Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie strategii inkorporacji kapsydu antygenu do opracowania metod szczepień z wektorem 5 serowirusa

DOI:

10.3791/52655

⸱

6 maja 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wektora Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 o nazwie Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 poprzez wykorzystanie strategii inkorporacji antygenu kapsydu. Wykazano, że wektor ten wykazuje przydatność jakościową, zdolność do ucieczki z surowic Ad5-dodatnich in vitro oraz antygenowość i immunogenność w stosunku do włączonych antygenów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adenowirus serotyp 5 (Ad5) został gruntownie zmodyfikowany tradycyjnymi metodami transgenowymi w celu opracowania szczepionki. Zmniejszona skuteczność tych tradycyjnie modyfikowanych wektorów Ad5 w badaniach klinicznych może być przede wszystkim skorelowana z istniejącą wcześniej odpornością Ad5 (PEI) u większości populacji. Aby promować rozwój szczepionki z wektorem Ad5 poprzez rozwiązanie problemu AD5 PEI, zastosowano innowacyjną strategię inkorporacji kapsydu antygenu. Dzięki tej strategii, wektorowi Ad5 najpierw skonstruowaliśmy plazmid wahadłowy HVR1-KWAS-HVR5-His6 / pH5S poprzez subklonację regionu hiperzmiennego (HVR) 1 heksonu do wcześniej skonstruowanego plazmidu wahadłowego HVR5-His6 / pH5S, który miał znacznik His6 włączony do HVR5. Ten fragment DNA HVR1 zawierający epitop HIV ELDKWAS został zsyntetyzowany. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S został następnie zlinearyzowany i poddany kotransformacji ze zlinearyzowanym plazmidem szkieletowym pAd5/∆H5 (GL) w celu rekombinacji homologicznej. Ten zrekombinowany plazmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 został transfekowany do komórek w celu wygenerowania wektora wirusowego Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. Zwalidowano, że wektor ten ma dopasowanie jakościowe wskazane przez miano fizyczne wirusa (VP/ml), miano zakaźne (IP/ml) i odpowiadający mu stosunek VP/IP. Zarówno epitop HIV, jak i znacznik His6 były eksponowane powierzchniowo na kapsyd Ad5 i zachowywały własną antygenowość specyficzną dla epitopu. Test neutralizacji wykazał zdolność tego dwuwartościowego wektora do obchodzenia neutralizacji przez surowice Ad5-dodatnie in vitro. Immunizacja myszy wykazała wytwarzanie silnej odporności humoralnej specyficznej dla epitopu HIV i His6. To badanie potwierdzające słuszność zasady sugeruje, że protokół związany ze strategią inkorporacji kapsydu antygenu może być wykonalnie wykorzystany do generowania szczepionek z wektorem Ad5 poprzez modyfikację różnych białek kapsydu. Protokół ten może być jeszcze bardziej zmodyfikowany w celu generowania rzadkich szczepionek wektorowych z wektorem adenowirusowym o rzadkim serotypie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki adenowirus (Ad) to średniej wielkości, bezotoczkowy wirus z dwudziestościennym nukleokapsydem zawierającym dwuniciowy genom DNA. Ad należy do rodziny Adenoviridae, z klasyfikacją na siedem grup (od A do G). Każda grupa zawiera wirusa o różnych serotypach. Spośród nich adenowirus serotyp 5 (Ad5) z grupy C został najszerzej przebadany i najszerzej stosowany w podejściach wektorowych, takich jak terapia genowa i szczepienia.

Tradycyjna strategia transgenu została opracowana i zastosowana do modyfikacji Ad5, która charakteryzuje się przemieszczeniem wczesnych genów wirusa za pomocą genu będącego przedmiotem zainteresowania, oraz skoncentrowaną ekspresją genu zainteresowania u gospodarza. Przykładami są budowa pENV9/Ad5hr∆E3 poprzez zastąpienie wczesnego genu 3 (E3) genem rev małpiego wirusa niedoboru odporności1, budowa AdCMVGag poprzez zastąpienie wczesnego genu 1 (E1) genem gag ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV)2 oraz budowa AdlacZ poprzez zastąpienie E1 genem lacZ 3. Szerokie zastosowanie tradycyjnej strategii transgenowej na Ad5 zależy od następujących zalet: szerokiego zakresu gospodarzy dla Ad5, wykonalnej inżynierii genetycznej w zakresie rozprzestrzeniania się wirusa i wirusa, dużej akomodacji obcej insercji genu oraz bezpieczeństwa Ad54,5. Jednak zmniejszona skuteczność terapii klinicznych z wektorem Ad5 przy zastosowaniu tej strategii była głównym wąskim gardłem, które zostało zmapowane jako związane przede wszystkim z AD5 PEI, ponieważ AD5 jest tak rozpowszechniony wśród większości dzieci i dorosłych4,6.

