Uproszczona izolacja i obsługa ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów (NET)

Podsumowanie

W poniższym protokole opisujemy bardzo prosty sposób izolowania neutrofilowych pułapek zewnątrzkomórkowych (NET) z ludzkiej krwi pełnej za pomocą łatwo dostępnych odczynników. Następnie pokazujemy, w jaki sposób wyizolowane NET można wykorzystać w teście adhezji in vitro z komórkami nowotworowymi.

Streszczenie

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NET) zostały niedawno zidentyfikowane jako część arsenału przeciwbakteryjnego neutrofilów. Oprócz ich roli w zwalczaniu infekcji, ostatnie badania wykazały, że mogą być zaangażowane w wiele innych procesów chorobowych, w tym w progresję raka. Izolowanie oczyszczonych sieci NET jest kluczowym elementem umożliwiającym badanie tych funkcji.

W tym filmie demonstrujemy uproszczoną metodę bezkomórkowej izolacji NET z ludzkiej krwi pełnej przy użyciu łatwo dostępnych odczynników. Wyizolowane NET mogą być następnie wykorzystywane do barwienia immunofluorescencyjnego, blottingu lub różnych testów funkcjonalnych. Umożliwia to ocenę ich właściwości biologicznych przy braku potencjalnego zakłócającego wpływu samych neutrofili.

Technika separacji gradientu gęstości jest stosowana do izolowania neutrofili od zdrowych dawców krwi pełnej. Wyizolowane neutrofile są następnie stymulowane przez 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) w celu wywołania NETozy. Aktywowane neutrofile są następnie odrzucane i uzyskuje się bezkomórkowy zapas NET.

Następnie pokazujemy, jak izolowane NET mogą być używane w teście adhezyjnym z ludzkimi komórkami raka płuc A549. Zapas NET służy do powlekania studzienek 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej O/N, a po zapewnieniu odpowiedniego uformowania monowarstwy NET na dnie studzienek, dodaje się komórki A549 oznaczone CFSE. Przylegające komórki są oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego TE300 firmy Nikon. W niektórych studzienkach 1000U DNAse1 dodaje się 10 minut przed zliczeniem w celu degradacji NET

Wprowadzenie

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to nowo odkryte elementy pochodzące z neutrofili, składające się z nici zewnątrzkomórkowego DNA ozdobionego setkami białek i histonów. Są one wydzielane przez neutrofile w kontekście infekcji i stanu zapalnego w następstwie określonych bodźców i początkowo uznano, że są częścią mechanizmów obronnych neutrofili przed infekcjami. Po raz pierwszy wykazano, że sprzyjają one łapaniu różnych mikrobiologicznych najeźdźców, w tym bakterii, wirusów i grzybów ^1-3. Uwięzienie drobnoustroju doprowadziłoby następnie do jego zniszczenia zarówno bezpośrednio przez białka związane z NET ^3,4, jak i pośrednio poprzez lokalną rekrutację komórek fagocytarnych ^5,6. Rola sieci NET nie wydaje się jednak ograniczać do obrony hosta. Ostatnio wykazano, że odgrywają one ważną rolę w chorobach autoimmunologicznych ^7,8, zakrzepicy ⁹, zaburzeniach związanych z ciążą 10, a nawet progresji raka ^11,12. W związku z tym wydaje się, że NET odgrywają ważną rolę w wielu różnych procesach fizjologicznych. Biorąc jednak pod uwagę nowatorski charakter takich badań, wiele pozostaje do wyjaśnienia w odniesieniu do mechanizmów, za pomocą których NET wywierają swoje skutki. W niniejszym artykule przedstawiamy uproszczoną metodę izolacji NET przy braku neutrofili.

W poniższym filmie pokazujemy uproszczoną i łatwą technikę izolowania NET z ludzkiej krwi pełnej. Bezkomórkowe NET mogą być następnie wykorzystywane w wielu eksperymentach in vitro, w tym w barwieniu, imuunofluorescencji, blotach, a także w wielu testach, takich jak adhezja, proliferacja i migracja. Istnieją inne protokoły ^{13, 19}, jednak są one zwykle długie, złożone, drogie i często mają niską wydajność ¹³. Ten uproszczony protokół wykorzystuje podstawowe odczynniki i zmniejsza liczbę kroków wymaganych do wyizolowania neutrofili, minimalizując w ten sposób długość procedury przy jednoczesnej maksymalizacji wydajności.

Poniższa metoda łączy różne techniki izolacji neutrofili wcześniej opisane w literaturze, aby uzyskać prosty protokół dający bardzo czystą próbkę żywych neutrofili. Jak sugeruje literatura, krew żylna jest pobierana w probówkach EDTA i zużywana w ciągu 10 minut, aby uniknąć aktywacji neutrofili ¹⁴. Używamy wirowania w gradiencie gęstości pożywki separacyjnej limfocytów (LSM) do izolowania granulocytów i czerwonych krwinek z heparynizowanej krwi pełnej, metody zaadaptowanej z techniki wirowania gęstości Ficoll początkowo opisanej przez Boyuma i wsp. ¹⁵. LSM jest modyfikacją preparatu Bojum, która zastępuje metrizoinian sodu ditrizoinianem sodu i jest z powodzeniem stosowana w wielu badaniach do izolacji neutrofili ^16-18.

Po odwirowaniu o zróżnicowanej gęstości, monocyty i limfocyty są odrzucane; czerwone krwinki są następnie sedymentowane za pomocą 6% roztworu Dekstranu ¹⁴, a pozostałe RBC są poddawane lizie w celu uzyskania populacji czystych neutrofili, która jest weryfikowana za pomocą barwienia błękitem trypanowym i błękitem metylenowym.

Do wywołania NETozy użyto wielu czynników, w tym lipopolisacharydu (LPS), octanu mirystynianu forbolu (PMA) i interleukiny (IL-8) ^3,5,6. W poniższym protokole izolowane neutrofile są stymulowane 500 nM PMA przez 4 godziny, co wykazano, że jest odpowiednim stężeniem, aby umożliwić spójne i niezawodne tworzenie NET bez promowania apoptozy ^19,20.

Po izolacji, pokazujemy, jak można wykorzystać bezkomórkowe sieci NET uzyskane z tego protokołu w teście adhezyjnym. DNAse1 służy do trawienia i degradacji NET, jak opisano wcześniej, a zatem służy jako kontrola ^2,3,11. Inne opcje obejmują zastosowanie inhibitora elastazy neutrofilowej (NEi) w celu zahamowania tworzenia NET, co jest akceptowalną alternatywą, gdy celem jest zahamowanie powstawania NET, a nie spowodowanie ich degradacji ¹¹. Chociaż NEi pełni wiele różnych funkcji, wcześniej wykazano, że depozycja NET może być hamowana przez NEi poprzez blokowanie dekondensacji chromatyny, degranulacji jądrowej i śmierci neutrofili ¹²

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi wytycznymi etycznymi instytucji.

1. Rysunek krwi

1. Poprzez żyłę przełokciową zbierz 14 probówek krwi od zdrowego ochotnika do zielonych górnych (heparynizowanych) probówek i odwróć każdą probówkę przed osiądnięciem na lodzie. Zbierz krew w ciągu 10-15 minut od eksperymentu, aby zapewnić optymalną wydajność neutrofili
.

2. Izolacja neutrofili z krwi pełnej

1. Przemyć każdą zieloną górną probówkę krwi 5 ml PBS bez Ca i Mg w celu rozcieńczenia krwi. Do każdej z 4 stożkowych probówek o pojemności 50 ml dodaj 15 ml pożywki do separacji limfocytów (LSM) w temperaturze pokojowej. Używając igły 18 G zamontowanej na strzykawce o pojemności 60 ml, ostrożnie nałóż rozcieńczoną krew na LSM, tworząc ostrą granicę LSM-krew.
   UWAGA: W miarę możliwości unikaj mieszania warstw.
2. Wirować przy 800 x g przez 30 min w temperaturze 21 °C bez przerwy.
   UWAGA: Nagłe pęknięcia mogą powodować mieszanie się różnych warstw.
3. Obserwuj osad erytrocytów i neutrofili na dnie. Odessaj i odrzuć górne 2 warstwy (osocze i LSM), upewniając się, że pozbyłeś się interfejsu między tymi warstwami, który zawiera limfocyty i komórki jednojądrzaste, pozostawiając tylko dolną czerwoną warstwę.
4. Do każdej probówki dodać 20 ml soli fizjologicznej z buforu fosforanowego (PBS) i 20 ml 6% roztworu dekstranu. Delikatnie odwrócić każdą probówkę, aby wymieszać ją z warstwą erytrocytów i neutrofili i pozostawić w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   UWAGA: Umożliwi to czerwonym krwinkom (RBC) osadzanie się na dnie.
5. Po 30 minutach przenieść supernatant bogaty w neutrofile do świeżych probówek i wyrzucić granulki RBC. Odwirować supernatanty w temperaturze 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Osad będzie zawierał głównie neutrofile i niewiele erytrocytów.
6. Przygotować roztwór lizujący, dodając 0,5 ml buforu do lizy do 4,5 ml sterylnej wody. Pozostałe erytrocyty należy poddać lizie przygotowanym 5 ml roztworu lizy, przenosząc wszystkie zawieszone osady do jednej probówki. Pozostawić do lizy w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut.
7. Odwirować przy 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i przemyć osad 5 ml PBS bez Ca i Mg i ponownie odwirować przy 450 x g w temperaturze 4 °C, aby usunąć resztki roztworu lizy. Osad otrzymany w tym momencie zawiera neutrofile. Zawiesić granulkę w 30 ml zimnego 3% RPMI i umieścić na lodzie.
   UWAGA: 3% RPMI wytwarza się przez uzupełnienie pożywki RPMI 3% płodową surowicą bydlęcą (FBS)
8. Sprawdź czystość próbki za pomocą barwienia błękitem metylenowym. >95% komórek powinno być granulocytami z jądrami wielopłatowymi. Użyj barwienia błękitem trypanowym, aby sprawdzić >95% żywotność komórek i policzyć ostateczną wydajność neutrofili. Rozcieńczyć neutrofile w lodowatym 3% RPMI, aby uzyskać końcowe stężenie 5 x 10⁶ neutrofili/ml.

3. Generowanie sieci NETs

1. Stymulować neutrofile za pomocą 500 nM PMA (na 30 ml roztworu neutrofili) i inkubować na płaskim naczyniu do hodowli tkankowej o wymiarach 150 x 25 mm z siatką 20 mm przez 4 godziny w temperaturze 37 °C 5% CO₂ . Umożliwi to NETosis.
2. Po 4 godzinach stymulacji delikatnie odessać i wyrzucić pożywkę, pozostawiając warstwę NET i neutrofili przylegającą na dnie. Nie naruszaj tej warstwy.
3. Używając łącznie 15 ml zimnego PBS bez Ca i Mg na naczynie, umyj dno każdego naczynia, pipetując 15 ml PBS na dno naczynia w celu usunięcia całego przylegającego materiału z dna
.
4. Zebrać roztwór otrzymany z mycia każdego naczynia (krok 3.3) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirować przez 10 minut przy 450 x g w temperaturze 4 °C. Neutrofile i wszelkie pozostałe komórki osadzają się na dnie, pozostawiając bezkomórkowy supernatant bogaty w NET.
5. Podzielić supernatant na 1,5 ml probówki do mikrowirówek i wirować przez 10 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Pozwoli to na granulowanie całego DNA.
   UWAGA: Wirowanie w większych probówkach jest łatwiejsze i mniej czasochłonne, jeśli tak wysokie prędkości są osiągalne w zwykłej wirówce, w przeciwnym razie konieczne będzie podzielenie supernatantów na mniejsze probówki, aby można było użyć mikrowirówki o dużej prędkości.
6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wszystkie otrzymane razem granulki w lodowatym PBS do stężenia odpowiadającego 2 x^10,7 neutrofili na 100 μl PBS. W ten sposób uzyskamy bezkomórkowy materiał NET, który można wykorzystać do kolejnych eksperymentów.
7. Zmierzyć stężenie DNA w próbce otrzymanej za pomocą spektrofotometrii lub alternatywnego narzędzia do oznaczania ilościowego DNA. Odpowiednie stężenie w próbce powinno mieścić się w przedziale 140 - 180 ng/μl.

