Artykuł metodologiczny

Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52656

⸱

15 marca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Stanford University School of Medicine, 2Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.

Streszczenie

Kość jest najczęstszym miejscem przerzutów raka piersi. Chociaż powszechnie przyjmuje się, że mikrośrodowisko wpływa na zachowanie komórek rakowych, niewiele wiadomo na temat właściwości i zachowań komórek raka piersi w natywnym mikrośrodowisku ludzkiej tkanki kostnej.Opracowaliśmy metody śledzenia, ilościowego określania i modulowania ludzkich komórek raka piersi w mikrośrodowisku hodowanych fragmentów ludzkiej tkanki kostnej wyizolowanych z wyrzuconych głów kości udowych po operacjach całkowitej wymiany stawu biodrowego. Korzystając z komórek raka piersi zmodyfikowanych pod kątem lucyferazy i zwiększonej ekspresji białka zielonej fluorescencji (EGFP), jesteśmy w stanie odtwarzalnie określić ilościowo wzorce migracji i proliferacji za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI), śledzić interakcje komórkowe we fragmentach kości za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i ocenić komórki piersi po kolonizacji za pomocą cytometrii przepływowej. Do najważniejszych zalet tego modelu należą: 1) natywne, nienaruszone architektonicznie mikrośrodowisko tkankowe, które obejmuje odpowiednie typy komórek ludzkich, oraz 2) bezpośredni dostęp do mikrośrodowiska, który ułatwia szybkie ilościowe i jakościowe monitorowanie i zaburzenia właściwości, zachowań i interakcji komórek piersi i kości. Podstawowym ograniczeniem jest obecnie skończona żywotność fragmentów tkanki, co ogranicza okno badania do krótkoterminowej hodowli. Zastosowania systemu modelowego obejmują badanie podstawowej biologii raka piersi i innych nowotworów złośliwych poszukujących kości w niszy przerzutowej oraz opracowywanie strategii terapeutycznych w celu skutecznego celowania w komórki raka piersi w tkankach kostnych.

Wprowadzenie

Mikrośrodowisko guza jest powszechnie uznawane za krytyczny czynnik determinujący zachowanie komórek rakowych podczas progresji raka piersi i rozprzestrzeniania się przerzutów1-3. Celem przedstawionej metody jest ułatwienie badania komórek raka piersi w mikrośrodowisku ludzkiej tkanki kostnej, najczęstszego miejsca przerzutów raka piersi4-6. Kość składa się ze zmineralizowanych i szpikowych przedziałów7-9, z których oba zawierają komórki i wydzielane czynniki zaangażowane w progresję przerzutów10,11. Chociaż szeroko stosowane modele mysie in vivo ułatwiają ogólnoustrojowe badania procesu przerzutowego12-15, interakcje komórkowe w szkielecie nie są łatwo dostępne do obserwacji i bezpośrednich zakłóceń. Systemy modelowe do badania i hodowli tkanek kostnych myszy i komórek szpiku myszy zapewniają lepszy dostęp i przyniosły wiele informacji na temat przesłuchów i mechanizmów leżących u podstaw przerzutów komórek raka piersi w szkielecie myszy16-22. Jednak badania sugerują, że mogą istnieć specyficzne dla gatunku wzorce osteotropizmu dla tkanki kostnej23,24. Wzorce te mogą odzwierciedlać nieodłączne specyficzne dla gatunku różnice we właściwościach tkanki kostnej, różnice wynikające ze zmienionych populacji szpiku kostnego u myszy z niedoborem odporności11 i / lub stosunkowo młody wiek myszy wykorzystywanych w eksperymentach, z których wszystkie są prawdopodobnymi determinantami mikrośrodowiska kości.

Podejścia in vitro do badania komórek raka piersi w ludzkich kokulturach kostnych zazwyczaj koncentrowały się na konkretnych typach komórek kostnych, takich jak osteoblasty pochodzące ze szpiku kostnego lub komórki zrębu hodowane jako monowarstwy lub w ramach zaprojektowanych systemów modeli trójwymiarowych25-35. Chociaż dwuwymiarowe modele hodowli komórkowych stanowią podstawę podejść in vitro do badań nad rakiem, od dawna wiadomo, że zachowanie komórek jest zasadniczo zmienione w systemach hodowli jednowarstwowych18,36,37. Doprowadziło to do opracowania zmodyfikowanych mikrośrodowisk, które naśladują złożoność trójwymiarowych żywych tkanek, w tym modeli opartych na matrycach i rusztowaniach złożonych z naturalnych materiałów, takich jak kolagen lub syntetycznych polimerów osadzonych określonymi typami komórek w celu stworzenia mikrośrodowisk podobnych do tkanek36-41. Podejścia inżynieryjne obejmowały również wykorzystanie platform bioreaktorów do kontrolowania i badania środowiska hormonalnego mikrośrodowiska18,19,41-43. Chociaż modele biomimetyczne i bioreaktory dostarczają wielu elementów złożonego mikrośrodowiska tkankowego w kontrolowanych warunkach i zostały z powodzeniem zastosowane do postępu w badaniach nad przerzutami raka piersi do kości18,19,35,42,43, inżynieryjne systemy modelowe na ogół nie obejmują pełnego spektrum typów komórek i składników macierzy zewnątrzkomórkowej obecnych w natywnym środowisku kostnym.

Do niedawna komórki raka piersi nie były badane w natywnym, nienaruszonym, trójwymiarowym mikrośrodowisku ludzkich tkanek kostnych. Niedawno informowaliśmy o opracowaniu modelu kohodowli przy użyciu fragmentów ludzkiej tkanki kostnej wyizolowanych z próbek do operacji całkowitej wymiany stawu biodrowego (THR)44. Próbki te zawierają zarówno zmineralizowane, jak i szpikowe przedziały niezbędne do badania mechanizmów leżących u podstaw mikroprzerzutów w krótkotrwałej hodowli. W poprzednich pracach ustaliliśmy dowód zasady stosowania obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) do monitorowania proliferacji komórek raka piersi wykazujących ekspresję lucyferazy (MDA-MB-231-fLuc) hodowanych wspólnie z fragmentami kości44. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły eksperymentalne do badania proliferacji, kolonizacji i migracji raka piersi w kontekście rodzimego mikrośrodowiska z wykorzystaniem eksplantatów ludzkiej tkanki kostnej.

Najpierw przedstawiamy protokół kohodowli komórek raka piersi sąsiadujących z fragmentami kości w celu zmierzenia proliferacji komórek piersi za pomocą BLI. W tej sekcji zawiesiny komórek piersi są wysiewane jako plamki komórkowe w 6-dołkowych płytkach przylegających do fragmentów kości, które są unieruchamiane przez kawałki wosku kostnego. Studzienki kontrolne zawierają wosk kostny, ale nie zawierają fragmentu kości. Po przyczepieniu się plamek komórkowych dodaje się pożywkę i hoduje się płytkę przez 24 godziny, po czym intensywność sygnału bioluminescencyjnego (związaną z liczbą komórek) mierzy się za pomocą BLI. W kolejnym kroku przedstawiamy metody kohodowli komórek raka piersi wysiewanych bezpośrednio na fragmentach kości w celu zbadania kolonizacji i proliferacji. Tutaj zawiesiny komórek piersi są pipetowane bezpośrednio na fragmenty tkanki kostnej, które są monitorowane w hodowli za pomocą BLI i mikroskopii fluorescencyjnej w czasie w celu śledzenia kolonizacji i liczby komórek. W tej metodzie przedział szpiku może być wypłukany z fragmentów kości w dowolnym momencie w celu analizy skolonizowanych komórek raka piersi za pomocą cytometrii przepływowej lub testów żywotności szpiku.

Ponadto opisujemy dwa różne podejścia do pomiaru migracji komórek raka piersi. W pierwszej metodzie przedstawiono etapy pomiaru migracji w kierunku supernatantów do hodowli tkanki kostnej. W tym protokole komórki raka piersi są wysiewane na wewnętrzne, górne powierzchnie membran wkładek Transwell o wielkości porów 8 μm (jak pokazano na rysunku 1A). Wkładki są następnie umieszczane na płytce odbiorczej z dołkami zawierającymi supernatant tkanki kostnej lub pożywkę kontrolną. W ciągu 20-godzinnego okresu inkubacji niewielka liczba komórek raka piersi migruje przez błony wsuwane do dolnych dołków hodowli tkankowych, gdzie przyczepiają się w celu wykrycia przez BLI. W drugiej metodzie migracji komórki raka piersi są wysiewane na dolne, zewnętrzne powierzchnie membran wkładek Transwell. Fragmenty tkanki kostnej są umieszczane w miseczkach wkładanych, a komórki raka piersi migrują w górę przez błony, aby skolonizować fragmenty kości (jak pokazano na rycinie 1B), które są następnie obrazowane za pomocą BLI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Głowy kości udowych pobrano od pacjentów poddawanych planowej operacji THR na Wydziale Chirurgii Ortopedycznej w Stanford University School of Medicine. Wszystkie tkanki zostały pobrane jako próbki pozbawione elementów pozwalających na identyfikację, zgodnie z przepisami Biura ds. Zgodności Badań Uniwersytetu Stanforda.

1. Wybór linii komórkowej raka piersi

  1. Uzyskać lub przetoczyć pożądaną linię komórkową (linie) komórkową raka piersi za pomocą konstruktu reporterowego lucyferazy-GFP. Następujące eksperymenty przeprowadzono przy użyciu linii komórkowych raka piersi MDA-MB-231 i MCF-7 zaprojektowanych do stabilnej ekspresji lucyferazy świetlików (fLuc) i wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) poprzez transfekcję z transpozonem Sleeping Beauty plazmidem pKT2/LuBiG i plazmidem transpozazy pK/hUbiC-SB1145,46.
    UWAGA: Transfekowane linie komórkowe są określane jako MDA-MB-231-fLuc-EGFP i MCF-7-fLuc-EGFP.

2. Izolowanie fragmentów tkanek od głów kości udowych

  1. Po operacji THR należy zebrać wyrzuconą głowę kości udowej do sterylnego pojemnika wypełnionego solą fizjologiczną. Przenieś próbkę do laboratorium i przetwórz ją w ciągu 1-3 godzin od zabiegu. Uwaga: w przypadku opóźnienia w przetwarzaniu należy umieścić próbkę w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj obszar roboczy, umieszczając następujące elementy na macie chłonnej w kapturze do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym: sterylne rękawice, rongeur chirurgiczny, kleszcze, zlewka z 70% izopropanolem do płukania narzędzi oraz naczynia do hodowli tkankowych, jak określono poniżej dla każdego rodzaju eksperymentu.
  3. Zakładając sterylną rękawicę chirurgiczną do trzymania okrągłej głowy kości udowej w jednej ręce, użyj rongeur w drugiej ręce, aby wydobyć fragmenty kości beleczkowej o pożądanej wielkości (~2-5 mm) z odsłoniętego górnego trzonu kości udowej. Przenieść fragmenty kości do naczynia hodowlanego (np. 6-, 12- lub 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej lub komory migracyjnej), w zależności od rodzaju eksperymentu proliferacji, kolonizacji lub migracji, jak opisano w krokach 3, 4 lub 5.
    UWAGA: Fragmenty tkanki kostnej powinny być pobierane w sposób opisany powyżej po wykonaniu wstępnych etapów dla każdego konkretnego testu proliferacji, kolonizacji lub migracji. Fragmenty będą miały różną wielkość, jak pokazano na rysunku 2. Fragmenty mogą być ważone przed lub po eksperymentach w celu standaryzacji.

