Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52691

⸱

1 maja 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Murdoch Childrens Research Institute, The Royal Children’s Hospital, 2Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne, 3Department of Anatomy and Developmental Biology, Faculty of Medicine, Nursing and Health Sciences, Monash University, Clayton

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.

Streszczenie

Zaburzenia układu limfatycznego, takie jak pierwotny obrzęk limfatyczny, wady rozwojowe układu limfatycznego i guzy limfatyczne, są rzadkimi schorzeniami, które powodują znaczną zachorowalność, ale niewiele wiadomo o ich biologii. Wyizolowanie ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego o wysokiej czystości (LEC) z chorych i zdrowych tkanek ułatwiłoby badania śródbłonka limfatycznego na poziomie genetycznym, molekularnym i komórkowym. Przewiduje się, że badania te mogą ujawnić cele dla nowych terapii, które mogą zmienić kliniczne leczenie tych schorzeń. Przedstawiono protokół opisujący izolację LEC ludzkiego napletka i komórek śródbłonka limfatycznego malformacji limfatycznych (LM LEC). Aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, tkankę rozdrabniono i poddano obróbce enzymatycznej przy użyciu dypazy II i kolagenazy II. Otrzymaną zawiesinę jednokomórkową oznaczono następnie przeciwciałami przeciwko markerom grupowania różnicowania (CD) CD34, CD31, czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego-3 (VEGFR-3) i PODOPLANINIE. Barwione żywe komórki posortowano na fluorescencyjnie aktywowanym sortowniku komórek (FACS) w celu oddzielenia populacji CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC od innych komórek śródbłonka i nieśródbłonka. Posortowane LM LEC hodowano i namnażano na kolbach pokrytych fibronektyną w celu dalszego wykorzystania eksperymentalnego.

Wprowadzenie

Główną funkcją układu naczyń limfatycznych jest wchłanianie limfy, czyli nadmiaru płynu śródmiąższowego zawierającego lipidy, białka i komponenty komórkowe, oraz transportowanie jej do żylnego układu krwi krążenia. Sieć naczyń limfatycznych kieruje limfę do węzłów chłonnych, gdzie jest ona filtrowana w celu wykrycia obecności obcych antygenów, co stanowi istotny proces w nadzorze immunologicznym i rozmieszczaniu białych krwinek w celu neutralizacji obcych antygenów.

Jednokierunkowy układ limfatyczny rozpoczyna się w tkankach od początkowych naczyń włosowatych limfatycznych, będących unikalną strukturą z nieciągłą, pojedynczą warstwą cienkościennych, płaskich komórek śródbłonka z wyspecjalizowanymi połączeniami międzykomórkowymi, które umożliwiają wnikanie limfy1,2. Naczynia włosowate te są przytwierdzone do sąsiedniej macierzy tkanki łącznej za pomocą włókien kotwiczących, co zapobiega zapadaniu się naczyń w obecności zwiększonego ciśnienia śródmiąższowego3. Początkowe naczynia włosowate limfatyczne uchodzą do zbierających naczyń włosowatych limfatycznych, które łączą się w większe naczynia limfatyczne lub żyły limfatyczne. W porównaniu do początkowych naczyń włosowatych limfatycznych, zbierające naczynia limfatyczne mają grubsze ściany, sparowane zastawki limfatyczne oraz są otoczone nieciągłą błoną podstawną, w której zatopionych jest kilka komórek mięśni gładkich4. Skoordynowane otwieranie i zamykanie zastawek limfatycznych oraz skurcze komórek mięśni gładkich ułatwiają przepływ limfy3. U ludzi żyły limfatyczne z różnych regionów ciała łączą się, tworząc pnie limfatyczne, które następnie zlewają się w dwa przewody limfatyczne: przewód piersiowy oraz prawy przewód limfatyczny. Przewód piersiowy odprowadza limfę z lewej strony ciała oraz z prawej strony poniżej klatki piersiowej, natomiast prawy przewód limfatyczny odprowadza limfę z prawego ramienia oraz prawej strony głowy, szyi i klatki piersiowej. Oba przewody odprowadzają limfę do żył podobojczykowych w okolicy szyi5.

