Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza

12.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52665

⸱

1 maja 2015

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine V, Innsbruck Medical University, 2Oncotyrol GmbH, 3Tyrolean Cancer Research Institute, 4Division of Vascular Biology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ludzkie komórki szpiczaka mnogiego (MM) wymagają wspierającego mikrośrodowiska komórek mezenchymalnych i składników macierzy zewnątrzkomórkowej do przetrwania i proliferacji. Stworzyliśmy model zarodka kurczaka in vivo z wszczepionym ludzkim szpiczakiem i komórkami mezenchymalnymi, aby zbadać wpływ leków przeciwnowotworowych na wzrost, inwazję i angiogenezę guza.

Streszczenie

Szpiczak mnogi (MM), złośliwa choroba komórek plazmatycznych, pozostaje nieuleczalna i potrzebne są nowe leki, aby poprawić rokowania pacjentów. Ze względu na brak mikrośrodowiska kostnego i auto/parakrynnych czynników wzrostu, ludzkie komórki szpiczaka szpiczanego są trudne do wyhodowania. W związku z tym istnieje pilna potrzeba stworzenia odpowiednich systemów hodowli in vitro i in vivo w celu zbadania działania nowych terapii na ludzkie komórki szpiczaka. Tutaj przedstawiamy model do hodowli ludzkich komórek szpiczaka mnogiego w złożonym środowisku 3D in vitro i in vivo. Linie komórkowe MM OPM-2 i RPMI-8226 transfekowano w celu ekspresji transgenu GFP i hodowano w obecności ludzkich komórek mezenchymalnych i matrycy kolagenu typu I jako trójwymiarowych sferoid. Ponadto sferoidy szczepiono na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) zarodków kurczaków, a wzrost guza monitorowano za pomocą stereofluorescencji mikroskopowej. Oba modele umożliwiają badanie nowych leków terapeutycznych w złożonym środowisku 3D oraz ilościowe określanie masy komórek nowotworowych po homogenizacji przeszczepów w transgenowym GFP-ELISA. Co więcej, angiogenne odpowiedzi gospodarza i inwazja komórek nowotworowych do tkanki gospodarza mogą być codziennie monitorowane przez mikroskop stereoskopowy i analizowane przez barwienie immunohistochemiczne przeciwko ludzkim komórkom nowotworowym (Ki-67, CD138, Vimentin) lub komórkom ściennym gospodarza pokrywającym naczynia krwionośne (desmin / ASMA).

Podsumowując, system onplant pozwala badać wzrost komórek MM i angiogenezę w złożonym środowisku 3D oraz umożliwia badania przesiewowe nowych związków terapeutycznych ukierunkowanych na przeżycie i proliferację komórek MM.

Wprowadzenie

Szpiczak mnogi (MM) charakteryzuje się proliferacją złośliwych komórek plazmatycznych w szpiku kostnym, zmianami kostnymi i niedoborem odporności 1. Chociaż dostępne są nowe opcje leczenia, takie jak inhibitory proteasomów (bortezomib) i leki immunomodulujące (pomalidomid i lenalidomid), szpik szpikowy nadal pozostaje nieuleczalnym nowotworem złośliwym o ponurym rokowaniu 2. Złe rokowanie można wytłumaczyć niezwykłą niejednorodnością klonów komórek MM, która przyczynia się do zmiennych odpowiedzi na leczenie, w szczególności w przypadku długotrwałego leczenia i presji selekcyjnej klonów MM 3.

Przedkliniczne testy nowych leków i ich kombinacji in vitro i in vivo to krytyczny i czasochłonny krok dla przyszłego rozwoju leków. W związku z tym potrzebne są użyteczne modele szpiku mnogiego in vivo, aby lepiej zrozumieć biologię choroby i umożliwić odkrycie nowych leków. W rzeczywistości najlepszymi modelami ksenotransplantacji nowotworów hematologicznych i terapii są myszy z niedoborem odporności, takie jak myszy z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID) 4-7, myszy bez otyłości z cukrzycą / SCID (NOD / SCID) 8,9 lub myszy NOD / SCID z β-mikroglobuliną z nokautem 10,11.

