Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.
Artykuł metodologiczny
Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.
Kość jest najczęstszym miejscem przerzutów raka piersi. Chociaż powszechnie przyjmuje się, że mikrośrodowisko wpływa na zachowanie komórek rakowych, niewiele wiadomo na temat właściwości i zachowań komórek raka piersi w natywnym mikrośrodowisku ludzkiej tkanki kostnej.Opracowaliśmy metody śledzenia, ilościowego określania i modulowania ludzkich komórek raka piersi w mikrośrodowisku hodowanych fragmentów ludzkiej tkanki kostnej wyizolowanych z wyrzuconych głów kości udowych po operacjach całkowitej wymiany stawu biodrowego. Korzystając z komórek raka piersi zmodyfikowanych pod kątem lucyferazy i zwiększonej ekspresji białka zielonej fluorescencji (EGFP), jesteśmy w stanie odtwarzalnie określić ilościowo wzorce migracji i proliferacji za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI), śledzić interakcje komórkowe we fragmentach kości za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i ocenić komórki piersi po kolonizacji za pomocą cytometrii przepływowej. Do najważniejszych zalet tego modelu należą: 1) natywne, nienaruszone architektonicznie mikrośrodowisko tkankowe, które obejmuje odpowiednie typy komórek ludzkich, oraz 2) bezpośredni dostęp do mikrośrodowiska, który ułatwia szybkie ilościowe i jakościowe monitorowanie i zaburzenia właściwości, zachowań i interakcji komórek piersi i kości. Podstawowym ograniczeniem jest obecnie skończona żywotność fragmentów tkanki, co ogranicza okno badania do krótkoterminowej hodowli. Zastosowania systemu modelowego obejmują badanie podstawowej biologii raka piersi i innych nowotworów złośliwych poszukujących kości w niszy przerzutowej oraz opracowywanie strategii terapeutycznych w celu skutecznego celowania w komórki raka piersi w tkankach kostnych.
Mikrośrodowisko guza jest powszechnie uznawane za krytyczny czynnik determinujący zachowanie komórek rakowych podczas progresji raka piersi i rozprzestrzeniania się przerzutów1-3. Celem przedstawionej metody jest ułatwienie badania komórek raka piersi w mikrośrodowisku ludzkiej tkanki kostnej, najczęstszego miejsca przerzutów raka piersi4-6. Kość składa się ze zmineralizowanych i szpikowych przedziałów7-9, z których oba zawierają komórki i wydzielane czynniki zaangażowane w progresję przerzutów10,11. Chociaż szeroko stosowane modele mysie in vivo ułatwiają ogólnoustrojowe badania procesu przerzutowego12-15
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Głowy kości udowych pobrano od pacjentów poddawanych planowej operacji THR na Wydziale Chirurgii Ortopedycznej w Stanford University School of Medicine. Wszystkie tkanki zostały pobrane jako próbki pozbawione elementów pozwalających na identyfikację, zgodnie z przepisami Biura ds. Zgodności Badań Uniwersytetu Stanforda.
1. Wybór linii komórkowej raka piersi
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Izolacja fragmentów tkanki z głowy kości udowej
Głowy kości udowej pobrano od równej liczby pacjentów płci męskiej i żeńskiej (w wieku 44-90 lat), którzy zostali poddani planowej operacji całkowitej endoprotezoplastyki stawu biodrowego w Departamencie Chirurgii Ortopedycznej w Stanford University School of Medicine. Każda usunięta głowa kości udowej zawiera niewielki fragment górnej części kości udowej, w której znajduje się tkanka kostna beleczkowata składająca się z zmineralizowanych spikul .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Mehra i in. opisali wcześniej pośmiertne pobieranie i analizę próbek kości od pacjentów z przerzutowym rakiem gruczołu krokowego pobranych w czasie autopsji, ujawniając wysokiej jakości tkanki i zatwierdzając użycie próbek kości ludzkich do badania procesu przerzutowego47. W tym miejscu opisaliśmy protokoły zbierania, przetwarzania i wykorzystywania fragmentów ludzkiej tkanki kostnej uzyskanych z wyrzuconych głów kości udowych po operacji THR w krótkoterminowym systemie kohodowli w celu zbadania migra.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Brak informacji do raportowania.
Te badania były częściowo finansowane z grantów Fundacji Alternatywnych Badań i Rozwoju (107588), Narodowego Instytutu Zdrowia (1U54CA136465-04S1) oraz Kalifornijskiego Programu Badań nad Rakiem Piersi (201B-0141). Dziękujemy doktorom Andrew Wilberowi i R. Scottowi McIvorowi za hojną darowiznę ich transponsonu transponsonu i plazmidów transpozazy pK/hUbiC-SB11. Wyrażamy wdzięczność dr. Johnowi Tamaresisowi za porady dotyczące metod statystycznych, Timothy'emu Brownowi za wykonanie cytometrii przepływowej, Georgette Henrich za porady dotyczące testów migracji oraz Nancy Bellagamba za ułatwienie pobierania próbek THR.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Uzupełnij wszystkie DMEM o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Uzupełnij wszystkie McCoy's 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% Pen/Strep |
| Płodowa surowica bydlęca | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicylen Streptomycyna | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocydyna (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Pożywka uzupełniająca stosowana do transfekowanych linii komórkowych. |
| Sokół® Wkładki do hodowli komórkowych na płytkę 24-dołkową z przezroczystą membraną PET (8,0 μ m wielkość porów) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-treated Polystyren Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *dla komórek ssaków* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite | DMEM Life Technologies | A18967-01 | |
| D-lucyferyna świetlik, sól potasowa 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sitko do sterylnych komórek 70 μ | m Fisher Scientific 22363548 | ||
| 6 Klaster kultur komórkowych z powłoką TC | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Klaster kultur komórkowych z powłoką TC | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Klaster kultur komórkowych z powłoką TC | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Narzędzia do nauki o naprawach | 16021-14 | |
| Wosk kostny | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Platforma obrazowania | Suwmiarka Nauki przyrodnicze/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL System obrazowania | Life Technologies | Wersja 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 komórki raka piersi | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 komórki raka piersi | ATCC | HTB-26 | |
| Monoklonalna mysia anty-ludzka cytokeratyna przeciwciało | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie