Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Summary

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.

Abstract

Zaburzenia układu limfatycznego, takie jak pierwotny obrzęk limfatyczny, wady rozwojowe układu limfatycznego i guzy limfatyczne, są rzadkimi schorzeniami, które powodują znaczną zachorowalność, ale niewiele wiadomo o ich biologii. Wyizolowanie ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego o wysokiej czystości (LEC) z chorych i zdrowych tkanek ułatwiłoby badania śródbłonka limfatycznego na poziomie genetycznym, molekularnym i komórkowym. Przewiduje się, że badania te mogą ujawnić cele dla nowych terapii, które mogą zmienić kliniczne leczenie tych schorzeń. Przedstawiono protokół opisujący izolację LEC ludzkiego napletka i komórek śródbłonka limfatycznego malformacji limfatycznych (LM LEC). Aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, tkankę rozdrabniono i poddano obróbce enzymatycznej przy użyciu dypazy II i kolagenazy II. Otrzymaną zawiesinę jednokomórkową oznaczono następnie przeciwciałami przeciwko markerom grupowania różnicowania (CD) CD34, CD31, czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego-3 (VEGFR-3) i PODOPLANINIE. Barwione żywe komórki posortowano na fluorescencyjnie aktywowanym sortowniku komórek (FACS) w celu oddzielenia populacji CD34^LowCD31^PosVEGFR-3^PosPODOPLANIN^Pos LM LEC od innych komórek śródbłonka i nieśródbłonka. Posortowane LM LEC hodowano i namnażano na kolbach pokrytych fibronektyną w celu dalszego wykorzystania eksperymentalnego.

Introduction

Główną funkcją układu limfatycznego jest wchłanianie limfy, nadmiaru płynu śródmiąższowego zawierającego lipidy, białka i składniki komórkowe, i odprowadzanie go do układu żylnego krwi. Sieć naczyń włosowatych limfatycznych kieruje limfę do węzłów chłonnych, gdzie jest ona badana pod kątem obecności obcych antygenów, co jest ważnym procesem w nadzorze immunologicznym i wykorzystaniu białych krwinek do neutralizacji obcych antygenów.

Jednokierunkowy układ limfatyczny zaczyna się w tkankach z początkową kapilarą limfatyczną, unikalną strukturą z nieciągłą pojedynczą warstwą cienkościennych płaskich komórek śródbłonka z wyspecjalizowanymi połączeniami komórkowymi, które umożliwiają wejście limfy^1,2. Te naczynia włosowate są połączone z sąsiednią macierzą tkanki łącznej za pomocą włókien kotwiczących, aby zapobiec zapadaniu się naczynia w obecności zwiększonego ciśnienia śródmiąższowego³. Początkowe naczynia włosowate limfatyczne opróżniają się do naczyń włosowatych gromadzących limfę, które łączą się w większe naczynia limfatyczne lub żyły. W porównaniu z początkowymi naczyniami naczyń włosowatych limfatycznych, naczynia limfatyczne zbiorcze mają grubsze ścianki naczyń, sparowane zastawki limfatyczne i są otoczone nieciągłą błoną podstawną, w której osadzonych jest kilka komórek mięśni gładkich⁴. Skoordynowane otwieranie i zamykanie zastawek limfatycznych oraz skurcz komórek mięśni gładkich ułatwia przepływ limfy³. U ludzi żyły limfatyczne z różnych obszarów ciała łączą się, tworząc pnie limfatyczne, które łączą się, tworząc dwa kanały limfatyczne: przewód piersiowy i prawy przewód limfatyczny. Przewód piersiowy odprowadza limfę z lewej strony ciała i z prawej strony poniżej klatki piersiowej, podczas gdy prawy przewód limfatyczny odprowadza limfę z prawego ramienia i prawej strony głowy, szyi i klatki piersiowej. Oba przewody przewodzą limfę do żył podobojczykowych w szyi⁵.

Zaburzenia układu limfatycznego dzielą się na nabyte i wrodzone (Tabela 1). Przykładami schorzeń nabytych są zapalenie naczyń chłonnych i wtórny obrzęk limfatyczny. Zapalenie naczyń chłonnych to zapalenie naczynia limfatycznego spowodowane infekcją bakteryjną. Dotknięte limfy rozszerzają się i wypełniają wysiękiem zawierającym komórki wielojądrzaste. Na skórze te naczynia limfatyczne są widoczne jako czerwone, bolesne smugi podskórne, którym często towarzyszy powiększenie związanego z nimi drenującego węzła chłonnego (zapalenie węzłów chłonnych)⁶. Wtórny obrzęk limfatyczny powstaje w wyniku uszkodzenia lub niedrożności naczynia limfatycznego lub niedrożności węzłów chłonnych. Prowadzi to do przewlekłego, postępującego obrzęku spowodowanego nagromadzeniem limfy dystalnie do uszkodzenia lub niedrożności. W krajach rozwiniętych wtórny obrzęk limfatyczny jest najczęściej związany z nowotworem złośliwym, w którym guzy z przerzutami blokują naczynia limfatyczne lub regionalne węzły chłonne, lub w wyniku terapii przeciwnowotworowej po chirurgicznym usunięciu węzłów chłonnych, zwłóknieniu po napromienieniu oraz zakrzepicy i bliznowaceniu⁷. W innych częściach świata wtórny obrzęk limfatyczny może być wtórny do niedrożności limfatycznej spowodowanej przez pasożytnicze robaki, takie jak Wuchereria bancrofti⁶.

Zaburzenia układu limfatycznego naczyniowego
nabyty	Wrodzone
Zapalenie węzłów chłonnych Wtórny obrzęk limfatyczny	Pierwotny obrzęk limfatyczny10	Sporadyczne malformacje limfatyczne13	Wady rozwojowe układu limfatycznego związane z zespołami13
	np. Zespół Milroya Zespół Meigego	Prosty: Wady rozwojowe układu limfatycznego	np. Zespół Klippela-Tranaunaya Zespół Parksa-Webera Zespół Sturge'a-Webera
		Łączny: Malformacje kapilarno-limfatyczne Malformacja kapilarno-limfatyczno-żylna Malformacja kapilarno-limfatyczno-żylna Malformacja kapilarno-limfatyczna żylno-żylna

Tabela 1. Przegląd zaburzeń układu limfatycznego naczyniowego.

Wrodzone zaburzenia układu limfatycznego obejmują pierwotny (idiopatyczny) obrzęk limfatyczny, który uważa się za spowodowany mutacjami genetycznymi, limfangiektazją i anomaliami układu limfatycznego^8,9. Pierwotny obrzęk limfatyczny może być sporadyczny, prawdopodobnie spowodowany mutacjami de novo lub dziedziczny. Zaburzenia limfatyczne mogą być również izolowane lub stanowić część bardziej uogólnionego zespołu¹⁰. W populacji pediatrycznej 97% obrzęku limfatycznego występuje sporadycznie z nieprawidłowościami w budowie naczyń limfatycznych, które upośledzają regionalny drenaż limfatyczny¹¹. Choroba Milroya jest przykładem pierwotnego obrzęku limfatycznego spowodowanego mutacją w genie VEGFR-3 widoczną po urodzeniu lub wkrótce po¹² roku życia. Chociaż choroba Milroya jest głównie chorobą rodzinną, można ją również zidentyfikować u niemowląt, u których w rodzinie nie występowała choroba Milroya³². Nasilenie obrzęku limfatycznego zależy od wielkości produkcji limfy i zdolności do transportu limfy z powrotem do krążenia żylnego⁶.

Na podstawie obrazu klinicznego i proliferacji komórek śródbłonka in situ, anomalie układu limfatycznego są klasyfikowane jako guzy limfatyczne lub malformacje limfatyczne¹³. Limfangiomatoza Kaposiform jest przykładem guza LEC¹⁴. Uważa się, że wady rozwojowe układu limfatycznego powstają podczas rozwoju embrionalnego i rosną proporcjonalnie do dziecka^15,16. Rzadko ulegają regresji, ale mogą pozostać bezobjawowe, dopóki uraz lub infekcja nie przyspieszy szybkiego wzrostu, prowadząc do powikłań klinicznych. Opisana powyżej uporządkowana struktura sieci limfatycznej i przewodzenie limfy z tkanki do krążenia żylnego jest zaburzona w malformacjach limfatycznych, które składają się z miejscowych nagromadzeń nieprawidłowych struktur torbielowatych wypełnionych płynem limfatycznym. Chociaż nie ma klinicznych ani eksperymentalnych dowodów na to, że te torbielowate naczynia są połączone z krążeniem limfatycznym lub że zawierają funkcjonalne zastawki limfatyczne, ich tożsamość limfatyczną potwierdza ekspresja szeregu markerów komórek limfatycznych, takich jak PODOPLANINA, CD31, Lymphatic Vessel Endothelial Receptor 1 (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) i VEGFR-3^15,17,18. Te struktury torbielowate mogą być małe (mikrotorbielowate) lub duże (makrotorbielowate), ale większość malformacji limfatycznych zawiera zarówno składniki mikrotorbielowate, jak i makrotorbielowate (ryc. 1)¹⁶. Po operacji, skleroterapii iniekcyjnej i/lub ablacji prądem o częstotliwości radiowej często dochodzi do narodzin wad chłonnych.

Rysunek 1. Morfologia naczyń limfatycznych człowieka i malformacji limfatycznych. Prawidłowe ludzkie naczynia limfatyczne (A) i malformacje limfatyczne (B i C) znakowane przeciwciałem przeciwko PODOPLANINIE (brązowa etykieta, strzałka). Ludzkie naczynia malformacji limfatycznej charakteryzują się wyraźnym poszerzeniem i znaczną zmiennością wielkości światła. Te zlokalizowane nieprawidłowe struktury torbielowate mogą być małe (mikrotorbielowate, *) (B) lub duże (makrotorbielowate, #) (C). Większość wad rozwojowych układu limfatycznego zawiera zarówno składniki mikrotorbielowate, jak i makrotorbielowate. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję rysunku.

Niektórzy badacze sugerowali, że malformacje limfatyczne reprezentują zaburzenie rozwojowe układu limfatycznego, w którym LEC nie mają nieprawidłowego potencjału wzrostu, ale nie łączą się z normalnym krążeniem¹⁹. Odkryliśmy jednak, że LEC LM namnażają się szybciej i są bardziej odporne na apoptozę niż LEC napletka¹⁵, co sugeruje, że istnieje pierwotna wada w LM LEC. Kiedy LM LEC są wszczepiane do mysiego modelu ksenoprzeszczepu, tworzą struktury przypominające malformacje limfatyczne¹⁵. Potwierdza to hipotezę, że wady rozwojowe układu limfatycznego mogą być spowodowane przez jedną lub więcej mutacji somatycznych powstających w LM LEC podczas rozwoju płodu. Rzeczywiście, ostatnie doniesienia zidentyfikowały jedną taką mutację w podjednostce katalitycznej p110α kinazy fosfoinozytowo-3-Kinazy (PIK3CA) ^{genu 20}.

Biorąc pod uwagę postęp w technologii sekwencjonowania DNA, odpowiednie mutacje mogą być łatwiej identyfikowane w izolowanych LM LEC, co będzie kierować przyszłymi badaniami nad tymi schorzeniami. Izolacja żywotnych LEC ułatwiłaby porównania między nieprawidłowymi i prawidłowymi LEC w testach takich jak migracja, proliferacja, zdolność tworzenia rurek i przeżycie w odpowiedzi na zmniejszoną dostępność składników odżywczych lub czynników proapoptotycznych¹⁵. Wyizolowane LEC umożliwiłyby nam ponadto przeprowadzenie specyficznych dla komórek badań ekspresji genów i proteomiki, aby wyznaczyć nowe subpopulacje LEC i odkryć nowe środki farmakologiczne odpowiednie do klinicznego leczenia wad rozwojowych układu limfatycznego.

Wcześniej opublikowaliśmy metodę izolacji LEC opartą na magnetycznym oddzielaniu LEC od napletka noworodka i malformacji limfatycznych¹⁵. Opisaliśmy strategię oddzielania normalnych i chorych LEC od komórek śródbłonka naczyń krwionośnych w oparciu o brak ekspresji CD34, a następnie poddawanie frakcji komórek^Neg CD34 pozytywnej selekcji dla CD31. Metoda ta była jednak utrudniona ze względu na obecność szczątkowych komórek nieśródbłonkowych. Było to niezależne od usunięcia naskórka przed późniejszym trawieniem tkanki łącznej. Zanieczyszczenia te na ogół rozprzestrzeniały się szybciej i w ten sposób ostatecznie przerosły hodowle komórek śródbłonka, pomimo kolejnych prób powtórzenia izolacji LEC. Rzeczywiście, początkowe zanieczyszczenie komórek nieśródbłonka na poziomie od 2% do 5% wystarczyło, aby przytłoczyć populację LEC¹⁵. To skłoniło nas do zbadania metody sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie jako opcji poprawy wydajności i czystości komórek LEC. Ponadto zastosowaliśmy sortowanie wieloparametrowe w celu zwiększenia swoistości populacji LEC, dodając VEGFR-3 i PODOPLANINĘ do markerów selekcyjnych w celu identyfikacji CD34^LowCD31^PosVEGFR-3^PosPODOPLANIN^Pos LECs.

Uzasadnienie wyboru tych markerów opierało się na raportach, że podczas gdy LEC i komórki śródbłonka naczyń krwionośnych mają wiele wspólnych markerów powierzchni komórek, takich jak CD31, LEC wykazują fenotypową zmienność w ekspresji CD34, PODOPLANINY i markera powierzchni komórek VEGFR-3 w porównaniu do komórek śródbłonka naczyń krwionośnych^21-23. CD31 jest transbłonową glikoproteiną o masie 130 kDa, znaną również jako cząsteczka adhezyjna komórek śródbłonka płytek krwi 1 (PECAM-1). Uważa się, że jest markerem komórek śródbłonka, ponieważ ulega ekspresji we wszystkich typach krwionośnych i naczyń limfatycznych^21,24,25. CD34 to transbłonowa glikoproteina o masie 110 kDa obecna na większości krwiotwórczych komórek progenitorowych i macierzystych, komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych i niektórych naczyniach limfatycznych²⁶.

VEGFR-3, receptor dla czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego C i D, jest początkowo obecny na rozwijających się żyłach w zarodku myszy, ale zgodnie ze specyfikacją limfatyczną regulowaną przez czynniki transkrypcyjne HMG-box (SOX)-18 związane z SRY, chicken ovalbumina upstream promoter transcription factor 2 (COUPTF-II) i PROX-1, ekspresja żylna VEGFR-3 zostaje utracona i zostaje ograniczona do embrionalnych LEC^25,27. PODOPLANINA, błonowa mukoproteina błony o masie 38 kDa, jest po raz pierwszy obserwowana na naczyniach limfatycznych około 11 dnia embrionalnego (~E11.0) rozwoju embrionalnego myszy ²⁸ i chociaż jest silnie eksprymowana przez mikronaczynia limfatyczne, ekspresja PODOPLANINY przez makrotorbielowaty śródbłonek limfatyczny w malformacjach limfatycznych jest bardziej zmienna¹⁵. Eksperymenty z cytometrią przepływową sugerują, że przynajmniej niektóre komórki śródbłonka CD34^HighCD31^Pos wyrażają marker limfatyczny PODOPLANIN²⁹. Chociaż systematyczna ocena barwienia LYVE-1 i PODOPLANINY w ludzkich wadach rozwojowych układu limfatycznego wykazała, że oba są skuteczne w barwieniu śródbłonka³⁰ malformacji limfatycznych w normalnych tkankach, stwierdzono, że LYVE-1 jest silnie obecny w początkowym śródbłonku naczyń włosowatych układu limfatycznego, ale jest zmniejszony, a nawet nieobecny w śródbłonku limfatycznego³¹. Ponieważ naszym celem jest wyizolowanie zarówno początkowych, jak i pobranych komórek śródbłonka limfatycznego, zdecydowaliśmy się nie używać LYVE-1 w ramach naszej strategii selekcji komórek. Wreszcie, decyzja o zastosowaniu tych markerów opierała się również na dostępności przeciwciał, które są stosowane diagnostycznie do znakowania naczyń limfatycznych do obrazowania mikroskopowego, co pozwoliłoby na korelację między cytometrią przepływową a badaniami immunofluorescencyjnymi.

Ten artykuł opisze metodę trawienia tkanek, barwienie komórek i ustawienia FACS wymagane do pomyślnej izolacji CD34^LowCD31^PosVEGFR-3^PosPODOPLANIN^Pos LECs, jak również CD34^HighCD31^{Pos VEGFR-3Pos}PODOPLANIN^Pos endothelial cells from foretle i tkanki malformacji limfatycznej.

Protocol

Oświadczenie etyczne: Etyczna zgoda na pobieranie malformacji limfatycznych i tkanek napletka została uzyskana od Komisji Etyki Badań Naukowych na Ludziach w Królewskim Szpitalu Dziecięcym w Melbourne, Australia. Przed zabiegiem uzyskano podpisaną zgodę od rodziców pacjentów. Próbki tkanek pobrano od pacjentów, u których zdiagnozowano LM poddawanych zabiegom chirurgicznym w ramach postępowania klinicznego oraz od pacjentów poddawanych planowemu obrzezaniu. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych w Australii.

1. Przygotowanie zawiesiny komórkowej z tkanek malformacji napletka i limfatycznego

1. i przygotowanie pożywek.
   1. Przygotuj kompletną pożywkę dla komórek śródbłonka za pomocą dostępnego w handlu zestawu EGM-2 MV Bullet Kit, podgrzewając pożywkę EGM-2 i delikatnie rozmrażając elementy zestawu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II asepcyjnie dodać każdy składnik do pożywki EGM-2. Po dodaniu wszystkich składników do pożywki należy nazywać tę pożywkę "kompletną pożywką dla komórek śródbłonka". Użyj sterylnej pipety o pojemności 50 ml, aby wymieszać zawartość przed użyciem.
      UWAGA: Wszystkie etapy związane z hodowlą komórkową są wykonywane w komorze zagrożenia biologicznego klasy II. Wszystkie roztwory są przechowywane w temperaturze 4 °C zgodnie z instrukcjami producenta i przed użyciem są podgrzewane do temperatury pokojowej. Kompletne podłoża komórkowe śródbłonka, do hodowli komórkowych i roztwory enzymatyczne ogrzewa się w temperaturze 37 °C przez 20 minut przed użyciem.
   2. Uzupełnij kompletne pożywki komórkowe śródbłonka w 50 ng/ml VEGF-C. Uzupełnioną pożywkę z komórek śródbłonka rozmieścić w sterylnych probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Pożywka jest stabilna przez co najmniej 4 tygodnie, jeśli jest przechowywana w temperaturze 4 °C.
   3. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami bez wapnia i magnezu (PBS), rozpuszczając 8,752 g NaCl, 1,416 g Na₂HPO, 4,2H2O i 0,395 g KH₂PO₄ w 1 000 ml wody. Dostosuj pH do 7,4. Filtrować, sterylizować PBS za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem dodać roztwór antybiotyku/antybiotyku (stosowany w stosunku 1:100).
   4. Aby przygotować ludzką fibronektynę, rozpuść 1 mg fibronektyny w 10 ml sterylnej wody. Przygotowany roztwór należy przechowywać w 100 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C. W dniu użycia dodać 10 ml sterylnego PBS do 100 μl podwielokrotności fibronektyny (aby uzyskać końcowe stężenie robocze 10 μg/ml).
   5. Dla pożywek enzymatycznych należy przygotować roztwór zawierający 0,04% dyspazy II, 0,25% kolagenazy II i 0,01% DNazy I w sterylnym PBS. Najpierw zważyć dypazę i kolagenazę, umieścić w sterylnej probówce o pojemności 50 ml, dodać wymaganą objętość PBS i inkubować przez 30 minut, wstrząsając w temperaturze 37 °C do rozpuszczenia. Po rozpuszczeniu wysterylizuj filtr (filtr 0,22 μm) roztwór dypazy/kolagenazy w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Dodać w asepcie DNazę I. Roztwór enzymatyczny należy przechowywać w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
      UWAGA: DNaza I jest komercyjnym odczynnikiem klasy do hodowli komórkowych dostępnym w postaci sterylnego liofilizowanego proszku.

2. Przygotowanie zawiesiny komórek z napletka i malformacji limfatycznych

1. Zważyć probówkę o pojemności 50 ml zawierającą 10 ml DMEM/2% roztworu antybiotyku przeciwgrzybiczego. Ta probówka będzie używana do pobierania tkanek.
2. Po chirurgicznym usunięciu malformacji limfatycznych i tkanek napletka, w asepcie dodać próbkę tkanki do probówki i przenieść na lodzie do laboratorium hodowli komórkowych.
3. Zważyć probówkę zawierającą tkankę i obliczyć masę tkanki. Użyj tej wagi, aby obliczyć objętość roztworu enzymatycznego potrzebnego do strawienia tkanki.
4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść tkankę i pożywkę do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm. Użyj sterylnych nożyczek, aby drobno zmielić tkankę na ~1 mm³ kawałki.
5. Tkankę mieloną zmieszaną z pożywką przenieść do probówki o pojemności 50 ml zawierającej dodatkowe 10 ml sterylnego roztworu przeciwgrzybiczego DMEM/2% antybiotyku. Wymieszaj przez odwrócenie, aby ponownie zawiesić tkankę. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut.
6. Usunąć supernatant. W zależności od masy tkanki dodać 1 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu trawiącego kolagenazy II/DNazy I/Dyspazy II na 100 mg tkanki mielonej. Zazwyczaj należy użyć 10 ml roztworu enzymatycznego na około 1 g tkanki mielonej.
7. Inkubować tkankę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 20-90 minut, stale wstrząsając z prędkością 200 obr./min. Pod koniec tego okresu upewnij się, że prawie cała tkanka została strawiona na drobne fragmenty.
   UWAGA: Narażenie komórek na kolagenazę i dyspazę w czasie izolacji z tkanek pierwotnych wpływa na przeżycie komórek. Stwierdziliśmy empirycznie, że większość próbek napletka noworodków optymalnie wymaga 20-30 minut trawienia, podczas gdy próbki zwłóknieniowych malformacji limfatycznych mogą wymagać 60-90 minut trawienia. Na wydajność LM LEC ma wpływ ilość obecnego zwłóknienia, więcej tkanki włóknistej daje mniej komórek, prawdopodobnie z powodu szkodliwych skutków długotrwałej ekspozycji na kolagenazę II i dypazę II.
8. Po roztrawieniu przenieść probówkę do komory bezpieczeństwa biologicznego i przepuścić strawiony roztwór tkankowy przez sitko o średnicy 70 μm umieszczone w sterylnej probówce o pojemności 50 ml. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml z gumowym tłokiem rozdrobnić pozostałą tkankę, aż zaobserwuje się tylko niewielkie ślady macierzy zewnątrzkomórkowej.
9. Przemyć sitko komórkowe objętością pożywki z komórek śródbłonka równą objętości dysocjującego podłoża enzymatycznego w celu odzyskania komórek przyklejonych do sita i dezaktywacji enzymów. Na przykład, aby uzyskać 2 ml pożywki enzymatycznej dysocjującej w celu strawienia tkanki mielonej, dodaj 2 ml pożywki z komórek śródbłonka, aby dezaktywować enzymy.
10. Odwirować roztwór komórkowy o stężeniu 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant. R>e zawiesić komórki w 10 ml PBS. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, a następnie powtórzyć dwukrotne płukanie komórek. >Zawiesić osad komórkowy w 20 ml pożywki dla komórek śródbłonka. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego, a następnie zasiej 2 x 10>⁶ komórek w kolbie o pojemności 150 cm>² wstępnie pokrytej fibronektyną w końcowej objętości 20 ml pożywki z komórek śródbłonka. Hodowla w temperaturze 37 °C w 5% CO>₂ w inkubatorze z nawilżanym powietrzem.>
    UWAGA: Oczekuje się, że 75%-90% komórek jądrzastych przetrwa trawienie tkankowe, zgodnie z oszacowaniem przez wykluczenie błękitu trypanowego. Początkowa liczba komórek odzwierciedla wszystkie komórki jądrzaste w zawiesinie komórkowej (tj. keratynocyty, leukocyty, makrofagi, komórki tkanki łącznej i komórki naczyń krwionośnych). Liczba komórek po 5-7 dniach odzwierciedla komórki, które przyczepiły się, przetrwały i namnażały się podczas hodowli komórek. Powlekanie kolb do hodowli tkankowych fibronektyną poprawia również późniejsze przeżycie LEC i LM LEC.
11. Po całonocnej inkubacji zmyć niezwiązane komórki w trzech przemyciach PBS/1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym i dodać świeżą pożywkę komórkową śródbłonka. Przeprowadzić trzy płukania, aby skutecznie usunąć niezwiązane komórki i czerwone krwinki obecne w kolbie. Zmieniaj nośniki co drugi dzień. Komórki będą zlewać się w ~80% po 5-7 dniach.

3. Barwienie komórek przeciwciałami dla markerów powierzchni komórek śródbłonka limfatycznego do cytometrii przepływowej

1. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, odessać pożywkę i przepłukać komórki PBS.
2. Odłączyć przylegające komórki przez inkubację komórek z 7 ml roztworu do odrwadzania komórek, takiego jak Accutase na 150^cm2 kolbę, przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C.
3. Zebrać oderwane komórki, dezaktywować roztwór do odłączania komórek, dodając 3 objętości pożywki z komórek śródbłonka i przenieść zawiesinę komórek do nowej sterylnej probówki.
4. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 5 minut.
5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml PBS. Odwirować komórki o masie 300 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, a następnie powtórzyć płukanie komórek. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml PBS.
6. Policz liczbę żywotnych komórek. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórkowej z 90 μl 0,4% błękitu trypanowego. Przenieść 10 μl tej zawiesiny do hemocytometru w celu obliczenia.
   UWAGA: Ostateczna wydajność komórek będzie zależeć od wielkości przetwarzanej próbki. Typowa wydajność komórek z kolby o długości 150^cm2 waha się od 7 x 10⁵ do 1,2 x 10⁶ komórek żywotnych.
7. Przygotuj roztwory przeciwciał do barwienia komórek.
   UWAGA: Następujące rozcieńczenia miareczkowano do barwienia 1 x 10⁶ w objętości barwienia 100 μl.
   1. Rozcieńczony PE sprzężony mysz anty ludzki VEGFR-3 (1:50); PE-Cy7 sprzężony mysz anty ludzki sprzężony CD34 (1:200); Sprzężona z APC mysia anty ludzka CD31 (1:100) i Alexa 488-sprzężona szczura anty ludzka PODOPLANINA (1:200) w łącznej objętości 100 μl sterylnego 5% roztworu FBS/PBS na próbkę tkanki. Po przygotowaniu roztworu przeciwciał przechowywać na lodzie do czasu użycia. Podobnie przygotować rozcieńczoną mieszaninę przeciwciał kontrolnych izotypu, aby ułatwić ustawienie bramek cytometrii przepływowej.
8. Aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przeciwciał, odwirować komórki przy 300 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant, a następnie zawiesić komórki w 100 μl sterylnego 5% roztworu FBS/PBS na próbkę do barwienia. Inkubować komórki na lodzie przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
9. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w sprzężonym koktajlu przeciwciał. Wybarwić również mniejszą porcję komórek (1 x 10⁵) w 100 μl mieszaniny przeciwciał kontrolujących izotyp. Inkubować komórki na lodzie przez 20 minut.
10. W celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała dodać 2 ml 2% roztworu FBS/PBS i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i powtórzyć płukanie.
11. Zawiesić osad komórkowy do kontroli izotypu i próbkę barwioną przeciwciałami, która ma być posortowana w 300 μl 0,5 mg/ml roztworu jodku propidyny/2% FBS/PBS. Umieść probówki na lodzie do czasu sortowania.

4. Sortowanie komórek

1. Do konfiguracji przyrządu należy użyć następujących materiałów: kulek wyrównujących, takich jak dostępne w handlu cząstki fluorescencyjne, płyn osłonowy na bazie soli fizjologicznej buforowany fosforanami oraz kulki opóźniające upadek, takie jak kulki fluorescencyjne Accudrop.
2. Wyizoluj oczyszczone ludzkie LEC na wieloparametrowym przyrządzie do sortowania komórek aktywowanym fluorescencją. Ustaw przyrząd i wyrównaj zgodnie z zaleceniami producenta. Ponadto należy przeprowadzić pojedyncze kontrole kompensacji barwienia dla każdego rodzaju, aby wygenerować matrycę kompensacyjną, a tym samym wyeliminować znaczne krwawienie emisji fluorochromów, takich jak PE, do kanału PE-Cy.
   UWAGA: Większa część komórek posortowanych przez FACS przeżywa izolację, jeśli używana jest dysza 100 μm, a komórki są sortowane na pożywkę komórkową śródbłonka.

5. Sortowanie po FACS w hodowli komórkowej

1. Po sortowaniu odwirować komórki w stężeniu 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5-10 ml pożywki (w zależności od kolby użytej do wysiewu komórki). Jeśli posortowanych jest mniej niż 50 000 komórek, komórki są hodowane w kolbie pokrytej fibronektyną o średnicy 25^cm2.
2. W przeciwnym razie hodować komórki w kolbie pokrytej fibronektyną o długości 75^cm2 w temperaturze 37 °C w inkubatorze nawilżanym powietrzem o stężeniu 5%_CO2. Zmień nośnik po 2 dniach.
   UWAGA: Pożywka komórkowa jest zmieniana co drugi dzień, ponieważ wydłużenie czasu między zmianami pożywki wydaje się sprzyjać przetrwaniu komórek nieśródbłonkowych. Walidujemy fenotyp komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą immunohistochemicznej detekcji markerów: PROX-1, VEGFR-3, Podoplaniny, CD34 i CD31, gdy komórki są najpierw dzielone w celu dalszej ekspansji¹⁵.

Results

Po wstępnym trawieniu tkanek, po 24 godzinach w hodowli niefrakcjonowanych próbek, można zaobserwować odrębne kolonie komórek śródbłonka (Rysunek 2A) wraz z komórkami podobnymi do fibroblastów i komórkami mięśni gładkich. Po sortowaniu i po 24 godzinach w hodowli komórkowej komórki CD34^LowCD31^PosVEGFR-3^PosPodoplanin^Pos przyczepiają się i wykazują typową morfologię bruku (Figura 2B i C). Za pomocą opisanej powyżej metody FACS je...

Discussion

LEC odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy płynów, odpowiedzi immunologicznej na obce antygeny oraz wchłanianiu i transporcie niektórych składników odżywczych. Na homeostazę LEC mogą wpływać procesy chorobowe, takie jak infekcje bakteryjne i przerzuty nowotworowe, ale LEC mogą również rozwijać mutacje somatyczne, które powodują powstawanie dysfunkcyjnych naczyń limfatycznych i znaczną zachorowalność u pacjentów dotkniętych chorobą. Aby lepiej zrozumieć etiologię malformacji limfatycznych poprzez implantację in ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies (Gibco)	11965-092	Służy do pobierania próbek tkanek z sali operacyjnej.
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	CC-3202	EGM-2 MV Bullet Kit zawiera 500 ml pożywki EBM-2 i ludzkiego EGF, hydrokortyzonu, gentamycyny (GA-1000), płodowej surowicy bydlęcej (FBS), VEGF, ludzkiego FGF-b, R3-IGF-1 i kwasu askorbinowego.
VEGF-C	R& D Systems	2179-VC-025	Kompletne podłoże komórkowe śródbłonka uzupełniono o 50 ng/ml VEGF-C
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)	Life Technologies (Gibco)	15240-062	Ten roztwór zawiera 10 000  U/ml penicyliny, 10 000  mg/ml streptomycyny i 25  mg/ml leku przeciwgrzybiczego Fungizone. Stosować w rozcieńczeniu 1:100.
Fibronektyna z ludzkiego osocza	Sigma-Aldrich	F2006	Stosowana w stężeniach 10 mg / ml. Może być ponownie używany przez okres do 1 miesiąca, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4  ° C i utrzymywane w sterylności. Posługiwać się 7  ml do pokrycia 150 cm2 kolby.
StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórek	Life Technologies (Gibco)	A11105-01	StemPro® Akumulator® stosuje się w ilości 0,05 ml na cm2 w celu pokrycia całej powierzchni kolby. Użycie mniejszych objętości może spowodować niepełne odłączenie komórek.
0,4% Trypan Blue dye	Life Technologies (Gibco)	15250-061	Stosowany jako barwnik żywotności.
Dispase II	Roche Applied Biosciences	4942078001	Stosowany w 0,04%
Kolagenaza II	Worthington Lab	4176	Stosowany w 0,25%
DNazy I	Roche Applied Biosciences	11284932001	komórkowych 0,01%
70 mm	BD Falcon	352350
[header]
PE-sprzężony klon VEGFR-3 9D9F9, klon WM59	BioLegend	356204	Stosowany w rozcieńczeniu 1:50
PE-Cy7-sprzężony CD34, klon 581	BioLegend	343516	Stosowany w rozcieńczeniu 1:200
Sprzężony z APC mysz anty ludzki CD31, klon WM59	BioLegend	303116,	Stosowany w rozcieńczeniu 1:100
Alexa 488-sprzężony szczur anty ludzka Podoplanina, klon NC-80.	BioLegend	337006	Stosowany w rozcieńczeniu 1:200
Mysz sprzężona z PE IgG1, izotyp k, klon MOPC-21	BioLegend	400112	Stosowany w rozcieńczeniu 1:50
IgG1 myszy sprzężony z PE-Cy7, izotyp k, klon MOPC-21	BioLegend	400126	Stosowany w rozcieńczeniu 1:200
Mysz sprzężona z APC IgG1, izotyp k, klon MOPC-21	BioLegend	400120	Stosowany w rozcieńczeniu
1:100IgG2a myszy sprzężonej z Alexa 488, izotyp k, klon RATK2758	BioLegend	400525	Używany w rozcieńczeniu 1:200