Chociaż mysie modele ludzkiego MM pod pewnymi względami mogą przypominać fenotyp ludzkiej choroby, myszy z niedoborem odporności są inbredowane, dlatego symulują tylko jedną indywidualną reakcję na lek, a koszty są bardzo wysokie. Ze względu na immunosupresję zwierzęta wymagają specjalnych warunków utrzymania, a wszczepienie ludzkiego szpiczaka szpiczaka u myszy trwa od 6 tygodni do 2 miesięcy 9,12, chyba że komórki są przeszczepiane bezpośrednio do szpiku kostnego przy użyciu technicznie wymagającej procedury o niższych wskaźnikach przeżywalności zwierząt 7,13. W związku z tym opracowano nowe metody wykorzystujące modele organoidów oparte na komórkach macierzystych 14 , inżynierię tkankową 15 lub zaawansowane modele hodowli komórkowych 3D 16 . W niedalekiej przyszłości będą one konkurować z klasycznymi eksperymentami na zwierzętach w zakresie przedklinicznych testów leków, ale nie mogą zastąpić testów toksyczności ogólnoustrojowej w organizmach żywych.

Wykazano wcześniej, że zarodek kurczaka jest odpowiednim organizmem do ksenotransplantacji ludzkich komórek i tkanek ze względu na brak adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej do 17-19 roku życia. Co więcej, każdy zarodek kurczaka odzwierciedla indywidualną reakcję na stosowane leki lub komórki nowotworowe ze względu na różnorodność genetyczną w populacji kurczaków. Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) jest dobrze ugruntowanym systemem do badania angiogenezy zależnej od guza 20-22. Kiedy guzy lite są przeszczepiane do CAM, wykazują wiele cech nowotworów in vivo, w tym proliferację, inwazję, angiogenezę i przerzuty 23-27.

Na podstawie wcześniejszych doświadczeń naszej grupy z modelami ksenoprzeszczepów CAM20,26,27, stworzono model ludzkiego MM, który łączy zalety ludzkiego systemu hodowli 3D z modelem rozwoju zarodków kurczaków ex ovo. Ten system modelowy MM umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym postępu wzrostu MM, ilościowe określanie masy komórek i przedkliniczne testowanie leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zgodnie z prawem austriackim oraz Urzędem ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych amerykańskiej publicznej służby zdrowia zarodki ptaków nie są uważane za żywe kręgowce do momentu wyklucia. Biuro ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych NIH wydało pisemne wytyczne w tej dziedzinie (http://www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm i publikacja NIH nr: 06-4515).

1. Hodowla komórkowa i transfekcja lentiwirusowa

  1. Hodowla linii komórkowych MM OPM-2, RPMI-8226 i ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego w RPMI1640 pożywce, uzupełniona 10% bydlęcą płodową surowicą cielęcą i 100 IU/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2 mM glutaminy w obecności 5% CO2 w temperaturze 37°C.
  2. Transfekcja 5 x 106 komórek HEK 293FT z mieszanką opakowań wirusowych (9 μg) DNA i 3 μg pLenti6/V5 dest wektorem eGFP przy użyciu 30 μl liposomalnego odczynnika do transfekcji i pożywki do transfekcji (10 ml). Po 12 godzinach usunąć pożywkę do transfekcji i dodać 10 ml pożywki DMEM z 10% surowicą cielęcą bydlęcą i 1% aminokwasami endogennymi (NEAA).
  3. Po 5 dniach zebrać supernatanty z HEK293FT komórek po odwirowaniu pływających komórek (1 000 x g, 5 min). Określ miano wirusa za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano w innym miejscu 28.
  4. Transfekcja 1 x 106 MM komórek z cząstkami lentiwirusa eGFP (1 x 105 cząstek) na 24-dołkowej płytce w kompletnym pożywce wzrostowej. Po 3 dniach rozpocznij proces selekcji od dodania 2 μg/ml blasticydyny do pożywki hodowlanej. W przypadku dostępnego na rynku lentiwirusa eGFP należy użyć 500 μg/ml neomycyny.
  5. Po 2 tygodniach selekcji pojawią się skupiska komórek MM wykazujących ekspresję eGFP; zebrać komórki przez wirowanie (1000 x g, 5 min) i rozwinąć je jako podlinie OPM-2eGFP i RPMI-8226eGFP do eksperymentów (sekcja 2 i 3).