Zaburzenia układu limfatycznego dzielą się szeroko na nabyte i wrodzone (Tabela 1). Przykładami stanów nabytych są zapalenie naczyń limfatycznych oraz wtórny obrzęk limfatyczny. Zapalenie naczyń limfatycznych to stan zapalny naczynia limfatycznego spowodowany infekcją bakteryjną. Dotknięte naczynia limfatyczne rozszerzają się i wypełniają wysiękiem zawierającym komórki wielojądrzaste. W skórze naczynia te są widoczne jako czerwone, bolesne pręgi podskórne, którym często towarzyszy powiększenie powiązanego z nimi drenującego węzła chłonnego (limfadenitis)6. Wtórny obrzęk limfatyczny powstaje w następstwie uszkodzenia lub niedrożności naczynia limfatycznego bądź niedrożności węzła chłonnego. Prowadzi to do chronicznej, postępującej opuchlizny z powodu gromadzenia się chłonki dystalnie względem miejsca uszkodzenia lub niedrożności. W krajach rozwiniętych wtórny obrzęk limfatyczny najczęściej wiąże się z nowotworami złośliwymi, w których przerzutowe guzy blokują naczynia limfatyczne lub regionalne węzły chłonne, lub jest konsekwencją terapii przeciwnowotworowej po chirurgicznym usunięciu węzłów chłonnych, włóknieniu po napromieniowaniu oraz zakrzepicy i bliznowaceniu pozapalnym7. W innych częściach świata wtórny obrzęk limfatyczny może wynikać z niedrożności limfatycznej spowodowanej przez nicienie pasożytnicze, takie jak Wuchereria bancrofti6.

Zaburzenia układu naczyniowego limfatycznego
NabytyWrodzony
Zapalenie węzłów chłonnych
Wtórny obrzęk limfatyczny		Pierwotny obrzęk limfatyczny10Sporadyczne malformacje limfatyczne13Malformacje limfatyczne związane z zespołami syndromicznymi13
np.
Zespół Milroya
Zespół Meige'a		Prosty:
Malformacje limfatyczne		np.
Zespół Klippela-Trenaunay
Zespół Parksa-Webera
Zespół Sturge-Weber
Połączone:
Wrodzone wady naczyniowe kapilarno-limfatyczne
Malformacja kapilarno-limfatyczno-żylna
Wrodzona malformacja naczyniowa kapilarno-limfatyczno-tętniczo-żylna
Wrodzona malformacja naczyniowa typu kapilarno-limfatycznego, żylnego i tętniczo-żylnego

Tabela 1. Przegląd zaburzeń układu naczyniowego limfatycznego.

Wrodzone zaburzenia układu limfatycznego obejmują pierwotny (idiopatyczny) obrzęk limfatyczny, który uważa się za spowodowany mutacjami genetycznymi, limfangiektazję oraz anomalie układu limfatycznego8,9. Pierwotny obrzęk limfatyczny może mieć charakter sporadyczny, prawdopodobnie wywołany mutacjami de novo, lub dziedziczny. Zaburzenia limfatyczne mogą występować w izolacji lub stanowić część bardziej uogólnionego zespołu10. W populacji pediatrycznej 97% przypadków obrzęku limfatycznego ma charakter sporadyczny, z nieprawidłowościami w strukturze naczyń limfatycznych, które upośledzają regionalny drenaż limfy11. Choroba Milroya jest przykładem pierwotnego obrzęku limfatycznego spowodowanego mutacją w genie VEGFR-3, widocznym przy urodzeniu lub wkrótce po nim12. Choć jest to głównie schorzenie rodzinne, chorobę Milroya można zidentyfikować również u niemowląt bez rodzinnego wywiadu w kierunku tej choroby32. Stopień nasilenia każdego obrzęku limfatycznego zależy od ilości produkowanej limfy oraz zdolności do jej transportu z powrotem do krążenia żylnego6.

Na podstawie obrazu klinicznego oraz proliferacji komórek śródbłonka in situ, anomalie układu limfatycznego klasyfikuje się jako guzy limfatyczne lub malformacje limfatyczne13. Przykładem guza LEC jest limfangiomatoza kaposiformna14. Uważa się, że malformacje limfatyczne powstają podczas rozwoju embrionalnego i rosną proporcjonalnie do wzrostu dziecka15,16. Rzadko ulegają regresji, lecz mogą pozostać bezobjawowe do momentu, gdy uraz lub infekcja wywoła szybki wzrost prowadzący do powikłań klinicznych. Opisana powyżej uporządkowana struktura sieci limfatycznej i odprowadzanie chłonki z tkanek do krążenia żylnego są zaburzone w malformacjach limfatycznych, które składają się z zlokalizowanych skupisk nieprawidłowych struktur torbielowatych wypełnionych chłonką. Choć nie ma dowodów klinicznych ani eksperymentalnych na to, że naczynia torbielowate te są połączone z krążeniem limfatycznym lub że zawierają funkcjonalne zastawki limfatyczne, ich tożsamość limfatyczna jest potwierdzona ekspresją szeregu markerów komórek limfatycznych, takich jak PODOPLANIN, CD31, receptor śródbłonka naczyń limfatycznych 1 (LYVE-1), białko Prospero homeobox 1 (PROX-1) oraz VEGFR-315,17,18. Struktury torbielowate te mogą być małe (mikrotorbielowate) lub duże (makrotorbielowate), jednak większość malformacji limfatycznych zawiera zarówno komponenty mikrotorbielowate, jak i makrotorbielowate (Rysunek 1)16. Po zabiegach chirurgicznych, skleroterapii iniekcyjnej i/lub ablacji radiofrekwencyjnej malformacje limfatyczne często nawracają.

