Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja ochrony nerwowo-naczyniowej po powtarzającym się kondycjonowaniu wstępnym hipoksyjnym i przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52675

⸱

4 maja 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology and Neurotherapeutics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Neurological Surgery, Washington University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje powtarzające się wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, czyli krótkie ekspozycje na niedotlenienie ogólnoustrojowe, które zmniejszają objętość zawału i zaburzenie bariery krew-mózg po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy. Szczegółowo opisano również podwójną kwantyfikację objętości zawału i przerwania bariery krew-mózg po udarze, aby ocenić skuteczność ochrony nerwowo-naczyniowej.

Streszczenie

Eksperymentalne modele zwierzęce udaru są nieocenionymi narzędziami do zrozumienia patologii udaru i opracowania bardziej skutecznych strategii leczenia. 2-tygodniowy protokół powtarzającego się kondycjonowania wstępnego hipoksyjnego (RHP) indukuje długotrwałą ochronę przed uszkodzeniem ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w mysim modelu ogniskowego udaru niedokrwiennego. RHP składa się z 9 stochastycznych ekspozycji na niedotlenienie, które różnią się zarówno czasem trwania (2 lub 4 godziny), jak i intensywnością (8% i 11%O2). RHP zmniejsza objętość zawału, zaburzenie bariery krew-mózg (BBB) i odpowiedź zapalną po udarze przez kilka tygodni po ostatniej ekspozycji na niedotlenienie, co sugeruje długotrwałą indukcję endogennego fenotypu chroniącego OUN. Metodologia podwójnej kwantyfikacji objętości zawału i zaburzenia bariery krew-mózg jest skuteczna w ocenie ochrony nerwowo-naczyniowej u myszy z RHP lub innymi przypuszczalnymi neuroprotektantami. Dorosłe samce szwajcarskich myszy Webster były wstępnie kondycjonowane przez RHP lub równoważną ekspozycji na 21%O2 (tj. powietrze w pomieszczeniu). 60-minutowe przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (tMCAo) zostało wywołane 2 tygodnie po ostatniej ekspozycji na niedotlenienie. Zarówno okluzję, jak i reperfuzję potwierdzono za pomocą przezczaszkowego laserowego dopplerowskiego flowmetrii. Dwadzieścia dwie godziny po reperfuzji Evans Blue (EB) został podany dożylnie poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. 2 godziny później zwierzęta uśmiercono z powodu przedawkowania izofluranu, a skrawki mózgu zabarwiono chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC). Objętość zawałów została następnie oznaczona ilościowo. Następnie EB ekstrahowano z tkanki przez 48 godzin w celu określenia przerwania BBB po tMCAo. Podsumowując, RHP jest prostym protokołem, który można powielić przy minimalnych kosztach w celu wywołania długotrwałej endogennej ochrony nerwowo-naczyniowej przed udarem mózgu u myszy, z potencjałem translacyjnym dla innych stanów prozapalnych opartych na OUN i ogólnoustrojowych.

Wprowadzenie

Jako główna przyczyna niepełnosprawności dorosłych i czwarta najczęstsza przyczyna śmierci, udar mózgu jest jednym z najbardziej wyniszczających stanów chorobowych, z jakimi boryka się dorosła populacja Stanów Zjednoczonych. 1 Zwierzęce modele udaru pozwalają na eksperymentalne badanie nowych metod zmniejszania uszkodzeń niedokrwiennych i poprawy rekonwalescencji po udarze. Jedną z nowatorskich ścieżek dla takich badań translacyjnych jest warunkowanie wstępne. Kondycjonowanie wstępne to celowe użycie bodźca, który nie uszkadza w celu zmniejszenia uszkodzeń spowodowanych kolejnym i poważniejszym urazem. 2 Wykazano, że wstępne kondycjonowanie hipoksyjne powoduje plejotropowe zmiany w mózgu, które zapewniają ochronę przed udarem zarówno w badaniach in vivo, jak i in vitro. 3 Jednak pojedyncza ekspozycja na niedotlenienie zapewnia tylko krótkotrwałą neuroprotekcję, wywołując mniej niż 72 godziny tolerancji na niedokrwienie u dorosłych myszy. Nawet po czterech tygodniach 14-godzinnej codziennej ekspozycji na hipoksję hipobaryczną, Lin i in. stwierdzili, że neuroprotekcja utrzymywała się tylko przez tydzień. 5 Powtarzalne kondycjonowanie wstępne hipoksyjności (RHP) charakteryzuje się stochastycznymi zmianami częstotliwości, czasu trwania i intensywności ekspozycji na hipoksyjność. W przeciwieństwie do pojedynczego wyzwania kondycjonowania wstępnego, RHP indukuje fenotyp mózgoprotekcyjny, który utrzymuje się do ośmiu tygodni u myszy. 6 RHP zmniejszyło objętość zawału, zaburzenie bariery krew-mózg (BBB), zapalenie naczyń krwionośnych i diapedezę leukocytów przez kilka tygodni po ostatecznej ekspozycji na niedotlenienie. RHP specyficznie zmniejszył stan zapalny w niedokrwionym mózgu poprzez zmniejszenie populacji limfocytów T, monocytów i makrofagów, przy jednoczesnym utrzymaniu populacji komórek B w półkuli niedokrwiennej. 7 W rzeczywistości RHP indukował fenotyp immunosupresyjny u myszy przed jakimkolwiek uszkodzeniem OUN, w tym udarem. Limfocyty B leczone RHP wyizolowane od zdrowych myszy leczonych RHP wykazywały unikalny fenotyp przeciwzapalny, z regulacją w dół zarówno prezentacji antygenu, jak i produkcji przeciwciał. Ogólne zmniejszenie prozapalnych adaptacyjnych mechanizmów immunologicznych sprawia, że RHP jest doskonałą metodologią indukowania endogennej immunosupresji nie tylko w chorobach zapalnych specyficznych dla OUN, ale także w urazach ogólnoustrojowych lub modelach chorób, które obejmują patologię prozapalną.

RHP zmniejsza zarówno objętość zawału, jak i zaburzenie BBB po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu (tMCAo). Zwierzęce modele udaru, takie jak powszechnie stosowany tMCAo, znacznie poprawiają zrozumienie patofizjologii udaru, a także projektowanie skuteczniejszych neuroterapii. Po raz pierwszy opracowana przez Koizumi i wsp. w 1986 r.8 procedura tMCAo jest szeroko stosowaną metodą wywoływania udaru u gryzoni i jedną z preferowanych metod badania stanu zapalnego po reperfuzji. Wraz z ewolucją metod tMCAo, nowsze zastosowanie włókien powlekanych silikonem jeszcze bardziej zmniejsza ryzyko krwotoku podpajęczynówkowego w porównaniu z innymi modelami9,10 i poprawia niezawodność, chociaż niestety tMCAo często powoduje duże różnice w objętości zawału. 11-13 Większość z tych badań wyznacza obszary zawału w koronalnych odcinkach mózgu poprzez barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC), uważanym za złoty standard w oznaczaniu ilościowym zawału, ponieważ jest to prosty i niedrogi sposób na uzyskanie żywych, powtarzalnych wyników. TTC służy jako substrat dehydrogenaz obecnych w mitochondriach. Kiedy wycinki mózgu są wystawione na działanie roztworu TTC, TTC jest selektywnie pobierany do żywych komórek, gdzie jego nierozpuszczalny produkt redukcyjny, formazan, wytrąca się do głębokiego czerwonego koloru w żywotnych mitochondriach. Ze względu na dysfunkcję mitochondriów w tkance niedokrwiennej, tkanka ta pozostaje biała, co pozwala na różnicowanie uszkodzonej i zdrowej tkanki. 14

RHP również zmniejsza zakłócenia BBB w półkuli niedokrwiennej. 6 W związku z tym podwójna kwantyfikacja integralności BBB w tych samych mózgach, co oznaczenia objętości zawału na podstawie TTC15 dostarczyłaby użytecznych informacji na temat pełnej skuteczności ochrony endogennej i potencjalnych związków przyczynowych między zaburzeniem BBB a zawałem u zwierząt nieleczonych i leczonych. Napływ krwi obwodowej przez zaburzoną barierę krew-mózg, wtórny do udaru, zwiększa populacje leukocytów, cytokiny prozapalne, stres oksydacyjny, obrzęk naczyniopochodny i transformację krwotoczną w półkuli niedokrwiennej, ostatecznie zwiększając wskaźniki infekcji i śmiertelności u pacjentów z udarem niedokrwiennym. 16,17 Powszechną metodą pomiaru zaburzeń bariery krew-mózg w modelach zwierzęcych jest ilościowe oznaczanie wycieku niebieskiego barwnika Evansa (EB) do mózgu. 15,18-21 EB selektywnie wiąże się z albuminą surowicy, białkiem globularnym (MW = 65 kDa), które nie przekracza bariery krew-mózg u zwierząt zdrowych. 22 Po udarze niedokrwiennym EB nacieka mózg i fluoryzuje przy długości fali 620 nm, co pozwala na pomiar gęstości optycznej w uszkodzonym miąższu perfundowanym. 22 Gęstość optyczna jest wprost proporcjonalna do przepuszczalności bariery krew-mózg, gdy EB została wypłukana z pośmiertnego naczynia korowego przez perfuzję przezsercową. Dzięki natychmiastowemu przetwarzaniu mózgów barwionych TTC u zwierząt, którym podawano EB, można skutecznie określić ilościowo zarówno objętość zawału, jak i zaburzenie bariery krew-mózg. Należy jednak zauważyć, że uszkodzenie neuronów i zaburzenie bariery krew-mózg nie są procesami towarzyszącymi w mózgu po udarze,23,24 więc wybór czasu poświęcenia jest ważnym czynnikiem.

Następujący protokół szczegółowo opisuje metodę RHP, metodę tMCAo do wywoływania tymczasowej niedrożności tętnic, która modeluje niedrożność tętnicy środkowej mózgu u pacjentów ludzkich, oraz podwójne metody histologiczne do określania punktów końcowych uszkodzeń udaru nerwowego i naczyniowego. TTC mierzy śmierć komórek i skumulowane uszkodzenia tkanek, co pozwala na ilościowe określenie całkowitej objętości zawału, podczas gdy EB zapewnia ilościowe określenie uszkodzenia BBB w półkuli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Ten protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w UT Southwestern Medical Center, który przestrzega polityki National Institutes for Health (NIH) dotyczącej eksperymentalnego wykorzystania zwierząt.

1. Powtarzalne warunkowanie hipoksyjne

  1. Specjalnie zaprojektowane cztery przepływomierze na regulatorach gazu i przymocowane do standardowych studzienek indukcyjnych o pojemności 15 litrów z rurkami PVC, aby umożliwić przepływ sprężonego gazu ze zbiorników tlenu (O2) do komór przez otwór wlotowy. Zobacz Sprzęt i materiały, aby uzyskać więcej informacji na temat projektowania niestandardowego.
  2. Podziel myszy na 2 grupy: grupę powtarzającego się kondycjonowania wstępnego hipoksyjnego (RHP), która otrzymuje jednocześnie ekspozycję na 8% i 11%O2, oraz grupę kontrolną, która otrzymuje jednocześnie ekspozycję na 21% O2 (powietrze w pomieszczeniu). Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z różnicami w częstotliwości, intensywności (8 i 11%O2 lub 21%O2) i czasie trwania (2 lub 4 godziny) ekspozycji na RHP.
  3. Zdejmij górną pokrywę filtra z każdej klatki i umieść klatkę z nienaruszonymi butelkami z żywnością i wodą w komorach podłączonych do odpowiednich zbiorników O2 . Zamknij i zabezpiecz pokrywę komory.
    1. Otwórz główny zawór gazowy zbiorników i ustaw początkowy przepływ dla każdej komory indukcyjnej na 2 l na minutę (LPM) przez pierwsze 5 minut ekspozycji. Zmniejsz natężenie przepływu do 1 l/min przez pozostałą część ekspozycji.
    2. Pod koniec ekspozycji zmniejsz przepływ do 0 l/min i zamknij zawór gazowy zbiorników.
    3. Otwórz pokrywy komory i załóż górną pokrywę filtra na każdą klatkę. Umieścić koszyki w standardowej obudowie do czasu następnej ekspozycji na niedotlenienie.
  4. Po każdym użyciu spryskaj każdą komorę indukcyjną NPD (Steris) lub równoważnym środkiem dezynfekującym/dezodorantem.
  5. Wystawiaj zarówno myszy 21%, jak i RHP o tej samej porze dnia w ciągu dwóch tygodni, jak opisano w Tabeli 1.

