Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Summary

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.

Abstract

Zaburzenia układu limfatycznego, takie jak pierwotny obrzęk limfatyczny, wady rozwojowe układu limfatycznego i guzy limfatyczne, są rzadkimi schorzeniami, które powodują znaczną zachorowalność, ale niewiele wiadomo o ich biologii. Wyizolowanie ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego o wysokiej czystości (LEC) z chorych i zdrowych tkanek ułatwiłoby badania śródbłonka limfatycznego na poziomie genetycznym, molekularnym i komórkowym. Przewiduje się, że badania te mogą ujawnić cele dla nowych terapii, które mogą zmienić kliniczne leczenie tych schorzeń. Przedstawiono protokół opisujący izolację LEC ludzkiego napletka i komórek śródbłonka limfatycznego malformacji limfatycznych (LM LEC). Aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, tkankę rozdrabniono i poddano obróbce enzymatycznej przy użyciu dypazy II i kolagenazy II. Otrzymaną zawiesinę jednokomórkową oznaczono następnie przeciwciałami przeciwko markerom grupowania różnicowania (CD) CD34, CD31, czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego-3 (VEGFR-3) i PODOPLANINIE. Barwione żywe komórki posortowano na fluorescencyjnie aktywowanym sortowniku komórek (FACS) w celu oddzielenia populacji CD34^LowCD31^PosVEGFR-3^PosPODOPLANIN^Pos LM LEC od innych komórek śródbłonka i nieśródbłonka. Posortowane LM LEC hodowano i namnażano na kolbach pokrytych fibronektyną w celu dalszego wykorzystania eksperymentalnego.

Introduction

Główną funkcją układu limfatycznego jest wchłanianie limfy, nadmiaru płynu śródmiąższowego zawierającego lipidy, białka i składniki komórkowe, i odprowadzanie go do układu żylnego krwi. Sieć naczyń włosowatych limfatycznych kieruje limfę do węzłów chłonnych, gdzie jest ona badana pod kątem obecności obcych antygenów, co jest ważnym procesem w nadzorze immunologicznym i wykorzystaniu białych krwinek do neutralizacji obcych antygenów.

Jednokierunkowy układ limfatyczny zaczyna się w tkankach z początkową kapilarą limfatyczną, unikalną strukturą z nieciągłą pojedynczą warstwą cienkościennych płaskich komórek śródbłonka z wyspecjalizowanymi połą....

Protocol

Oświadczenie etyczne: Etyczna zgoda na pobieranie malformacji limfatycznych i tkanek napletka została uzyskana od Komisji Etyki Badań Naukowych na Ludziach w Królewskim Szpitalu Dziecięcym w Melbourne, Australia. Przed zabiegiem uzyskano podpisaną zgodę od rodziców pacjentów. Próbki tkanek pobrano od pacjentów, u których zdiagnozowano LM poddawanych zabiegom chirurgicznym w ramach postępowania klinicznego oraz od pacjentów poddawanych planowemu obrzezaniu. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych w Australii.

1. Przygotowanie zawiesiny komórkowej z tkanek malformacji napletka....

Results

Po wstępnym trawieniu tkanek, po 24 godzinach w hodowli niefrakcjonowanych próbek, można zaobserwować odrębne kolonie komórek śródbłonka (Rysunek 2A) wraz z komórkami podobnymi do fibroblastów i komórkami mięśni gładkich. Po sortowaniu i po 24 godzinach w hodowli komórkowej komórki CD34^LowCD31^PosVEGFR-3^PosPodoplanin^Pos przyczepiają się i wykazują typową morfologię bruku (Figura 2B i C). Za pomocą opisanej powyżej metody FACS je.......

Discussion

LEC odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy płynów, odpowiedzi immunologicznej na obce antygeny oraz wchłanianiu i transporcie niektórych składników odżywczych. Na homeostazę LEC mogą wpływać procesy chorobowe, takie jak infekcje bakteryjne i przerzuty nowotworowe, ale LEC mogą również rozwijać mutacje somatyczne, które powodują powstawanie dysfunkcyjnych naczyń limfatycznych i znaczną zachorowalność u pacjentów dotkniętych chorobą. Aby lepiej zrozumieć etiologię malformacji limfatycznych poprzez implantację in .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies (Gibco)	11965-092	Służy do pobierania próbek tkanek z sali operacyjnej.
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	CC-3202	EGM-2 MV Bullet Kit zawiera 500 ml pożywki EBM-2 i ludzkiego EGF, hydrokortyzonu, gentamycyny (GA-1000), płodowej surowicy bydlęcej (FBS), VEGF, ludzkiego FGF-b, R3-IGF-1 i kwasu askorbinowego.
VEGF-C	R& D Systems	2179-VC-025	Kompletne podłoże komórkowe śródbłonka uzupełniono o 50 ng/ml VEGF-C
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)	Life Technologies (Gibco)	15240-062	Ten roztwór zawiera 10 000  U/ml penicyliny, 10 000  mg/ml streptomycyny i 25  mg/ml leku przeciwgrzybiczego Fungizone. Stosować w rozcieńczeniu 1:100.
Fibronektyna z ludzkiego osocza	Sigma-Aldrich	F2006	Stosowana w stężeniach 10 mg / ml. Może być ponownie używany przez okres do 1 miesiąca, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4  ° C i utrzymywane w sterylności. Posługiwać się 7  ml do pokrycia 150 cm2 kolby.
StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórek	Life Technologies (Gibco)	A11105-01	StemPro® Akumulator® stosuje się w ilości 0,05 ml na cm2 w celu pokrycia całej powierzchni kolby. Użycie mniejszych objętości może spowodować niepełne odłączenie komórek.
0,4% Trypan Blue dye	Life Technologies (Gibco)	15250-061	Stosowany jako barwnik żywotności.
Dispase II	Roche Applied Biosciences	4942078001	Stosowany w 0,04%
Kolagenaza II	Worthington Lab	4176	Stosowany w 0,25%
DNazy I	Roche Applied Biosciences	11284932001	komórkowych 0,01%
70 mm	BD Falcon	352350
[header]
PE-sprzężony klon VEGFR-3 9D9F9, klon WM59	BioLegend	356204	Stosowany w rozcieńczeniu 1:50
PE-Cy7-sprzężony CD34, klon 581	BioLegend	343516	Stosowany w rozcieńczeniu 1:200
Sprzężony z APC mysz anty ludzki CD31, klon WM59	BioLegend	303116,	Stosowany w rozcieńczeniu 1:100
Alexa 488-sprzężony szczur anty ludzka Podoplanina, klon NC-80.	BioLegend	337006	Stosowany w rozcieńczeniu 1:200
Mysz sprzężona z PE IgG1, izotyp k, klon MOPC-21	BioLegend	400112	Stosowany w rozcieńczeniu 1:50
IgG1 myszy sprzężony z PE-Cy7, izotyp k, klon MOPC-21	BioLegend	400126	Stosowany w rozcieńczeniu 1:200
Mysz sprzężona z APC IgG1, izotyp k, klon MOPC-21	BioLegend	400120	Stosowany w rozcieńczeniu
1:100IgG2a myszy sprzężonej z Alexa 488, izotyp k, klon RATK2758	BioLegend	400525	Używany w rozcieńczeniu 1:200