3. Współhodowla komórek raka piersi sąsiadujących z fragmentami kości w celu pomiaru proliferacji komórek piersi za pomocą BLI

  1. Przed eksperymentem należy przygotować zawiesinę zawierającą 2 x 105 komórek raka piersi/50 μl oraz przygotować czopy wosku kostnego do unieruchomienia fragmentów kości w hodowli. Pokrój końcówkę mikropipety P200 na 3 części i użyj wąskiego końca największego kawałka w formie "foremki do ciastek", aby pokroić małe (~35 mg) kawałki wosku kostnego. Użyj szerokiego końca najmniejszego kawałka, aby wysunąć korki wosku kostnego do szalki Petriego w celu przechowywania.
  2. Umieść kawałek wosku kostnego w pozycji godziny 12 każdego dołka i delikatnie dociśnij palcem wskazującym w sterylnej rękawiczce.
  3. Odpipetować 50 μl zawiesiny komórkowej zawierającej 1 x 105 komórek raka piersi w DMEM-10% FBS + Pen-Strep w środku każdego dołka 6-dołkowej płytki. (Alternatywnie, komórki nasienne w rozproszonym wzorze, jeśli jest to pożądane.) Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 45 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek.
  4. Umieść 1 fragment kości na 1 kawałku wosku kostnego dla każdej studzienki eksperymentalnej i delikatnie dociśnij rongeur, aby go zabezpieczyć. Przeprowadzaj eksperymenty w trzech egzemplarzach, tak aby 3 fragmenty kości z danej próbki THR były umieszczane w trzech górnych studzienkach, podczas gdy trzy dolne dołki zawierały wosk kostny tylko jako kontrole.
  5. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml delikatnie i powoli podaj 5 ml DMEM-10% FBS na bok każdej studzienki, aby uniknąć przemieszczenia komórek piersi lub fragmentów kości. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 20-24 godziny.
  6. Aby wykonać obrazowanie bioluminescencyjne (BLI), wyjmij płytkę z inkubatora i dodaj substrat lucyferyny (do osiągnięcia stężenia 300 μg/ml) do każdej studzienki. Zobrazuj płytkę natychmiast na platformie obrazowania IVIS przy użyciu następujących parametrów: przysłona 1, małe binning, czas ekspozycji 1 s, poziom D. Zmierz intensywność sygnału w każdej studzience jako średnie promieniowanie (fotony/sekunda/centymetr kwadratowy/steradian).
  7. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby zdefiniować obszary zainteresowania (ROI) w celu ilościowego określenia średniego promieniowania dla wszystkich studni eksperymentalnych i kontrolnych. Eksportuj średnie wartości radiancji do arkusza Excel, aby wykonywać statystyki i generować wykresy.

4. Współhodowla komórek raka piersi wysiewanych bezpośrednio na fragmentach kości w celu zbadania kolonizacji i liczby komórek

  1. Za pomocą kleszczy umieść fragmenty kości bezpośrednio w pustych dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (1 fragment/dołek).
  2. Odpipetować kroplę 50 μl zawiesiny komórkowej DMEM-10% FBS zawierającą 1 X 103-6 komórek raka piersi bezpośrednio na każdym fragmencie kości. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 45 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek. Delikatnie dodaj 1-2 ml DMEM-10% FBS do boku każdej studzienki, tak aby fragment był całkowicie zanurzony w podłożu. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 20-24 godziny.
  3. Po inkubacji za pomocą kleszczy przenieś każdy fragment tkanki kostnej na świeżą 24-dołkową płytkę zawierającą 1 ml DMEM-10% FBS w każdym dołku. Aby wykonać BLI, wykonaj kroki 3.6-3.7 powyżej. Dodatkowo fragmenty można oglądać za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub przepłukiwać w celu uzyskania populacji szpiku do analizy liczby komórek i właściwości raka piersi, jak opisano w kroku 6.
  4. Aby przygotować nienaruszone fragmenty do oceny jakościowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po BLI, należy pobrać pipetę 5 μl fluorescencyjnego roztworu znakującego bisfosfoniany (przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta) do każdej studzienki w celu oznaczenia zmineralizowanych kolców fragmentów kości. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych przez kolejne 24 godziny.
  5. Po 24 godzinach hodowli w fluorescencyjnym roztworze znakowania bisfosfonianów, za pomocą kleszczy przenieś fragmenty na płytki do hodowli tkankowej zawierające pożywkę wolną od czerwieni fenolowej i obejrzyj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego skonfigurowanego do obrazowania GFP (485 nm) i znakowania bisfosfonianów (680 nm).

