Artykuł metodologiczny

Pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych

28K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52695

⸱

16 czerwca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Michigan Medical School, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan Medical School, 4Department of Surgery, Section of Plastic Surgery, University of Michigan Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Analiza właściwości kurczliwych chemicznie skórowanych lub przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych oferuje potężny sposób oceny funkcji mięśni na poziomie pojedynczej komórki mięśniowej. W tym artykule przedstawiamy ważną i wiarygodną technikę przygotowania i badania przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych in vitro.

Streszczenie

Analiza właściwości kurczliwych chemicznie skórowanych lub przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych oferuje potężny sposób oceny funkcji mięśni na poziomie pojedynczej komórki mięśniowej. Badania pojedynczych włókien mięśniowych są przydatne zarówno w naukach podstawowych, jak i badaniach klinicznych. W przypadku badań podstawowych, pomiary kurczliwości pojedynczych włókien mięśniowych pozwalają na zbadanie podstawowych mechanizmów wytwarzania siły oraz analizę funkcji mięśni w kontekście manipulacji genetycznych. Klinicznie badania pojedynczych włókien mięśniowych dostarczają użytecznych informacji na temat wpływu urazów i chorób na funkcjonowanie mięśni i mogą być wykorzystane do zrozumienia patologii mięśniowych. W tym artykule wideo przedstawiamy kroki wymagane do przygotowania i wyizolowania pojedynczego segmentu włókien mięśni szkieletowych, przymocowania go do aparatury do pomiaru siły, aktywacji w celu wytworzenia maksymalnej siły izometrycznej i oszacowania jego pola przekroju poprzecznego w celu normalizacji wytwarzanej siły.

Wprowadzenie

Podstawową funkcją mięśni szkieletowych jest generowanie siły. Siła mięśniowa jest wywoływana in vivo poprzez złożoną sekwencję zdarzeń, która obejmuje potencjały czynnościowe nerwów ruchowych, przekaźnictwo nerwowo-mięśniowe, potencjały czynnościowe włókien mięśniowych, uwalnianie wewnątrzkomórkowego wapnia oraz aktywację systemu białek regulatorowych i kurczliwych. Ponieważ generowanie siły jest ostatecznym wynikiem tej sekwencji, deficyt siły może być spowodowany awarią jednego lub więcej pojedynczych kroków. Kluczową cechą preparatu z włókien przepuszczalnych jest to, że eliminuje on większość etapów wymaganych do wytworzenia siły in vivo, pozostawiając tylko funkcje regulacyjne i kurczliwe związane z aparatem miofibrylarnym. Badacz przejmuje kontrolę nad dostarczaniem aktywującego wapnia i energii (ATP) i jest nagradzany uproszczonym systemem, który umożliwia ocenę izolowanych struktur regulacyjnych i kurczliwych w ich natywnej konfiguracji. Pomiary siły przy użyciu przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych są zatem cenne przy ocenie zmian w funkcjonowaniu mięśni obserwowanych in vivo. Na przykład użyliśmy tej techniki do scharakteryzowania zdolności generowania siły przez włókna myszy z niedoborem miostatyny1 oraz do oceny przyczyny utrzymującego się osłabienia mięśni po przewlekłym zerwaniu stożka rotatorów2,3.

Nowoczesna metodologia włókien przepuszczalnych może być śledzona we wczesnych wpływowych badaniach4,5 i jest obecnie używana przez wiele grup badawczych. Chociaż techniki te zostały opisane w literaturze, nie zostały one jeszcze przedstawione w formie wideo. Celem tego artykułu jest zilustrowanie zaktualizowanej, ważnej i wiarygodnej techniki pomiaru maksymalnej zdolności generowania siły przez pojedyncze włókna z chemicznie przepuszczalnych próbek mięśni szkieletowych. Aby to osiągnąć, pojedynczy segment włókna (określany tutaj jako "włókno") jest ekstrahowany ze wstępnie przepuszczalnej wiązki włókien i umieszczany w komorze doświadczalnej zawierającej roztwór relaksujący, którego cechą definiującą jest stężenie wapnia <10 nM. Włókno jest następnie podłączane z jednej strony do przetwornika siły, a z drugiej do regulatora długości. Gdy włókno jest utrzymywane na optymalnej długości sarkomeru, jest przenoszone do roztworu aktywującego, który ma stężenie wapnia wystarczające do wywołania maksymalnej aktywacji, a tym samym maksymalnej izometrycznej siły skurczu. Dane dotyczące siły są pozyskiwane, przechowywane i analizowane za pomocą komputera osobistego.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt lub ludzi powinny być wykonywane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Michigan (UCUCA) oraz Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Centrum Medycznego Uniwersytetu Michigan zatwierdziły wszystkie procedury na zwierzętach i ludziach opisane w tym artykule.

