Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Podsumowanie

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Streszczenie

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest ogólnie uważana za kluczową cechę nowotworów złośliwych (w przeciwieństwie do łagodnych). W szczególności w przypadku niektórych nowotworów (np. guzów mózgu, takich jak glejak wielopostaciowy i rak płaskonabłonkowy głowy i szyi – SCCHN) jest przyczyną ciężkiej chorobowości i może zagrażać życiu nawet przy braku odległych przerzutów. Ponadto nowotwory, u których nastąpił nawrót choroby po leczeniu, niestety często mają bardziej agresywny fenotyp. W związku z tym istnieje możliwość ukierunkowania procesu inwazji w celu zapewnienia nowatorskich terapii, które mogłyby być komplementarne ze standardowymi środkami antyproliferacyjnymi. Do tej pory strategia ta była utrudniona ze względu na brak solidnych, powtarzalnych testów odpowiednich do szczegółowej analizy inwazji i badań przesiewowych leków. Tutaj udostępniamy prostą metodę mikropłytek (opartą na jednolitych, samoorganizujących się sferoidach nowotworowych 3D), która ma ogromny potencjał dla takich badań. Ilustrujemy platformę testową wykorzystującą ludzką linię komórkową glejaka, a także model SCCHN, w którym rozwój oporności na inhibitory receptora docelowego naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) wiąże się ze zwiększonym potencjałem inwazyjnym macierzy. Oferujemy również dwie alternatywne metody półautomatycznej kwantyfikacji: jedną z wykorzystaniem cytometru obrazującego i drugą, która wymaga po prostu standardowej mikroskopii i przechwytywania obrazu z cyfrową analizą obrazu.

Wprowadzenie

Klasyczny rozwój leków przeciwnowotworowych jest głównie skoncentrowany na wykorzystaniu testów in vitro opartych na komórkach do wykrywania czynników cytotoksycznych, które hamują proliferację komórek nowotworowych i/lub promują programowaną śmierć komórki (apoptozę). Ostatnio wysiłki przeniosły się na terapie celowane wraz z opracowaniem inhibitorów molekularnych przyczyn leżących u podstaw proliferacji komórek nowotworowych. Pomimo spektakularnych wyników, takie środki często wiążą się z szybkim rozwojem lekooporności. Biorąc pod uwagę, że to właśnie potencjał inwazyjny i przerzutowy komórek nowotworowych jest odpowiedzialny za większość zgonów z powodu raka, a nawrót choroby często ma bardziej agresywny fenotyp, logiczne jest również rozważenie komplementarnych modeli eksperymentalnych in vitro ^1,2 w celu zidentyfikowania nowych czynników, które będą hamować te dodatkowe kluczowe "cechy charakterystyczne" raka.

Podczas progresji nowotworu, komórki nowotworowe nabywają zdolność do atakowania otaczającej tkanki i/lub rozprzestrzeniania się na odległe narządy (przerzuty). Komórki nowotworowe przenikają przez błonę podstawną poprzez tworzenie inwadopodiów^3,4. Struktury te są wzbogacone o filamenty aktynowe, specyficzne białka adhezyjne i proteinazy i są wspólnie odpowiedzialne za ruchliwość komórek nowotworowych i degradację macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)⁵. Inwadopodia rozciągają się do ECM i uważa się, że są ważne dla inwazji komórek nowotworowych, a także wynaczynienia do kanałów naczyniowych, ułatwiając rozsiewanie krwiopochodne (lub limfatyczne) i przerzuty.

Obecne standardowe metody oceny inwazji komórek nowotworowych in vitro obejmują następujące. Testy w komorze Transwella lub w komorze Boydena^2,6, w których zawiesiny pojedynczych komórek są wysiewane na wierzchu filtra pokrytego grubą warstwą białek pochodzących z ECM. Komórki następnie atakują i przemieszczają się do dolnej komory w odpowiedzi na chemoatraktant. Powszechnie stosowanymi białkami ECM są kolagen typu I lub macierz przypominająca błonę podstawną (BMM, np. Matrigel, pochodząca z guza EHS⁷), która naśladuje naturalny skład błon podstawnych.