2. Przejściowa niedrożność tętnicy środkowej mózgu (tMCAo)

  1. Zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji na temat czasu udaru po końcowej ekspozycji na RHP.
  2. Przygotuj aseptyczne miejsce pracy chirurgii. Oczyść otaczające miejsce pracy 70% etanolem lub równoważnym środkiem dezynfekującym i autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne.
    1. Skonfiguruj przyrząd do laserowej przepływomierza dopplerowskiego (LDF), aby mierzyć względne zmiany w przepływie krwi w mózgu (CBF). Włączyć poduszkę grzewczą do 37 °C. Włączyć inkubator do 34 °C.
  3. Znieczulenie myszy poprzez krótką ekspozycję na mieszaninę 4% izofluranu/70% NO2/30% O2 w małej komorze indukcyjnej. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, lekko szczypiąc łapę. Jeśli mysz wycofa łapę, należy umieścić mysz z powrotem w komorze indukcyjnej i kontynuować ekspozycję na izofluran.
  4. Wyjmij myszy z komory indukcyjnej znieczulenia i szybko włóż nos myszy do stożka nosowego. Otworzyć przepływ gazu do stożka nosowego, zamykając przepływ do komory indukcyjnej znieczulenia.
    1. Nie zmieniając mieszaniny gazów 70% NO2 / 30% O2 należy ustalić izofluran na poziomie 1,8% jako dawkę podtrzymującą przez pozostałą część zabiegu. Oddech powinien pozostać powolny i regularny przez cały zabieg, ale jeśli oddech staje się szybki i płytki, należy zwiększyć dawkę izofluranu. Dawka podtrzymująca może się różnić w zależności od producenta sprzętu i zwierzęcia użytego w doświadczeniu.
  5. Za pomocą mikrogolarki zgol włosy w okolicy skroniowej między kącikiem oka a uchem, a także w brzusznej linii środkowej szyi. Usuń nadmiar sierści i nałóż lubrykant do oczu za pomocą sterylnego bawełnianego wacika, aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas zabiegu. Przetrzyj miejsce nacięcia wacikami nasączonymi alkoholem i przetrzyj prowidon-jod sterylnym wacikiem, aby zachować warunki aseptyki.
  6. Podawać leki przeciwbólowe zgodnie z wytycznymi chirurgicznymi gryzoni.
  7. Wykonaj nacięcie przez skórę skroniową między okiem a uchem. Odsłoń mięsień skroniowy. Za pomocą mikronożyczek chirurgicznych przetnij więzadło mięśnia skroniowego na grzbiecie skroniowym w obszarze prążkowania mięśni białych.
    1. Delikatnie popchnij masę mięśniową na boki za pomocą kleszczy, aby uwidocznić środkową tętnicę mózgową (MCA) przez czaszkę. Po nacięciu mięśnia skroniowego obszar ten może wypełnić się krwią. Delikatnie użyj bawełnianego wacika, aby zatamować potencjalne krwawienie.
    2. Skieruj końcówkę sondy LDF na obszar MCA. Zapisz wybrane naczynie, ponieważ ten obszar różni się u różnych myszy.
    3. Przytrzymaj LDF na miejscu i zrównaj z czaszką, aż zostanie odczytany stabilny strumień czerwonych krwinek i zapisz tę wartość jako podstawowy CBF. Idealne wyjściowe CBF w laserowym przepływomierzu dopplerowskim to strumień >600, ale będzie się to różnić w zależności od producenta. Jeśli wyjściowy CBF wynosi strumień <400, zapis przepływu najprawdopodobniej pochodzi z pobliskiej żyły lub niepełnego umieszczenia sondy nad naczyniem docelowym.
  8. Po ustaleniu wyjściowego CBF zmień położenie myszy tak, aby szyja była odsłonięta. Podeprzyj jego głowę i utrzymuj mysz w stałym znieczuleniu z nosa.
  9. Wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej od tuż poniżej żuchwy do obojczyka.
    1. Za pomocą kleszczy tępo wypreparuj całą powierzchowną powięź, aby odsłonić lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA). Oddziel CCA od tkanki łącznej i nerwu błędnego.
    2. Trwale podwiązaj CCA za pomocą jedwabnego szwu 6.0. Umieść szew podwiązkujący tak proksymalnie, jak to możliwe, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na umieszczenie włókna okluzyjnego.
    3. Zapnij pętlę i luźno zawiąż drugi jedwabny szew 6.0 wokół CCA dystalnie do szwu okluzyjnego. Uważaj, aby nie zatkać tętnicy, ponieważ włókno okluzyjne zostanie następnie przewleczone przez tętnicę szyjną.
    4. Użyj lekkiego zacisku mikro serrafine areterial o wymiarach 8 x 2 mm, aby zacisnąć CCA dystalnie do luźno zawiązanego szwu jedwabnego. Delikatnie podnieś CCA kleszczami i wykonaj małe podłużne nacięcie, jak najbliżej szwu podwiązującego za pomocą 3 mm vannas.
    5. Przeciągnij 12 mm pokryty silikonem nylonowy włókno okluzyjne o grubości 6,0 przez nacięcie, aby wejść do światła tętnicy, a następnie przesunąć go o kilka mm. Luźno zaciśnij drugi luźny jedwabny szew wokół końcówki włókna okluzyjnego, aby upewnić się, że przepływ krwi nie wypycha włókna z CCA i usuń zacisk tętniczy.
    6. Przy pierwszym rozwidleniu CCA na tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) i tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA), nawlecz włókno zamykające w prawą gałąź pierwszego rozwidlenia, aby wejść do ICA. Przesuń włókno okluzyjne o 9 do 10,5 mm za drugi szew jedwabny do lewej tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA).
    7. Krótko po wejściu do ICA przesuń włókno okluzyjne do lewej gałęzi przy drugim rozwidleniu między ICA a tętnicą pterogopalantynową (PPA). Wizualizacja PPA jest mało prawdopodobna, więc kontynuuj, aż poczujesz łagodny opór przy pełnym umieszczeniu filamentu okluzyjnego. Podnoszenie ICA za pomocą kleszczy może pomóc w łatwiejszym nawlekaniu się filamentu na lewą gałąź drugiego rozwidlenia. Zaciśnij drugi jedwabny szew.
    8. Obróć mysz tak, aby nacięcie nad MCA było widoczne. Za pomocą sprzętu LDF upewnij się, że CBF jest zablokowany przez odczyty LDF. Udana okluzja to redukcja o >80% w stosunku do wyjściowego CBF.
    9. Całkowicie zaciśnij i podwójnie zawiąż drugi jedwabny szew wokół włókna okluzyjnego, gdy zostanie osiągnięta właściwa pozycja. W razie potrzeby lekko wciśnij lub wyciągnij filament okluzyjny, aby spełnić kryteria CBF dla udanej okluzji (np. redukcja >80% w stosunku do wyjściowego CBF).
    10. Zamknij otwór na szyję i głowę za pomocą nylonowych szwów 6.0.
  10. Umieścić myszy w inkubatorze o temperaturze 34 °C na czas trwania okluzji. Zalecana długość okluzji to 60 minut, ale różni się w zależności od wieku, zależnych od szczepu różnic w anatomii naczyń mózgowych25 i pożądanego zakresu urazu (łagodny, umiarkowany, ciężki). Upewnij się, że zwierzęta odzyskają przytomność w ciągu kilku minut od wyjścia z narkozy.
  11. Ponownie znieczulić zwierzęta izofluranem, jak opisano w kroku 2.3, 5 minut przed końcem wstępnie zdefiniowanego okresu okluzji, otworzyć nacięcie skóry głowy i potwierdzić, że perfuzja MCA jest nadal zmniejszona za pomocą przezczaszkowych odczytów LDF. Jeśli CBF nie jest wystarczająco zredukowany (np. <20% wyjściowego CBF), MCA uległo reperfuzji w pewnym momencie podczas okluzji i mysz powinna zostać wykluczona z dalszych eksperymentów.
  12. Otwórz nacięcie szyjki w linii środkowej i luźno zawiąż trzeci jedwabny szew wokół CCA, dystalnie do drugiego szwu jedwabnego, ale proksymalnie do rozwidlenia CCA, aby upewnić się, że zewnętrzna tętnica szyjna (ECA) pozostanie żywotna po usunięciu włókna.
    1. Przeciąć lub rozwiązać węzeł, który przytrzymuje włókno okluzyjne (tj. drugi szew jedwabny) i powoli wycofać włókno okluzyjne. Po usunięciu szybko zamknij trzeci jedwabny szew wokół CCA, aby zminimalizować cofanie się krwi z ICA. Podwójnie zawiąż ten szew i zamknij nacięcie nylonowymi szwami 6.0.
    2. Zmień położenie myszy, aby określić ilościowo poziom CBF po 5 minutach reperfuzji. Udana reperfuzja jest ogólnie definiowana jako CBF na poziomie >50% wyjściowego CBF, ale podobnie jak w przypadku przepływu okluzyjnego, badacze mogą ustalić własne kryterium. Jeśli zwierzęta wykazują CBF poniżej 50% ich wartości wyjściowej, jest prawdopodobne, że MCA jest "trwale" niedrożny, a zatem stanowi kolejne kryterium wykluczenia z badania.
    3. Zamknij oba nacięcia nylonowymi szwami 6.0. Zapewnij sól fizjologiczną, środek znieczulający (lidokaina) i antybiotyki zgodnie z wytycznymi dla gryzoni. Stwierdzono jednak, że niektóre małe dawki antybiotyków (3 mg/kg minocykliny) działają neuroprotekcyjne po udarze. 26
  13. Po odzyskaniu przytomności w podgrzewanym inkubatorze po operacji, umieść myszy w czystej, sterylnej klatce. Zapewnij zwilżoną karmę lub odżywcze nawodnienie, żelowe suplementy diety i płytkę Petriego z wodą, ponieważ zwierzęta będą miały ograniczoną mobilność po udarze. Uważnie monitoruj zwierzęta podczas rekonwalescencji pod kątem nadmiernego bólu pooperacyjnego i śmierci.