5. Pomiar migracji komórek raka piersi do fragmentów tkanki kostnej i supernatantów z hodowanych fragmentów kości

  1. Migracja w kierunku supernatantu do hodowli tkanki kostnej.
    UWAGA: Wykonaj eksperymenty w trzech egzemplarzach tak, aby 3 fragmenty z danej próbki THR zostały użyte do wytworzenia 3 supernatantów. Dla każdego eksperymentu migracja jest porównywana przez trzy studzienki zawierające supernatanty kostne z trzema studzienkami zawierającymi tylko pożywkę kontrolną.
    1. Wytwarzaj supernatanty tkanki kostnej, umieszczając fragmenty kości w dołkach 12-dołkowej płytki zawierającej 2,2 ml DMEM-10% FBS na studzienkę. Hodowla w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Wycofaj pożywkę po 24 godzinach i zastąp 2,2 ml świeżego DMEM-10% FBS. Studzienki kontrolne zawierające DMEM-10% FBS należy traktować w ten sam sposób.
      UWAGA: Pożywka jest zmieniana po 24 godzinach w celu usunięcia czynników wydzielanych w odpowiedzi na uraz tkanki wynikający z operacji. Ponieważ supernatanty tkanki kostnej są generowane w pożywce zawierającej FBS, studzienki zawierające tylko pożywkę zawierającą FBS są uwzględniane w celu kontroli udziału FBS w migracji komórek raka piersi.
    2. Po 48 godzinach zebrać 0,9 ml każdego supernatantu/pożywki kontrolnej i odpipetować do studzienek płytki odbiorczej. Wkładki zostaną później umieszczone w tych studzienkach. Inkubować płytkę odbiorczą w inkubatorze do hodowli tkankowych podczas wysiewu wkładek. Uwaga: Pozostały supernatant (~1 ml po odparowaniu) można w razie potrzeby pobrać do analizy czynników sekretomu44.
    3. Aby wysiać wkładki Transwell, umieść je na standardowej, pustej 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Odpipetować 350 μl zawiesiny komórek zawierającej 1 x 105 komórek raka piersi w DMEM-10% FBS na górną, wewnętrzną powierzchnię błony każdej wkładki, jak pokazano na rysunku 1A. Umieścić 24-dołkową płytkę zawierającą wkładki z nasionami w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 45 minut, aby ułatwić przyczepienie.
    4. Po przymocowaniu ogniw do wkładek należy za pomocą kleszczyków przenieść wkładki na płytkę odbiorczą zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw każdą wkładkę pod kątem podczas umieszczania jej w studzience odbiornika, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków między membraną wkładu a supernatantem studzienki odbiornika. Inkubować płytkę odbiorczą z wkładkami przez 20 godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Sprawdzić, czy na dolnej stronie płytki odbiornika nie ma pęcherzyków powietrza między membraną wkładu a supernatantem studzienki odbiornika. Jeśli widoczne są bąbelki, wyjmij określone wkładki i umieść je ponownie w komorze odbiorczej, aż nie będzie żadnych pęcherzyków.
    5. Po 20 godzinach za pomocą kleszczy wyjmij wkładki z płytki odbiornika. Korzystając z procedur opisanych w krokach 3.6-3.7, wykonaj BLI, aby zobrazować komórki, które migrowały i przyczepiły się do dna studzienki płytkowej odbiornika.
  2. Migracja w kierunku fragmentów tkanki kostnej.
    UWAGA: Wykonaj eksperymenty w trzech egzemplarzach tak, aby 3 fragmenty z danej próbki THR umieszczać w 3 oddzielnych wkładkach, a 3 szklane koraliki umieszcza się w 3 oddzielnych wkładkach jako kontrole.
    1. Przygotować płytkę odbiorczą, pipetując 0,9 ml DMEM-10% FBS do każdej studzienki. Umieścić go w inkubatorze do hodowli tkankowych podczas przygotowywania wkładek.
    2. Aby wysadzić wkładki, odwróć je na powierzchni plastikowego pudełka z rurką do mikrofuge, które ma pokrywkę. Odpipetować kroplę zawiesiny komórkowej o objętości 50 μl DMEM-10% FBS zawierającą 1 x10 5 komórek raka piersi bezpośrednio na zewnętrzną, dolną powierzchnię każdej membrany wkładki (która jest skierowana do góry na odwróconych wkładkach). Przykryj pudełko probówki do mikrofuge z otwartą pokrywką i przenieś je do inkubatora tkanek w temperaturze 37 °C na 45 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek.
    3. Przenieś pudełko probówki do mikrofuge do okapu do hodowli tkankowych i za pomocą kleszczy obróć wkładki z nasionami prawą stroną do góry i przenieś je do dołków płytki odbiorczej. Odpipetować 0,450 ml DMEM-10% FBS do każdego kubka wkładki. Za pomocą kleszczy przenieś jeden fragment tkanki kostnej (~3 mm) do każdej przygotowanej miseczki na wkładkę. Opcjonalnie użyj szklanych kulek jako kontroli ujemnych w dodatkowych studzienkach. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 20 godzin.
    4. Aby zmierzyć migrację, należy przygotować standardową 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej zawierającą 1 ml DMEM-10% FBS na dołek. Wyjąć płytkę odbiorczą z inkubatora i za pomocą kleszczy przenieść fragmenty kości i koraliki z każdej wkładki do oddzielnych dołków płytki standardowej. Dodaj substrat lucyferyny (aby osiągnąć końcowe stężenie 300 μg/ml) do każdego dołka i wykonaj BLI, stosując procedury opisane w krokach 3.6-3.7.

