Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52685

⸱

17 kwietnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Faculty of Medicine, The University of British Columbia, 2Coastal Genomics, 3British Columbia Public Health Microbiology and Reference Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Streszczenie

Sekwencjonowanie próbek środowiskowych nowej generacji może być wyzwaniem ze względu na zmienną ilość i jakość DNA w tych próbkach. Do uzyskania optymalnych wyników sekwencjonowania nowej generacji potrzebne są wysokiej jakości biblioteki DNA. Próbki środowiskowe, takie jak woda, mogą mieć niską jakość i ilość DNA, a także zanieczyszczenia, które współwytrącają się z DNA. Procesy mechaniczne i enzymatyczne związane z ekstrakcją i przygotowaniem biblioteki mogą dodatkowo uszkodzić DNA. Wybór wielkości żelu umożliwia oczyszczanie i odzyskiwanie fragmentów DNA o określonej wielkości do zastosowań sekwencjonowania. Niemniej jednak zadanie to jest jednym z najbardziej czasochłonnych etapów w procesie przygotowania biblioteki DNA. Opisany tutaj protokół umożliwia pełną automatyzację ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA.

W tym badaniu opisujemy wysokoprzepustowe podejście do przygotowania wysokiej jakości bibliotek DNA z próbek słodkowodnych, które mogą być również zastosowane do innych próbek środowiskowych. Zastosowaliśmy podejście pośrednie do koncentracji komórek bakteryjnych z próbek słodkiej wody środowiskowej; DNA wyekstrahowano przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA, a biblioteki DNA przygotowano przy użyciu komercyjnego protokołu opartego na transpozonach. Fragmenty DNA o wielkości od 500 do 800 pz zostały wyselekcjonowane przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej do elektroforezy Ranger Technology. Sekwencjonowanie bibliotek DNA o wybranej wielkości wykazało znaczną poprawę długości odczytu i jakości odczytów sekwencjonowania.

Wprowadzenie

Metagenomika polega na sekwencjonowaniu całego materiału genetycznego w próbce w celu scharakteryzowania obecnych społeczności mikroorganizmów. Jest to złożony i kosztowny proces, który obejmuje konwersję wyekstrahowanych kwasów nukleinowych do bibliotek DNA, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji. Wysokiej jakości biblioteki są niezbędne do uzyskania maksymalnych danych wyjściowych i dokładnej analizy metagenomicznej. Próbki środowiskowe, takie jak próbki wody, często stanowią poważne wyzwanie dla generowania wysokiej jakości bibliotek ze względu na małe ilości DNA, które mogą również ulec degradacji1-3 oraz obecność inhibitorów PCR4-6.

Biblioteki wysokiej jakości idealnie składają się z dłuższych segmentów DNA w wąskim zakresie długości. Aby zmaksymalizować ilość użytecznych danych generowanych w każdym cyklu sekwencjonowania, długość DNA w bibliotece powinna być co najmniej tak długa, jak maksymalna długość odczytu stosowanej metody sekwencjonowania. W przypadku korzystania z technologii sekwencjonowania przez syntezę, takiej jak Illumina MiSeq, rozmiar fragmentów DNA wpływa na wydajność, z jaką klastry są generowane w komórce przepływowej. Na przykład, gdy biblioteka zawiera zarówno krótsze, jak i dłuższe fragmenty DNA, krótsze będą nadreprezentowane w danych sekwencjonowania7,8. Natomiast biblioteka z fragmentami DNA o podobnej wielkości będzie proporcjonalnie reprezentowana w danych sekwencjonowania. Wiele zestawów do przygotowania bibliotek wykorzystuje metody oparte na ligacji do dodawania adapterów do fragmentów DNA, a wybór rozmiaru jest konieczny do usunięcia dimerów adapterów, które nie zawierają insertu9,10. Istnieje wiele metod11,12, aby to osiągnąć, ale jedną techniką, która daje najbardziej spójne wyniki, jest elektroforetyczne rozdzielanie DNA, a następnie odzyskiwanie pożądanych długości DNA13,14. Proces ten można przeprowadzić ręcznie dla niewielkiej liczby próbek, ale w przypadku przetwarzania setek próbek wymagane są zautomatyzowane rozwiązania. Obecnie dostępne platformy do automatycznego wyboru wielkości żelu charakteryzują się niską przepustowością i potrzebne są nowe platformy do przetwarzania dużej liczby próbek do sekwencjonowania. Technologię Ranger można zintegrować z istniejącymi stacjami roboczymi do obsługi cieczy, aby umożliwić wykorzystanie elektroforezy w żelu agarozowym do doboru wielkości i celów analitycznych na skalę, która spełnia dzisiejsze środowisko o wysokiej przepustowości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Gromadzenie i filtracja wody

