkoholu tert-amylowego, a następnie rozpuścić w 200 ml wody. Utrzymuj pH poniżej 5. ¹⁵

2.2) Przygotowanie myszy

1. Avertynę należy podawać w zależności od masy ciała myszy (375 mg/kg). ¹⁵ Wstrzyknij myszu awertynę poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP), a następnie umieść ją z powrotem w klatce do czasu całkowitego znieczulenia.
2. Podaj środek przeciwbólowy we wstrzyknięciu IP (ketaprofen, 5 mg/kg) i umieść sztuczne łzy na oczach myszy, aby zapobiec wysuszeniu.
3. Upewnij się, że mysz jest w pełni uśpiona, ściskając stopę. Jeśli mysz zareaguje na uszczypnięcie stopy, podaj więcej środka znieczulającego (w dawkach 50 μl). Ogol głowę myszy za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Ogol obszar, na którym ma być operowany (zwykle od tuż za uszami, do górnej części pyska) i okolice.
4. Umieść mysz w aparacie stereotaktycznym. Zatrzaśnij przednie zęby na przednim zacisku, opuść zacisk i dokręć go tak, aby szczęka była w pełni bezpieczna.
5. Włóż nauszniki do kanału słuchowego, aby w pełni ustabilizować głowę. Uważaj, aby nie wkładać wkładek dousznych zbyt głęboko, ponieważ może to spowodować uszkodzenie ucha wewnętrznego. Po zakończeniu korpus myszy powinien być w stanie lekko się poruszać bez zakłócania pozycji głowy.
6. Umieść poduszkę grzewczą pod myszką, aby regulować temperaturę ciała myszy przez cały czas trwania zabiegu.
7. Dokładnie oczyść obszar operacyjny. Za pomocą bawełnianego wacika wetrzyj 10% jodu powidonu okrężnymi ruchami, zaczynając od środka pola operacyjnego i kierując się na zewnątrz. Następnie za pomocą bawełnianego wacika wetrzyj 70% alkohol etylowy w miejsce operacji w ten sam sposób. Powtórz dwa razy.

2.3) Pierwsze nacięcie

1. Po przygotowaniu myszy otwórz sterylną torbę na sprzęt. Zmień rękawiczki przed dotknięciem instrumentów. Wyjmij sterylną szmatkę i połóż narzędzia na szmatce. Jeśli jakikolwiek instrument dotknie niesterylnej powierzchni, użyj sterylizatora z kulkami szklanymi przez 15 sekund, aby go wysterylizować.
2. Weź skalpel w rękę dominującą i kleszcze z końcami w rękę niedominującą. Użyj kleszczyków z końcami, aby delikatnie chwycić skórę myszy i wykonaj nacięcie za pomocą skalpela. Rozpocznij nacięcie około 1,5 cm powyżej uszu (w kierunku nosa) i rozciągnij do około 0,5 cm poniżej uszu. Rozciągnij nacięcie pionowo w dół środka głowy myszy, aby odsłonić bregmę (Rysunek 1).
3. Po wizualizacji bregmy weź sterylną bawełnianą końcówkę, aby delikatnie usunąć krew pokrywającą powierzchnię czaszki. Użyj dwóch bawełnianych końcówek, aby popchnąć skórę w kierunku boku głowy.

2.4) Ustawienia sprzętu

1. Po usunięciu krwi z powierzchni czaszki i wyraźnym uwidocznieniu bregmy, należy przygotować strzykawkę (stężenie 10⁸ TU/ml, objętość 1 μl). W dygestorii napełnić strzykawkę wirusem, który ma zostać wstrzyknięty. Upewnij się, że w środku nie ma bąbelków. Umieścić strzykawkę w aparacie stereotaktycznym, upewniając się, że jest w pełni zabezpieczona.
2. Powoli opuścić strzykawkę, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią czaszki, tak aby końcówka sterylnej igły strzykawki znajdowała się na przecięciu bregmy i linii międzyusznej. Ustaw ten punkt jako zero i określ współrzędne od tego punktu.
3. W zależności od obszaru zainteresowania mózgu zmieniaj współrzędne stereotaktyczne. Określ te współrzędne, korzystając z atlasu mózgu⁴. Po ustaleniu współrzędnych przesuń igłę strzykawki, aby dopasować te współrzędne. Wyceluj w zakręt zębaty za pomocą współrzędnych: M/L= +/- 1 mm, A/P= -1,82 mm. Opuść igłę tuż nad czaszką, aby zobaczyć, gdzie należy wywiercić otwór.
4. Lekko podnieść strzykawkę, wziąć wiertło i umieścić wiertło tuż nad docelowym miejscem wiercenia pod kątem około 45° do czaszki. Rozpocznij wiercenie i kontynuuj wiercenie, aż czaszka ustąpi. Kiedy czaszka ustępuje, można wykryć spadek oporu. Uważaj, aby nie wwiercać się w mózg, aby zapobiec uszkodzeniu kory mózgowej.
5. Weź sterylną bawełnianą końcówkę i zetrzyj krew z otworu.
6. Opuścić strzykawkę tak, aby końcówka przylegała bezpośrednio do powierzchni mózgu (nie do czaszki). Ustaw współrzędną D/V (głębokość) na 0. Opuścić strzykawkę na żądaną głębokość, na podstawie współrzędnych atlasu mózgu. Aby dotrzeć do zakrętu zębatego, ustaw D/V na -1,79 mm.
7. Rozpocząć wstrzykiwanie z szybkością 0,2 μl/min. Należy uważać, aby strzykawka nie zsunęła się poniżej żądanej głębokości. W takim przypadku należy delikatnie podnieść strzykawkę na żądaną głębokość.
8. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać około 2 minut, aby upewnić się, że wszelkie resztki wirusa zostały wchłonięte. Powoli podnieść strzykawkę i za pomocą bawełnianej końcówki usunąć płyn z miejsca wstrzyknięcia.
9. Powtórz dla drugiej półkuli.

2.5) Szycie

1. Wyjąć sterylny szew i igłę z opakowania i chwycić igłę za pomocą uchwytów na igły. Skierować ostro zakończoną krawędź igły z dala od uchwytu igły. Trzymaj kleszcze z końcem w niedominującej ręce i użyj ich do uchwycenia skóry myszy. Zacznij od dominującej ręki.
2. Delikatnie przepchnij szew przez skórę i użyj kleszczy z końcem, aby chwycić skórę po drugiej stronie nacięcia. Przeciągnij materiał szwowy, aż pozostanie około 0,75 cala.
3. Puść igłę i użyj kleszczyków z końcem, aby owinąć szew wokół uchwytu igły jeden raz, a następnie chwyć pozostały szew o długości 0,75 cala za pomocą uchwytu igły i przeciągnij szew, tak aby igła i uchwyt igły znalazły się po stronie głowy przeciwnej do tej, na której były pierwotnie założone. To powinno uformować węzeł.
4. Powtórz ten krok jeszcze trzy razy, za każdym razem zmieniając stronę głowy, na której znajduje się uchwyt igły.
5. Przeciąć szew i powtarzać kroki 2.5.1-2.5.3, aż nacięcie zostanie zamknięte.

2.6) Opieka pooperacyjna

1. Delikatnie zdejmij nauszniki z myszy i wyjmij jej szczękę z przedniego zacisku.
2. Trzymaj mysz na poduszce grzewczej, aż się obudzi i sama się porusza. Codziennie monitoruj mysz i zwracaj uwagę na oznaki bólu, takie jak brak pielęgnacji, jedzenia lub picia. W razie potrzeby należy podać dodatkowe leki przeciwbólowe.