3. Wtrysk Evans Blue (EB)

  1. Wstrzyknąć EB 22 godziny po reperfuzji i powinien krążyć w krwiobiegu przez 2 godziny przed uśmierceniem i barwieniem TTC.
  2. Przygotować roztwór EB do wstrzykiwań (2% EB w soli fizjologicznej) i delikatnie wymieszać w temperaturze pokojowej. Przefiltrować roztwór przez bibułę filtracyjną lub przecisnąć przez filtr 0,2 μm przymocowany do małej strzykawki, aby usunąć nierozpuszczony EB i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować ilość EB potrzebną do wstrzyknięcia (4 ml/kg masy ciała) Pobrać żądaną ilość barwnika do strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 cm3 za pomocą igły o rozmiarze 29 i upewnić się, że roztwór ma temperaturę pokojową
    1. Unieruchamiaj mysz za pomocą ogranicznika z płaskim dnem. Przytrzymaj ogon tak, aby żyła boczna znajdowała się najwyżej. Żyły boczne znajdują się po obu stronach linii środkowej ogona. Przytrzymaj czubek ogona, aby utrzymać mysz stabilnie do wstrzyknięcia.
    2. Wbić igłę do żyły na około 3,5 mm, uważając, aby nie przebić żyły. Upewnij się, że igła znajduje się w żyle, odciągając strzykawkę i szukając śladów krwi.
    3. Wstrzyknij cały barwnik w ciągu 1 minuty. Jeśli roztwór dostaje się do żyły, opór powinien być minimalny, ponieważ nacisk jest wywierany na strzykawkę. Potwierdź pomyślne ogólnoustrojowe podanie żylne EB poprzez natychmiastową zmianę koloru ogona, kończyn i oczu myszy.
    4. Wyjmij igłę z ogona i delikatnie uciskaj czystą gazą, aby zatrzymać krwawienie.
  4. Rozpocznij odmierzanie czasu, gdy skóra myszy zmieni kolor na niebieski. Pozwól EB krążyć przez 2 godziny, aby przeniknąć do osłabionej bariery krew-mózg.