1. Wykonaj roztwór zapasów do preparowania i przechowywania

Uwaga: Końcowe woluminy określone w poniższych instrukcjach można dowolnie skalować w górę lub w dół.

  1. Do zlewki o pojemności 1 000 ml dodać 800 ml wody dejonizowanej (ASTM Typ 1). Delikatnie mieszając, dodaj wszystkie związki wymienione w tabeli 1 do wody dejonizowanej i pozwól im się rozpuścić. pkt. pkt. pkt. Pokój pkt. zł Pokój pkt. pkt.
    związekPożądane stężenie (M)Formuła Waga (g/mol)Dodać do 1 L (g)
    K-propionian0,250112,17Godzina 28.040
    Imidazol0,040 68,08 2.720
    EGTA (EGTA)0,010380,40 3.800
    MgCl2•6H2O0,004203,31 0,813

Tabela 1: Składniki roztworu podstawowego do preparacji i przechowywania.

  1. Doprowadzić do końcowej objętości 1 000 ml wodą dejonizowaną. Należy pamiętać, że w tym czasie nie ma potrzeby pH roztworu. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.

2. Stwórz rozwiązanie do przechowywania

  1. Aby przygotować 200 ml roztworu do przechowywania, należy rozpocząć od 100 ml roztworu podstawowego do preparowania i przechowywania w zlewce o pojemności 250 ml. Dodać wystarczającą ilość Na2H2ATP, aby doprowadzić końcowe stężenie trifosforanu adenozyny (ATP) do 2 mM. Doprowadzić do końcowej objętości 200 ml glicerolem. Dostosuj do pH 7,00 za pomocą wodorotlenku potasu (KOH). Przechowywać roztwór do przechowywania w temperaturze -20 °C.
    Uwaga: Ze względu na lepki charakter glicerolu dokładne dozowanie objętościowe może być trudne. Z tego powodu zazwyczaj dodajemy wagowo glicerol (100 ml glicerolu waży około 126 g).

3. Wykonaj rozwiązanie do analizy

  1. Aby przygotować 200 ml roztworu preparacyjnego, należy rozpocząć od 100 ml roztworu podstawowego do rozwarstwiania i przechowywania w zlewce o pojemności 250 ml.
  2. Dodać wystarczającą ilość Na2H2ATP, aby doprowadzić końcowe stężenie ATP do 2 mM. Dostosuj pH do 7,00 za pomocą KOH. Doprowadzić końcową objętość do 200 ml wodą dejonizowaną. Podwielokrotność w objętości 2,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Zrób roztwór do preparowania za pomocą Brij 58

Uwaga: Brij 58 to niejonowy detergent, który rozbija (przepuszcza) dwuwarstwy lipidowe.

  1. Aby przygotować 200 ml roztworu preparacyjnego za pomocą Brij 58, należy rozpocząć od 200 ml roztworu preparacyjnego w zlewce o pojemności 250 ml. Delikatnie mieszając, dodać 1 g Brij 58 (0,5% w/v) do roztworu preparacyjnego i pozostawić do rozpuszczenia. Podwielokrotność w objętości 2,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Twórz rozwiązania testowe

Uwaga: Poniższy tekst został zaczerpnięty z Moisescu i Thieleczek 1978 (6). Zobacz Dyskusja, aby uzyskać dodatkowe uwagi na temat przygotowywania rozwiązań testowych.