  1. Zbierz próbki słodkiej wody z różnych miejsc (rysunek 1). Przepuszczaj próbki przez szereg filtrów: filtr 1 μm, filtr 0,2 μm i filtr o odciętym przepływie stycznym 30 kDa, aby systematycznie oddzielać cząstki o rozmiarach odpowiednio eukariotycznych, bakteryjnych i wirusowych.
    Uwaga: W niniejszym raporcie opisano jedynie oczyszczanie i analizę materiału odzyskanego z filtrów 0,2 μm (bakterie wolno żyjące), ale podobne podejścia można zastosować w odniesieniu do innych cząstek odzyskanych z filtrów.

2. Koncentracja bakterii, ekstrakcja i oczyszczanie DNA

  1. Wyjmij filtr(y) membranowy(e) 0.2 μm z systemu filtracji wody (schemat ideowy, rysunek 2). Złóż filtr krążkowy 0,2 μm na pół i umieść go w probówce o pojemności 50 ml otwartą stroną do góry. Dodać 5 ml 1x buforowanego roztworu fosforanowego (PBS) i 0,01% Tween, pH 7,4 do probówki. Jeśli podczas procesu używany jest więcej niż jeden filtr, należy użyć innej rurki na filtr. Probówkę (probówki) z filtrem przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia. W przeciwnym razie przejdź do kroku 2.2.
  2. Wyjmij filtr membranowy 0,2 μm z probówki o pojemności 50 ml za pomocą sterylnych kleszczyków. Umieść filtr(y) na szalce Petriego (pozostaw bufor PBS w probówce).
    1. Za pomocą sterylnych kleszczyków i sterylnych nożyczek pokrój filtr na małe paski (1 cm x 1 cm). Zdezynfekuj kleszcze i nożyczki, mocząc je w 70% izopropanolu, przecierając środkiem odkażającym powierzchnię DNA i spłukując ultraczystą wodą typu 1 między różnymi próbkami.
  3. Umieść filtr pokrojony w paski z powrotem w tej samej probówce o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml 1x PBS i 0,01% Tween, pH 7,4 do filtra, tak aby w probówce o pojemności 50 ml znajdowało się łącznie 15 ml buforu.
  4. Dodaj 6 czystych kulek wolframowych (o średnicy 3 mm) do każdej probówki o pojemności 50 ml, przykryj probówkę Parafilmem i energicznie wiruj przez 20 minut (użyj adaptera wirowego do probówek o pojemności 50 ml). Jeżeli z jednej próbki przetwarzanych jest wiele filtrów, przenieść i zebrać cały homogenat w czystej probówce o pojemności 50 ml. Odwirować probówki o sile 3 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zawiesić osad i podwielokrotne komórki bakteryjne (~1 ml podwielokrotności) w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Należy pamiętać, że w każdej próbce będzie 5 probówek do mikrowirówek.
  6. Wirować probówki do mikrowirówek o masie 10 000 x g przez 10 minut i usunąć większość supernatantu do oznaczenia ~200 μl.
  7. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub przystąpić do ekstrakcji bakteryjnego DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do izolacji DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Podczas ekstrakcji DNA bakteryjnego należy użyć PBS lub wody jako negatywnej kontroli ekstrakcji oraz E. coli jako pozytywnej kontroli ekstrakcji.
  8. Ponieważ ekstrakcja DNA z wielu probówek polega na zebraniu równoległych podwielokrotności z tej samej próbki w jednej probówce o pojemności 2 ml. Następnie przeprowadzić wytrącanie O/N przy użyciu roztworu składającego się z 0,1 objętości 3 M octanu sodu, 2 objętości 100% etanolu i 5 μl liniowego akrylamidu 5 μg/μl. Dobrze wymieszać i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.
  9. Wirować z maksymalną prędkością (17 000 x g) przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć osad 1 ml lodowatego 70% etanolu, wysuszyć na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego nie dłużej niż 5 minut i ponownie zawiesić osad DNA w 34 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5,
    Uwaga: Liniowy akrylamid pomoże uwidocznić osad DNA po wytrąceniu O/N.
  10. Oznaczyć ilość i jakość DNA, używając odpowiednio fluorescencyjnego testu ilościowego kwasów nukleinowych o wysokiej czułości i spektrofotometru mikroobjętościowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
    Uwaga: Jeśli w tym czasie przygotowywanych jest wiele próbek, można zamiast tego użyć ultraczułego fluorescencyjnego testu kwasów nukleinowych do ilościowego oznaczania dsDNA i fluorometru/spektrofotometru na płytce.