Jako alternatywa dla testów typu komora Boydena opartych na filtrze⁸, komórki mogą być wysiewane na wierzchu żelu ECM (do którego mogą być dodawane fibroblasty), gdzie tworzą monowarstwę, a następnie indywidualnie lub zbiorowo intrują w żelu. Inwazję można zmierzyć pod względem liczby atakujących komórek i/lub odległości przebytej od powierzchni żelu⁹. Komórki nowotworowe mogą być również całkowicie osadzone w macierzy, albo jako zawiesina pojedynczej komórki, albo jako sferoidy - zwykle umieszczone między dwiema warstwami żelu ECM - umożliwiając komórkom inwazję z masy guza do otaczającej macierzy^2,6,10,11.

Opisany tutaj trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza zapewnia szybki, zautomatyzowany system inwazji przy użyciu wysoce powtarzalnej, ustandaryzowanej metody¹² w formacie płytki 96-dołkowej z jedną sferoidą na studzienkę. BMM jest dodawany bezpośrednio do każdej studzienki, aby zapewnić półstałą matrycę, do której komórki nowotworowe atakują z ciała sferoidalnego. Stopień inwazji komórek nowotworowych jest monitorowany w odstępach czasu przez okres 72 - 96 godzin. Metoda ta zapewnia następujące zalety w porównaniu z obecnymi testami inwazji in vitro, o których mowa powyżej: komórki nowotworowe są zorganizowane w strukturę 3D naśladującą mikroregion guza lub mikroprzerzuty; sferoidy guza są wysoce powtarzalne pod względem wielkości; Test inwazji przeprowadza się in situ na tej samej płytce, na której rozwija się sferoid guza, bez konieczności przenoszenia ich na płytki wtórne; Metoda, w połączeniu z najnowszymi technologiami automatycznej analizy obrazu, umożliwia zarówno wysokotreściowe, jak i wysokoprzepustowe analizy inwazji komórek nowotworowych.

Analiza obrazu jest wykonywana za pomocą cytometru obrazowego, który skanuje 96-dołkową płytkę w ciągu 10 minut. Korzystając z aplikacji konfluencji, zakres i szybkość inwazji osiągniętej zarówno przez pojedyncze komórki, jak i przez klastry komórek rozprzestrzeniające się ze sferoid guza i wnikające do macierzy, można zmierzyć w sposób dynamiczny. W celu uzyskania mniejszej przepustowości przedstawiono alternatywną metodę analizy obrazu, opartą na wykorzystaniu mikroskopu odwróconego i standardowego oprogramowania do obrazowania.

Protokół

1. Generowanie sferoid guza o powtarzalnej wielkości

1. Przemyć monowarstwy komórek nowotworowych solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS; 5 ml dla kolby o średnicy 25 cm2 lub 8 - 10 ml dla kolby o średnicy 75^cm2), dodać enzym dysocjujący komórki (1 ml dla kolby o średnicy 25 cm lub 2 ml dla kolby o średnicy 75^cm2) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 - 5 minut.
2. Sprawdzić oderwanie komórek pod mikroskopem i zneutralizować enzym dysocjujący komórki za pomocą kompletnej pożywki wzrostowej (5 ml dla kolby o średnicy 25 cm² lub 8 ml dla kolby o średnicy 75 cm²).
3. Zawiesina komórek wirówki przy 500 x g przez 5 min.
4. Usunąć supernatant, postukać w probówkę i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej za pomocą pipety P1000. Powinno to dać zawiesinę pojedynczej komórki bez skupisk komórek.
5. Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz zawiesinę komórek, aby uzyskać 0,5 - 2 x 10⁴ komórek/ml (optymalna gęstość komórek musi być określona dla każdej linii komórkowej w celu uzyskania sferoid guza o średnicy 300 - 500 μm 4 dni po wysiewie komórek^12,13).
6. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i za pomocą pipety wielokanałowej dozować 200 μl/studzienkę do 96-dołkowych płytek o okrągłym dnie¹² z bardzo niskim mocowaniem (ULA).
7. Przenieść płytki do inkubatora (37 °C, 5% CO₂, 95% wilgotności). Cztery dni później wizualnie potwierdź tworzenie sferoidów guza i przystąp do testu inwazji 3D.

2. 3D Test inwazji sferoidów nowotworowych

1. Rozmrozić BMM na lodzie.
2. Zestaw sterylnych końcówek filtrujących do pipet i sterylnych probówek P10, P200 i P1000 (o objętości 1,5 ml lub większej, w zależności od wymaganej całkowitej objętości) należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Umieścić na lodzie 96-dołkowe płytki ULA zawierające 4-dniowe sferoidy.
4. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie usunąć 100 μl/studzienkę podłoża wzrostowego z płytek sferoidalnych. W przypadku tego kroku należy ustawić końcówki pod kątem w kierunku wewnętrznej ściany studzienek z dnem w kształcie litery U, unikając kontaktu z dnem studni i położeniem sferoid; zminimalizować zakłócenia sferoidów.
5. Za pomocą lodowatych końcówek przenieś BMM do lodowatych rur. W przypadku inwazji wywołanej cytokinami lub w badaniach oceny leków, dodaj odczynniki (o stężeniu 2x końcowym) do BMM za pomocą lodowatych końcówek. Na przykład użyj naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), aby stymulować inwazję komórek raka płaskonabłonkowego CAL^S i^{CAL R}. Dobrze wymieszaj, delikatnie obracając, unikając tworzenia się pęcherzyków.
6. Delikatnie dozuj 100 μl BMM do studzienki w kształcie litery U, kierując końcówkę w stronę wewnętrznej ścianki studzienki. Ten krok jest najbardziej krytyczny, ponieważ, aby zapewnić optymalną analizę obrazu, sferoidy muszą pozostać w środku studzienki¹².
7. Powtórz krok 2.6 dla wszystkich wymaganych studzienek, pozwalając na 5-6 powtórzeń/warunek. W razie potrzeby zmień końcówkę na świeżo schłodzoną.
   UWAGA: Jeśli masz większe doświadczenie, dozuj BMM za pomocą pipety wielokanałowej.
8. Za pomocą sterylnej igły usuń pęcherzyki, jeśli są obecne.
   1. Za pomocą mikroskopu sprawdź wzrokowo, czy sferoidy znajdują się w centralnym położeniu. W przeciwnym razie należy odwirować płytkę o masie 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Zapewni to, że sferoidy będą umieszczone centralnie w każdej studni.
9. Przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i pozostawić BMM do zestalenia się.
10. 1 godzinę później, za pomocą pipety wielokanałowej, delikatnie dodaj 100 μl/studzienkę kompletnego podłoża wzrostowego. W przypadku badań inwazji wywołanej cytokinami lub oceny leku, należy uwzględnić cytokiny lub inhibitory w pożywce (1x stężenie końcowe). Alternatywnie, jeśli odczynniki nie zostały dodane do BMM w kroku 2.5, dodaj je do pożywki w tym momencie (3x pożądane stężenie końcowe).

3. Automatyczne pozyskiwanie obrazów

1. Skanuj płytki na cytometrze (specyfikacje znajdują się w Tabeli sprzętu i materiałów) w odstępach czasu, zaczynając od czasu zerowego (t0 = dzień przygotowania testu inwazji, bezpośrednio po kroku 2.10 do 72 godzin lub 96 godzin dla wolniej atakujących linii komórek nowotworowych.
2. Wybierz aplikację "Confluence".
3. Sprawdź, czy sferoida jest ostra i, jeśli to konieczne, wyreguluj ręcznie i napraw "Przesunięcie ostrości".
4. W sekcji "Ustawienia próbkowania" wybierz, aby zeskanować jedno centralne pole widzenia (FOV). Po dodaniu BMM sferoidy guza powinny pozostać w pozycji centralnej, dlatego nie ma potrzeby skanowania całej studni.
5. W oprogramowaniu zdefiniuj studnie, które mają zostać zeskanowane, zaznaczając je na mapie płyty. Kliknij "Rozpocznij skanowanie".
   UWAGA: Skan jest zapisywany automatycznie i można go później przejrzeć w trybie offline.

4. Automatyczna analiza obrazu

1. Wybierz aplikację "Confluence".
2. W zakładce "Analiza" dostosuj ustawienia aplikacji (np. "precyzja": niska, normalna, wysoka; "próg intensywności": 1 - 15), aby uzyskać precyzyjną segmentację wokół sferoidy, w tym procesy komórkowe i inwadopodia rozciągające się do BMM (patrz rysunek 1). Dostosuj ustawienia dla każdej linii komórek nowotworowych i/lub w różnych punktach czasowych. Aplikacja "Confluence" mierzy % powierzchni studzienki pokrytej przez atakujące komórki, w wybranym polu widzenia.
3. Sprawdź, czy ustawienia analizy są odpowiednie (tj. segmentacja jest dokładna) dla innych sferoid na płycie, klikając kilka różnych dołków. Jeśli segmentacja nie wyznacza dokładnie sferoidy, dostosuj ustawienia aplikacji dalej.
4. Kliknij "Rozpocznij analizę".
5. W zakładce "Wyniki" sprawdź wiele dołków, aby zweryfikować jakość analizy. Eksportuj "Dane na poziomie studni" do programu arkusza kalkulacyjnego.
6. Powtórz analizę dla wszystkich punktów czasowych. Oblicz średnią % konfluencji dla zduplikowanych odwiertów i inwazji wykresu (% konfluencji) w funkcji czasu na wykresie słupkowym, korzystając z wybranych wykresów naukowych i oprogramowania statystycznego.

5. Ręczne pozyskiwanie obrazów

1. Rejestruj obraz dla każdej sferoidy guza w odstępach od t = 0 do 72 - 96 godzin, w zależności od prędkości inwazji danej linii komórkowej, za pomocą mikroskopu odwróconego (w przypadku płytki 96-dołkowej zajmuje to około 20 - 30 minut). Użyj obiektywu 10X. Użyj obiektywu 4X, gdy zaatakowany obszar jest zbyt duży, aby można go było całkowicie uchwycić w polu widzenia 10X.
2. Zapisz każdy uzyskany obraz z osobna.
3. W celu kalibracji zrób zdjęcia siatki stolika (1 mm) przy użyciu obiektywów 10X i 4X (i zapisz obrazy).

6. Ręczna analiza obrazu

1. Otwórz obrazy siatki stołu montażowego w wybranym oprogramowaniu do analizy obrazu.
2. Wprowadź pomiary siatki, jednostki (μm), używane obiektywy (10X lub 4X) i przeprowadź kalibrację. Ten krok jest wymagany tylko raz. W celu późniejszej analizy obrazu wystarczy ponownie załadować wymagane ustawienia kalibracji.
3. Otwórz obrazy testu inwazji i wybierz ustawienia kalibracji w zależności od obiektywu mikroskopu (10X lub 4X) użytego do uzyskania obrazów.
   1. Alternatywnie można zaimportować obrazy uzyskane za pomocą cytometru obrazowego (krok 3) i przeanalizować je ręcznie, zgodnie z opisem dla obrazów uzyskanych przy użyciu mikroskopu odwróconego (patrz wyniki pokazane na rysunku 3 i rysunku 4).
4. Zmierz obszar pokryty sferoidami.
   1. W oprogramowaniu używanym tutaj do reprezentatywnych wyników (specyfikacje znajdują się w tabeli wyposażenia i materiałów) przejdź do "Pomiaru" i wybierz "Liczba/rozmiar". Wybierz "Plik", a następnie "Załaduj ustawienia" i wybierz wstępnie określone ustawienia testu. Następnie wybierz opcję "Policz". Sferoida powinna być następnie dokładnie podzielona na segmenty.
   2. Możesz też przejść do "Edytuj", a następnie "Rysuj/Scalaj obiekty", aby otworzyć okno "Magiczna różdżka/Śledź". Użyj kursora różdżki, aby kliknąć obraz sferoidalny i uzyskać segmentację. Wybierz "Śledź" (w oknie "Magiczna różdżka"), aby ręcznie obrysować sferoidę za pomocą myszy.
5. Eksport pomiarów o różnych parametrach (powierzchnia, średnica, obwód itp.) do arkusza kalkulacyjnego. Zapisz w arkuszu kalkulacyjnym odpowiednie informacje o obrazie (np. numer studni, względny punkt czasowy).
6. Wykreśl średnią powierzchnię replikowanych sferoid (inwazji) w funkcji czasu, korzystając z wykresów naukowych i oprogramowania statystycznego. Alternatywnie, oblicz zmianę obszaru sferoidalnego w każdym punkcie czasowym względem obszaru przy t = 0. Następnie wykreśl inwazję (% t0) w funkcji czasu jako wykres liniowy.

Wyniki

Inwazję sferoid nowotworowych 3D ocenia się za pomocą prostej, powtarzalnej i zautomatyzowanej metody przedstawionej schematycznie na Rysunku 1: sferoidy nowotworowe o powtarzalnej wielkości uzyskuje się poprzez wysiewanie komórek do płytek 96-dołkowych o okrągłym dnie typu ULA. 4 dni po inicjacji sferoidy zostają zatopione w BMM. Zapewnia to półstałą strukturę, w którą wnikają komórki nowotworowe, rozprzestrzeniając się poza sferoid. Sferoidy znajdują się centralnie u podstawy każdego dołka, a inwazję do BMM można łatwo monitorować w odstępach czasu od t = 0 do 72 - 96 hr za pomocą cytometru obrazowego. Pozwala to na w pełni zautomatyzowaną analizę obrazu.

Przykłady różnych typów inwazji komórek nowotworowych przedstawiono na Rysunkach 2 - 4. Wysoce złośliwa ludzka linia komórkowa glioblastoma multiforme (GBM) U-87 MG tworzy zwartą, sferyczną strukturę 3D i służy tutaj jako przykład guzów mózgu, w których lokalna inwazja jest kluczową cechą zagrażającą życiu. Po osadzeniu w BMM, komórki ze sferoidów U-87 MG rozprzestrzeniają się w typowy wzór inwazji przypominający „wybuch gwiazdy”¹². Komórki nowotworowe rozszerzają się promieniście w macierzy, w której zachowują trójwymiarowy kształt. Proces ten śledzono przez okres 72 hr, co pokazano na Rysunku 2 dla sferoidów U-87 MG, gdzie wyraźnie widoczny jest zakres inwazji komórek nowotworowych, wraz ze szczegółami procesów komórkowych i invadopodiów wnikających w BMM. W pełni zautomatyzowana analiza obrazu z wykorzystaniem cytometru obrazowego umożliwia precyzyjną kwantyfikację inwazji komórek nowotworowych w czasie. Kwantyfikacja na Rysunku 2 została uzyskana zgodnie z ilustracją na Rysunku 1, gdzie zautomatyzowana analiza generuje segmentację wokół wypustek komórkowych wnikających do BMM z korpusu sferoidu U-87 MG. Należy zauważyć, że w przypadku tej linii komórkowej korpus sferoidu nowotworowego jest wykluczony z pomiaru obszaru inwazji.

Inny wzorzec inwazji zaobserwowano w liniach komórkowych ludzkiego raka płaskonakletkowego głowy i szyi. Linie CAL^S i CAL^R są izogeniczne, jednak CAL^S jest wrażliwa na inhibitory tyrozynowej kinazy EGFR, natomiast CAL^R jest na nie oporna¹⁴. Wobec braku EGF żadna z linii komórkowych nie wykazała inwazji do BMM (Rysunek 3), jednak wraz ze wzrostem stężenia EGF (do 2,5 ng/ml) sferoidy zaczęły „pączkować”. Przy wyższych stężeniach EGF (40 i 80 ng/ml) stopień inwazji uległ zmniejszeniu. Jest to zgodne z wcześniej opisaną, klasyczną dzwonowatą odpowiedzią dawka-odpowiedź na EGF w kontekście inwazji¹⁵. Przy stężeniu 20 ng/ml EGF, z głównego ciała sferoidów CAL^R wydzielały się wypustki przypominające palce, podczas gdy komórki CAL^S wykazywały mniejszą zdolność do inwazji po 72 h (Rysunek 3). Ta różnica w inwazji była widoczna 48 h po umieszczeniu sferoidów w BMM (zawierającym 20 ng/ml EGF w celu maksymalnego rozróżnienia linii komórkowych), a najwyższą była po 72 h (Rysunek 4). Obrazy te pozyskano szybko za pomocą cytometru obrazowego, podobnie jak w przypadku U-87 MG. Jednak w tym przypadku, aby zaprezentować alternatywną metodę, stopień inwazji określono ilościowo ręcznie, korzystając z samodzielnego oprogramowania do analizy obrazu, i przedstawiono go graficznie (Rysunki 3 i 4). Wyniki te ilustrują różnice fenotypowe między komórkami wrażliwymi a opornymi na lek, co mogłoby zostać wykorzystane do przesiewania związków, które specyficznie zniesą oporny na leki, inwazyjny fenotyp.

Rycina 1. Schematyczny przegląd testu inwazji 3D sferoidów nowotworowych. Przepływ pracy przedstawia etapy metody, w tym reprezentatywne obrazy sferoidów glejaka U-87 MG bezpośrednio po osadzeniu w BMM (panel górny; t = 0) oraz po inwazji do BMM (panel dolny; t = 72 hr), z segmentacją mierzącą obszar zajęty przez komórki naciekające oraz bez niej. Pasek skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2. Przebieg czasowy inwazji sferoidów glejaka U-87 MG do BMM. Inwazja 3D sferoidów U-87 MG do BMM była monitorowana i ilościowo określana do 72 h przy użyciu cytometru obrazowego. (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy, a (B) ilościowe oznaczenie inwazji komórek nowotworowych. Pasek = 500 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3. Inwazja sferoidów nowotworowych CAL^R (opornych) i CAL^S (wrażliwych). (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy oraz (B) manualną kwantyfikację zależnej od dawki EGF inwazji sferoidów nowotworowych CAL^R i CAL^S. Pasek = 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Komórki ze sferoidówCAL^R (opornych) wykazują większą inwazyjność niż sferoidy nowotworowe CAL^S (wrażliwe) po umieszczeniu w BMM. Po stymulacji EGF sferoidy nowotworowe CAL^R wykazują bardziej nasiloną inwazję niż CAL^S. (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy oraz (B) manualną kwantyfikację inwazji. Pasek = 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Dwa opisane tutaj modele nowotworów (glejak wielopostaciowy i SCCHN) zostały specjalnie wybrane, aby zilustrować nasz test 3D, ponieważ są to klinicznie istotne nowotwory miejscowo inwazyjne z niezaspokojoną potrzebą skutecznych terapii¹². Po leczeniu farmakologicznym ocenę zmian biomarkerów farmakodynamicznych (PD) in vitro można łatwo przeprowadzić za pomocą western blot lub testów immunologicznych lizatów po zastosowaniu specyficznych dostępnych na rynku odczynników, aby umożliwić regenerację komórek z BMM i/lub analizę immunofluorescencyjną inwazyjnych sferoid guza przez barwienie całego wierzchowca.

Ten test inwazji jest przydatną techniką do szybkiej i powtarzalnej oceny inwazji komórek nowotworowych na półstałe podłoże i dlatego jest szczególnie odpowiedni do przyszłych badań przesiewowych leków in vitro . Komórki rakowe atakują macierz w sposób 3D, gdy rozprzestrzeniają się z "mikroguza", reprezentowanego przez sferoidę guza, i rozszerzają się do środowiska przypominającego macierz zewnątrzkomórkową. Prawdziwa trójwymiarowość testu jest widoczna w morfologii komórki, która różni się od płaskiej, przylegającej morfologii, jaką komórki przyjmują, poruszając się po stałym podłożu. Stopień inwazji można łatwo określić ilościowo za pomocą cytometru obrazowego, umożliwiającego automatyczny odczyt, lub za pomocą standardowego mikroskopu w połączeniu z oprogramowaniem do obrazowania. Ponadto metoda ta nadaje się do obrazowania fluorescencyjnego¹³ (na przykład z liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję białek fluorescencyjnych lub wstępnie znakowanymi barwnikami fluorescencyjnymi).

Metoda jest prosta do wykonania, a jedynym krytycznym krokiem jest dodanie BMM, gdy istnieje ryzyko zakłócenia centralnego położenia sferoidy w studzience w kształcie litery U. Może to skutkować nieoptymalną analizą obrazu, ze sferoidami w różnych płaszczyznach ogniskowych. Dlatego bardzo ważne jest, aby ostrożnie i powoli dodawać BMM do każdej studzienki. Po dodaniu BMM zaleca się sprawdzenie płytki pod mikroskopem, a jeśli lokalizacja jest uważana za niedopuszczalną, można temu zaradzić poprzez delikatne odwirowanie. Z doświadczenia rzadko jest to konieczne. Chociaż metoda ta jest solidna i bardzo powtarzalna, zmienność międzydoświadczalna może wystąpić w przypadku różnych partii BMM. Aby tego uniknąć, zaleca się zakup wystarczającej ilości BMM z jednej partii, aby ukończyć serię badań.

Ograniczeniem metody (jak w przypadku każdego takiego testu) jest trudność w rozróżnieniu między inwazją a proliferacją, której komórki nowotworowe prawdopodobnie podlegają w czasie testu. Chociaż można wziąć pod uwagę czas podwajania komórek lub wprowadzić inhibitory cyklu komórkowego, takie jak cytochalazyna D, nie jest łatwo kontrolować lub wyraźnie rozróżnić te dwa różne aspekty progresji guza, szczególnie w przypadku szybko rosnących komórek nowotworowych i tych, które mają bardziej "ekspansywny", a nie naciekający, wzorzec inwazji. Z tego powodu sugeruje się, aby przeprowadzić równoległy test wzrostu 3D w celu oceny specyficznych skutków wszelkich środków hamujących lub stymulujących. Jeżeli przeprowadzone zostaną dokładne badania odpowiedzi na dawkę, możliwe będzie wybranie stężeń, które minimalizują wpływ na proliferację. Na przykład wykazaliśmy, że inhibitor HSP90 17-AAG hamuje inwazję sferoidalną guza U-87 MG 3D już po 24 godzinach i w stężeniach poniżej stężenia, hamując wzrost 3D o 50% (GI₅₀)¹².

Z drugiej strony, znaczenie tego testu w porównaniu z innymi standardowymi testami inwazji (np. Testy oparte na filtrze lub inwazja pojedynczych komórek na matryce 3D¹) polega na tym, że komórki nowotworowe intrują do otaczającej macierzy ze sferoidy, która przypomina "mikroguz" lub "mikroprzerzuty", a zatem uwzględnia ważne aspekty patofizjologii masy guza. Przedstawiona przez nas metoda dostarcza informacji na temat zbiorowego zachowania komórek nowotworowych, gdy początkowo opuszczają sferoidy, a także indywidualnie, gdy pojedyncze komórki docierają do bardziej odległych obszarów BMM. Ponadto komórki w sferoidach guza mogą doświadczać niedotlenienia i niedoboru składników odżywczych, co poprzez zmiany w ekspresji genów może sprzyjać migracji i inwazji; takie cechy są nieobecne w testach 2D. Co więcej, wszystko to jest dostępne w formacie o wysokiej przepustowości dzięki zastosowaniu specjalnych 96-dołkowych płytek i najnowszej technologii obrazowania, co pozwala na łatwe wykorzystanie bardziej złożonego testu 3D do walidacji celów i odkrywania leków.

Metoda, którą prezentujemy, może pomieścić dalsze zastosowania w celu rozwiązania dodatkowych aspektów inwazji komórek nowotworowych. W szczególności można przewidzieć dodatkową złożoność poprzez dodanie komórek gospodarza, takich jak fibroblasty i/lub komórki śródbłonka, do samej sferoidy lub otaczającej ją macierzy. Można to również modyfikować, nie tylko pod względem sztywności (poprzez zastosowanie różnych stężeń BMM), ale także pod względem składu (poprzez dodanie innych składników zależnych od konkretnej tkanki/narządu przyjętego modelu nowotworu: np. tenascyny w przypadku raka mózgu¹⁶ i kolagenu w przypadku raka piersi¹⁷).

Podobny układ (generowanie sferoid i obrazowanie) można również dostosować do oceny inwazji tkanek w 3D, gdzie sferoidy guza są współhodowane z ciałami embrionalnymi przypominającymi złożoną tkankę¹² lub z innymi organoidami specyficznymi dla komórek (np. astrocytami w przypadku glejaka¹⁸ lub kulturami krypt w przypadku nowotworów przewodu pokarmowego), ale konieczne są dalsze prace, aby umożliwić automatyczną analizę obrazu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Matryca błony podstawnej Corning Matrigel	Corning	354234	Przechowywać w 4 °C, aby zapobiec krzepnięciu; dozować za pomocą schłodzonych końcówek do pipet
Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex, PathClear	Trevigen	3432-005-01	Przechowywać w 4 °C, aby zapobiec krzepnięciu; dozować za pomocą schłodzonych końcówek do pipet
Płytka 96-dołkowa o ultra niskim przytwierdzaniu	Corning	7007
EGF	Miltenyi Biotec	130-093-825	Do 100 μg EGF dodać 100 μl 1% BSA (w/v) w wodzie. Do 25 μl tak przygotowanego roztworu dodać 4,975 μl pożywki RHB-A, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 5 μg/ml. Podzielić na aliquoty i przechowywać w -20 °C
Pożywka RHB-A	Stem Cells Inc.	SCS-SF-NB-01	Do rozcieńczania EGF
DMEM	GIBCO	31966-021	Przed użyciem ogrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C
Płodowa surowica bydlęca	Biosera	1001/500	Przed użyciem podgrzać do 56 °C w celu inaktywacji dopełniacza
TrypLE	GIBCO	12605	Roztwór do dysocjacji komórek
Cytometr Celigo	Nexcelom Bioscience	n/a	Specjalistyczny sprzęt do przechwytywania i analizy obrazów. Alternatywą jest ręczne przechwytywanie obrazów za pomocą mikroskopii i niezależnego oprogramowania do analizy obrazu
Mikroskop odwrócony IX70	Olympus	n/a	Używany z kamerą do ręcznego przechwytywania obrazów
Cyfrowa kamera Retiga Exi Fast 1394	Qimaging	n/a	Przymocowana do mikroskopu do ręcznego przechwytywania obrazów
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	n/a	Oprogramowanie służące do sterowania kamerą i mikroskopem podczas ręcznego przechwytywania obrazów
Image-Pro Analyzer 7.0	Media Cybernetics	n/a	Samodzielne oprogramowanie do analizy obrazu do ręcznego pomiaru wielkości sferoidów
Excel 2010	Microsoft	n/a	Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy statystycznej
Prism 6.0	GraphPad	n/a	Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy statystycznej