  1. Przygotuj trzy oddzielne zlewki o pojemności 1 000 ml oznaczone jako "Relaksujące", "Wstępnie aktywujące" i "Aktywujące". Do każdej zlewki dodać 400 ml wody dejonizowanej.
  2. Dodać związki wskazane w tabeli 2 do odpowiedniej zlewki, a następnie podgrzać roztwory do temperatury między 70 °C a 80 °C. Utrzymywać temperaturę roztworu 70-80 °C przez 30 minut, ciągle mieszając.
    Uwaga: Temperatura 70-80 °C pomaga w eliminacji kwasu węglowego powstałego w wyniku reakcji węglanu wapnia z EGTA w roztworze aktywującym. Roztwór relaksujący i roztwory wstępnie aktywujące są traktowane w taki sam sposób, jak roztwór aktywujący, aby zachować spójność.
zł pkt. jedn. pkt. jedn. jedn. pkt. pkt. pkt. zł pkt. Prętów Prętów pkt. pkt. TGL TGL pkt.
RELAKSUJĄCE ROZWIĄZANIEROZWIĄZANIE PRZED AKTYWACJĄAKTYWACJA ROZWIĄZANIA
związekFormuła Waga (g/mol)Pożądane stężenie (mM)Wymagana masa (g)Pożądane stężenie (mM)Wymagana masa (g)Pożądane stężenie (mM)Wymagana masa (g)
HEPES (kwas)238,3090,010,72490,010,724godz. 90.0010,724
MgO Godzina 40,31Rozdział 10.3 0,208 8,5 0,171 Klasa 8.12 0,164
EGTA (kwas)380,4052,0 9.890Godzina 52.00 9.890
HDTA (kwas)348,3650,0 8,709
EmisjaCO3100,10Godzina 50.00 2,503

Tabela 2: Relaksujące, wstępnie aktywujące i aktywujące składniki rozwiązania.

  1. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i dodać wystarczającą ilość NaN3/KOH, aby doprowadzić końcowe stężenie NaN3 do 1 mM.
    UWAGA: NaN3 (azydek sodu) jest trujący. Zapoznaj się z chemiczną kartą charakterystyki przed użyciem tej substancji chemicznej.
    1. Aby przygotować 100 ml 100 mM roztworu azydku sodu, dodać 0,65 g NaN3 do 10 ml 1 N KOH. Doprowadzić do końcowej objętości 100 ml z wodą dejonizowaną.
  2. Dostosuj pH do około 7,10 za pomocą KOH.
  3. Postępując zgodnie z krokiem 5.4, dodać wystarczającą ilość Na2H2ATP, aby doprowadzić końcowe stężenie ATP do 8 mM i wystarczającą ilość Na2CrP, aby doprowadzić końcowe stężenie fosfatanu kreatyny (CrP) do 10 mM.
  4. Doprowadzić każdy roztwór do końcowej objętości 500 ml za pomocą wody dejonizowanej. Schłodzić lub podgrzać roztwory do temperatury, w której będą przeprowadzane eksperymenty, a następnie użyć KOH, aby doprowadzić pH do 7,10, utrzymując tę temperaturę.
  5. Dodać roztwór relaksujący do zlewki zawierającej roztwór wstępnej aktywacji w taki sposób, aby końcowy roztwór wstępnej aktywacji stanowił 1 część roztworu relaksującego w 500 roztworze wstępnej aktywacji. Podwielokrotność w objętości 2,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Zrób pętle do szwów

  1. Zacznij od pasma niesterylnego nici nylonowego z monofilamentu USP 10-0.
  2. Użyj kleszczy, aby utworzyć pętlę z pasmem za pomocą techniki podwójnego węzła z góry. Zmniejsz rozmiar węzła do około 750 μm średnicy. Średnicę pętli można ocenić pod mikroskopem za pomocą oznaczeń siatki okularowej.
  3. Użyj nożyczek do mikropreparacji, aby usunąć nadmiar szwów, pozostawiając tylko pętlę i małe (500 μm) ogonki po obu stronach. Przykład gotowej pętli pokazano na rysunku 1.
  4. Powtarzaj kroki 6.2-6.3, aż zostaną wykonane 4 użyteczne pętle. Przechowuj pętle na szalce Petriego pokrytej elastomerem silikonowym do wykorzystania w przyszłości.
    Uwaga: Dla każdego testowanego włókna wymagane są cztery pętle do szwów.

7. Próbka pakietu

Uwaga: Poniższe kroki opisują procedurę dzielenia oryginalnej próbki na mniejsze eksperymentalne 'wiązki', z których ostatecznie zostaną wyodrębnione i przetestowane pojedyncze włókna. Przez cały czas z próbką należy obchodzić się ostrożnie. Na potrzeby tego opisu instrukcje będą wydawane tak, jakby badacz był praworęczny.

  1. Pobrać badaną próbkę i przenieść ją do obiektu, w którym odbędzie się sekcja.
    Uwaga: Metody biopsji tkanek będą się różnić w zależności od modelu eksperymentalnego i projektu badania. Tam, gdzie to możliwe, perfuzja mięśni powinna być utrzymana aż do czasu biopsji.
  2. Jeżeli próbka ma być przeniesiona między miejscem zbioru a miejscem preparacji, należy ją przetransportować w fiolce zawierającej schłodzony roztwór preparacyjny, podczas gdy jest przechowywana na lodzie.
  3. Przygotuj 5 cm szalkę Petriego pokrytą elastomerem silikonowym ze schłodzonym roztworem preparacyjnym i dwoma lub trzema kołkami montażowymi na owady (średnica 100 μm, stal nierdzewna).
  4. Przenieść próbkę do naczynia. Upewnij się, że próbka pozostaje zanurzona, dodając w razie potrzeby więcej roztworu preparacyjnego.
  5. Zbadaj próbkę pod mikroskopem i manipuluj nią, aby wyrównać osie podłużne włókien w kierunku prawego ramienia badacza (ryc. 2). Następnie zakotwicz próbkę w naczyniu, przypinając ją w rogach.
    Uwaga: W tym czasie należy wykorzystać pozostałą tkankę łączną jako punkty zakotwiczenia, ponieważ zmaksymalizuje to wykorzystanie próbki i zachowa integralność włókien. Wiązka może być lekko napięta, aby pomóc w określeniu marginesów między włóknami.
  6. Trzymając kleszcze w lewej ręce i nożyczki do mikropreparowania w prawej, zacznij delikatnie preparować wiązkę wzdłuż podłużnych brzegów między włóknami
    Uwaga: W zależności od całkowitej długości, należy go dalej podzielić na wiele mniejszych wiązek.
  7. Upewnij się, że wymiary wiązki wynoszą około 0,5-1 mm szerokości i ≥3 mm długości. Oceń wymiary za pomocą mikroskopu z oznaczeniami siatki w okularze lub umieszczając linijkę pod naczyniem.
  8. Usuń i wyrzuć wszelkie tkanki, które zostały uszkodzone przez kleszcze lub szpilki w wyniku procesu preparacji.
  9. Powtarzać ten proces do momentu wycięcia wystarczającej liczby wiązek lub do wyczerpania próbki.
    Uwaga: Liczba wiązek, które można uzyskać, będzie zależeć od wielu czynników, w tym wielkości i stanu początkowej próbki, morfologii mięśnia i umiejętności badacza.

8. Przepuszczalność włókien

  1. Przenieść wiązki z roztworu preparacyjnego do fiolki zawierającej 2,5 ml świeżego, schłodzonego roztworu preparacyjnego z dodatkiem niejonowego detergentu "Brij 58" (0,5% m/v). Inkubować na lodzie przez 30 minut, od czasu do czasu delikatnie mieszając. Upewnij się, że wiązki pozostają zanurzone przez cały czas inkubacji.
  2. Pod koniec 30-minutowej inkubacji przenieść wiązki do fiolki zawierającej świeży roztwór preparacyjny (nie Brij 58) i delikatnie i krótko wymieszać w celu usunięcia resztek detergentu.

9. Przygotuj pakiety do przechowywania

  1. Przenieść wiązki do fiolki zawierającej schłodzony roztwór do przechowywania i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.

10. Zestawy sklepowe

  1. Następnego dnia należy przygotować pojemnik do przechowywania, odporny na temperaturę -80 °C, z wystarczającą ilością pojedynczych stożkowych probówek z nakrętką o pojemności 0,5 ml, aby pomieścić wszystkie wiązki otrzymane podczas procesu preparowania (jedna wiązka na probówkę). Każda stożkowa probówka powinna być wypełniona 200-400 μl świeżego roztworu do przechowywania.
  2. Przenieś wiązki do indywidualnie oznaczonych stożkowych probówek. Upewnij się, że wiązka nie jest przyklejona do boku stożkowej rurki lub nie unosi się na powierzchni roztworu. Zakryć stożkowe probówki i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do dnia badania.

11. Przygotuj aparaturę doświadczalną

Uwaga: Niestandardowe urządzenie składa się ze stolika, w którym znajduje się kontroler długości i przetwornik siły, system ruchomych komór i 10-krotny mikroskop preparacyjny. Mikrometryczne instalacje napędowe pozwalają na precyzyjną manipulację powierzchniami mocowania włókien. Wzory dyfrakcji laserowej służą do oszacowania długości sarkomeru. Dane generowane podczas eksperymentowania są rejestrowane na komputerze osobistym. Patrz rysunek 3, aby zapoznać się z obrazami z adnotacjami przedstawiającymi konfigurację eksperymentalną.

  1. Rozmrozić po jednej fiolce z roztworów relaksujących, wstępnie aktywujących i aktywujących i utrzymywać na lodzie. Należy pamiętać, że ATP i CrP są labilnymi związkami, które należy utrzymywać w niskich temperaturach.
  2. Przygotować mikroskop, aparaturę testującą i powiązany komputer do użycia.
  3. Napełnij pierwszą komorę doświadczalną roztworem relaksującym. W naszej aparacie pierwsza komora zawiera pryzmaty, które pozwalają badaczowi na sfotografowanie włókna z boku. Napełnij drugą komorę doświadczalną roztworem wstępnie aktywującym, a trzecią roztworem aktywującym.
  4. Wyreguluj temperaturę tak, aby wyświetlacz termometru w komorze wskazywał 15 °C. Nawlecz dwie przygotowane pętle szwów na powierzchnie mocujące ze stali nierdzewnej, wystające zarówno z przetwornika siły, jak i regulatora długości (rysunek 5A).

12. Ekstrakt z przepuszczalnego pojedynczego włókna

  1. Rozmrozić interesujący Cię pakiet włókien i przenieść na pokrytą elastomerem silikonowym szalkę Petriego ze świeżym, schłodzonym roztworem relaksującym. Zabezpiecz wiązkę kołkami na obu końcach i upewnij się, że jest zanurzona.
  2. Za pomocą kleszczy chwyć włókno na jednym końcu i zacznij płynnie wyciągać je wzdłuż jego osi podłużnej.
    Uwaga: Ściskające uszkodzenie końca włókna spowodowane przez kleszcze nie stanowi obecnie problemu, ponieważ właściwości skurczowe w tym obszarze nie zostaną przetestowane. Należy jednak zachować ostrożność podczas ekstrakcji włókien z wiązki, ponieważ zrosty między włóknami a macierzą zewnątrzkomórkową mogą powodować nadmierne napięcie, co ostatecznie prowadzi do uszkodzeń spowodowanych rozciąganiem. Należy zauważyć, że wśród mięśni istnieje znaczna zmienność w stopniu, w jakim włókna przylegają do otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej. Włókna, co do których istnieje podejrzenie, że zostały uszkodzone przez takie rozciąganie, należy wyrzucić.
  3. Użyj żyletki lub skalpela, aby zmodyfikować końcówkę pipety, jak pokazano na rysunku (Rysunek 4). Wprowadź błonnik do końcówki wraz z niewielką ilością relaksującego roztworu. Przenieś pojedyncze włókno z płytki Petriego pokrytej elastomerem silikonowym do komory doświadczalnej, która zawiera roztwór relaksujący.

13. Zamontuj pojedynczy światłowód

Uwaga: Na rysunku 5 można zobaczyć opis krok po kroku.