4. Barwienie chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC) 2,3,5-

  1. Barwienie perfuzji i TTC powinno nastąpić 24 godziny po reperfuzji.
  2. Przygotuj 2% roztwór TTC przed wyznaczonym czasem poświęcenia. Dodać 10 g proszku TTC do 500 ml 0,01 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,4. Podgrzać roztwór do temperatury 37 °C w łaźni wodnej, aby ułatwić solubiizację TTC. UWAGA: Proszek i roztwór TTC działają drażniąco na skórę, płuca i oczy. Podczas pracy z tymi materiałami należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
    1. Po całkowitym rozpuszczeniu proszku należy natychmiast przenieść do butelki, przykryć folią i przechowywać w temperaturze 4 °C. TTC i tkanki zabarwione TTC są wrażliwe na światło.
  3. Po 24 godzinach od podania tMCAo i 2 godziny po podaniu EB należy uśmiercić zwierzę z powodu przedawkowania izofluranu w małej komorze indukcyjnej. Perfuzja powinna rozpocząć się natychmiast po sakricice, aby zminimalizować autolizę, która rozpoczyna się przy braku tlenu po śmierci.
  4. Szybko zabezpiecz zwierzę na styropianowej platformie z przedramionami przypiętymi przez łapy. Wytnij boczne nacięcie w ścianie brzucha od linii środkowej tuż poniżej klatki piersiowej. Ostrożnie przeciąć przeponę, aby odsłonić serce.
    1. Uruchomić pompę perfuzyjną przy natężeniu przepływu 5 ml/min za pomocą strzykawki o pojemności 60 cm3 wypełnionej lodowatym 0,01 M PBS i podłączonej do igły infuzyjnej ze skrzydełkami o pojemności 27 gów. Umieść końcówkę igły około 0,5 cm w lewej komorze serca i przetnij prawy przedsionek. Stopniowo rozcieńczana krew żylna powinna wypływać z przedsionka podczas perfuzji, aż krew żylna stanie się bezbarwna. Przezsercowo perfuzjonować 30 ml 0,01 M buforowanej soli fizjologicznej (PBS) fosforanowej przez serce.
  5. Dodać 5 ml roztworu TTC do przezroczystych 20 butelek scyntylacyjnych.
  6. Natychmiast po perfuzji odetnij głowy zwierzętom i wypreparuj mózgi za pomocą małych nożyczek i szpatułki, jeśli to konieczne. Zbadaj mózgi, aby wykluczyć zwierzęta, które przeszły krwotok podpajęczynówkowy w Kręgu Willisa, wtórny do założenia szwów. Sprawdź, czy półkula przeciwległa do okluzowanego MCA wydaje się blada, bez zauważalnego wycieku EB lub obrzęku.
  7. Wlej PBS do akrylowej matrycy mózgowej zaprojektowanej do wykonania odcinków koronalnych mózgu myszy o grubości 1,0 mm. Umieść mózg, grzbietową stroną do góry, w macierzy i natychmiast wylej PBS na mózg. Utrzymuj mózg wilgotny.
    1. Usuń opuszki węchowe, wkładając ostrze ze stali nierdzewnej o grubości 0,21 mm do drugiej szczeliny od strony rostralnej matrycy.
    2. Usuń móżdżek, wkładając ostrze w czwartą szczelinę od ogonowej strony macierzy.
    3. Włóż ostrze do środkowej szczeliny pozostałych szczelin w matrycy. Włóż pozostałe ostrza, równomiernie przecinając pozostałą tkankę, aby zapewnić najbardziej równomierne rozprowadzenie tkanki podczas krojenia.
    4. Po włożeniu wszystkich ostrzy dodaj 1 do 2 kropli PBS do mózgu, aby go zwilżyć.
    5. Usuwaj ostrza pojedynczo z matrycy, zaczynając od obszaru rostralnego. Zachowaj pierwsze 7 wycinków do analizy TTC po tMCAo. Użyj małej szpatułki, aby ostrożnie przenieść plastry z ostrza do fiolki wypełnionej TTC.
  8. Gdy wszystkie fragmenty znajdą się w fiolce, zakręć ją i umieść w ciepłej łaźni wodnej, aż skrawki zmienią kolor na różowy. W razie potrzeby delikatnie obróć butelkę w wannie, aby uniknąć nakładania się sekcji, co może prowadzić do nierównomiernego zabarwienia. Następnie wyrzuć TTC i wlej 4% roztwór paraformaldehydu do fiolki, aby zakryć skrawki mózgu i zakończyć reakcję chemiczną TTC.
  9. Natychmiast ułóż sekcje na czystym szkiełku o wymiarach 1 "x 3" i zorientuj sekcje od rostralnego do ogonowego.
    1. Gdy sekcje zostaną ułożone na szkiełku, zeskanuj slajd za pomocą standardowego skanera. Ustaw rozdzielczość na co najmniej 600 dpi dla analizy obrazu. Pamiętaj, aby na zeskanowanym obrazie umieścić imię zwierzęcia i linijkę metryczną.
    2. Odwróć slajd i zeskanuj tylną stronę, aby upewnić się, że wszystkie dane zostały zebrane.

5. Kwantyfikacja objętości zawału

  1. Określ ilościowo objętość zawału za pomocą standardowego oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ).
  2. Skanuj obrazy w wysokiej rozdzielczości (np. 600 dpi) w celu odpowiedniej analizy. Kadrowanie obrazów. Ustandaryzuj skalę dla wszystkich obrazów za pomocą linijki metrycznej dołączonej do zeskanowanego obrazu.
  3. Oblicz całkowitą objętość półkuli przeciwległej, korzystając z następującego wzoru. Powtórz ten wzór, aby obliczyć całkowitą objętość półkuli ipsilateralnej.
    Suma całkowitej przeciwległej półkuli każdego wycinka x grubość warstwy
  4. Oblicz objętość pośredniego zawału. Kontrola obrzęku ipsilateralnego spowodowanego udarem mózgu przy użyciu zdrowej, przeciwległej półkuli jako kontroli. 27 Użyj następującego wzoru, aby obliczyć objętość pośredniego zawału:
    Całkowita objętość półkuli przeciwległej -
    (Całkowita objętość półkuli ipsilateralnej – średnia objętość 3 pomiarów zawału)