Histologia tkanki wątroby z barwionymi komórkami, strzałki wskazujące struktury, analiza mikroskopowa.
Rysunek 1. Morfologia ludzkich naczyń limfatycznych i malformacji limfatycznych. Normalne ludzkie naczynia limfatyczne (A) oraz naczynia w malformacjach limfatycznych (B i C) znakowane przeciwciałem przeciwko PODOPLANINIE (brązowe barwienie, strzałka). Ludzkie naczynia w malformacjach limfatycznych charakteryzują się wyraźnym rozszerzeniem i znaczną zmiennością średnicy światła. Te zlokalizowane nieprawidłowe struktury torbielowate mogą być małe (mikrotorbielowate, *) (B) lub duże (makrotorbielowate, #) (C). Większość malformacji limfatycznych zawiera komponenty zarówno mikrotorbielowate, jak i makrotorbielowate. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję rysunku.

Niektórzy badacze sugerowali, że malformacje limfatyczne stanowią zaburzenie rozwojowe naczyń limfatycznych, w którym komórki śródbłonka limfatycznego (LEC) nie posiadają nieprawidłowego potencjału wzrostu, lecz nie połączyły się z normalnym krwiobiegiem19. Stwierdziliśmy jednak, że LEC z malformacji limfatycznych (LM) proliferują szybciej i są bardziej odporne na apoptozę niż LEC ze skóry napletka15, co sugeruje obecność pierwotnego defektu w LEC z LM. Po wszczepieniu LEC z LM w mysim modelu ksenoprzeszczepu tworzą one struktury przypominające malformacje limfatyczne15. Wspiera to hipotezę, że malformacje limfatyczne mogą być spowodowane jedną lub wieloma mutacjami somatycznymi powstającymi w LEC z LM podczas rozwoju płodowego. Rzeczywiście, w ostatnich doniesieniach zidentyfikowano jedną taką mutację w podjednostce katalitycznej p110α fosfoinozytydio-3-kinazy (gen PIK3CA)20.

Biorąc pod uwagę postępy w technologii sekwencjonowania DNA, odpowiednie mutacje mogłyby zostać łatwiej zidentyfikowane w izolowanych LEC z LM, co byłoby wskazówką dla przyszłych badań nad tymi schorzeniami. Izolacja żywotnych LEC ułatwiłaby porównania między nieprawidłowymi a prawidłowymi LEC w testach takich jak migracja, proliferacja, zdolność do tworzenia cewek oraz przeżywalność w odpowiedzi na ograniczoną dostępność składników odżywczych lub czynniki proapoptotyczne15. Izolowane LEC pozwoliłyby nam ponadto na przeprowadzenie specyficznych dla komórek badań ekspresji genów i proteomiki, aby wyodrębnić nowe subpopulacje LEC i odkryć nowe środki farmakologiczne odpowiednie do klinicznego leczenia malformacji limfatycznych.

Wcześniej opublikowaliśmy metodę izolacji LEC opartą na separacji magnetycznej LEC z napletka noworodka i malformacji limfatycznych15. Przedstawiliśmy strategię oddzielania prawidłowych i chorych LEC od komórek śródbłonka naczyniowego w oparciu o brak ekspresji CD34, a następnie poddanie frakcji komórek CD34Neg selekcji pozytywnej pod kątem CD31. Metoda ta była jednak utrudniona przez obecność resztkowych komórek nieśródbłonkowych. Zjawisko to występowało niezależnie od usunięcia naskórka przed następującym po nim trawieniem tkanki łącznej. Zanieczyszczenia te zazwyczaj proliferowały szybciej, przez co w konsekwencji przerastały kultury komórek śródbłonka, mimo późniejszych prób powtórzenia izolacji LEC. W rzeczywistości początkowe zanieczyszczenie komórkami nieśródbłonkowymi na poziomie zaledwie 2% do 5% było wystarczające, aby zdominować populację LEC15. Skłoniło nas to do zbadania metody sortowania komórek z użyciem fluorescencji (FACS) jako opcji poprawy wydajności i czystości uzyskanych LEC. Dodatkowo zastosowaliśmy sortowanie wieloparametryczne w celu zwiększenia specyficzności populacji LEC, dodając VEGFR-3 i PODOPLANIN do markerów selekcyjnych, aby zidentyfikować LEC o fenotypie CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos.