Aby przezwyciężyć główne wąskie gardło Ad5, głównym celem jest opracowanie alternatywnej strategii omijającej Ad5 PEI. Wykazano, że odporność wrodzona7, odporność adaptacyjna, taka jak przeciwciała neutralizujące (NAbs)8-10 i odpowiedzi limfocytów T CD8 + 10 przeciwko Ad5, przyczynia się do AD5 PEI, przy czym AD5 NAb wydają się odgrywać dominującą rolę we wkładach w AD5 PEI10,11. Co więcej, AD5 NAb celują w epitopy znajdujące się w białkach kapsydu, w tym główny hekson białkowy, błonnik i zasada pentonowa. Z czego hekson jest głównym celem Ad5 NAbs8,11-13. Na podstawie tych ustaleń wprowadzono innowacyjną strategię inkorporacji kapsydu antygenu. Ta nowatorska strategia kładzie nacisk na zastępowanie lub włączanie białek będących przedmiotem zainteresowania do białek kapsydu Ad5, które przesuwają lub maskują epitopy neutralizujące Ad5, prowadząc do zmniejszonego rozpoznawania przez NAb i wydajnego podawania wektorów Ad5. Warto zauważyć, że strategia ta jest konkurencyjna, ponieważ może również pomóc gospodarzom w wywołaniu silnej odporności humoralnej i silnej odporności komórkowej poprzez bezpośrednie prezentowanie antygenów będących przedmiotem zainteresowania układu odpornościowego4,14,15. W oparciu o tę strategię, klonowanie molekularne i ratowanie rekombinowanych wektorów wirusowych Ad można strukturalnie podzielić na cztery główne etapy: (a) przygotowanie fragmentu genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) lub syntezy; b) ligacja fragmentu genu do plazmidu wahadłowego, który zawiera fragment genu będącego przedmiotem zainteresowania i ramiona homologiczne do szkieletu adenowirusa; c) rekombinacja homologiczna poprzez kotransformację plazmidu czółenka zawierającego fragment genu będącego przedmiotem zainteresowania ze zlinearyzowanym plazmidem szkieletowym pAd5/∆H5 (GL)16; (d) transfekcja linearyzowanego rekombinowanego plazmidu adenowirusowego w celu uratowania rekombinowanego wektora Ad włączonego z antygenami będącymi przedmiotem zainteresowania.

Nasza grupa i kilka innych rozszerzyły tę alternatywną strategię integracji reklam dla rozwoju szczepionek wektorowych przeciwko różnym zakaźnym patogenom. Informowaliśmy o generowaniu rekombinowanego wektora reklamowego Ad-HVR1-lgs-His6-V3 poprzez włączenie znakowanego przez Hisa antygenu HIV-1 V3 do lokalizacji HVR1 heksonu Ad5 (hexon5). Wygenerowany w ten sposób wektor wywołał silną humoralną odpowiedź immunologiczną specyficzną dla epitopu V34. Informowaliśmy również o rozwoju Ad5 / HVR2-MPER-L15∆E1 poprzez włączenie bliższego regionu ektodomeny błony HIV-1 (MPER) do lokalizacji HVR2 heksonu52. Ponadto grupa dr Zhou wykorzystała korzyści płynące z tej strategii inkorporacji Ad do opracowania szczepionek wektorowych Ad serotyp 3 (Ad3), tj. generowania wektora wirusowego R1SP70A3 poprzez włączenie neutralizującego epitopu SP70 Enterowirusa 71 do HVR1 heksonu Ad3 (hexon3). R1SP70A3 generowały silną produkcję NAb i IFN-γ specyficzną dla epitopu SP70, co doprowadziło do wysokiego wskaźnika ochrony przed prowokacją Enterowirusa 7115.