2. 3D-Model sferoidalny szpiczaka mnogiego

  1. Schłodź roztwór kolagenu typu I i 10 x DMEM na lodzie.
  2. Wymieszać 1/10 objętości 10 x pożywki DMEM z matrycą kolagenową; dodać NaOH (0,2 N), aby zneutralizować kwaśny roztwór kolagenu do wartości pH 7,4; przechowywać kolagen/roztwór pożywki na lodzie.
  3. Wymieszaj transgeniczne linie komórek MM (OPM-2eGFP lub RPMI-8226 eGFP; 250 000 na sferoidę) z ludzkimi komórkami mezenchymalnymi (50 000 komórek / sferoidę, tj. kropla 30 μl).
  4. Odwirować mieszaninę komórek w probówkach o pojemności 15 ml (1000 x g, 5 min), dodać przygotowaną na zimno mieszaninę kolagenu (1 ml) do osadu komórkowego i dobrze wymieszać (końcówką 1 000 μl).
  5. Natychmiast odpipetować 30 μl mieszaniny kolagen/komórka (końcówką 100 μl) na 24-dołkowej płytce na sterylnej folii parafinowej i pozostawić mieszaninę komórek/kolagenów do polimeryzacji przez 30 minut w temperaturze 37°C (patrz rysunek 1A).
  6. Nałożyć sferoidy MM na 1 ml pożywki hodowlanej zawierającej bortezomib o stężeniu 1, 10 i 100 nM (patrz rysunek 1B).
  7. Po 72 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C należy udokumentować sferoidy za pomocą stereomikroskopii fluorescencyjnej (patrz rysunek 1C).
  8. Przenieść każdą sferoidę za pomocą kleszczy z szerokimi płaskimi szczękami w probówce reakcyjnej w celu pomiaru GFP (patrz rysunek 1D).

3. 3D Model ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego w CAM

  1. Jaja kurze inkubować w specjalnym inkubatorze dla jaj ptasich w temperaturze 37°C i wilgotności 70% przez trzy dni.
  2. Następnie należy otworzyć jaja i przenieść zarodki do wysterylizowanych etanolem, kwadratowych, 10-centymetrowych plastikowych łódek wagowych z pokrywką z płytki do hodowli komórkowych i inkubować "ex ovo" przez kolejne sześć dni, aby CAM mógł się rozwinąć (patrz ryc. 2A).
  3. Schłodzić roztwór kolagenu typu I i 10 x DMEM na lodzie, wymieszać 1/10 objętości 10 x pożywki DMEM z matrycą kolagenową, dodać NaOH (0,2 N), aby zneutralizować kwaśny roztwór kolagenu do wartości pH 7,4; przechowywać kolagen/roztwór podłoża na lodzie.
  4. Wymieszaj transgeniczne linie komórek MM (OPM-2eGFP lub RPMI-8226eGFP; 250 000 na sferoidę) z ludzkimi komórkami mezenchymalnymi (50 000 komórek / sferoidę).
  5. Odwirować komórki w probówkach o pojemności 15 ml (1 000 x g, 5 min; na każdy badany związek 1 fiolka), dodać 1 ml przygotowanej na zimno mieszaniny kolagenu z lekiem (o pożądanym stężeniu roboczym) do osadu komórkowego i dobrze wymieszać (końcówką 1 000 μl).
  6. Umieść krople kolagenu (po 30 μl każda) na parafilmie w pasztecie 6-dołkowym na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację macierzy zewnątrzkomórkowej w temperaturze 37°C.
  7. Przenieść "na rośliny" z kroku 3.6 za pomocą kleszczy na niepoddaną działaniu środka powierzchnię CAM (2 cm od zarodka) 9-dniowych zarodków kurcząt (4 na każdy zarodek kurczaka, patrz rysunek 2B)
  8. Po 5 dniach wzrostu in vivo w inkubatorze jaj w temperaturze 37°C i wilgotności 70% należy udokumentować ksenoprzeszczepy za pomocą stereomikroskopii fluorescencyjnej (patrz ryc. 2C). Eutanazję zarodków kurczaka przez hipotermię w temperaturze 4°C w lodówce przez 5 godzin.
  9. Usunąć ksenoprzeszczepy z subjadacyjną tkanką CAM za pomocą nożyczek okulistycznych i kleszczy z szerokimi płaskimi szczękami. Używaj ich do pomiaru GFP (sekcja 4, patrz rysunek 2D) lub do analizy immunohistochemicznej naczyń krwionośnych i/lub atakujących komórek nowotworowych (sekcja 5).

4. Kwantyfikacja białka eGFP za pomocą testu ELISA

  1. Przenieść każdy sferoid MM lub wycięty ksenoprzeszczep do 0,5 ml buforu RIPA zawierającego 200 μg/ml inhibitorów proteazy.
  2. Homogenizować sferoidę/ksenoprzeszczep za pomocą homogenizatora tkankowego na lodzie.
  3. Wykonaj trzy cykle zamrażania/rozmrażania w ciekłym azocie i łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
  4. Odwirować homogenat w temperaturze 4°C przez 20 minut (12 000 g) i przechowywać supernatanty.
  5. Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:20 w buforze do oznaczania (200 μl) zestawu ELISA. Zmierz poziom GFP za pomocą komercyjnego zestawu ELISA GFP przy użyciu biotynylowanych przeciwciał anty-GFP, zgodnie z protokołem producenta.

5. Analiza immunohistochemiczna naczyń krwionośnych i atakujących komórek nowotworowych

  1. Utrwalić wycięte ksenoprzeszczepy z obszarem CAM w 4% paraformaldehydzie O/N w temperaturze 4°C.
  2. Utrwalone ksenoprzeszczepy umieścić w kasetach do zatapiania i przenieść do stacji do zatapiania tkanek z coraz większą serią alkoholi (50%, 70%, 80%, 95% etanolu, ksylolu i parafiny; każdy etap 60 minut).
  3. Sekcja ksenoprzeszczepów (5 μm) przy użyciu laboratoryjnego mikrotomu obrotowego. Upiec sekcje parafinowe na szkiełkach typu O/N w temperaturze 56°C.
  4. Odparafinować skrawki za pomocą zmniejszającej się serii alkoholi do wody podwójnie destylowanej (ksylol, 95%, 80%, 70%, 50% etanol, woda podwójnie destylowana; każdy etap 10 min).
  5. Pobrać antygen w łaźni wodnej (95°C, 20 min) z roztworem do pobierania antygenu (bufor cytrynianowy; pH 7,0; objętość 100 μl).
  6. Blokować aktywność endogennej peroksydazy za pomocą 100 μl 3%H2O2/metanolu przez 30 min.
  7. Blokuj skrawki w PBS zawierające 10% płodowej surowicy cielęcej przez 45 min (objętość 100 μl).
  8. Barwić przez 1 godzinę 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała (1 μg/ml) rozcieńczonego w PBS zawierającym 1% płodową surowicę cielęcą w temperaturze pokojowej.
  9. Po 3-krotnym przemyciu w PBS inkubować przez 1 godzinę z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym (0,1 μg/ml) w PBS zawierającym 1% płodową surowicę cielęcą w temperaturze pokojowej.
  10. Po 3-krotnym umyciu w PBS przeprowadzić reakcję barwną za pomocą roztworu substratu awidyna/biotyna (ABC) i diaminobenzydyny (DAB) zgodnie z instrukcjami producenta.
  11. 5.11. Zatrzymać reakcję, przenosząc sekcje do podwójnie destylowanej wody, przeciwbarwić hematoksyliną i zamontować sekcje syntetycznym medium montażowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

In vitro analiza związków docelowych w testach 3D sferoidów szpiczaka mnogiego

Ze względu na ograniczenia w hodowli pierwotnych ludzkich komórek MM in vitro, opracowaliśmy nowe modele hodowli 3D in vitro dla ludzkich linii komórkowych MM, wykorzystując macierz wzrostu pozakomórkowego oraz wspomagające pierwotne ludzkie komórki mezenchymalne z szpiku kostnego (Rysunek 1A, B). Transgeniczne linie komórkowe MM z eGFP um...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowanie nowych środków terapeutycznych do opornej na leczenie szpiku szpikowego wymaga mniej czasochłonnych i kosztownych systemów in vivo do oceny wrażliwości ludzkich komórek szpiczaka szpiczaka szpiczanego na leki. Do tej pory dostępnych jest tylko kilka systemów in vivo do przedklinicznej oceny nowych terapii przeciwszpiczakowych. Wszystkie z nich mają swoje ograniczenia w zakresie badań przesiewowych bibliotek złożonych na dużą skalę 29. 