6. Kwantyfikacja integralności bariery krew-mózg (BBB)

  1. Aby przygotować się do kwantyfikacji EB, najpierw zważ 2,5-calowe łodzie wagowe. Zapisz wagę i oznacz dwie łodzie wagowe dla każdego zwierzęcia: jedną dla półkuli ipsilateralnej i jedną dla półkuli przeciwległej.
  2. Po zeskanowaniu skrawków poplamionych TTC, przetnij każdą sekcję jednorazową żyletką na półkule ipsilateralne i przeciwległe. Umieść półkule ipsilateralne ze wszystkich 7 sekcji w łodzi do ważenia i zapisz wagę. Powtórz dla półkuli przeciwległej.
  3. Natychmiast przenieś łódki obciążeniowe do piekarnika nastawionego na 56 °C na 48 godzin.
  4. Zważ wysuszone kawałki. Przenieś obie półkule do oddzielnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    1. Obliczyć ilość formamidu potrzebną na każdą półkulę (8 ml/g suchej tkanki) i dodać do odpowiednich probówek do mikrowirówek. Formamid jest wrażliwy na światło i od tego momentu wszystkie próbki poddane działaniu formamidu należy pokryć folią.
    2. Przenieść probówki do mikrowirówki do inkubatora ustawionego na 56 °C na kolejne 48 godzin.
  5. Po upływie 48 godzin odpipetować niebieski supernatant do innego zestawu oznakowanych probówek do mikrowirówek. Dociśnij tkankę do dna probówki, aby zmaksymalizować objętość wyekstrahowanego supernatantu. Przechowywać probówki z supernatantem i wyrzucić całą tkankę.
  6. Przygotować wykładnicze seryjne rozcieńczenia EB w formamidzie dla krzywej wzorcowej. Dodać 1 ślepą próbę (tylko formamid), a następnie 10 roztworów wykładniczych od 0,125 μg/ml do 64 μg/ml EB w formamidzie.
    1. Odpipetować 300 μl rozcieńczeń przygotowanych dla krzywej wzorcowej do płytki 96-dołkowej. Pobrać pipetą 300 μl supernatantu do odpowiednich studzienek.
    2. Zmierzyć absorbancję na spektrofotometrze przy długości fali 620 nm.
    3. Porównać krzywą wzorcową rozcieńczeń EB z absorbancją próbek supernatantu. Gęstość optyczna jest wprost proporcjonalna do integralności bariery krew-mózg.
    4. Przyjmij gęstość optyczną półkuli przeciwległej jako tło i użyj wzoru (ipsilateral-contralateral)/contralateral), aby określić zmianę fałdowania. Więcej informacji na temat analizy statystycznej można znaleźć w Martin et al., 2010. Rozdział 18

