Produkcja, charakterystyka i potencjalne zastosowania 3D modelu błony śluzowej przełyku dla człowieka opartego na inżynierii tkankowej

Summary

Ten manuskrypt opisuje produkcję, charakterystykę i potencjalne zastosowania konstruktu przełyku 3D wykonanego z normalnego pierwotnego ludzkiego fibroblastu przełyku i płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych umieszczonych w pozbawionym komórek rusztowaniu wieprzowym. Wyniki wskazują na tworzenie się dojrzałego nabłonka warstwowego podobnego do normalnego ludzkiego przełyku.

Abstract

Częstość występowania zarówno gruczolakoraka przełyku, jak i jego prekursora, metaplazji Barretta, gwałtownie rośnie w świecie zachodnim. Ponadto gruczolakorak przełyku ma na ogół złe rokowanie, z niewielką poprawą wskaźników przeżycia w ostatnich latach. Są to trudne warunki do zbadania i brakuje odpowiednich platform eksperymentalnych do badania zaburzeń błony śluzowej przełyku.

W laboratorium MacNeila opracowano model ludzkiej błony śluzowej przełyku, który, w przeciwieństwie do konwencjonalnych systemów hodowli komórkowych 2D, podsumowuje interakcje komórka-komórka i komórka-matryca obecne in vivo i wytwarza dojrzały, warstwowy nabłonek podobny do tego z normalnego ludzkiego przełyku. Krótko mówiąc, model wykorzystuje nieprzekształcone normalne pierwotne ludzkie fibroblasty przełyku i komórki nabłonkowe wyhodowane w bezkomórkowym rusztowaniu przełyku pochodzącym od świń. Charakterystyka immunohistochemiczna tego modelu za pomocą CK4, CK14, Ki67 i barwienia inwolukryny wykazuje odpowiednią rekapitulację histologii prawidłowej ludzkiej błony śluzowej przełyku.

Ten model dostarcza solidny, biologicznie istotny eksperymentalny model błony śluzowej ludzkiego przełyku. Można nim łatwo manipulować w celu zbadania szeregu pytań badawczych, w tym skuteczności środków farmakologicznych i wpływu ekspozycji na czynniki środowiskowe, takie jak alkohol, toksyny, wysoka temperatura lub składniki refluksu żołądkowo-przełykowego. Model ułatwia również wydłużenie okresów hodowli, które nie są osiągalne w przypadku konwencjonalnej hodowli komórkowej 2D, umożliwiając m.in. badanie wpływu powtarzającej się ekspozycji dojrzałego nabłonka na czynnik będący przedmiotem zainteresowania przez okres do 20 dni. Co więcej, różne linie komórkowe, takie jak te pochodzące z guzów przełyku lub metaplazji Barretta, mogą zostać włączone do modelu w celu zbadania procesów, takich jak inwazja guza i reakcja na lek w bardziej istotnym biologicznie środowisku.

Introduction

Błona śluzowa przełyku składa się z warstwowego, płaskonabłonkowego nabłonka ponad warstwą tkanki łącznej, blaszką właściwą, i jest jednym z pierwszych miejsc, w których stwierdzono spożycie stresorów środowiskowych. Narażenie na toksyny dietetyczne jest związane z rozwojem raka płaskonabłonkowego przełyku, podczas gdy refluks dwunastniczo-przełykowy jest krytycznym czynnikiem w patogenezie metaplazji Barretta, co wiąże się ze zwiększonym ryzykiem progresji do gruczolakoraka przełyku. Rak przełyku jest ósmym najczęstszym nowotworem złośliwym u mężczyzn w Wielkiej Brytanii, a gruczolakorak przełyku gwałtownie rośnie w świecie zachodnim¹. Co więcej, nastąpiła niewielka poprawa w rokowaniu choroby, z ogólnym wskaźnikiem 5-letniego przeżycia wynoszącym około 15%. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na platformy eksperymentalne w celu zbadania wpływu ekspozycji na stresory środowiskowe na ten nabłonek przełyku i ich potencjalny udział w rozwoju metaplazji lub nowotworu.

Chociaż unieśmiertelnione lub nowotworowe linie komórkowe pozwalają badaczom badać reakcję komórek nabłonkowych na te stresory in vitro, pozostają one proliferacyjne i nie różnicują się w dojrzałe komórki nabłonkowe znajdujące się na najwyższych warstwach błony śluzowej przełyku. Co więcej, linie komórkowe, które już przeszły nowotworzenie mogą dostarczać tylko ograniczonych informacji na temat początkowych reakcji normalnych komórek w nabłonku na czynniki środowiskowe; I to jest etap, w którym potencjał interwencji terapeutycznej może być największy. Wreszcie, konwencjonalne systemy hodowli komórkowych nie są w stanie uchwycić potencjalnie ważnych interakcji między komórkami nabłonkowymi i mezenchymalnymi oraz między tymi komórkami a otaczającą macierzą, które zachodzą w tkankach in vivo.

Modele zwierzęce dostarczają bardziej realistycznego mikrośrodowiska do badania reakcji nabłonka przełyku i mogą zawierać sztuczną indukcję choroby refluksowej przełyku². Jednak manipulowanie stresorami środowiskowymi w tych modelach może być trudniejsze i mogą one nie w pełni reprezentować reakcję w ludzkim przełyku.

Inne eksperymentalne modele ludzkiego przełyku zostały opracowane, które wykorzystują komórki pierwotne, unieśmiertelnione komórki lub linie komórek nowotworowych na kolagenie lub połączonym kolagenie/Matrigelu, rusztowaniu zawierającym fibroblasty^3,4. Generowanie tych rusztowań jest mniej pracochłonne niż bezkomórkowe rusztowanie przełyku opisane w tym manuskrypcie, a te modele organotypowe stanowią użyteczne narzędzie, szczególnie w badaniu inwazji guza^5,6, gdzie można łatwo zaobserwować infiltrację komórek nowotworowych do żelu kolagenowego. Jednak te żele kolagenowe mają nienatywne właściwości mechaniczne i brakuje im pewnych cech oryginalnej tkanki, w tym specyficznej błony podstawnej i odpowiedniej topografii powierzchni. Może to wpływać na zachowanie komórek, powodując na przykład gorszą przyczepność między nabłonkiem a rusztowaniem podczas stosowania rusztowania z żelu kolagenowego⁷. W związku z tym opracowano bezkomórkowe rusztowanie przełyku świń, którego zaletą jest to, że jest bardziej realistycznym biologicznie rusztowaniem, a tym samym bardziej odpowiednim do wykorzystania jako platforma doświadczalna. Wykazano również, że lepiej jest włączyć komórki pierwotne do konstruktów przełyku niż unieśmiertelnione linie komórkowe nabłonka przełyku, takie jak Het-1A, ponieważ komórki te tworzą wielowarstwowy nabłonek, ale nie rozwarstwiają się ani nie różnicują^4,7,8.

W związku z tym, ten protokół został zaadaptowany z metody już używanej w laboratorium MacNeila do tworzenia tkankowo modyfikowanej błony śluzowej skóry i jamy ustnej^9,10 i zawiera pozbawione komórek rusztowanie przełyku świń połączone z pierwotnymi ludzkimi komórkami nabłonka przełyku i fibroblastami. Protokół ten wytwarza dojrzały, warstwowy nabłonek, podobny do nabłonka normalnego ludzkiego przełyku, jak wykazano za pomocą barwienia CK4, CK14, Ki67 i inwolukryny. Powstały w ten sposób model stanowi platformę eksperymentalną do badania reakcji na stresory środowiskowe i został skutecznie wykorzystany do zbadania zmian w ekspresji genów w nabłonku przełyku w odpowiedzi na składniki refluksowe¹¹.

Protocol

Ludzkie komórki przełyku pozyskuje się od pacjentów poddawanych operacji żołądka lub przełyku. Uzyskuje się świadomą zgodę na wykorzystanie tkanki do celów badawczych oraz anonimowe wykorzystanie tkanki zgodnie z odpowiednimi zatwierdzeniami etycznymi (SSREC 165/03, licencja banku tkanek przeznaczonych do badań klinicznych na ludziach 12179).

1. Izolacja ludzkich komórek nabłonka przełyku

1. Pracując w kapturze do hodowli tkankowych z przepływem laminarnym i stosując sterylną technikę, przygotuj pożywkę do hodowli nabłonkowych, mieszając zmodyfikowaną pożywkę Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco i F12 Ham's w stosunku 3:1 (v:v). Dodać 10% (v/v) FCS, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 0,4 μg/ml hydrokortyzonu, 1,8 x ^10-4 M adenina, 5 μg/ml insuliny, 5 μg/ml transferyny, 2 x ^10-7 M trójjodotyroniny, 1 x ^10-10 M toksyny, 2 x ^10-3 M glutamina, 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,625 μg/ml amfoterycyny B.
2. Stosując standardowe sterylne techniki, umieść 11 ml DMEM, 10% FCS, 2 x ^10-3 M L-glutaminy, 100 IU / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny i 0,625 μg / ml amfoterycyny B do kolby do hodowli tkankowej T75. Dodać 1 x 10⁶ śmiertelnie napromieniowanych mysich fibroblastów 3T3¹² w 1 ml tej samej pożywki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO₂, wilgotnej atmosferze. W ten sposób powstanie warstwa zasilająca dla późniejszej hodowli komórek nabłonkowych.
3. Za pomocą skalpela i zgodnie z zaleceniami histopatologa należy wypreparować około 2^cm2 próbkę tkanki z wolnego od choroby obszaru tła błony śluzowej przełyku uzyskanego od pacjentów poddawanych operacji żołądka lub przełyku. Transport do laboratorium w pojemniku o pojemności 50 ml ze sterylnym podłożem transportowym (PBS 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,625 μg/ml amfoterycyny B) w temperaturze pokojowej.
4. W tym momencie należy przechowywać tkankę w podłożu transportowym do 12 godzin (przez noc) w temperaturze 4 °C, dla wygody; jednak nie należy stosować dłuższych okresów przechowywania, ponieważ powodują one zmniejszenie żywotności komórek.
5. Pracując w kapturze do hodowli tkanek z przepływem laminarnym i stosując sterylną technikę, wysterylizuj ostrze skalpela, mocząc je w 70% etanolu przez 5 minut. Spłucz w sterylnym PBS.
6. Umieść tkankę na sterylnej szalce Petriego i skalpelem pokrój ją w paski o długości 0,5 cm. Dodać 5 ml 0,1% (m/v) trypsyny z PBS do szalki Petriego, przykryć szalkę pokrywką i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
7. Dodać 5 ml FCS do tkanki na szalce Petriego, aby zahamować działanie trypsyny. Trzymając pasek tkanki sterylnymi kleszkami, delikatnie zeskrob powierzchnię nabłonka ostrzem skalpela przez 1-2 minuty na pasek, aby usunąć komórki nabłonka do otaczającego podłoża. Usuń zeskrobaną chusteczkę i odłóż na bok. Powtórz ten proces dla wszystkich pasków tkanki.
8. Zebrać pożywkę zawierającą oderwane komórki nabłonka do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować (5 min, 200 x g). Odlać supernatant i ponownie zawiesić osad w 12 ml podłoża nabłonkowego (opisanego w kroku 1.1).
9. Odlać i wyrzucić pożywkę z warstwy komórek zasilających w kolbie T75 przygotowanej w kroku 1.2. Za pomocą sterylnej pipety dodać zawiesinę zawierającą świeżo wyizolowane komórki nabłonka do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% nawilżonej atmosferze_CO2.
10. Po 24 godzinach odlać i wyrzucić pożywkę hodowlaną, która będzie również zawierać resztki komórek, i zastąpić 12 ml świeżej pożywki nabłonkowej. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO_{2 .} Kolonie zaczną pojawiać się w ciągu najbliższych 24 do 48 godzin i można je obejrzeć, umieszczając kolbę hodowlaną pod standardowym mikroskopem świetlnym. Odlej zużytą pożywkę hodowlaną i zastąp równą objętością świeżej pożywki co 2 do 3 dni.
11. Gdy kolba osiągnie 80% zbieżności, przeprowadź przez komórki¹³. Podziel komórki w stosunku 1:5, aby zwiększyć liczbę komórek do użycia w modelu. Postępuj zgodnie z krokiem 1.2, aby ustalić warstwy zasilające napromieniowanych komórek 3T3 w każdej kolbie, która będzie otrzymywać komórki nabłonkowe na 24 godziny przed pasażowaniem komórek.
    Uwaga: Używaj komórek nabłonkowych w modelu przełyku opisanym poniżej tylko między przejściami 1 i 4.

2. Izolacja ludzkich fibroblastów przełyku

1. Pracując w komorze z przepływem laminarnym i stosując technikę sterylną, należy odłożyć tkankę odłożoną na bok w kroku 1.7. Umieść na sterylnej szalce Petriego i drobno posiekaj sterylnym ostrzem skalpela. Dodać 10 ml 0,5% (m/v) roztworu kolagenazy A i przykryć pokrywką szalkę Petriego i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5%_CO2.
2. Przenieść trawienie do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować (10 min, 200 x g), ostrożnie odlać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki hodowlanej fibroblastów (DMEM 10% FCS, 2 x ^10-3 M L-glutamina, 100 j.m./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,625 μg/ml amfoterycyny B).
3. Umieścić zawiesinę w kolbie T75 i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% nawilżonej atmosferze o stężeniu 5% CO₂ . Po 24 godzinach odlej pożywkę, która będzie zawierać zanieczyszczenia i zastąp 12 ml świeżej pożywki fibroblastowej. Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 2 do 3 dni i pasażuj komórki, gdy osiągną 80% konfluencji¹³, dzieląc komórki w stosunku 1:5, aby zwiększyć liczbę komórek.
   Uwaga: Użyj komórek fibroblastów w modelu opisanym poniżej tylko między przejściami 4 i 10.

3. Przygotowanie rusztowania przełyku bez komórek

1. Uzyskaj nienaruszony przełyk świń w rzeźni ze świeżo ubitych świń rasy Landrace, które są wykorzystywane do produkcji żywności. Pojedynczy przełyk zapewni wystarczającą ilość rusztowań dla około 30 oddzielnych konstrukcji.
   Uwaga: Ze względu na wymagany obszerny i czasochłonny protokół sterylizacji, zwykle warto uzyskać i przetworzyć minimum 10 przełyków jednocześnie.
2. Świeżo wycięty przełyk należy natychmiast umieścić w sterylnym garnku o pojemności 180 ml zawierającym około 150 ml 10% roztworu jodu powidonu na 5 minut, aby zmniejszyć zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Przenieść przełyk do drugiego garnka zawierającego około 100 ml sterylnego PBS zawierającego 200 j.m./ml penicyliny, 200 μg/ml streptomycyny i 1,25 μg/ml amfoterycyny B.
   1. Załóż pokrywkę na pojemnik i przetransportuj przełyk z powrotem do laboratorium w temperaturze pokojowej. W każdym pojemniku można przewozić dwa lub trzy przełyki, w zależności od ich wielkości.
3. Po przybyciu do laboratorium należy obchodzić się z tkanką w okapie z przepływem laminarnym przy użyciu techniki aseptycznej, aby zminimalizować zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Wysterylizuj pęsety, nożyczki i ostrza skalpela, mocząc przez 5 minut w 70% etanolu i spłukując w sterylnym PBS.
4. Dotykaj przełyku za pomocą sterylnej pęsety. Za pomocą nożyczek rozetnij przełyk wzdłużnie. Opłucz tkankę, umieszczając przełyk w sterylnym pojemniku o pojemności 180 ml zawierającym około 100 ml sterylnego PBS i delikatnie potrząsając, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
5. Wyczyść deskę do preparowania korka, spryskując obficie 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
6. Wyjmij przełyk z PBS i za pomocą sterylnych igieł przypnij przełyk do deski, powierzchnią błony śluzowej do góry. Chwyć powierzchnię błony śluzowej na jednym końcu przełyku sterylną pęsetą i oderwij od deski. Spowoduje to oddzielenie błony śluzowej od leżącej pod nią błony podśluzowej.
   1. Następnie użyj sterylnego ostrza skalpela, aby wyciąć przełyk wzdłużnie wzdłuż blaszki właściwej, usuwając szpilki w miarę postępu sekcji, aby umożliwić usunięcie błony śluzowej.
7. Zachowaj wypreparowaną błonę śluzową i odrzuć leżącą pod nią błonę podśluzową.
8. Odetnij i odrzuć najbardziej proksymalne i dystalne 2 cm błony śluzowej, ponieważ w tych obszarach występuje większa liczba gruczołów podśluzówkowych i grubsza blaszka właściwa⁷.
9. Za pomocą skalpela pokrój pozostałą tkankę na 5 cm². Umieść całą pociętą tkankę w sterylnym garnku o pojemności 180 ml zawierającym około 150 ml sterylnego PBS i delikatnie mieszaj, aby spłukać tkankę. W przypadku przetwarzania więcej niż pięciu przełyków jednocześnie może być konieczne użycie wielu doniczek do tego i trzech kolejnych kroków.
10. Za pomocą sterylnej pęsety przenieś pociętą tkankę do garnka o pojemności 180 ml zawierającego 150 ml sterylnego 1 M NaCl, 200 j.m./ml penicyliny, 200 μg/ml streptomycyny i 1,25 μg/ml amfoterycyny B. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C.
11. Umieść tkankę w świeżym pojemniku o pojemności 180 ml zawierającym 150 ml sterylnego PBS. Nabłonek zacznie widocznie oddzielać się od leżącej pod nim tkanki. Delikatnie oderwij odklejający się nabłonek od przełyku świni za pomocą sterylnych kleszczy i wyrzuć.
    1. Umieść pozostałą tkankę w świeżym garnku o pojemności 180 ml i dodaj 150 ml sterylnego PBS. Mieszaj delikatnie przez 5 minut do umycia. Odlej PBS i powtórz kolejne dwa razy ze świeżym PBS.
12. Umieść całą tkankę w szklanej butelce o pojemności 500 ml zawierającej 400 ml sterylnego 80% (v/v) roztworu glicerolu na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Przenieść do 400 ml sterylnego 90% (v/v) roztworu glicerolu na kolejne 24 godziny.
13. Przechowywać w 400 ml sterylnego roztworu 100% glicerolu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 4 miesiące w celu odwodnienia i wysterylizowania tkanki przy zachowaniu integralności błony podstawnej.

4. Produkcja pożywki hodowlanej

1. Przygotować chelatowaną surowicę cieląt nowonarodzonych do użycia w pożywce hodowlanej.
   1. Wlej 100 g Chelex 100 do szklanej butelki o pojemności 1 l i dodaj wodę dejonizowaną. Dokładna objętość nie jest krytyczna, ale należy dodać wystarczającą ilość wody, aby pokryć proszek Chelex. Dodać mieszadło magnetyczne i sterylizować w autoklawie (121 °C przez 15 min).
   2. Pozwól butelce ostygnąć, a Chelex osiądzie. W komorze z przepływem laminarnym odlewać nadmiar wody, dodać 500 ml surowicy dla nowonarodzonych cieląt (NCS) i pozostawić na noc do wymieszania w temperaturze 4 °C.
   3. Przestań mieszać i pozwól Chelexowi się uspokoić, może to potrwać do 30 minut. W komorze z przepływem laminarnym zdekantować chelatowaną surowicę za pomocą sterylnej pipety, uważając, aby nie naruszyć Chelexu, i przechowywać w 10 ml porcji w temperaturze -20 °C.
2. Przygotuj trzy różne podłoża w komorze z przepływem laminarnym, zaczynając od preparatów proproliferacyjnych, a kończąc na preparatach proróżnicujących.
   1. Przygotować pożywkę złożoną I składającą się z DMEM i szynki F12 w stosunku 3:1 (v:v), 4 x ^10-3 M L-glutaminy, 0,5 μg/ml hydrokortyzonu, 1 x ^10-4 M O-fosforyloetanoloaminy, 2 x ^10-12 M trójjodotyroniny, 1,8 x ^10-4 M adeniny, 1,88 x ^10-3 M CaCl₂, 4 x ^10-12 M progesteronu, 10 μg/ml insuliny, 10 μg/ml transferyny, 10 ng/ml selenu, 1 x ^10-3 M etanoloaminy i 0,1% (v/v) chelatowany NCS.
   2. Przygotować Pożywkę Kompozytową II jako Pożywkę Złożoną I, z wyjątkiem zastąpienia chelatowanej surowicy 0,1% (v/v) niechelatowanym NCS.
   3. Preparat Composite Medium III należy przygotować jako pożywkę kompozytową II, z wyjątkiem pominięcia progesteronu i zwiększenia surowicy do 2% (v/v) niechelatowanego NCS.

5. Produkcja modelu ludzkiej błony śluzowej przełyku

1. Wszystkie prace należy wykonywać w okapie z przepływem laminarnym, stosując technikę aseptyczną, aby utrzymać sterylne środowisko. Wysterylizuj wszystkie narzędzia, mocząc je w 70% etanolu przez 5 minut, a następnie spłucz w sterylnym PBS.
2. Dzień przed zapotrzebowaniem należy nawodnić bezkomórkowe rusztowanie przełyku świń. Do przygotowania każdej konstrukcji wymagany jest jeden kawałek rusztowania.
   1. Aby nawodnić tkankę, umieść wystarczającą ilość rusztowania wieprzowego w garnku zawierającym 100 ml sterylnego PBS, mieszaj i moczyć przez 10 minut. Zdekantuj PBS i zastąp świeżym PBS. Powtórz proces mycia pięć razy, aby upewnić się, że wszystkie ślady glicerolu zostaną usunięte.
3. Sprawdzić sterylność rusztowania poprzez inkubację uwodnionej tkanki przez noc w 100 ml DMEM w temperaturze 37 °C. Jeżeli pod koniec okresu inkubacji nie nastąpi zmiana koloru lub zmętnienia pożywki, zakłada się, że rusztowanie jest sterylne. Po potwierdzeniu bezpłodności umieść rusztowanie bezkomórkowe o średnicy 5 cm² w 6-dołkowej płytce, stroną podśluzówkową do góry.
4. Umieść sterylny pierścień ze stali nierdzewnej klasy medycznej (średnica wewnętrzna 10 mm, średnica zewnętrzna 20 mm) na środku każdego rusztowania i delikatnie dociśnij za pomocą sterylnych kleszczyków, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie z tkanką.
5. Zbierz fibroblasty za pomocą trypsyny-EDTA¹³, aby wytworzyć zawiesinę komórkową. Policz komórki za pomocą hemocytometru¹⁴. Odwirować zawiesinę komórek (10 min, 200 x g). Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki z fibroblastami, aby uzyskać końcową liczbę komórek 2,5 x 10⁶ komórek na ml.
6. Dodać 0,2 ml pożywki z fibroblastami, zawierającej 5 x 10⁵ ludzkich fibroblastów przełyku, do każdego pierścienia. Zalać obszar wokół zewnętrznej strony pierścienia około 2 ml pożywki z fibroblastów. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w wilgotnej atmosferze.
7. Po 24 godzinach usuń pierścienie i pożywkę z fibroblastów i dodaj co najmniej 5 ml świeżej pożywki fibroblastowej do każdej studzienki, upewniając się, że rusztowanie jest całkowicie zanurzone w podłożu. Hodowla przez 1 tydzień, w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 ,} nawilżona atmosfera wymieniając pożywkę co 2 do 3 dni.
8. Po 1 tygodniu wyjmij 6 płytek dołkowych zawierających rusztowania do laminarnego okapu zalewowego, usuń podłoże i odwróć każde rusztowanie za pomocą sterylnych kleszczy, umieszczając powierzchnię błony śluzowej u góry. Ten punkt czasowy jest określany jako Dzień 0.
9. Umieść stalowe pierścienie na powierzchni błony śluzowej w środku tkanki, jak w kroku 5.4.
10. Przygotować kolby T75 komórek nabłonka do trypsynizacji¹³. Po przemyciu PBS, a przed dodaniem roztworu trypsyny-EDTA, do każdej kolby dodać 2 ml sterylnego 0,02% (m/v) roztworu EDTA. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C. Delikatnie postukać w kolbę, aby selektywnie oderwać warstwę zasilającą i3T3, pozostawiając przyczepione komórki nabłonka.
    Uwaga: Generalnie nie jest praktyczne ani konieczne dopasowywanie komórek nabłonka do fibroblastów już włączonych do modelu w poprzednim tygodniu.
11. Odlej roztwór EDTA zawierający warstwę zasilającą i dodaj roztwór trypsyny-EDTA, aby zebrać komórki nabłonkowe¹³. Policz komórki za pomocą hemocytometru¹⁴. Odwirować zawiesinę komórek (10 min, 200 x g). Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki kompozytowej 1, aby uzyskać końcową liczbę komórek 5 x 10⁶ komórek na ml.
12. Dodać 0,2 ml pożywki Composite Medium I, zawierającej 1 x 10⁶ komórek nabłonkowych, do pierścienia. Zalać obszar wokół zewnętrznej strony pierścienia około 2 ml pożywki kompozytowej I i umieścić konstrukty w inkubatorze w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze o stężeniu 5%_CO2.
13. Po 24 godzinach (dzień 1) usunąć pierścienie i podłoże i dodać co najmniej 5 ml świeżego podłoża kompozytowego I, upewniając się, że rusztowania są całkowicie zanurzone i powrócić do inkubatora. Po kolejnych 24 godzinach (dzień 2) usuń pożywkę i zastąp ją co najmniej 5 ml pożywki kompozytowej II, ponownie upewniając się, że rusztowania są całkowicie zanurzone i wróć do inkubatora.
14. W dniu 4 umieść sterylne siatki siatkowe ze stali nierdzewnej klasy medycznej (2 cm szerokości x 2 cm długości x 0,5 cm wysokości) w świeżych 6-dołkowych płytkach, po jednej na konstrukcję. Użyj sterylnej pęsety, aby przenieść konstrukcje na wierzch stalowych siatek, powierzchnią błony śluzowej do góry.
    1. Dodać wystarczającą ilość podłoża kompozytowego III, aby ciecz dotarła do spodu kompozytu, ale powierzchnia była wystawiona na działanie powietrza, co zapewnia utrzymanie próbki na granicy faz powietrze-ciecz. Dokładna wymagana objętość medium będzie się różnić w zależności od grubości rusztowania, objętości studni i dokładnej wysokości siatki ze stali nierdzewnej.
15. Utrzymuj kompozyty na granicy faz powietrze-ciecz przez okres od 10 do 20 dni (dzień 14 do dnia 24), w zależności od wymagań eksperymentu. Podłoże kompozytowe III należy wymieniać na świeże co 2 do 3 dni (poniedziałki, środy, piątki to reżim przyjazny dla użytkownika).
    Uwaga: Po 5 dniach na granicy faz powietrze-ciecz (dzień 9) konstrukty mają wystarczająco dojrzały nabłonek przełyku, który można wykorzystać w eksperymentach dotyczących wpływu czynników środowiskowych na nabłonek przełyku.
16. Pod koniec eksperymentu utrwal konstrukty do analizy histologicznej i barwienia immunohistochemicznego⁷ lub wyekstrahuj białko¹⁵ lub RNA^11,16 z nabłonka do dalszej analizy. W razie potrzeby należy zachować kondycjonowaną pożywkę hodowlaną do analizy zewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych¹⁷.

Results

Ten manuskrypt opisuje proces wymagany, pokazany w formie schematycznej na rysunku 1, aby pomyślnie wyhodować modele 3D ludzkiego nabłonka przełyku. Aby potwierdzić przydatność modelu jako platformy eksperymentalnej, przeprowadzono badania histologiczne i immunohistochemiczne, porównując hodowane tkanki z normalną błoną śluzową płaskonabłonkową przełyku ludzkiego.

Ocena histologiczna nabłonka wytworzonego opisaną metodą pokazuje dojrzały, wielowarstwowy, warstwowy nabłonek pła...

Discussion

Niniejszy manuskrypt opisuje produkcję i charakterystykę biologicznie istotnego modelu błony śluzowej ludzkiego przełyku, nadającego się do wykorzystania jako platforma eksperymentalna do badania wpływu narażenia na stresory środowiskowe na nabłonek przełyku.

Najważniejszymi etapami pomyślnego wytworzenia modelu ludzkiej błony śluzowej przełyku są: zapewnienie, że większość komórek nabłonka pozostaje proliferacyjna i nie zaczęła się różnicować jeszcze przed umieszczeniem ich na rusztowaniu; ut...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsyna	BD Biosciences	215240	Przygotować 0,1% w/v roztwór w PBS i wysterylizować filtrem. Ciepło w 37  ° C kąpiel wodna przed użyciem.
DMEM	Labtech	LM-D1112	Ciepły w 37  ° C kąpiel wodna przed użyciem
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37  ° C Kąpiel wodna przed użyciem
Surowica dla cieląt płodowych	Labtech	FB-1090
Naskórkowy czynnik wzrostu	R+D Systems	236-EG-200	Przygotuj 200 &mikro; g/ml roztwór podstawowy w 10 mM kwasie octowym, 1% FCS
Hydorkortyzon	Sigma-Aldrich	H0396	Przygotować roztwór podstawowy w PBS i wysterylizować filtr przed użyciem
Adenina	Sigma-Aldrich	A2786	Przygotować roztwór podstawowy w PBS i wysterylizować filtr przed użyciem
Insulina	Sigma-Aldrich	I2767	Przygotować 10 mg/ml roztwór w 0,01  M HCl, rozcieńczyć w stosunku 1:10 w wodzie destylowanej i przefiltrować sterylizować przed użyciem
Transferyna	Sigma-Aldrich	T2036	Przygotować roztwór podstawowy w wodzie destylowanej i filtrować sterylizować przed użyciem
Trijodotyronina	Sigma-Aldrich	T2752	Przygotować roztwór podstawowy w wodzie destylowanej i przefiltrować sterylizować przed użyciem
Toksyna	Sigma-Aldrich	C8052	Przygotować roztwór podstawowy w wodzie
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P0781
Amfoterycyna B	Gibco	15290-026	Nazwa handlowa Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Rozpuścić 1 tabletkę w 100  ml wody i autoklawu do sterylizacji
Kolagenaza A	Roche	10103578001
roztwór jodu powidonu	Ecolab	10830E	Nazwa handlowa Videne
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Surowica dla noworodków	Gibco	26010074
Progesteron	Sigma-Aldrich	P8783	Przygotować roztwór podstawowy w DMEM i przefiltrować sterylizować przed użyciem
Etanoloamina	Sigma-Aldrich	E9508	Przygotować roztwór podstawowy w DMEM i filtrować sterylizować przed użyciem
Hydrokortyzon	Sigma-Aldrich	H0888	Przygotować roztwór podstawowy w DMEM i filtrować sterylizować przed użyciem
użycieO-fosforyloetanoloamina	Sigma-Aldrich	P0503	Przygotować roztwór podstawowy w DMEM i przefiltrować, sterylizować przed użyciem
ITS (insulina, transferyna, selen)	Lonza	17-838Z	Używany do przygotowania pożywek kompozytowych
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Ciepły w 37  ° C kąpiel wodna przed użyciem
Roztwór EDTA 0,02%	Sigma-Aldrich	E8008	Ciepły w 37  ° C Kąpiel wodna przed użyciem
Kolba hodowlana T75	VWR	734-2313
Probówka wirówkowa 50 ml	Fisher	11819650
15 ml probówka uniwersalna	SLS	SLS7504
180 ml	VWR	216-2603
Szalka Petriego	SLS	150350
Płytka 6-dołkowa	VWR	734-2323
pierścienie ze stali nierdzewnej	Wyprodukowano we własnym zakresie - stal nierdzewna klasy medycznej, średnica wewnętrzna 10 mm, średnica zewnętrzna 20 mm
			cm (szer.) x 2 cm (gł.) x 0,5 cm (wys.)
KI67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Klon MM1. Użyj w 1:100.
CK4	Abcam	ab9004	Klon 6B10. Użyj o 1:200.
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Klon LL002. Użyj o 1:200.
Involucrin	Novocastra	INV	Clone SY5. Użyj w 1:100.
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mysie fibroblasty 3T3	ATCC-LGC	CRL-1658	wcześniej zatrzymane przez napromieniowanie (60 Gy)