3. Przygotowanie biblioteki DNA

  1. Normalizować genomowe DNA bakteryjne wyekstrahowane z próbek wody do stężenia ~0,2 ng/μl.
  2. Enzymatycznie rozdrobnić jeden nanogram bakteryjnego DNA za pomocą metody opartej na transpozonach (tagmentacja). Dodaj sekwencje adaptera i indeksu do rozdrobnionego DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Oznaczone próbki należy poddać 12 cyklom PCR, jak wskazano w instrukcjach producenta, w którym to momencie włącza się wskaźniki sekwencjonowania.

4. Automatyczny wybór rozmiaru żelu

  1. Pomiń standardowy etap czyszczenia po PCR opisany w instrukcjach producenta (patrz tabela materiałów). Wybieraj rozmiar próbek po PCR bezpośrednio za pomocą zautomatyzowanej platformy doboru rozmiaru na bazie żelu.
    1. Do każdej próbki dodać 3,5 μl buforu ładującego.
    2. Postępując zgodnie z protokołem producenta, załaduj próbki na stację roboczą do elektroforezy, określając docelową wielkość 500-800 pz, w objętości ekstrakcji 300 μl, przy użyciu wstępnie odlanej kasety z 1,5% agarozy.
    3. Zagęścić surowiec wyjściowy (300 μl) do 25 μl poprzez wytrącanie etanolu.
      Uwaga: Alternatywnie można użyć stacji roboczej do elektroforezy, aby zautomatyzować zatężanie większej liczby próbek za pomocą płyty filtracyjnej i kolektora próżniowego.
      1. Wytrącić surową objętość elucji, stosując 0,1 objętości 3 M octanu sodu, 2 objętości 100% etanolu i 5 μl liniowego akryloamidu 5 μg/μl. Dobrze wymieszać, umieścić próbki w temperaturze -80 °C O/N. Próbki odwirować w temperaturze 17 000 x g przez 30 minut.
      2. Odrzucić supernatanty i przystąpić do przemywania osadu DNA 1 ml lodowatego 70% etanolu.
      3. Ponownie odwirować próbki przy 17 000 x g przez 30 minut, wyrzucić supernatanty, wysuszyć na powietrzu, a na koniec ponownie zawiesić osad DNA w 25 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5.
  2. (Opcjonalnie) Użyj 1 μl biblioteki DNA o wielkości wybranej za pomocą automatycznej platformy wyboru wielkości żelu, aby wykonać pięciokrotne rozcieńczenie przy użyciu roztworu buforowego Tris-EDTA o pH 8,0. Analizuj biblioteki za pomocą przyrządu do elektroforezy kapilarnej na bazie chipa, aby analizować jakość dsDNA zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Normalizacja i sekwencjonowanie bibliotek

  1. Przejdź do normalizacji próbek za pomocą koralików normalizacyjnych biblioteki (zawartych w zestawie do przygotowywania biblioteki opartej na transpozonach) zgodnie z opisem w przewodniku przygotowawczym producenta.
    1. Alternatywnie, zmierz biblioteki dsDNA za pomocą fluorescencyjnego testu ilościowego kwasów nukleinowych o wysokiej czułości, a następnie połącz je w proporcjach równomolowych, aby osiągnąć końcowe stężenie dsDNA 2 nM. Przystąpić do denaturacji bibliotek przy użyciu 10 μl bibliotek zbiorczych i 10 μl 0,2 N NaOH, inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć zdenaturowane biblioteki za pomocą buforu hybrydyzacyjnego (dołączonego do zestawu do przygotowywania na bazie transpozonów) do końcowej objętości 1 ml i stężenia 11,5 pM.
  2. Załaduj próbki do platformy sekwencjonowania nowej generacji, postępując zgodnie ze standardowymi protokołami sekwencjonowania producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena stężenia i jakości DNA

Stężenia bakteryjnego DNA w próbkach wody z różnych obszarów zlewni wahały się od 0,01 do 0,11 ng/ml (Tabela 1). DNA wyizolowane z frakcji bakteryjnej wykazywało stosunki A260/280 i A260/230 odpowiednio od 1,4 do 1,8 oraz od 0,3 do 1,6. Mimo że niektóre wartości stosunku A260/230 były stosunkowo niskie, nie zaobserwowano wyraźnego hamowania w przygotowanej bibliotece ani w innych późniejszych zastos...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecność dimerów adapterowych i grupowanie małych rozmiarów wkładek, które są preferencyjnie sekwencjonowane w obecnych platformach, oznacza spadek użytecznej wydajności i niedostateczne wykorzystanie pojemności sprzętu15. Zastosowanie metod bicia koralików w połączeniu z podejściem opartym na transpozonach do przygotowania bibliotek może skutkować większym ścinaniem DNA w porównaniu z innymi metodami ekstrakcji4,5. Niemniej jednak wszystkie metody ekstrakcji i przygotowania biblioteki potencjalnie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Jared R. Slobodan i Matthew J. Nesbitt posiadają udziały w Coastal Genomics, prywatnej korporacji z Kolumbii Brytyjskiej oferującej technologię Ranger.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Genome BC, Genome Canada i Coastal Genomics. Autorzy dziękują Kirby'emu Croninowi i Michaelowi Chanowi za pomoc w zbieraniu i przetwarzaniu próbek. Chcielibyśmy również podziękować Thei Van Rossum i dr Fionie Brinkman za pomoc w zakresie bioinformatyki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa perystaltyczna Masterflex P/S 1400 SeriesThermo Scientific 1400-1620
0,2 i mikro; m Membrana Supor VWRCA28143-969Pall Corporation, Ann Harbor, MI
Koraliki z węglika wolframu 3 mm (200)Qiagen69997
Alkohol izopropylowy 70%Jedmon Produkty825751Healthcare Plus
DNA awayVWR7010Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA
System oczyszczania wody Milli-QFisher ScientificZMQS6VF0YMerck Millipore. Ten system został wycofany z produkcji.
20x PBS pH 7,5VWRE703-1LAmresco, Inc., Solon, OH
Tween 20Fisher ScientificBP337-100Fisher chemicals
Adapter wirowy dla 2 (50  ml) rurkiVWR13000-V1-50MoBio, Karlowe Wary, CA
Vortex-Genie 2, 120  V (model G560)VWRSI-0236Scientific Industries, Inc.
Wirówka BeckmanRaeyco Lab Equipment Systems Management LtdModel J-6B
Zestaw do izolacji DNA PowerLyzer PowersoilVWR12855-100MoBio, Karlowe Wary, CA
Adapter Vortex do probówek 24 (1,5-2 ml)VWR13000-V1-24MoBio, Karlowe Wary, CA
Wirówka Microfuge 18Beckman Coulter367160
Stacja robocza Nimbus Select z Ranger TechnologyHamilton Robotics92720-01Zawiera stację roboczą do obsługi cieczy i zintegrowany zestaw odczynników Ranger Tech (sprzęt do elektroforezy)
CoastalGenomicsCG-10600-150-12-21Zawiera bufor załadowczy i kasety
Alkohol etylowy (bezwodny)Alkohole komercyjneP016EAANGreenfield Etanol
Octan soduSigma-AldrichS2889-250G
Akrylamid liniowy (5  mg / ml)Life TechnologiesAM9520
Wirówka z chłodzeniem Ambion EppendorfRaeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.5417R
Bufor EB (250 ml)Qiagen19086
NanoDrop 1000 SpektrofotometrThermo ScientificND-1000
Qubit FluorometrLife TechnologiesQ32857Invitrogen. Ten produkt został wycofany z produkcji.
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSLife TechnologiesQ32854Invitrogen
Odczynnik DNA o wysokiej czułościAgilent Technologies5067-4626
Chipy DNA o wysokiej czułościAgilent Technologies5067-4626
Bioanalizator Agilent 2011Agilent TechnologiesG2938B
Zestaw do przygotowania próbek DNA Nextera XTIlluminaFC-131-1024
Zestaw indeksów Nextera XTIlluminaFC-131-1001
Zestaw odczynników MiSeq v2 (500 cykli)IlluminaMS-102-2003
System MiseqIlluminaSY-410-1003

Bibliografia

  1. Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
  2. Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
  3. Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
  4. Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
  5. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
  6. Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
  7. Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320(2013).
  8. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18(2011).
  9. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18(2009).
  10. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
  11. Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
  12. Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
  15. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
  16. Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
  17. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
  18. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
  19. Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. , (2014).
  20. Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przygotowanie biblioteki DNAtechnologia Rangerstacja robocza do elektroforezyekstrakcja bakteryjnego DNAselekcja wielko ci 500 800 bpprzetwarzanie wysokoprzepustoweanaliza spo eczno ci mikrobiologicznych

Powiązane artykuły