  1. Prowadząc delikatnie kleszczami, usuń włókno z końcówki pipety i zakotwicź je w regulatorze długości (po lewej) za pomocą pierwszej pętli do szwów.
    1. Podczas zaciskania pętli za pomocą kleszczy wykonuj pojedynczy, płynny ruch. Upewnij się, że na obu końcach szwu zastosowano równe i przeciwne napięcie.
    2. Pierwszą pętlę należy zawiązać w odległości około 1 mm do 2 mm od końca powierzchni mocującej regulator długości.
  2. Manipuluj drugim końcem światłowodu w kierunku przetwornika siły (po prawej) i zabezpiecz światłowód, stosując tę samą procedurę. Usuń nadmiar szwu za pomocą nożyczek do mikropreparacji (ryc. 5C).
  3. Umieść włókno pod niewielkim napięciem, zwiększając odległość między ramieniem regulatora długości i przetwornika siły za pomocą napędu mikrometru o współrzędnych x (rysunek 3A).
  4. Przeciągnij drugą pętlę na pierwszą i zakotwicz włókno w punkcie w odległości 0,2 mm od końca powierzchni mocowania przetwornika siły (rysunek 5D).
    1. Usuń nadmiar szwów za pomocą nożyczek do mikropreparacji.
  5. Proces przyłączania włókien może spowodować utratę roztworu z komory. W razie potrzeby dodaj więcej relaksującego roztworu, aby upewnić się, że powierzchnia roztworu jest płaska (ani wklęsła, ani wypukła). Płaska powierzchnia jest ważna przy ocenie długości sarkomeru za pomocą dyfrakcji laserowej.
  6. Ustaw włókno równolegle do ścian bocznych komory doświadczalnej, regulując położenie regulatora długości w kierunku osi y.
  7. Zbadaj światłowód za pomocą pryzmatu view z boku i dostosuj położenie regulatora długości w kierunku osi z, aż światłowód będzie równoległy do podłogi komory.
    Uwaga: Ustawienie światłowodu równolegle do podłogi komory można osiągnąć bez pryzmatów komory, skupiając się najpierw na jednym końcu światłowodu, a następnie, bez regulacji ostrości mikroskopu, ustawiając ostrość na drugim końcu światłowodu za pomocą napędu mikrometrycznego w osi z.
  8. Jeśli włókno jest w jakikolwiek sposób wykrzywione, skręcone lub uszkodzone w wyniku procesu montażu, włókno należy wyrzucić i dołączyć nowe włókno.

14. Ustaw optymalną długość sarkomeru

  1. Gdy światłowód zostanie prawidłowo ustawiony w komorze, włóż skalibrowany ekran docelowy do przedniej części mikroskopu i ustaw go nad pierwszą komorą doświadczalną.
    Uwaga: Ekran docelowy jest kalibrowany przy użyciu standardowego równania siatki, λ = SL sinθ, gdzie SL to długość sarkomeru, θ to kąt dyfrakcji między wiązkami dyfrakcyjnymi od 0° do 1°, a λ to długość fali lasera.
  2. Włącz laser i dostosuj położenie stolika tak, aby laser przechodził przez środek światłowodu.
    UWAGA: Skoncentrowane światło lasera może być szkodliwe dla wzroku. Nigdy nie próbuj wizualizować światłowodu przez mikroskop, gdy laser jest włączony.
  3. Ustaw światłowód w stosunku do wiązki laserowej, aby załamać światło lasera i obserwuj wzór zakłóceń na skalibrowanym ekranie celu (rysunek 6). Wyłącz światła, aby wyraźniej zobrazować ten wzór.
    Uwaga: Jeśli przy prawidłowym ustawieniu wiązki laserowej nie widać wzoru zakłóceń, sugeruje to, że składniki miofibrylarne włókna są nieprawidłowe/uszkodzone i że włókno należy wymienić na nowe.
  4. Aby ustawić długość sarkomeru, zwiększ lub zmniejsz napięcie włókna za pomocą regulatora długości napędu mikrometrycznego osi x, aż na ekranie docelowym zostanie zaobserwowany żądany odstęp między światłem dyfrakcyjnym.
    Uwaga: Optymalna długość włókna sarkomerowego będzie zależeć od gatunku zwierzęcia, od którego uzyskano próbkę. Powszechnie przyjmuje się, że długość sarkomeru wynosząca 2,7 μm jest optymalna przy ocenie włókien z tkanki ludzkiej7,8.
  5. Po ustaleniu optymalnej długości sarkomeru zmierz odległość między dwoma najbardziej wewnętrznymi szwami. Najłatwiej jest to osiągnąć za pomocą cyfrowego odczytu na napędzie mikrometrycznym, który steruje ruchem osi X komory. Ustawić komorę tak, aby pionowy krzyż nitkowy okularu był wyrównany na najbardziej wewnętrznej granicy najbardziej wewnętrznego szwu i wyzeruj odczyt cyfrowy na napędzie mikrometrycznym.
  6. Przesuń stolik wzdłuż osi x względem mikroskopu, aż dotrze do drugiego najbardziej wewnętrznego szwu. Cyfrowy wyświetlacz wskaże długość włókna. Wartość tę należy zapisać jako długość włókna, Lf.
    Uwaga: Należy rozumieć, że odległość między dwoma najbardziej wewnętrznymi szwami określi funkcjonalną długość ocenianej tkanki kurczliwej. Badacz powinien dążyć do spójności w tym wymiarze (tj. Lf) w ramach serii eksperymentów.