4. Test adhezji statycznej komórek rakowych NET.

1. Dodać 100 μl wcześniej otrzymanego materiału NET na studzienkę do 96-dołkowej płaskiej płytki dennej i pozostawić do pokrycia studzienek O/N w temperaturze 4 °C w ciemności.
2. Między 12 a 20 godziną później sprawdź, czy na dnie studzienek pod mikroskopem tworzy się jednolita monowarstwa bezkomórkowych sieci NET (ryc. 1). W tym momencie delikatnie zassaj cały nieprzylegający materiał z dołków, uważając, aby nie naruszyć monowarstwy NET na dole.
3. Dodać 100 μl 1% roztworu blokującego albuminę surowicy bydlęcej (BSA) do każdej studzienki i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Odłączyć komórki rakowe A549 od kolby T-75 za pomocą 2 ml 0,25% roztworu trypsyny. Po odłączeniu dodać 10 ml pożywki A549 do trypsynizowanych komórek i odwirować w temperaturze 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce, aby uzyskać stężenie 2 x10⁴ komórek rakowych na 100 μl pożywki.
   UWAGA: Komórki A549 hodowano oddzielnie. Krótko mówiąc, komórki hodowano i utrzymywano w pożywkach DMEM F12 zawierających 10% FBS i 1% penicyliny Streptomycyny i inkubowano w temperaturze 37 °C 5% CO₂ . Po osiągnięciu 70 - 80% konfluencji komórek, zostały one odłączone za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA i ponownie zawieszone w tym samym pożywce, które opisano powyżej.
5. Wybarwić komórki rakowe za pomocą CFSE, dodając 1 μl CFSE na ml pożywki i pozostawić do barwienia w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po barwieniu odwirować w temperaturze 450 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w początkowej objętości pożywki, aby uzyskać stężenie 2 x10⁴ komórek nowotworowych na 100 μl pożywki.
6. Po 1 godzinie blokowania NETs delikatnie odessać roztwór blokujący i dodać 2 x10⁴ komórki rakowe w pożywce, co odpowiada 100 μl, na basenie nad monowarstwą NET i pozostawić do przylegania przez 90 minut w temperaturze 37 °C 5% CO₂ . Delikatnie odessać komórki i dodać 100 μl PBS do każdej studzienki, aby umyć wszelkie nieprzylegające komórki.
7. W niektórych studzienkach dodaj 1000U DNAse1 na studzienkę przez 10 minut przed myciem, aby zdegradować NET. Będzie to służyć jako kontrola negatywna. W innych studzienkach dodaj 100 μl sterylnej wody na studzienkę przez 10 minut, która posłuży jako kontrola pojazdu (VC).
   UWAGA: Zwykle wykonuje się 3 powtórzenia na warunek w celu zwiększenia wielkości próby.
8. Odessać i wyrzucić cały roztwór ze studzienek, pozostawiając na dnie tylko NET i przylegające komórki rakowe. Dodać 100 μl 4% roztworu formaldehydu na studzienkę, aby przymocować przylegające komórki rakowe do NETS i odczytać test pod mikroskopem fluorescencyjnym (ryc. 1). Wykreśl i przeanalizuj wyniki (Rysunek 3).

Wyniki

Pomyślne osiągnięcie statycznego testu adhezyjnego za pomocą NET wymaga odpowiedniego pokrycia studzienek monowarstwą NET przed dodaniem komórek rakowych (Rysunek 1). Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać ostrożnie, aby nie naruszyć tej warstwy. Oczekuje się, że po utworzeniu odpowiedniej warstwy NET nastąpi znaczna adhezja komórek rakowych do NET, jak pokazano na rycinach 2A i 2C. Efekt ten jest znoszony przez dodanie DNAse1, który degraduje NET, jak widać na

Dyskusja

Protokół izolacji zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili pokazany w tym filmie łączy różne techniki stosowane w literaturze do izolacji neutrofili i tworzenia NET. Upraszcza dość złożony i zmienny proces oraz oferuje bardzo niezawodny i powtarzalny sposób izolowania oczyszczonych, bezkomórkowych sieci NET przy mniejszej liczbie kroków niż inne protokoły. Ponadto stosowane są łatwo dostępne odczynniki, co upraszcza protokoły i znacznie obniża ich koszt. Zastosowanie NET do statycznego testu adhezyjnego służy wykazaniu elas...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), modyfikowana, bez chlorku wapnia i chlorku magnezu	Żubr	311-425-CL
Pożywka do separacji limfocytów (LSM)	Żubr	305-010-CL
Chlorowodorek dekstranu (proszek)	Spectrum	DE130	6% roztwór dekstranu wytwarzany jest przez uzupełnienie PBS z Ca i Mg 6% Dekstranem w proszku
RPMI-1640 Pożywka z L-glutaminą	Żubr	350-000-CL	3% roztwór RPMI jest wytwarzany przez uzupełnienie RPMI 3% płodową surowicą bydlęcą
BD Pharm Lyse Lysing bufor lizujący	BD Biosciences	555899
12-mirystynian 13-octanu (PMA) Phorbol 12-mirystynian 13-octan (PMA)	Sigma-Alrdrich	P8139
DNAse1	Roche	11284932001
F12 DMEM	Żubr	319-075-CL
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Żubr	080-150
Penicylina/Streptomycyna	Gibco	15140-122
CFSE	Invitrogen	C1157
0,25% Trypsyna-EDTA	Gibco	25200-056
Integralne naczynie do hodowli tkankowych z siatką 20 mm (150 x 25 mm)	Falcon	353025