Uzasadnienie wyboru tych markerów oparto na doniesieniach, z których wynika, że choć LEC i śródbłonek naczyń krwionośnych mają wiele wspólnych markerów powierzchniowych, takich jak CD31, LEC wykazują zmienność fenotypową w ekspresji markerów powierzchniowych CD34, PODOPLANIN oraz VEGFR-3 w porównaniu do śródbłonka naczyń krwionośnych21-23. CD31 jest 130 kDa transmembrane glycoprotein, znaną również jako cząsteczka adhezyjna płytek krwi i śródbłonka 1 (PECAM-1). Jest ona uważana za pan-endotelialny marker komórkowy, ponieważ wykazuje ekspresję we wszystkich typach naczyń krwionośnych i limfatycznych21,24,25. CD34 to 110-kDa transmembrane glycoprotein obecna w większości hematopoetycznych komórek progenitorowych i macierzystych, komórkach śródbłonka naczyniowego oraz w niektórych naczyniach limfatycznych26.

VEGFR-3, receptor dla czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego C i D, występuje początkowo w rozwijających się żyłach zarodka myszy, jednak po specyfikacji limfatycznej regulowanej przez czynniki transkrypcyjne SRY-related HMG-box (SOX)-18, chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 2 (COUPTF-II) oraz PROX-1, ekspresja żylna VEGFR-3 zanika, a jego obecność ogranicza się do zarodkowych LECs25,27. PODOPLANIN, błonowe mukoprotein o masie 38 kDa, jest po raz pierwszy zauważany w naczyniach limfatycznych około 11. dnia rozwoju zarodkowego myszy (~E11.0) 28; podczas gdy jest on silnie eksprimowany przez mikro naczyniowe naczynia limfatyczne, ekspresja PODOPLANIN przez makrocystyczne śródbłonek limfatyczny w malformacjach limfatycznych jest bardziej zmienna15. Eksperymenty z wykorzystaniem cytometrii przepływowej sugerują, że przynajmniej część komórek śródbłonka CD34HighCD31Pos eksprimuje marker limfatyczny PODOPLANIN29. Chociaż systematyczna ocena barwienia LYVE-1 i PODOPLANIN w ludzkich malformacjach limfatycznych wykazała, że oba są skuteczne w barwieniu śródbłonka malformacji limfatycznych30, w tkankach prawidłowych zgłoszono, że LYVE-1 występuje silnie w śródbłonku początkowych naczyń włosowatych limfatycznych, ale jest zredukowany, a nawet nieobecny w śródbłonku naczyń zbiorczych31. Ponieważ naszym celem jest izolacja zarówno początkowych, jak i zbiorczych komórek śródbłonka limfatycznego, zdecydowaliśmy się nie używać LYVE-1 jako części naszej strategii selekcji komórek. Wreszcie, decyzja o zastosowaniu tych markerów opierała się również na dostępności przeciwciał stosowanych diagnostycznie do znakowania naczyń limfatycznych w obrazowaniu mikroskopowym, co umożliwi korelację między cytometrią przepływową a badaniami immunofluorescencyjnymi.

W niniejszym artykule opisano metodę trawienia tkanek, barwienia komórek oraz ustawienia FACS niezbędne do skutecznej izolacji LECs CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos oraz komórek śródbłonka CD34HighCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos z tkanki napletka i tkanki malformacji limfatycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Etyczna zgoda na pobieranie malformacji limfatycznych i tkanek napletka została uzyskana od Komisji Etyki Badań Naukowych na Ludziach w Królewskim Szpitalu Dziecięcym w Melbourne, Australia. Przed zabiegiem uzyskano podpisaną zgodę od rodziców pacjentów. Próbki tkanek pobrano od pacjentów, u których zdiagnozowano LM poddawanych zabiegom chirurgicznym w ramach postępowania klinicznego oraz od pacjentów poddawanych planowemu obrzezaniu. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych w Australii.

1. Przygotowanie zawiesiny komórkowej z tkanek malformacji napletka i limfatycznego

  1. i przygotowanie pożywek.
    1. Przygotuj kompletną pożywkę dla komórek śródbłonka za pomocą dostępnego w handlu zestawu EGM-2 MV Bullet Kit, podgrzewając pożywkę EGM-2 i delikatnie rozmrażając elementy zestawu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II asepcyjnie dodać każdy składnik do pożywki EGM-2. Po dodaniu wszystkich składników do pożywki należy nazywać tę pożywkę "kompletną pożywką dla komórek śródbłonka". Użyj sterylnej pipety o pojemności 50 ml, aby wymieszać zawartość przed użyciem.
      UWAGA: Wszystkie etapy związane z hodowlą komórkową są wykonywane w komorze zagrożenia biologicznego klasy II. Wszystkie roztwory są przechowywane w temperaturze 4 °C zgodnie z instrukcjami producenta i przed użyciem są podgrzewane do temperatury pokojowej. Kompletne podłoża komórkowe śródbłonka, do hodowli komórkowych i roztwory enzymatyczne ogrzewa się w temperaturze 37 °C przez 20 minut przed użyciem.
    2. Uzupełnij kompletne pożywki komórkowe śródbłonka w 50 ng/ml VEGF-C. Uzupełnioną pożywkę z komórek śródbłonka rozmieścić w sterylnych probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Pożywka jest stabilna przez co najmniej 4 tygodnie, jeśli jest przechowywana w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami bez wapnia i magnezu (PBS), rozpuszczając 8,752 g NaCl, 1,416 g Na2HPO, 4,2H2O i 0,395 g KH2PO4 w 1 000 ml wody. Dostosuj pH do 7,4. Filtrować, sterylizować PBS za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem dodać roztwór antybiotyku/antybiotyku (stosowany w stosunku 1:100).
    4. Aby przygotować ludzką fibronektynę, rozpuść 1 mg fibronektyny w 10 ml sterylnej wody. Przygotowany roztwór należy przechowywać w 100 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C. W dniu użycia dodać 10 ml sterylnego PBS do 100 μl podwielokrotności fibronektyny (aby uzyskać końcowe stężenie robocze 10 μg/ml).
    5. Dla pożywek enzymatycznych należy przygotować roztwór zawierający 0,04% dyspazy II, 0,25% kolagenazy II i 0,01% DNazy I w sterylnym PBS. Najpierw zważyć dypazę i kolagenazę, umieścić w sterylnej probówce o pojemności 50 ml, dodać wymaganą objętość PBS i inkubować przez 30 minut, wstrząsając w temperaturze 37 °C do rozpuszczenia. Po rozpuszczeniu wysterylizuj filtr (filtr 0,22 μm) roztwór dypazy/kolagenazy w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Dodać w asepcie DNazę I. Roztwór enzymatyczny należy przechowywać w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
      UWAGA: DNaza I jest komercyjnym odczynnikiem klasy do hodowli komórkowych dostępnym w postaci sterylnego liofilizowanego proszku.