Najlepszymi obecnie modelami ludzkich komórek szpic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Pani Cornelii Heis za doskonałą pomoc techniczną w zakresie immunohistochemii i przygotowania zarodków kurzych. Prace te były wspierane przez Austriacki Fundusz Naukowy (grant FWF nr P19552) oraz Unię Europejską (projekt UE 7PR Optatio No: 278570).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI-8226 komórkiDSMZACC 9STR profilowane
komórki OPM-2DSMZACC 50STR profilowane
ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste Ogniwa HEK293FT PromoCellPC-C-12974
 InvitrogenR700-07
RPMI1640 MediumSigma AldrichR0883
Surowica bydlęca dla płodu  HyCloneThermoScientificSH30070.03
L-Glut- Pen- Streproztwór SigmaG6784
DMEM MediumGibco31966
NEAASigma Life SciencesM7145
Transfekcja Medium/Opti-MEM Gibco51985
eGFP lentiviral particlesGeneCopoeiaLPP-EGFP-LV105Gotowe do użycia cząsteczki wirusowe
pLenti6/V5Dest6 eGFP vectorInvitrogenPN 35-1271od autorów
ViralpowerTM packaging mix InvitrogenP/N 35-1275
Odczynnik do transfekcji/ Lipofectamin 2000Invitrogen11668-027
BlasticidinInvitrogenR210-01
NeomycynaBiochromA2912
Collagen-Type1  Rat TailBD Biosciences354236
DMEM w proszkuLife TechnologiesArt.Nr. 10338582
plitidepsynaPharmamar
bortezomibLKT Lab., Inc.B5871
SPF-białe jaja kurzeRiverZapłodnione  biały Leghorn  jaja kurze
Plastikowe łodzie wagoweneoLabArt.Nr. 1-1125do hodowli ex-ovo
Kwadrat Petrydisha (pokrywki)SimportD210-16do hodowli ex-ovo
Bufor RIPA (10x)Sygnalizacja komórkowa#9806
Proteaza Tabletki inhibitoroweRoche11 836 170 001
Kompletna mini
Biolabs, Inc.AKR-121
Histocette IISimportM493-6
PFA  37%Roth7398.1
DPBSLonzaBE17-512F
Etanol absolutNormapur20,821,321
Roti-HistolRothArt.Nr.6640.4
ParaplastSigmaA6330
Szkiełka mikroskopowe SuperFrostR. Langenbrinck Art.-Nr.
Labor- u. Medizintechnik03-0060
Bufor do płukania DakoCytomation 10xDakoCytomationCode-Nr.
S 3006
Roztwór do odzyskiwania celu (10x)  pH 6,1Kod DAKO-Nr.
S 1699
H2O2Merck
m-a-hu ASMA klon 1A4DAKOM0851
m-a-hu CD138 klon MI15DAKOM7228
m-a-hu Vimentin klon V9DAKOM0725
m-a-hu Desmin klon D33DAKO  M0760
m-a-hu Ki67  klon MIB-1   DAKO  M7240
biotynylowana koza anty-mysie IgGVector Laboratories Inc.BA-9200
Zestaw Vectastain Elite ABCVector Laboratories Inc.# Zestaw tabletek PK-6100
FAST DAB.Sigma Biochemikalia#D4293
Mayer' s haemalaun solutionMerck1,092,490,500
Roti HistokittRothArt.Nr.6638.2
Stołowy mikrotom obrotowyThermo Electron, Shandon Finesse ME+
Stacja do zatapiania tkanekLeica, TP1020
Inkubator jajGrumbach BSS160
Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny wyposażony w połączony z kamerą cyfrową (Olympus E410) i elastyczne zimne światło Olympus, SZX10
Ultra Turrax HomogenizatorIKA T10
Charles komórka ELISA ELISA bez EDTA

Bibliografia

  1. Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
  2. Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
  3. Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. The genetic architecture of multiple myeloma. Adv.Hematol. 2014, 864058(2014).
  4. Chauhan, D., et al. A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma. Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).
  5. Kuehl, W. M. Mouse models can predict cancer therapy. Blood. 120 (2), 238-240 (2012).
  6. Nefedova, Y., Gabrilovich, D. Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies. Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).
  7. Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations. Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).
  8. Dazzi, F., et al. Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation. Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Feuring-Buske, M., et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).
  11. Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
  12. Li, M., et al. Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect. Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).
  13. Tassone, P., et al. A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma. Blood. 106 (2), 713-716 (2005).
  14. Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Drug discovery through stem cell-based organoid models. Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).
  15. Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair. Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).
  16. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds). Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  17. Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. J.Vis.Exp. (41), (2010).
  18. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).
  19. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).
  20. Kern, J., et al. GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib. Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).
  21. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).
  22. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Exp.Cell Res. , (2014).
  23. Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J.Vis.Exp. (33), (2009).
  24. Kobayashi, T., et al. A chick embryo model for metastatic human prostate cancer. Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).
  25. Koop, S., et al. Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate. Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).
  26. Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines. BMC.Cancer. 12, 501(2012).
  27. Martowicz, A., et al. EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth. Mol.Cancer. 12, 56(2013).
  28. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. 6, 34(2006).
  29. Farnoushi, Y., et al. Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos. Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).
  30. Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability. Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).
  31. Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets. Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).
  32. Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies. J.Vis.Exp. (85), (2014).
  33. Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal. Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).
  34. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).
  35. Jilani, S. M., et al. Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature. J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model zarodka kurczakaanaliza wzrostu nowotworupomiar ekspresji GFPprzeszczep b ony chorioallantoicznejstereomikroskopia fluorescencyjnabarwienie immunohistochemiczneilo ciowe oznaczenie GFP metod ELISAludzkie kom rki mezenchymalnemacierz z kolagenu typu I
Opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.