6. Dodatkowe analizy przed- i poeksperymentalne

  1. Analiza zaczerwienionego szpiku.
    1. Przenieść fragment kości do sitka o wielkości 70 μm umieszczonego na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o pojemności 25 g energicznie przepłukać fragment 10 ml PBS w celu uzyskania zawiesiny komórek szpiku kostnego w stożkowej probówce. Odwirować zawiesinę komórek przez 3 minuty w temperaturze 300 x g i temperaturze 21 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w PBS lub innym pożądanym roztworze do cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Objętość ponownego zawieszenia będzie się różnić w zależności od wielkości osadu komórkowego po odwirowaniu i aplikacji.
    2. Do testów żywotności odpowiednie są ~ 75-300 μl objętości PBS, a zawiesiny te można analizować za pomocą dostępnych na rynku testów żywotności opartych na fluorescencji zgodnie z instrukcjami producenta, pipetować do konwencjonalnego hemocytometru i liczyć za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
    3. W przypadku analizy lub sortowania metodą cytometrii przepływowej w oparciu o wykrycie komórek raka piersi z dodatnim wynikiem GFP, należy ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS zawierającym 2% FBS, 2mM EDTA i 10 mM HEPES, tak aby stężenie wynosiło 1 x 106 komórek/ml.
  2. Barwienie H & E i immunohistochemia.
    1. Aby przetworzyć fragmenty do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) i/lub immunohistochemii, umieść fragmenty w plastikowych kasetach oznaczonych ołówkiem numer 2 i zanurz w pojemniku wypełnionym 10% buforowaną formaliną na 24 godziny.
    2. Przetwarzaj tkanki pod kątem osadzania, cięcia i barwienia parafiny przy użyciu rutynowych protokołów, które obejmują etap odwapnienia, aby uwzględnić zmineralizowane kolce w każdym fragmencie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja fragmentów tkanki z głowy kości udowej

Głowy kości udowej pobrano od równej liczby pacjentów płci męskiej i żeńskiej (w wieku 44-90 lat), którzy zostali poddani planowej operacji całkowitej endoprotezoplastyki stawu biodrowego w Departamencie Chirurgii Ortopedycznej w Stanford University School of Medicine. Każda usunięta głowa kości udowej zawiera niewielki fragment górnej części kości udowej, w której znajduje się tkanka kostna beleczkowata składająca się z zmineralizowanych spikul ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mehra i in. opisali wcześniej pośmiertne pobieranie i analizę próbek kości od pacjentów z przerzutowym rakiem gruczołu krokowego pobranych w czasie autopsji, ujawniając wysokiej jakości tkanki i zatwierdzając użycie próbek kości ludzkich do badania procesu przerzutowego47. W tym miejscu opisaliśmy protokoły zbierania, przetwarzania i wykorzystywania fragmentów ludzkiej tkanki kostnej uzyskanych z wyrzuconych głów kości udowych po operacji THR w krótkoterminowym systemie kohodowli w celu zbadania migra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak informacji do raportowania.