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W badaniu wzięło udział 25 samców myszy rasy Swiss Webster, które w momencie randomizacji do grupy RHP (n = 10) lub grupy 21% O2 (n = 15) miały 10 tygodni. Procedury chirurgiczne przeprowadzono dwa tygodnie po ostatniej ekspozycji na RHP, przy zastosowaniu metody ślepej próby oraz zrównoważeniem grup w poszczególnych dniach. Po tMCAo jedna mysz padła podczas rekonwalescencji pooperacyjnej, a jedna mysz została wykluczona z badania z powodu niespełnienia kryterium CBF dla reperfuzji. Obie wykluczone myszy należ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pojedyncza ekspozycja na niedotlenienie ogólnoustrojowe (tj. 2 godziny 11%O2) u myszy "przejściowo" chroni mózg przed tMCAo,29 co oznacza, że odpowiedź epigenetyczna na wyzwanie związane z kondycjonowaniem wstępnym jest krótkotrwała, a wyjściowy fenotyp zostaje przywrócony w ciągu kilku dni. Powtarzające się prezentacje bodźca kondycjonowania wstępnego hipoksyjnego dramatycznie wydłużają czas trwania fenotypu neuroprotekcyjnego. 6 Wiele badań wykazało, że częstotliwość, wielkość ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Specjalne podziękowania dla laboratorium Gidday za ich pracę nad opracowaniem protokołu RHP, a także dla Neuro-Models Facility (UTSW) za pomoc w operacjach tMCAo. Praca ta była wspierana przez granty z American Heart Association (AMS), The Haggerty Center for Brain Injury and Repair (UTSW; AMS) oraz Fundacja Badań nad Paraliżem Spatycznym Dystryktu Illinois-Eastern Iowa of Kiwanis International (JMG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przepływomierze, regulatoryVetEquip, IncZamówienie specjalistyczneCztery przepływomierze są przymocowane do elastycznej rurki PVC o średnicy 6,0 mm, która łączy się z portem wlotowym w każdej komorze indukcyjnej za pomocą plastikowego złącza żeńskiego. Te przepływomierze są przykręcone do metalowego pręta o wymiarach 6,5" x 1" x 1". Ten metalowy pręt jest przykręcony do manometru MI-246-P z wylotem DISS. Ten manometr i przepływomierz można przymocować do każdej nowej butli z gazem za pomocą klucza.
21% zbiornik O2zbiornik AirGasOX USP200
11% O2 tankAirGas Specjalne zamówienie
8% zbiornika O2 tank AirGasSpecjalistyczne zamówienie
15 L komory indukcyjneVetEquip941454
Moor Laber Dopper Flow Instrumenty wrzosowiskowe moorVMS-LDF1-HPSonda o średnicy 0,8 mm 
Oświetlacz o wysokiej intensywności NikonNI-150
z zoomem NIkonSMZ800Można stosować inne mikroskopy chirurgiczne. 
Kent Scientific Right Temperature CODAKent Scientific CorporationWycofane z produkcjiZalecanym zamiennikiem jest PhysioSuite z monitorowaniem temperatury RightTemp i kontrolą homeotermiczną (Kent Scientific, #PS-RT).
Inkubator HovabatorStromberg's2362-ENasz model to 2362N. 2362E to nowszy model i zawiera elektroniczny termostat.
V010 System anestezjologiczny VetEquip901807Zawiera: wysokociśnieniowy wąż tlenowy o długości dziesięciu stóp, ramę, przepływomierz, zespół spłukiwacza tlenowego, parownik, obwód oddechowy, komorę, noski, rurkę odprowadzającą gazy odlotowe i dwa filtry VapoGuard
250 ml izofluranu Butler ScheinNDC-11695
D-6 Vet Trim Akumulatorowa podkaszarka dla zwierząt Andis #23905Wymienne ostrza są dostępne w Andis (#23995)
Betadine Fisher Scientific19-898-867 
Q-tipsWielu sprzedawców Numer katalogowy niedostępny 
Płatki z gazyFisher Scientific67622
Serweta chirurgicznaFisher ScientificGM300 
Szwy jedwabne Look/Div Specjalizacje ChirurgiczneSP115
Nici nylonoweLook/Div Specjalizacje ChirurgiczneSP185
Kleszcze Durmont #5 (2) Narzędzia naukowe 11251-35Kąt 45°
Nożyczki chirurgiczneNarzędzia do nauki pięknej 14028-10
3 mm VannasKent Scientific CorporationINS600177Ostrze proste
Hartman Hemostats Fine Scientific Tools13002-10
Zamykanie filamentówZamówienie specjalistyczneUniwersytetu WaszyngtońskiegoFilamenty są powlekane silikonem na Uniwersytecie Waszyngtońskim i dostarczane do obiektów UTSW za opłatą.
Evans BlueSigma AldritchE2129-10G
 Sigma AldritchWHA1001150150 mm, koła, Grade 1 
Łodzie wagoweFisher Scientific02-202-101Średnica 2,5 cala
0,9% Wtrysk chlorku sodu USP Baxter Pharmaceutics 2B1321
Strzykawka insulinowa 0,3 cc z igłą o rozmiarze 29 BectonDickinson Labware309301
Ogranicznik z płaskim dnem Braintree Naukowe FB  MŚrednica 2,0"
TTCSigmaT8877
10x PBS, pH 7,4Fisher ScientificBP399-20
Łaźnia wodnaWielu sprzedawców Numer katalogowy niedostępny Rurki scyntylacyjne z TTC mogą być ręcznie trzymane pod bieżącą ciepłą wodą jako alternatywa dla kąpieli wodnej.
Płyta styropianowaWielu sprzedawców Numer katalogowy niedostępny 
Duży zestaw strzykawekPumpSystems IncP-SYRKIT-LG
Pompa perfuzyjnaPumpSystems IncNE-300 
Strzykawka 60 ccFisher ScientificNC9203256
27 zestaw do infuzji ze skrzydłamiKawasumi Laboratories, IncD3K1-25G 1
fiolka scyntylacyjna o pojemności 20 mlFisher Scientific50-367-126
Szpatułka ze stali nierdzewnejFisher Scientific14-373-25A
Alto akrylowy 1,0 mm mózg myszy, koronalnyCellPoint Naukowe Numer katalogowy niedostępny 
Ostrza ze stali nierdzewnej 0,21 mm, 25 pkCellPoint Scientific Numer katalogowy niedostępny Ostrza kriostatu wielokrotnego użytku to niedroga alternatywa.
4% paraformaldehydSanta Cruz Biotechnologia SC-281692
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Fisher Scientific12-550-15
HP Scanjet G4050Wielu sprzedawców Numer katalogowy niedostępny Inne komercyjne skanery są odpowiednie do tego kroku w protokole.
Obraz J katalogowy Narodowego Instytutu Zdrowianiedostępny 
Waga analitycznaMETTLER TOLEDO precyzyjny XSE 205U
   Thermo Scientific 
Probówki do mikrowirówek 1,7 ml (Eppendorfs)Denville Scientific C2170
FormamidFisher ScientificBP228-100
96-dołkowe płytkiFisher Scientific07-200-9
Epokowy spektrofotometr mikropłytkowy BioTek Numer katalogowy niedostępny 
Mikroskop stereoskopowy Bibuła filtracyjna Numer Kompaktowy piekarnik PR305225M

Bibliografia

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
  3. Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
  4. Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
  5. Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
  6. Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
  7. Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22(2014).
  8. Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  9. Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
  10. Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
  11. Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561(2013).
  12. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  13. Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
  14. Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
  15. Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
  16. Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
  17. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
  18. Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
  19. Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
  20. Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
  21. Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019(2012).
  22. Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
  23. Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
  24. Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
  25. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
  26. Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7(2004).
  27. Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
  28. Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517(2010).
  29. Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
  30. Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
  31. Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065(2013).
  32. Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
  33. Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
  34. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
  35. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  36. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
  37. Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
  38. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
  39. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
  40. Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
  41. Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
  42. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  43. Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
  44. Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
  45. Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
  46. Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
  47. Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
  48. Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
  49. Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie obj to ci zawa uprzerwanie bariery krew m zgtest z b kitem Evansabarwienie TTCmysi model udaruprotok ekspozycji na hipoksjpodw jna metoda ilo ciowego oznaczania

Powiązane artykuły