3. Test w otwartym polu

3.1) Konfiguracja

1. Zdobądź pustą kwadratową, plastikową arenę o wymiarach 50 cm x 50 cm, ze ścianami o wysokości 50 cm (ale mogą być nieco większe). Oczyść arenę 70% alkoholem etylowym przed rozpoczęciem eksperymentu. Upewnij się, że alkohol etylowy całkowicie wyschł przed umieszczeniem myszy na arenie.
2. Umieść arenę na podłodze i postaraj się, aby oświetlenie było ustawione tak, aby zminimalizować cienie i odblaski.
3. Jeśli korzystasz z oprogramowania śledzącego, umieść kamerę bezpośrednio nad otwartym polem, około 1.5 stopy nad otwartym polem (wystarczająco daleko, aby w pełni objąć całą arenę, ale wystarczająco blisko, aby mieć wyraźny widok myszy).
4. Ustaw strefę na środku pudełka (około obszaru 30 cm x 30 cm). ¹⁶ Aby ustawić strefę, kliknij zakładkę strefa 1 w panelu bocznym.
   1. Zaznacz kontur kształtu w górnym panelu i obrysuj obwód strefy środkowej. Wybierz dodaj strefę i kliknij wewnątrz środkowej strefy. Korzystając z monitów programu, nazwij strefę (w tej procedurze będzie ona określana jako "środek"). Jeśli test behawioralny będzie oceniany ręcznie, upewnij się, że spód pola jest podzielony na kwadraty o wymiarach 10 cm x 10 cm, zaznaczone taśmą.
5. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby ustawienia były poprawne, a mysz była dobrze widoczna na ekranie. Aby to osiągnąć, należy dostosować ustawienia wykrywania na maszynie tak, aby były zgodne z areną testową (oświetleniem) i kolorem myszy.
   UWAGA: Gdy ustawienia są prawidłowe, system powinien śledzić tylko mysz, a nie cienie lub mocz/kał. Konkretne ustawienia oprogramowania zależą od oświetlenia areny i koloru myszy.

3.2) Aklimatyzacja i test

1. Przenieś myszy eksperymentalne do pokoju behawioralnego na 1 godzinę przed testem, aby zaaklimatyzować je w otoczeniu. Zostaw myszy w klatce na czas aklimatyzacji.
2. Włącz kamerę, aby nagrać zadanie behawioralne i umieść mysz w kierunku środka przodu areny, tak aby mysz była skierowana w stronę ściany.
3. Ustaw stoper na 5 minut i odejdź od areny. Jeśli to możliwe, opuść pomieszczenie, aby przypadkowo nie wpłynąć na mysz.
4. Po upływie 5 minut wyjmij mysz i umieść ją w klatce.
5. Użyj 70% alkoholu etylowego, aby dokładnie oczyścić pole przed przystąpieniem do następnej myszy. Upewnij się, że alkohol etylowy całkowicie wyschł.

3.3) Punktacja

1. Rozważ, że mysz znajduje się w środku pola, gdy wszystkie cztery łapy znajdują się w środku o wymiarach 30 cm x 30 cm.
2. Określ ilościowo ilość czasu, jaką mysz spędza w środku. Alternatywnie określ ten czas za pomocą oprogramowania śledzącego (takiego jak Noldus ethovison).
   1. W tym celu należy przejść do zakładki analizy i kliknąć na "ruch" pod profilami analizy. Usuń aktualnie ustawione kategorie, a następnie wybierz "w strefie" pod zakładką lokalizacji. Wybierz strefę środkową. Następnie wybierz "wynik analizy" (w zakładce wyników), aby wyświetlić wyniki. Powinna pojawić się tabela z listą czasu spędzonego w bezruchu dla każdej próby.
3. W przeciwnym razie oceń OFT ręcznie. Otwarte pole powinno mieć 25 kwadratów o wymiarach 10 cm x 10 cm obrysowanych na spodzie otwartego pola (zgodnie z opisem w kroku 3.1.3). Określ ilościowo ilość czasu, jaką mysz spędza w centrum, oprócz liczby wejść na środek areny. ¹⁶
   UWAGA: Środek obszaru o wymiarach 30 cm x 30 cm jest uważany za środek otwartego pola. Uważa się, że mysz zamieszkuje obszar środkowy, jeśli wszystkie cztery łapy znajdują się w obszarze o wymiarach 30 x 30 cm.

4. Test wymuszonego pływania

UWAGA: Zachowaj minimum pięć dni między zadaniami behawioralnymi.

4.1) Konfiguracja

1. Zaopatrzyć się w przezroczyste wiadro o pojemności 2 l i zalać wodą o temperaturze 22 °C. Umieść wiadro na stole i postaraj się, aby oświetlenie było ustawione tak, aby zminimalizować cienie i odblaski.
2. Jeśli korzystasz z oprogramowania śledzącego, umieść kamerę bezpośrednio nad łyżką.
3. Zainstaluj oprogramowanie tak, aby mysz była dobrze widoczna na ekranie.