Dla celów technicznych, nasze badanie wykorzystało strategię jakościowego włączania kapsydu antygenu, aby skupić się na generowaniu dwuwartościowego wektora Ad5 Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 poprzez włączenie antygenu HIV-1 do HVR1 i znacznika His do HVR5 hexon5. Wygenerowany wektor wirusowy został również poddany ocenie immunologicznej. Strategia inkorporacji kapsydu antygenu może zostać wykorzystana do opracowania metod szczepień z wektorem AD5 przeciwko różnym chorobom zakaźnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komitet ds. Instytucjonalnego Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Alabama w Birmingham zatwierdził użycie myszy zgodnie z opisem w niniejszym protokole o numerze zatwierdzonym 101109272.

1. Genetyczna budowa zmodyfikowanego plazmidu pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 ze strategią inkorporacji antygenu kapsydu

  1. Budowa plazmidu wahadłowego HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S
    1. Zamów plazmid zawierający zsyntetyzowaną sekwencję DNA HVR1-KWAS między miejscami enzymu restrykcyjnego od AgeI do AccI genu hexon5.
    2. Wytrawić 6 μg zsyntetyzowanego fragmentu (HVR1-KWAS) za pomocą enzymów AgeI (6 jednostek) i AccI (6 jednostek) przez 3 godziny w temperaturze 37 °C. Rozpuścić strawiony fragment w 2% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy i oczyścić fragment za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z protokołem producenta.
    3. Opierając się na stosunku molowym insercji do wektora w stosunku 3 : 1, użyj ligazy DNA T4 i buforu ligazy do ligacji 12 ng fragmentu (HVR1-KWAS) do 100 ng wcześniej skonstruowanego plazmidu wahadłowego HVR5-His6 / pH5S17 w objętości 10 μl w RT przez 2 godziny, przez miejsca AgeI i AccI.
    4. Przekształć 1 μl z 10 μl produktu ligacji w 50 μl elektrokompetentnych ogniw DH5α w elektroporatorze (przy 1800 V). Dodać 950 μl pożywki SOC do przekształconych komórek DH5α i inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, z prędkością 300 obr./min. Rozprowadzić 100-200 μl 1 ml mieszaniny na agarze Luria-Bertani (LB) zawierającym kanamycynę i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
      1. Aby przesiać ~ 10 kolonii metodą PCR ukierunkowaną na fragment HVR1-KWAS, wymieszaj starter do przodu (TATGTGTGTCATGTATGCGT), starter odwrotny (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) i pojedynczą kolonię DH5α do roztworu mieszanki głównej PCR (zgodnie z protokołem producenta). Uruchom próbki na termocyklerze, odwołując się do instrukcji dołączonej do roztworu do mieszania głównego PCR.
      2. Użyj startera do przodu (TATGTGTGTCATGTATGCGT), aby zsekwencjonować fragment HVR1-KWAS w klonach przesiewanych w sekcji 1.1.4.1.
  2. Budowa plazmidu pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6
    1. Trawić 6 μg HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S za pomocą enzymów EcoRI (6 jednostek) i PmeI (6 jednostek) przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i oczyszczać fragment zawierający homologiczne ramiona rekombinacyjne i podwójnie zmodyfikowany gen hexon5, jak określono w kroku 1.1.2. Linearyzuj plazmid szkieletowy pAd5/∆H5 (GL)16 za pomocą SwaI.
    2. Przekształcaj 100 ng docelowego fragmentu z plazmidu wahadłowego i 100 ng zlinearyzowanego szkieletu pAd5/∆H5 (GL) w 50 μl elektrokompetentnych ogniw BJ5183 w celu rekombinacji homologicznej w elektroporatorze (przy 1800 V). Dodać 950 μl pożywki SOC do przekształconych komórek i inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 300 obr./min. Rozprowadzić 100-200 μl mieszaniny 1 ml na agarze LB zawierającym kanamycynę (końcowe 50 μg/ml) do inkubacji O/N w temperaturze 37 °C.
      1. Zbierz ~ 10 maleńkich kolonii do 3 ml płynnego LB zawierającego kanamycynę (końcowe 50 μg / ml) do inkubacji O/N w wytrząsarce (250 obr./min, 37°C). Wyodrębnij plazmidy z kultury. Użyj analizy PCR, aby przesiać 10 kolonii, celując we fragment HVR1-KWAS, jak pokazano w kroku 1.1.4.1.
      2. Aby przebadać te same kolonie za pomocą analizy PCR ukierunkowanej na fragment pIX genomu szkieletowego, należy wymieszać starter do przodu (AGCTGTTGGATCTGCCCCAGCAGGTTTT), starter odwrotny (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTATTATTATTAT) i pojedynczą kolonię BJ5183 do roztworu mieszanki głównej PCR (zgodnie z protokołem producenta). Uruchom próbki na termocyklerze, odwołując się do instrukcji dołączonej do roztworu do mieszania głównego PCR.
      3. Oznacz podwójnie dodatnie kolonie PCR jako pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6.
    3. Przekształć 100 ng plazmidu pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 w komórki DH5α, jak pokazano w kroku 1.1.4.
      1. Użyj analizy PCR, aby przesiać ~ 10 kolonii, celując we fragment HVR1-KWAS, jak pokazano w kroku 1.1.4.1.
      2. Użyj analizy PCR, aby przeprowadzić badania przesiewowe tych samych kolonii, celując w fragment pIX genomu szkieletowego, jak pokazano w kroku 1.2.2.2.
      3. Użyj startera do przodu (TATGTGTGTCATGTATGCGT), aby zsekwencjonować fragment HVR1-KWAS w pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6.

2. Przygotowanie zmodyfikowanego wektora wirusowego Ad5 Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6

  1. Przygotuj kompletną pożywkę, dodając FBS (ostatnie 10%), 100X Aminokwasy Endogenne (końcowe 0,1 mM), 200 mM L-glutaminy (ostatnie 2 MM) i roztwór penicyliny/streptomycyny (końcowy 1%) do DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Utrzymuj ludzkie embrionalne komórki nerki (HEK293) w kompletnym podłożu w inkubatorze hodowlanym (37 °C i 5% CO2 w 85% wilgotnych warunkach).
  2. Na ratunek wektorowi wirusowemu Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6
    1. Zasiew: 3,0 x 106 komórek HEK293 w jednej kolbie T-25 zawierającej 5 ml kompletnej pożywki i kultury O/N w celu uzyskania monowarstwy o 80% konfluencji.
    2. Natlearyzować 15 μg pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 w objętości 100 μl enzymem restrykcyjnym PacI (15 jednostek) w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
      1. Ekstrahować zlinearyzowany pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 przez dwukrotne odwirowanie reakcji (10 000 x g przez 1 min) z równą objętością alkoholu fenolowo-chloroformowego:izoamylowego (stosunek 25 : 24 : 1) w dygestoriach i przez sekwencyjne odwirowanie (10 000 x g przez 10 min) zmieszanym roztworem (300 μl 100% etanolu i 10 μl octanu sodu) i 700 μl 70% etanolu. Odrzucić supernatant na każdym etapie wirowania.
    3. Zawiesić oczyszczony plazmid w ~ 40 μl wody destylowanej lub buforu Tris-EDTA (TE). Określ ilościowo plazmidowe DNA, mierząc gęstość optyczną (OD) przy 260 nm.
    4. Transfekcję 3 μg zlinearyzowanego plazmidu za pomocą dostępnego w handlu odczynnika do transfekcji liposomalnej w kolbie T-25, zgodnie z instrukcją producenta. Zmienić pożywkę do transfekcji na pełną pożywkę po 6 godzinach od transfekcji, a następnie inkubacji w inkubatorze kultur. Utrzymuj transfekowane komórki, wymieniając całe podłoże co dwa do trzech dni, aż utworzą się pojedyncze blaszki wirusowe.
    5. Gdy blaszki miażdżycowe rozwiną się do pełnego efektu cytopatycznego (CPE), zeskrobać pozostałe komórki z kolby w sterylnym kapturze i zebrać lizat komórkowy przez odwirowanie pożywki o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w ~ 1 ml pożywki zawierającej 2% FBS i rozbić komórki przez czterokrotne zamrażanie i rozmrażanie. Zebrać supernatant zawierający uratowanego wirusa po odwirowaniu lizatu w temperaturze 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Rozprzestrzenianie się na dużą skalę wektora wirusowego Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6
    1. Rozmnażać wirusa w kolbie T-75 zawierającej komórki HEK293 w sterylnym kapturze, zakażając 1/3 do pełnego lizatu z kolby T-25. Pozwól, aby pełne CPE rozwinęło się w ciągu dwóch do trzech dni w inkubatorze kultur. Zebrać supernatant lizatu zgodnie z krokiem 2.2.5.
    2. Namnażać wirusa w jednej do trzech kolb T-175 w sterylnym kapturze, zakażając 1/2 do pełnego lizatu z kolby T-75, w zależności od warunków namnażania się wirusa. Pozwól, aby pełne CPE rozwinęło się w ciągu dwóch do trzech dni w inkubatorze kultur. Zebrać supernatant lizatu zgodnie z krokiem 2.2.5.
    3. Namnażać wirusa w jednej lub więcej kolbach T-175 w sterylnym kapturze, zakażając 1/2 do pełnego lizatu z poprzedniej kolby (kolb) T-175. Określ ilość użycia kolby w oparciu o warunki namnażania się wirusa i ilość potrzebnego wirusa. Zebrać supernatant lizatu, jak podano w kroku 2.2.5, gdy w ciągu dwóch do trzech dni w inkubatorze hodowl nastąpi pełne CPE.
  4. Oczyszczanie Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 przez chlorek cezu
    1. Przygotować dwie gęstości roztworów CsCl w 5 mM HEPES: 1,33 g/ml i 1,45 g/ml, unikając kontaktu z CsCl.
    2. Załadować 4 ml CsCl (1,33 g/ml) do sterylnej probówki ultrawirówki i delikatnie obciążyć 4 ml CsCl (1,45 g/ml) na dno probówki. Powoli załadować 4 ml supernatantu lizatu na wierzch gradientów w sterylnym kapturze.
    3. Odwirować probówkę o masie 110 000 x g przez 3 godziny w temperaturze 4 °C, aby oddzielić dojrzały/dolny prążek wirusa od wadliwego/wyższego pasma wirusa. Zebrać dolną prążek za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml uzbrojonej w igłę o pojemności 33 G i rozcieńczyć opaskę za pomocą 5 mM HEPES do objętości 4 ml w sterylnym kapturze.
    4. Załadować kolejną probówkę roztworami CsCl o dwóch gęstościach i rozcieńczonym pasmem wirusa, jak opisano w kroku 2.4.2. Odwirować probówkę przy 110 000 x g O/N w temperaturze 4 °C. Zebrać pasmo wirusa zgodnie z opisem w kroku 2.4.3.
    5. Zebrany roztwór wirusa wstrzyknąć do kasety dializacyjnej za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml uzbrojonej w igłę 33 G umieszczoną w sterylnym kapturze.
    6. Umieścić kasetę w 700 ml 1x buforu do dializy (przepis na 1 l: 100 ml 10x PBS, 100 ml 100% glicerolu i 800 ml wody destylowanej; przefiltrować bufor przez filtr 0,22 μm) i wymieniać bufor dializacyjny co 3 godziny 4 razy. Odessać dializowany roztwór wirusa za pomocą strzykawki z igłą.