Podziękowania

Te badania były częściowo finansowane z grantów Fundacji Alternatywnych Badań i Rozwoju (107588), Narodowego Instytutu Zdrowia (1U54CA136465-04S1) oraz Kalifornijskiego Programu Badań nad Rakiem Piersi (201B-0141). Dziękujemy doktorom Andrew Wilberowi i R. Scottowi McIvorowi za hojną darowiznę ich transponsonu transponsonu i plazmidów transpozazy pK/hUbiC-SB11. Wyrażamy wdzięczność dr. Johnowi Tamaresisowi za porady dotyczące metod statystycznych, Timothy'emu Brownowi za wykonanie cytometrii przepływowej, Georgette Henrich za porady dotyczące testów migracji oraz Nancy Bellagamba za ułatwienie pobierania próbek THR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM (1X) + GlutaMAX-lLife Technologies10569-010Uzupełnij wszystkie DMEM o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)Life Technologies16600-082Uzupełnij wszystkie McCoy's  10% płodową surowicą bydlęcą i 1% Pen/Strep
Płodowa surowica bydlęcaLife Technologies16000-044
Penicylen StreptomycynaLife Technologies15140-122
Blastocydyna (10 mgl/ml)InvivoGen ant-blPożywka uzupełniająca stosowana do transfekowanych linii komórkowych.
Sokół® Wkładki do hodowli komórkowych na płytkę 24-dołkową z przezroczystą membraną PET (8,0 μ m wielkość porów)Corning Incorporated353097
Falcon® 24 Well TC-treated Polystyren Cell Culture Insert Companion PlateCorning Incorporated353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *dla komórek ssaków*Invitrogen Detection TechnologiesL-3224
FluoroBriteDMEM Life TechnologiesA18967-01
D-lucyferyna świetlik, sól potasowa 5 g (30 mg/ml)Life TechnologiesL-8220
Sitko do sterylnych komórek 70 μ m Fisher Scientific 22363548
6 Klaster kultur komórkowych z powłoką TCCorning Incorporated3516
12 Klaster kultur komórkowych z powłoką TCCorning Incorporated3513
24 Klaster kultur komórkowych z powłoką TCCorning Incorporated3526
Friedman-Pearson RongeurNarzędzia do nauki o naprawach16021-14
Wosk kostnySurgical Specialties Corporation903
IVIS 50 Platforma obrazowaniaSuwmiarka Nauki przyrodnicze/PerkinElmer
Living Image Software Program Caliper Life Sciences/PerkinElmer133026
EVOS FL System obrazowaniaLife TechnologiesWersja 4.2
OsteoSense 680 EXPerkinElmerNEV10020EX
MCF-7 komórki raka piersiATCCHTB-22
MDA-MB-231 komórki raka piersiATCCHTB-26
Monoklonalna mysia anty-ludzka cytokeratyna przeciwciałoDAKO CytomationClone (AE1/AE3)

Bibliografia

  1. Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227(2011).
  2. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  3. Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
  4. Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
  5. Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
  6. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  7. Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, Suppl 3. S131-S139 (2008).
  8. Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
  9. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
  10. Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
  11. Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
  12. Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
  13. Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
  14. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212(2006).
  15. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
  16. Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45(2009).
  17. Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
  18. Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
  19. Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
  20. Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
  21. Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265(2012).
  22. Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
  23. Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
  24. Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
  25. Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
  26. Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
  27. Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
  28. Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
  29. Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
  30. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
  31. Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
  32. Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
  33. Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
  34. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
  35. Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
  36. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  37. Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
  38. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
  39. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
  40. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
  41. Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
  42. Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
  43. Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
  44. Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
  45. Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
  46. Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
  47. Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
  48. Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
  49. Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ludzka tkanka kostnakom rki raka piersiobrazowanie bioluminescencyjnemikroskopia fluorescencyjnacytometria przep ywowamigracja w uk adzie Transwellhodowla tkankowaprzedzia szpiku kostnegoproliferacja kom rek

Powiązane artykuły