15. Oszacuj pole przekroju poprzecznego (CSA)

  1. Utrzymuj światłowód w pozycji Lf i użyj kamery zamontowanej na mikroskopie, aby uchwycić obraz środkowej części światłowodu w dużym powiększeniu zarówno z góry, jak i z boku. Obrazy z boku można rejestrować za pomocą pryzmatu umieszczonego z boku komory.
    Uwaga: Podczas przełączania między widokiem z góry i z boku ważne jest, aby przesuwać mikroskop tylko w kierunku y, aby upewnić się, że dwa obrazy są "w rejestrze", a zatem pokazują dwa różne widoki tego samego odcinka światłowodu.
  2. W tym momencie należy wykonać pomiary, aby znormalizować siłę bezwzględną w dalszej części badania. Techniki uzyskiwania tych pomiarów są opisane później i zilustrowane na rysunkach 7A i 7B.

16. Wywołaj skurcz izometryczny

Uwaga: Podczas gdy dane generowane podczas tych eksperymentów mogą być zbierane i interpretowane bez użycia komputera, korzystne jest oprogramowanie, które pozwala na pozyskiwanie, wyświetlanie, przechowywanie i analizę reakcji siły. Niestandardowe oprogramowanie LabVIEW stworzone przez nasze laboratorium umożliwia te funkcje, jak również możliwość projektowania "ciągów ruchu", które zarządzają działaniem regulatora długości podczas eksperymentu.

  1. Upewnić się, że temperatura roztworów relaksujących, wstępnie aktywujących i aktywujących jest stabilna i wynosi 15 °C.
  2. Za pomocą oprogramowania sterującego komorą przenieś włókno do komory zawierającej roztwór wstępnej aktywacji i inkubuj tam przez 3 minuty
    Uwaga: Roztwór wstępnej aktywacji jest słabo buforowany dla Ca2+, co powoduje bardzo szybką aktywację i rozwój siły po wprowadzeniu światłowodu do roztworu aktywującego.
  3. Gdy w roztworze wstępnej aktywacji pozostało 10 sekund, a długość włókna utrzymuje się na poziomie Lf, ustal zerowy poziom siły w zapisie eksperymentalnym.
    Uwaga: Ruch "Znajdź siłę zero" regulatora długości ujawnia poziom przetwornika siły, który odpowiada zerowej sile (tj. włókno na krótko staje się luźne w wyniku ruchu). Siła bierna to różnica między tym zerem a poziomem siły tuż przed ruchem zerowania przetwornika.
  4. Pod koniec 3 minut przenieś włókno do komory zawierającej roztwór aktywujący i pozwól, aby wytworzyła się maksymalna siła izometryczna, o czym świadczy plateau siły, które jest poprzedzone szybkim wzrostem.
  5. Po osiągnięciu maksymalnej siły izometrycznej należy użyć regulatora długości, aby zidentyfikować wyjście przetwornika siły, które odpowiada zerowej sile w komorze zawierającej roztwór aktywujący.
    Uwaga: Jest to konieczne, ponieważ wyjście przetwornika siły, które odpowiada sile zerowej, jest na ogół różne dla każdej komory wypełnionej roztworem.
  6. Po osiągnięciu drugiego plateau siły, włókno należy wciągnąć z powrotem do komory zawierającej roztwór relaksujący. Testy zostały zakończone. Aby przetestować wiele włókien podczas jednej sesji, odessaj wszystkie roztwory i dodaj nowe, schłodzone roztwory.
    Uwaga: Protokoły rowerowe Brennera powinny być brane pod uwagę przy wywoływaniu maksymalnych skurczów przez dłuższy czas. Wykazano, że protokół ten zachowuje właściwości strukturalne i mechaniczne w maksymalnie aktywowanym włóknie9.

Wyniki

Zdrowe, chemicznie permeabilizowane pojedyncze włókna powinny mieć jednolity kształt i spójne odstępy między prążkami podczas obserwacji przy dużym powiększeniu. Włókna, które są sztywne podczas manipulacji pęsetą lub wykazują wyraźne uszkodzenia strukturalne, należy odrzucić.