3. Walidacja uratowanego wektora wirusowego

  1. Miareczkowanie wektorów wirusowych
    1. W przypadku fizycznego miana wirusa rozcieńczyć zarówno wirusa, jak i bufor dializacyjny (kontrola tła) w stosunku 1 : 10 i 1 : 20 w buforze do lizy wirusa (10% SDS w Tris-EDTA) w małych probówkach i inkubować wszystkie probówki w temperaturze 56 °C przez 10 minut.
    2. Włącz biofotometr i ustaw tryb absorbancji na OD 260 nm. Użyj rozcieńczonego buforu do dializy (1 : 10), aby zrównoważyć sygnał tła, klikając "puste" dno. Wpisz "10 + 90" na ekranie biofotometru i odczytaj sygnał rozcieńczonego wirusa (1 : 10).
    3. Odczytać sygnał rozcieńczonego wirusa (1 : 20), postępując zgodnie z metodą opisaną w kroku 3.1.2, ale zamiast tego wpisz "5 + 95" na ekranie biofotometru. Pomnóż dwie liczby odczytu wirusa przez 1,1x1012 i oblicz średnie miano za pomocą jednostki VP/ml, na podstawie dwóch indywidualnych mian z dwóch rozcieńczeń.
    4. W przypadku miana infekcji wirusa (IP/ml) należy użyć statystycznej metody TCID50 KARBER14, aby określić głębokość infekcji na komórkach HEK293 po 10 dniach od zakażenia (d.p.i.)
  2. Ocena ekspozycji na antygen na wektorze wirusowym
    1. Pokryj wektor wirusowy na płytce ELISA i kontynuuj pozostałe kroki w standardowej metodzie ELISA14. Użyć ludzkiego przeciwciała monoklonalnego (mAb) anty-gp41 (2F5) i mysiego mAb z tagiem anty-His do wykrywania odpowiednich włączonych antygenów14.
    2. Rozpuść wektor wirusowy w elektroforezie w żelu zdenaturowanym (SDS-PAGE) i postępuj zgodnie z pozostałymi krokami w standardowej metodzie western blot14. Użyć ludzkiego przeciwciała monoklonalnego (mAb) anty-gp41 (2F5) i mysiego mAb z tagiem anty-His do wykrywania odpowiednich włączonych antygenów14.
  3. Ocena in vitro wektora pod kątem zdolności do ominięcia surowic dodatnich na poziomie Ad5
    1. Komórki HeLa należy utrzymywać w kompletnym podłożu w inkubatorze hodowlanym (37 °C i 5% CO2 w warunkach wilgotności 85%). Przygotować kompletną pożywkę, dodając FBS (ostatnie 10%), 200 mM L-glutaminy (końcowe 2 mM) i roztwór penicyliny/streptomycyny (końcowy 1%) do Minimum Essential Medium Eagle (MEME).
    2. Wysiewaj komórki HeLa na płytkach 6-dołkowych w 1x106 komórek/basenie i inkubuj płytki w inkubatorze hodowli (37 °C i 5% CO2 w warunkach 85% wilgotnych) przez 2 godziny. Inkubować surowice Ad5-dodatnie (0,1 μl lub 0 μl) z 5 IP/komórkę wektora wirusowego (Ad5 lub Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6) w inkubatorze hodowli przez 1 godzinę przed dodaniem mieszanin na 6-dołkowe płytki zawierające komórki.
    3. Po 24 godzinach od zakażenia (h.p.i.) przepłucz komórki raz PBS i zlizuj komórki w 0,5 ml buforu do lizy. Wirować przy 15 000 x g przez 5 minut i zebrać supernatant. Zmieszać 20 μl supernatantu ze 100 μl substratu lucyferazy w celu odczytu sygnału lucyferazy, ponieważ wirusy zawierają gen lucyferazy.

