Artykuł metodologiczny
Ten protokół opisuje powtarzające się wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, czyli krótkie ekspozycje na niedotlenienie ogólnoustrojowe, które zmniejszają objętość zawału i zaburzenie bariery krew-mózg po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy. Szczegółowo opisano również podwójną kwantyfikację objętości zawału i przerwania bariery krew-mózg po udarze, aby ocenić skuteczność ochrony nerwowo-naczyniowej.
Eksperymentalne modele zwierzęce udaru są nieocenionymi narzędziami do zrozumienia patologii udaru i opracowania bardziej skutecznych strategii leczenia. 2-tygodniowy protokół powtarzającego się kondycjonowania wstępnego hipoksyjnego (RHP) indukuje długotrwałą ochronę przed uszkodzeniem ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w mysim modelu ogniskowego udaru niedokrwiennego. RHP składa się z 9 stochastycznych ekspozycji na niedotlenienie, które różnią się zarówno czasem trwania (2 lub 4 godziny), jak i intensywnością (8% i 11%O2). RHP zmniejsza objętość zawału, zaburzenie bariery krew-mózg (BBB) i odpowiedź zapalną po udarze przez kilka tygodni po ostatniej ekspozycji na niedotlenienie, co sugeruje długotrwałą indukcję endogennego fenotypu chroniącego OUN. Metodologia podwójnej kwantyfikacji objętości zawału i zaburzenia bariery krew-mózg jest skuteczna w ocenie ochrony nerwowo-naczyniowej u myszy z RHP lub innymi przypuszczalnymi neuroprotektantami. Dorosłe samce szwajcarskich myszy Webster były wstępnie kondycjonowane przez RHP lub równoważną ekspozycji na 21%O2 (tj. powietrze w pomieszczeniu). 60-minutowe przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (tMCAo) zostało wywołane 2 tygodnie po ostatniej ekspozycji na niedotlenienie. Zarówno okluzję, jak i reperfuzję potwierdzono za pomocą przezczaszkowego laserowego dopplerowskiego flowmetrii. Dwadzieścia dwie godziny po reperfuzji Evans Blue (EB) został podany dożylnie poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. 2 godziny później zwierzęta uśmiercono z powodu przedawkowania izofluranu, a skrawki mózgu zabarwiono chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC). Objętość zawałów została następnie oznaczona ilościowo. Następnie EB ekstrahowano z tkanki przez 48 godzin w celu określenia przerwania BBB po tMCAo. Podsumowując, RHP jest prostym protokołem, który można powielić przy minimalnych kosztach w celu wywołania długotrwałej endogennej ochrony nerwowo-naczyniowej przed udarem mózgu u myszy, z potencjałem translacyjnym dla innych stanów prozapalnych opartych na OUN i ogólnoustrojowych.
Jako główna przyczyna niepełnosprawności dorosłych i czwarta najczęstsza przyczyna śmierci, udar mózgu jest jednym z najbardziej wyniszczających stanów chorobowych, z jakimi boryka się dorosła populacja Stanów Zjednoczonych. 1 Zwierzęce modele udaru pozwalają na eksperymentalne badanie nowych metod zmniejszania uszkodzeń niedokrwiennych i poprawy rekonwalescencji po udarze. Jedną z nowatorskich ścieżek dla takich badań translacyjnych jest warunkowanie wstępne. Kondycjonowanie wstępne to celowe użycie bodźca, który nie uszkadza w celu zmniejszenia uszkodzeń spowodowanych kolejnym i poważniejszym urazem. 2 Wykazano, że wstępne kondycjonowanie hipok....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
UWAGA: Ten protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w UT Southwestern Medical Center, który przestrzega polityki National Institutes for Health (NIH) dotyczącej eksperymentalnego wykorzystania zwierząt.