2. Przygotowanie zawiesiny komórek z napletka i malformacji limfatycznych

  1. Zważyć probówkę o pojemności 50 ml zawierającą 10 ml DMEM/2% roztworu antybiotyku przeciwgrzybiczego. Ta probówka będzie używana do pobierania tkanek.
  2. Po chirurgicznym usunięciu malformacji limfatycznych i tkanek napletka, w asepcie dodać próbkę tkanki do probówki i przenieść na lodzie do laboratorium hodowli komórkowych.
  3. Zważyć probówkę zawierającą tkankę i obliczyć masę tkanki. Użyj tej wagi, aby obliczyć objętość roztworu enzymatycznego potrzebnego do strawienia tkanki.
  4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść tkankę i pożywkę do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm. Użyj sterylnych nożyczek, aby drobno zmielić tkankę na ~1 mm3 kawałki.
  5. Tkankę mieloną zmieszaną z pożywką przenieść do probówki o pojemności 50 ml zawierającej dodatkowe 10 ml sterylnego roztworu przeciwgrzybiczego DMEM/2% antybiotyku. Wymieszaj przez odwrócenie, aby ponownie zawiesić tkankę. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut.
  6. Usunąć supernatant. W zależności od masy tkanki dodać 1 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu trawiącego kolagenazy II/DNazy I/Dyspazy II na 100 mg tkanki mielonej. Zazwyczaj należy użyć 10 ml roztworu enzymatycznego na około 1 g tkanki mielonej.
  7. Inkubować tkankę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 20-90 minut, stale wstrząsając z prędkością 200 obr./min. Pod koniec tego okresu upewnij się, że prawie cała tkanka została strawiona na drobne fragmenty.
    UWAGA: Narażenie komórek na kolagenazę i dyspazę w czasie izolacji z tkanek pierwotnych wpływa na przeżycie komórek. Stwierdziliśmy empirycznie, że większość próbek napletka noworodków optymalnie wymaga 20-30 minut trawienia, podczas gdy próbki zwłóknieniowych malformacji limfatycznych mogą wymagać 60-90 minut trawienia. Na wydajność LM LEC ma wpływ ilość obecnego zwłóknienia, więcej tkanki włóknistej daje mniej komórek, prawdopodobnie z powodu szkodliwych skutków długotrwałej ekspozycji na kolagenazę II i dypazę II.
  8. Po roztrawieniu przenieść probówkę do komory bezpieczeństwa biologicznego i przepuścić strawiony roztwór tkankowy przez sitko o średnicy 70 μm umieszczone w sterylnej probówce o pojemności 50 ml. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml z gumowym tłokiem rozdrobnić pozostałą tkankę, aż zaobserwuje się tylko niewielkie ślady macierzy zewnątrzkomórkowej.
  9. Przemyć sitko komórkowe objętością pożywki z komórek śródbłonka równą objętości dysocjującego podłoża enzymatycznego w celu odzyskania komórek przyklejonych do sita i dezaktywacji enzymów. Na przykład, aby uzyskać 2 ml pożywki enzymatycznej dysocjującej w celu strawienia tkanki mielonej, dodaj 2 ml pożywki z komórek śródbłonka, aby dezaktywować enzymy.
  10. Odwirować roztwór komórkowy o stężeniu 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant. R>e zawiesić komórki w 10 ml PBS. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, a następnie powtórzyć dwukrotne płukanie komórek. >Zawiesić osad komórkowy w 20 ml pożywki dla komórek śródbłonka. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego, a następnie zasiej 2 x 10>6 komórek w kolbie o pojemności 150 cm>2 wstępnie pokrytej fibronektyną w końcowej objętości 20 ml pożywki z komórek śródbłonka. Hodowla w temperaturze 37 °C w 5% CO>2 w inkubatorze z nawilżanym powietrzem.>
    UWAGA: Oczekuje się, że 75%-90% komórek jądrzastych przetrwa trawienie tkankowe, zgodnie z oszacowaniem przez wykluczenie błękitu trypanowego. Początkowa liczba komórek odzwierciedla wszystkie komórki jądrzaste w zawiesinie komórkowej (tj. keratynocyty, leukocyty, makrofagi, komórki tkanki łącznej i komórki naczyń krwionośnych). Liczba komórek po 5-7 dniach odzwierciedla komórki, które przyczepiły się, przetrwały i namnażały się podczas hodowli komórek. Powlekanie kolb do hodowli tkankowych fibronektyną poprawia również późniejsze przeżycie LEC i LM LEC.
  11. Po całonocnej inkubacji zmyć niezwiązane komórki w trzech przemyciach PBS/1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym i dodać świeżą pożywkę komórkową śródbłonka. Przeprowadzić trzy płukania, aby skutecznie usunąć niezwiązane komórki i czerwone krwinki obecne w kolbie. Zmieniaj nośniki co drugi dzień. Komórki będą zlewać się w ~80% po 5-7 dniach.

3. Barwienie komórek przeciwciałami dla markerów powierzchni komórek śródbłonka limfatycznego do cytometrii przepływowej

  1. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, odessać pożywkę i przepłukać komórki PBS.
  2. Odłączyć przylegające komórki przez inkubację komórek z 7 ml roztworu do odrwadzania komórek, takiego jak Accutase na 150cm2 kolbę, przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Zebrać oderwane komórki, dezaktywować roztwór do odłączania komórek, dodając 3 objętości pożywki z komórek śródbłonka i przenieść zawiesinę komórek do nowej sterylnej probówki.
  4. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 5 minut.
  5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml PBS. Odwirować komórki o masie 300 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, a następnie powtórzyć płukanie komórek. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml PBS.
  6. Policz liczbę żywotnych komórek. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórkowej z 90 μl 0,4% błękitu trypanowego. Przenieść 10 μl tej zawiesiny do hemocytometru w celu obliczenia.
    UWAGA: Ostateczna wydajność komórek będzie zależeć od wielkości przetwarzanej próbki. Typowa wydajność komórek z kolby o długości 150cm2 waha się od 7 x 105 do 1,2 x 106 komórek żywotnych.
  7. Przygotuj roztwory przeciwciał do barwienia komórek.
    UWAGA: Następujące rozcieńczenia miareczkowano do barwienia 1 x 106 w objętości barwienia 100 μl.
    1. Rozcieńczony PE sprzężony mysz anty ludzki VEGFR-3 (1:50); PE-Cy7 sprzężony mysz anty ludzki sprzężony CD34 (1:200); Sprzężona z APC mysia anty ludzka CD31 (1:100) i Alexa 488-sprzężona szczura anty ludzka PODOPLANINA (1:200) w łącznej objętości 100 μl sterylnego 5% roztworu FBS/PBS na próbkę tkanki. Po przygotowaniu roztworu przeciwciał przechowywać na lodzie do czasu użycia. Podobnie przygotować rozcieńczoną mieszaninę przeciwciał kontrolnych izotypu, aby ułatwić ustawienie bramek cytometrii przepływowej.
  8. Aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przeciwciał, odwirować komórki przy 300 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant, a następnie zawiesić komórki w 100 μl sterylnego 5% roztworu FBS/PBS na próbkę do barwienia. Inkubować komórki na lodzie przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut, usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w sprzężonym koktajlu przeciwciał. Wybarwić również mniejszą porcję komórek (1 x 105) w 100 μl mieszaniny przeciwciał kontrolujących izotyp. Inkubować komórki na lodzie przez 20 minut.
  10. W celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała dodać 2 ml 2% roztworu FBS/PBS i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i powtórzyć płukanie.
  11. Zawiesić osad komórkowy do kontroli izotypu i próbkę barwioną przeciwciałami, która ma być posortowana w 300 μl 0,5 mg/ml roztworu jodku propidyny/2% FBS/PBS. Umieść probówki na lodzie do czasu sortowania.

4. Sortowanie komórek

  1. Do konfiguracji przyrządu należy użyć następujących materiałów: kulek wyrównujących, takich jak dostępne w handlu cząstki fluorescencyjne, płyn osłonowy na bazie soli fizjologicznej buforowany fosforanami oraz kulki opóźniające upadek, takie jak kulki fluorescencyjne Accudrop.
  2. Wyizoluj oczyszczone ludzkie LEC na wieloparametrowym przyrządzie do sortowania komórek aktywowanym fluorescencją. Ustaw przyrząd i wyrównaj zgodnie z zaleceniami producenta. Ponadto należy przeprowadzić pojedyncze kontrole kompensacji barwienia dla każdego rodzaju, aby wygenerować matrycę kompensacyjną, a tym samym wyeliminować znaczne krwawienie emisji fluorochromów, takich jak PE, do kanału PE-Cy.
    UWAGA: Większa część komórek posortowanych przez FACS przeżywa izolację, jeśli używana jest dysza 100 μm, a komórki są sortowane na pożywkę komórkową śródbłonka.

5. Sortowanie po FACS w hodowli komórkowej

  1. Po sortowaniu odwirować komórki w stężeniu 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5-10 ml pożywki (w zależności od kolby użytej do wysiewu komórki). Jeśli posortowanych jest mniej niż 50 000 komórek, komórki są hodowane w kolbie pokrytej fibronektyną o średnicy 25cm2.
  2. W przeciwnym razie hodować komórki w kolbie pokrytej fibronektyną o długości 75cm2 w temperaturze 37 °C w inkubatorze nawilżanym powietrzem o stężeniu 5%CO2. Zmień nośnik po 2 dniach.
    UWAGA: Pożywka komórkowa jest zmieniana co drugi dzień, ponieważ wydłużenie czasu między zmianami pożywki wydaje się sprzyjać przetrwaniu komórek nieśródbłonkowych. Walidujemy fenotyp komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą immunohistochemicznej detekcji markerów: PROX-1, VEGFR-3, Podoplaniny, CD34 i CD31, gdy komórki są najpierw dzielone w celu dalszej ekspansji15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po wstępnym trawieniu tkanki, po 24 godzinach hodowli niefrakcjonowanych próbek, można zaobserwować wyraźne kolonie komórek śródbłonka (Rycina 2A) wraz z komórkami fibroblastopodobnymi i komórkami mięśni gładkich. Po sortowaniu i 24 godzinach hodowli komórkowej, komórki CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPodoplaninPos przylegają i wykazują typową morfologię brukową (Rycina 2B oraz C). Stosując opisaną powyżej metodę FACS, jesteśmy w stani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

LEC odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy płynów, odpowiedzi immunologicznej na obce antygeny oraz wchłanianiu i transporcie niektórych składników odżywczych. Na homeostazę LEC mogą wpływać procesy chorobowe, takie jak infekcje bakteryjne i przerzuty nowotworowe, ale LEC mogą również rozwijać mutacje somatyczne, które powodują powstawanie dysfunkcyjnych naczyń limfatycznych i znaczną zachorowalność u pacjentów dotkniętych chorobą. Aby lepiej zrozumieć etiologię malformacji limfatycznych poprzez implantację in ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Fundacji Bakera i Royal Children's Foundation 'Women in Science Fellowship' za wsparcie Zeriny Lokmic. Andrew G. Elefanty i Edouard G. Stanley są starszymi pracownikami naukowymi NHMRC. Prace w ich laboratoriach były wspierane przez NHMRC i Stem Cells Australia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMLife Technologies (Gibco)11965-092Służy do pobierania próbek tkanek z sali operacyjnej.
EGM-2 MV Bullet KitLonzaCC-3202EGM-2 MV Bullet Kit zawiera 500 ml pożywki EBM-2 i ludzkiego EGF, hydrokortyzonu, gentamycyny (GA-1000), płodowej surowicy bydlęcej (FBS), VEGF, ludzkiego FGF-b, R3-IGF-1 i kwasu askorbinowego.
VEGF-CR& D Systems2179-VC-025Kompletne podłoże komórkowe śródbłonka uzupełniono o 50 ng/ml VEGF-C
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)Life Technologies (Gibco)15240-062Ten roztwór zawiera 10 000  U/ml penicyliny, 10 000  mg/ml streptomycyny i 25  mg/ml leku przeciwgrzybiczego Fungizone. Stosować w rozcieńczeniu 1:100.
Fibronektyna z ludzkiego osoczaSigma-AldrichF2006Stosowana w stężeniach 10 mg / ml. Może być ponownie używany przez okres do 1 miesiąca, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4  ° C i utrzymywane w sterylności. Posługiwać się 7  ml do pokrycia 150 cm2 kolby.
StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórekLife Technologies (Gibco)A11105-01StemPro® Akumulator® stosuje się w ilości 0,05 ml na cm2 w celu pokrycia całej powierzchni kolby. Użycie mniejszych objętości może spowodować niepełne odłączenie komórek.
0,4% Trypan Blue dyeLife Technologies (Gibco)15250-061Stosowany jako barwnik żywotności.
Dispase IIRoche Applied Biosciences4942078001Stosowany w 0,04%
Kolagenaza IIWorthington Lab4176Stosowany w 0,25%
DNazy IRoche Applied Biosciences11284932001komórkowych 0,01%
70 mmBD Falcon352350
[header]
PE-sprzężony klon VEGFR-3 9D9F9, klon WM59BioLegend356204Stosowany w rozcieńczeniu 1:50
PE-Cy7-sprzężony CD34, klon 581BioLegend343516Stosowany w rozcieńczeniu 1:200
Sprzężony z APC mysz anty ludzki CD31, klon WM59BioLegend303116,Stosowany w rozcieńczeniu 1:100
Alexa 488-sprzężony szczur anty ludzka Podoplanina, klon NC-80.BioLegend337006Stosowany w rozcieńczeniu 1:200
Mysz sprzężona z PE IgG1, izotyp k, klon MOPC-21BioLegend400112Stosowany w rozcieńczeniu 1:50
IgG1 myszy sprzężony z PE-Cy7, izotyp k, klon MOPC-21BioLegend400126Stosowany w rozcieńczeniu 1:200
Mysz sprzężona z APC IgG1, izotyp k, klon MOPC-21BioLegend400120Stosowany w rozcieńczeniu
1:100IgG2a myszy sprzężonej z Alexa 488, izotyp k, klon RATK2758BioLegend400525Używany w rozcieńczeniu 1:200
Używany w nylonowych sitkach

Bibliografia

  1. Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
  2. Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).
  3. Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).
  4. Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).
  5. Andrade, M., Jacomo, A. Anatomy of the human lymphatic system. Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).
  6. Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, Elsevier Saunders. Robbins. (2009).
  7. Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).
  8. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. , University Press. Oxford. 1059-1076 (2013).
  9. Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, University Press. Oxford. 562-594 (2013).
  10. Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
  11. Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).
  12. Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. Genetics of lymphatic anomalies. J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).
  13. for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).
  14. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).
  15. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).
  16. Smith, R. J. Lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).
  17. Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).
  18. Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).
  19. Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. Vascular malformations. Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).
  20. Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , Melbourne, Australia. (2014).
  21. Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
  22. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).
  23. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).
  24. Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).
  25. Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
  26. Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
  27. Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).
  28. Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).
  29. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).
  30. Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).
  31. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).
  32. Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wieloparametryczna FACStrawienie tkanekmarkery powierzchniowe komórekCD34 CD31 VEGFR-3 podoplaninaekspansja hodowli komórkowychkolby pokryte fibonektynąbarwienie w cytometrii przepływowejwykluczanie jodku propidyny
Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.