4. Ocena immunologiczna uratowanego wektora wirusowego

  1. Przygotuj dwie grupy immunizacyjne: Ad5 i Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6.
    1. Wstrzyknąć myszom (n = 8 / grupę) domięśniowo wirusy w dawce 1x1010 VP / mysz, w homologicznym schemacie immunizacji "prime-boost", w odstępie 2 tygodni.
    2. Po 2 tygodniach od każdego wstrzyknięcia należy wykrwawić myszy bez znieczulenia poprzez krwawienie z policzka za pomocą lancetów zwierzęcych (długość końcówki 5 mm) w celu zebrania krwi w probówkach o pojemności 1,5 ml.
  2. Wymieszać krew w probówkach, odwracając się w górę i w dół, i inkubować krew w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Obracać probówki w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i przenieść surowice (górna warstwa) do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.
    1. Wirować nowe probówki w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i przenieść surowice do nowo oznaczonych probówek o pojemności 1,5 ml w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.
  3. Ocena odporności humoralnej swoistej dla antygenu za pomocą testu ELISA opartego na surowicach
    1. Rozcieńczyć Jego peptyd (zapas w 1 mM) i peptyd HIV-1 (zapas w 1 mM) oddzielnie w 100
      2. .
    2. mM bufor węglanowy (pH 9,5) w celu uzyskania stężenia powłoki peptydowej na poziomie 10 μM. Pokryć płytki ELISA rozcieńczonymi peptydami oddzielnie, dodając 100 μl na basenik i inkubując płytki O/N w temperaturze 4 °C.
    3. Umyć płytki PBST czterokrotnie w 200 μl/studzienkę i zablokować na 1 godzinę w 5% BSA w PBST. Nanieść surowice myszy na płytki w rozcieńczeniu 1: 100 w buforze blokującym, 100 μl/basenik. Inkubować przez 2 godziny inkubacji w RT.
    4. Umyj płytki PBST cztery razy. Blokować płytki przez inkubację w temperaturze pokojowej przez 30 minut w buforze blokującym przy 100 μl/basenik.
    5. Zastosować kozią anty-mysią IgG-HRP (1:5000 w buforze blokującym) w dawce 100 μl/studzienkę na obie płytki pokryte peptydem He i peptydem HIV-1 indywidualnie. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Umyć płytki PBST.
    6. Odczytać płytki przy OD450 nm po inkubacji z substratem HRP przez 30 minut.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategia inkorporacji kapsydu antygenu (Rysunek 1A) została wykorzystana do wygenerowania dwuwartościowego wektora wirusowego Ad5 Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. Po pierwsze, plazmid wahadłowy HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S został skonstruowany poprzez subklonowanie fragmentu HVR1-KWAS do poprzednio skonstruowanego plazmidu wahadłowca HVR5-His6/pH5S17. Po drugie, plazmid pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His614 został zbudowany przez homologiczną rekombinac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie tradycyjnej strategii transgenowej w modyfikacji Ad5 w celu opracowania szczepionek zostało zmniejszone głównie ze względu na wąskie gardło związane z Ad5 PEI4,6. To wąskie gardło można częściowo zmniejszyć, stosując alternatywną strategię inkorporacji kapsydu antygenu (Figura 1A), ponieważ strategia ta może uniknąć neutralizacji przez AD5 NAb poprzez zastąpienie neutralizujących epitopów Ad5 antygenami będącymi przedmiotem zainteresowania i ułatwić wytworzenie silnej odporności n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health 5T32AI7493-20 i 5R01AI089337-03. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x DPBSThermo ScientificSH30256.01do rozdzielania komórek 
10x DPBSThermo ScientificSH30378.02do przygotowania buforu do dializy
glicerolSIGMAG5516-1Ldo preparatu buforu do dializy
SDSBIO-RAD161-0301do przygotowania buforu do lizy wirusów
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo ScientificSH30910.03składnik pożywki
hodowlanej 100x Aminokwasy Endogenne& nbsp;Thermo ScientificSH30238.01składnik pożywki hodowlanej
200 mM L-glutaminaCellgro25-005-CIskładnik pożywki hodowlanej
roztwór penicyliny/streptomycyny Cellgro30-002-CIskładnik pożywki hodowlanej
DMEM o wysokiej zawartości glukozyThermo ScientificSH30081.01do hodowli komórkowych HEK293
Minimum Essential Medium EagleSIGMAM5650do hodowli komórkowych HeLa
fenol:chloroform:alkohol izoamylowy SIGMAP3803-100MLdo dużych rozmiarów oczyszczania DNA
chlorek cezu Produkty Badawcze Międzynarodowa Corp.C68050do oczyszczania wirusów
HEPESCellgro25-060-CIdo przygotowania roztworu CsCl
HEK293ATCC51-0036do ratowania wirusów i ekskluzywnych
HeLaATCCCCL-2do testu neutralizacji
Kolba T-25Thermo Scientific156367do hodowli komórkowych 
Kolba T-75CORNING430641do hodowli komórkowych 
Kolba T-175Thermo Scientific159910do hodowli komórkowych 
UltrawirówkaBECKMANNAdo oczyszczania wirusów
Probówka do ultrawirówkiBECKMAN344059do oczyszczania wirusów
kaseta dializacyjna Thermo Scientific66380do dializy wirusowej
Płytka ELISAThermo Scientific442404do ELISA
ludzki anty-gp41 (2F5) mAbNIH AIDS Reagent Program1475do testów immunologicznych
mysi znacznik anty-His mAbGenScriptA00186do testów immunologicznych
Pożywka SOCCORNING46-003-CRdo transformacji
Roztwór do PCR Master MixQIAGEN201445do PCR
Nakłuwacz zwierzęcy (długość końcówki 5 mm)MEDIpointdla myszy krwawiących 
BiofotometrEppendorfdo fizycznego miareczkowania miana wirusa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
  2. Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815(2010).
  3. DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
  4. Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112(2014).
  5. Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
  6. Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
  7. Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571(2013).
  8. Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
  9. Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
  10. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
  11. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
  12. Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
  13. Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
  14. Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347(2013).
  15. Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381(2012).
  16. Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
  17. Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
  18. Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
  19. Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
  20. Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089(2014).
  21. Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
  22. Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
  23. Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
  24. Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
  25. Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
  26. Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533(2013).
  27. Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699(2012).
  28. Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Viral Vector ConstructionPlasmid Shuttle SystemHomologous RecombinationViral Titer AnalysisNeutralization AssayHIV Epitope DisplayHis6 Tag IncorporationCesium Chloride Purification

Powiązane artykuły