1. Powtarzalne warunkowanie hipoksyjne
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W badaniu wzięło udział 25 samców myszy rasy Swiss Webster, które w momencie randomizacji do grupy RHP (n = 10) lub grupy 21% O2 (n = 15) miały 10 tygodni. Procedury chirurgiczne przeprowadzono dwa tygodnie po ostatniej ekspozycji na RHP, przy zastosowaniu metody ślepej próby oraz zrównoważeniem grup w poszczególnych dniach. Po tMCAo jedna mysz padła podczas rekonwalescencji pooperacyjnej, a jedna mysz została wykluczona z badania z powodu niespełnienia kryterium CBF dla reperfuzji. Obie wykluczone myszy należ.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Pojedyncza ekspozycja na niedotlenienie ogólnoustrojowe (tj. 2 godziny 11%O2) u myszy "przejściowo" chroni mózg przed tMCAo,29 co oznacza, że odpowiedź epigenetyczna na wyzwanie związane z kondycjonowaniem wstępnym jest krótkotrwała, a wyjściowy fenotyp zostaje przywrócony w ciągu kilku dni. Powtarzające się prezentacje bodźca kondycjonowania wstępnego hipoksyjnego dramatycznie wydłużają czas trwania fenotypu neuroprotekcyjnego. 6 Wiele badań wykazało, że częstotliwość, wielkość .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Specjalne podziękowania dla laboratorium Gidday za ich pracę nad opracowaniem protokołu RHP, a także dla Neuro-Models Facility (UTSW) za pomoc w operacjach tMCAo. Praca ta była wspierana przez granty z American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS) oraz Fundacja Badań nad Paraliżem Spatycznym Dystryktu Illinois-Eastern Iowa of Kiwanis International (JMG).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przepływomierze, regulatory | VetEquip, Inc | Zamówienie specjalistyczne | Cztery przepływomierze są przymocowane do elastycznej rurki PVC o średnicy 6,0 mm, która łączy się z portem wlotowym w każdej komorze indukcyjnej za pomocą plastikowego złącza żeńskiego. Te przepływomierze są przykręcone do metalowego pręta o wymiarach 6,5" x 1" x 1". Ten metalowy pręt jest przykręcony do manometru MI-246-P z wylotem DISS. Ten manometr i przepływomierz można przymocować do każdej nowej butli z gazem za pomocą klucza. |
| 21% zbiornik O2 | zbiornik AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas Specjalne zamówienie | ||
| 8% zbiornika O2 tank | AirGas | Specjalistyczne zamówienie | |
| 15 L komory indukcyjne | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Instrumenty wrzosowiskowe | moorVMS-LDF1-HP | Sonda o średnicy 0,8 mm |
| Oświetlacz o wysokiej intensywności | Nikon | NI-150 | |
| z zoomem | NIkon | SMZ800 | Można stosować inne mikroskopy chirurgiczne. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Wycofane z produkcji | Zalecanym zamiennikiem jest PhysioSuite z monitorowaniem temperatury RightTemp i kontrolą homeotermiczną (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Inkubator Hovabator | Stromberg's | 2362-E | Nasz model to 2362N. 2362E to nowszy model i zawiera elektroniczny termostat. |
| V010 System anestezjologiczny | VetEquip | 901807 | Zawiera: wysokociśnieniowy wąż tlenowy o długości dziesięciu stóp, ramę, przepływomierz, zespół spłukiwacza tlenowego, parownik, obwód oddechowy, komorę, noski, rurkę odprowadzającą gazy odlotowe i dwa filtry VapoGuard |
| 250 ml izofluranu | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Akumulatorowa podkaszarka dla zwierząt | Andis | #23905 | Wymienne ostrza są dostępne w Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Wielu sprzedawców | Numer katalogowy niedostępny | |
| Płatki z gazy | Fisher Scientific | 67622 | |
| Serweta chirurgiczna | Fisher Scientific | GM300 | |
| Szwy jedwabne | Look/Div Specjalizacje Chirurgiczne | SP115 | |
| Nici nylonowe | Look/Div Specjalizacje Chirurgiczne | SP185 | |
| Kleszcze Durmont #5 (2) | Narzędzia naukowe | 11251-35 | Kąt 45° |
| Nożyczki chirurgiczne | Narzędzia do nauki pięknej | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Ostrze proste |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Zamykanie filamentów | Zamówienie specjalistyczne | Uniwersytetu Waszyngtońskiego | Filamenty są powlekane silikonem na Uniwersytecie Waszyngtońskim i dostarczane do obiektów UTSW za opłatą. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, koła, Grade 1 | |
| Łodzie wagowe | Fisher Scientific | 02-202-101 | Średnica 2,5 cala |
| 0,9% Wtrysk chlorku sodu USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| Strzykawka insulinowa 0,3 cc z igłą o rozmiarze 29 Becton | Dickinson Labware | 309301 | |
| Ogranicznik z płaskim dnem | Braintree Naukowe | FB M | Średnica 2,0" |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7,4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Łaźnia wodna | Wielu sprzedawców | Numer katalogowy niedostępny | Rurki scyntylacyjne z TTC mogą być ręcznie trzymane pod bieżącą ciepłą wodą jako alternatywa dla kąpieli wodnej. |
| Płyta styropianowa | Wielu sprzedawców | Numer katalogowy niedostępny | |
| Duży zestaw strzykawek | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Pompa perfuzyjna | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| Strzykawka 60 cc | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 zestaw do infuzji ze skrzydłami | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| fiolka scyntylacyjna o pojemności 20 ml | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Szpatułka ze stali nierdzewnej | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto akrylowy 1,0 mm mózg myszy, koronalny | CellPoint Naukowe | Numer katalogowy niedostępny | |
| Ostrza ze stali nierdzewnej 0,21 mm, 25 pk | CellPoint Scientific | Numer katalogowy niedostępny | Ostrza kriostatu wielokrotnego użytku to niedroga alternatywa. |
| 4% paraformaldehyd | Santa Cruz Biotechnologia | SC-281692 | |
| Szkiełka mikroskopowe Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Wielu sprzedawców | Numer katalogowy niedostępny | Inne komercyjne skanery są odpowiednie do tego kroku w protokole. |
| Obraz J | katalogowy Narodowego Instytutu Zdrowia | niedostępny | |
| Waga analityczna | METTLER TOLEDO | precyzyjny XSE 205U | |
| Thermo Scientific | |||
| Probówki do mikrowirówek 1,7 ml (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamid | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-dołkowe płytki | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epokowy spektrofotometr mikropłytkowy | BioTek | Numer katalogowy niedostępny |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie