Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zaburzenia układu limfatycznego, takie jak pierwotny obrzęk limfatyczny, wady rozwojowe układu limfatycznego i guzy limfatyczne, są rzadkimi schorzeniami, które powodują znaczną zachorowalność, ale niewiele wiadomo o ich biologii. Wyizolowanie ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego o wysokiej czystości (LEC) z chorych i zdrowych tkanek ułatwiłoby badania śródbłonka limfatycznego na poziomie genetycznym, molekularnym i komórkowym. Przewiduje się, że badania te mogą ujawnić cele dla nowych terapii, które mogą zmienić kliniczne leczenie tych schorzeń. Przedstawiono protokół opisujący izolację LEC ludzkiego napletka i komórek śródbłonka limfatycznego malformacji limfatycznych (LM LEC). Aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, tkankę rozdrabniono i poddano obróbce enzymatycznej przy użyciu dypazy II i kolagenazy II. Otrzymaną zawiesinę jednokomórkową oznaczono następnie przeciwciałami przeciwko markerom grupowania różnicowania (CD) CD34, CD31, czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego-3 (VEGFR-3) i PODOPLANINIE. Barwione żywe komórki posortowano na fluorescencyjnie aktywowanym sortowniku komórek (FACS) w celu oddzielenia populacji CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC od innych komórek śródbłonka i nieśródbłonka. Posortowane LM LEC hodowano i namnażano na kolbach pokrytych fibronektyną w celu dalszego wykorzystania eksperymentalnego.
Wprowadzenie
Główną funkcją układu naczyń limfatycznych jest wchłanianie limfy, czyli nadmiaru płynu śródmiąższowego zawierającego lipidy, białka i komponenty komórkowe, oraz transportowanie jej do żylnego układu krwi krążenia. Sieć naczyń limfatycznych kieruje limfę do węzłów chłonnych, gdzie jest ona filtrowana w celu wykrycia obecności obcych antygenów, co stanowi istotny proces w nadzorze immunologicznym i rozmieszczaniu białych krwinek w celu neutralizacji obcych antygenów.
Jednokierunkowy układ limfatyczny rozpoczyna się w tkankach od początkowych naczyń włosowatych limfatycznych, będących unikalną strukturą z nieciągłą, pojedynczą warstwą cienkoś....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Etyczna zgoda na pobieranie malformacji limfatycznych i tkanek napletka została uzyskana od Komisji Etyki Badań Naukowych na Ludziach w Królewskim Szpitalu Dziecięcym w Melbourne, Australia. Przed zabiegiem uzyskano podpisaną zgodę od rodziców pacjentów. Próbki tkanek pobrano od pacjentów, u których zdiagnozowano LM poddawanych zabiegom chirurgicznym w ramach postępowania klinicznego oraz od pacjentów poddawanych planowemu obrzezaniu. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych w Australii.
1. Przygotowanie zawiesiny komórkowej z tkanek malformacji napletka....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po wstępnym trawieniu tkanki, po 24 godzinach hodowli niefrakcjonowanych próbek, można zaobserwować wyraźne kolonie komórek śródbłonka (Rycina 2A) wraz z komórkami fibroblastopodobnymi i komórkami mięśni gładkich. Po sortowaniu i 24 godzinach hodowli komórkowej, komórki CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPodoplaninPos przylegają i wykazują typową morfologię brukową (Rycina 2B oraz C). Stosując opisaną powyżej metodę FACS, jesteśmy w stani.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
LEC odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy płynów, odpowiedzi immunologicznej na obce antygeny oraz wchłanianiu i transporcie niektórych składników odżywczych. Na homeostazę LEC mogą wpływać procesy chorobowe, takie jak infekcje bakteryjne i przerzuty nowotworowe, ale LEC mogą również rozwijać mutacje somatyczne, które powodują powstawanie dysfunkcyjnych naczyń limfatycznych i znaczną zachorowalność u pacjentów dotkniętych chorobą. Aby lepiej zrozumieć etiologię malformacji limfatycznych poprzez implantację in .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Fundacji Bakera i Royal Children's Foundation 'Women in Science Fellowship' za wsparcie Zeriny Lokmic. Andrew G. Elefanty i Edouard G. Stanley są starszymi pracownikami naukowymi NHMRC. Prace w ich laboratoriach były wspierane przez NHMRC i Stem Cells Australia.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Służy do pobierania próbek tkanek z sali operacyjnej. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit zawiera 500 ml pożywki EBM-2 i ludzkiego EGF, hydrokortyzonu, gentamycyny (GA-1000), płodowej surowicy bydlęcej (FBS), VEGF, ludzkiego FGF-b, R3-IGF-1 i kwasu askorbinowego. |
| VEGF-C | R& D Systems | 2179-VC-025 | Kompletne podłoże komórkowe śródbłonka uzupełniono o 50 ng/ml VEGF-C |
| Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | Ten roztwór zawiera 10 000 U/ml penicyliny, 10 000 mg/ml streptomycyny i 25 mg/ml leku przeciwgrzybiczego Fungizone. Stosować w rozcieńczeniu 1:100. |
| Fibronektyna z ludzkiego osocza | Sigma-Aldrich | F2006 | Stosowana w stężeniach 10 mg / ml. Może być ponownie używany przez okres do 1 miesiąca, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4 ° C i utrzymywane w sterylności. Posługiwać się 7 ml do pokrycia 150 cm2 kolby. |
| StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórek | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro® Akumulator® stosuje się w ilości 0,05 ml na cm2 w celu pokrycia całej powierzchni kolby. Użycie mniejszych objętości może spowodować niepełne odłączenie komórek. |
| 0,4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Stosowany jako barwnik żywotności. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Stosowany w 0,04% |
| Kolagenaza II | Worthington Lab | 4176 | Stosowany w 0,25% |
| DNazy I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | komórkowych 0,01% |
| 70 mm | BD Falcon | 352350 | |
| [header] | |||
| PE-sprzężony klon VEGFR-3 9D9F9, klon WM59 | BioLegend | 356204 | Stosowany w rozcieńczeniu 1:50 |
| PE-Cy7-sprzężony CD34, klon 581 | BioLegend | 343516 | Stosowany w rozcieńczeniu 1:200 |
| Sprzężony z APC mysz anty ludzki CD31, klon WM59 | BioLegend | 303116, | Stosowany w rozcieńczeniu 1:100 |
| Alexa 488-sprzężony szczur anty ludzka Podoplanina, klon NC-80. | BioLegend | 337006 | Stosowany w rozcieńczeniu 1:200 |
| Mysz sprzężona z PE IgG1, izotyp k, klon MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Stosowany w rozcieńczeniu 1:50 |
| IgG1 myszy sprzężony z PE-Cy7, izotyp k, klon MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Stosowany w rozcieńczeniu 1:200 |
| Mysz sprzężona z APC IgG1, izotyp k, klon MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Stosowany w rozcieńczeniu |
| 1:100IgG2a myszy sprzężonej z Alexa 488, izotyp k, klon RATK2758 | BioLegend | 400525 | Używany w rozcieńczeniu 1:200 |
Bibliografia
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