4.2) Aklimatyzacja i test

1. Przenieś myszy eksperymentalne do pokoju behawioralnego na 1 godzinę przed testem, aby zaaklimatyzować się w otoczeniu. Zostaw myszy w klatce na czas aklimatyzacji.
2. Włącz kamerę, aby nagrać zadanie behawioralne. Delikatnie umieść mysz na środku wiadra z wodą. Uważaj, aby nie wpuścić myszy. Powoli opuść mysz tak, aby jej przednie łapy najpierw dotykały wody. Uważaj, aby ich głowa się nie zanurzyła.
3. Ustaw minutnik na 6 minut i odsuń się od obszaru zachowania.
4. Po upływie 6 minut wyjmij mysz z wiadra i zetrzyj nadmiar wody przed ponownym umieszczeniem myszy w klatce.

4.3) Punktacja

1. Jeśli korzystasz z oprogramowania śledzącego, ustaw procent bezruchu na 11%, zgodnie z sugestią Noldusa (powinno to być ustawienie domyślne), aby określić ilościowo czas pływania w porównaniu z pływaniem.
2. Aby dokonać kwantyfikacji za pomocą systemu śledzenia, należy przejść do zakładki analizy i kliknąć na ruch w obszarze profile analizy. Usuń aktualnie ustawione kategorie, a następnie wybierz stan mobilności w panelu po lewej stronie (w obszarze indywidualnego zachowania). Ustaw unieruchomienie na 11%.
3. Wybierz opcję Śledź wizualizację na karcie wyników. Wybierz dane wyjściowe analizy (na karcie wyników), aby wyświetlić wyniki. Powinna pojawić się tabela z listą czasu spędzonego w bezruchu dla każdej próby.
4. Jeśli ręka zdobywa punkty, zmierz czas, w którym mysz spędza pływanie lub wspinanie się, oraz czas, w którym mysz spędza nieruchomo. Ponadto zmierz opóźnienie do pierwszego unieruchomienia. Zobacz rysunek 2 w sekcji wyników.

Wyniki

Dokładne wstrzykiwanie stereotaktyczne zależy w dużej mierze od ustawienia prawidłowych współrzędnych. Końcówka igły użytej do wstrzyknięcia wirusa powinna znajdować się bezpośrednio na przecięciu bregmy i linii międzyusznej (ryc. 1). Pomocne jest użycie mikroskopu stereoskopowego w celu upewnienia się, czy igła jest prawidłowo umieszczona. Patrząc przez mikroskop, igła powinna być ustawiona w taki sposób, aby w przypadku wstrzyknięcia wirusa wylądowała bezpośrednio na przecięciu bregmy i linii międzyusz...

Dyskusja

Udane wstrzyknięcia stereotaktyczne opierają się na trzech czynnikach: utrzymaniu myszy przy życiu, ustawieniu prawidłowego punktu zerowego dla współrzędnych (końcówka igły na przecięciu bregmy i linii międzyusznej) oraz ustawieniu odpowiedniej głębokości do punktu zerowego (końcówka igły dotyka tylko zewnętrznej strony tkanki mózgowej). Żywotność myszy jest ważna. Przeżycie po operacji można wspomóc, upewniając się, że mysz jest odpowiednio znieczulona i otrzymuje odpowiednie środki przeciwbólowe. Wiadomo, że ból jest g...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aparatura stereotaktyczna pozycja 51725	Stoelting co.	51725
Kwintesencja pompy stereotaktycznej	Stoelting co.	53311
Styringe iniekcyjne, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polinauki Inc.	23966
Nożyczki	Drobne narzędzia chirurgiczne	14084-08
Kleszcze z końcem	Drobne narzędzia chirurgiczne	11002-12
Uchwyt na igłę	Drobne narzędzia chirurgiczne	12001-13
Wiertło	Ram Products Inc	Skrzynka kontrolna Microtorque, rękojeść Tech2000	z pedałem
Sterylizator szklanych kulek	Inotech	IS-400
Szwy wchłanialne	Unify	M-K518r19	Wchłanialny, odwrotne cięcie
Waciki bawełniane	VWR	89031-270
Poduszka grzewcza	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Sztuczne łzy	Rugby	NDC 0536-6550-91
Jednorazowa strzykawka	BD Strzykawka 309623
Rękawice z tkaniny
& nbsp;	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin lub inny środek znieczulający	patrz cytat
Ketoprofen lub inny środek przeciwbólowy	patrz weterynarz
Oprogramowanie śledzące	Noldus	Ethovision XT
Kamera śledząca	Noldus	Media Recorder