Cyfrowe obrazy o dużym powiększeniu wykonane w kroku 15 są analizowane w celu uzyskania 5 par pomiarów średnicy wzdłuż środkowej sekcji włókna. Powierzchnię przekroju poprzecznego (CSA) włókna szacuje się, zakładając eliptyczny przekrój poprzeczny i wyciągając średnią z 5 indywidualnych pomiarów CSA, jak przedstawiono na Rysunku 7A. Rysunek 7B służy również do zilustrowania, że wymiary włókna w jednym rzucie mogą znacznie różnić się od wymiarów parzystych w drugim rzucie (tzn. przekroje poprzeczne zazwyczaj nie są okrągłe).

Reprezentatywne przebiegi siły dla ludzkich włókien wolnokurczliwych i szybkokurczliwych przedstawiono odpowiednio na Rysunku 8A oraz 8B. Wyjściowe napięcie przetwornika siły jest rejestrowane podczas testu i przeliczane na siłę (mN) przy użyciu oprogramowania do akwizycji i analizy danych (LabVIEW). Rysunek 9 ilustruje metodę stosowaną do oceny maksymalnej siły aktywnej (Fo), która jest obliczana poprzez odjęcie siły wymaganej do utrzymania włókna w optymalnej długości sarkomeru w stanie rozluźnienia (siła pasywna, FP) od największej siły izometrycznej wygenerowanej podczas maksymalnej aktywacji włókna (siła całkowita, FT). Ponieważ wartość wyjściowa przetwornika siły odpowiadająca zerowej sile jest zazwyczaj inna dla każdej z komór kąpielowych, krótko poluzowujemy włókno zarówno w roztworze przedaktywacyjnym, jak i aktywującym, aby zarejestrować poziom zerowy w zapisie eksperymentalnym. Normalizacja maksymalnej siły aktywnej przez przekrój poprzeczny (CSA) włókna jest wykorzystywana do wyznaczenia bardziej informacyjnej wartości siły specyficznej (sFo). Dzięki uwzględnieniu CSA włókna, sFo stanowi miarę wewnętrznej zdolności do generowania siły przez aparat kurczliwy włókna, co umożliwia funkcjonalne porównania między włóknami o różnych rozmiarach. Należy jednak zauważyć, że pomiary CSA nie pozwalają na rozróżnienie proporcji włókna zajmowanej przez filamenty kurczliwe od proporcji zajmowanej przez inne struktury subkomórkowe.

Typowe charakterystyki zdrowych włókien dorosłych osobników podane przez Claflin et al. 201110 dla ludzi, Mendias et al. 20111 dla myszy oraz Gumucio et al. 20122 dla szczurów szczegółowo opisano w tabeli 3. Wszystkie dane przedstawione w tabeli 3 zostały wygenerowane przy użyciu technik opisanych w niniejszym artykule.

Człowiek
(mięsień obszerny boczny)		Mysz
(EDL)		Szczur
(mięsień podgrzebieniowy)
SamiecKobietaSamiecSamiec
Typ 1Typ 2aTyp 1Typ 2aProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi.
CSA (μm2)4880 - 69005270 - 83803870 - 54704010 - 56101850 - 30805290 - 8010
Fo (mN)0.79 - 1.171.02 - 1.540.64 - 0.970.71 - 1.070.14 - 0.250.55 - 0.97
sFo (kPa)142 - 182165 - 210156 - 193172 - 21467 - 94102 - 131
n1291601492073794

Tabela 3. Typowe charakterystyki zdrowych włókien dorosłych z mięśnia obszernobocznego człowieka10, mięśnia prostownika palców długiego myszy1 oraz mięśnia podrostkowego szczura2. Optymalne długości sarkomerów ustalono na 2,7 µm dla włókien ludzkich7,8 oraz 2,5 µm zarówno dla włókien mysich (36,37), jak i szczurzych (38). Eksperymentalne zakresy Lf (kwartyle 25ny i 75ny) wynosiły odpowiednio 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm i 1,32-1,59 mm dla człowieka, myszy i szczura. Przedstawione zakresy wskazują kwartyle 25ny i 75ny, a n oznacza liczbę przebadanych włókien.

Do najczęstszych problemów występujących podczas testowania należą poślizg pętli szwu, który skutkuje odpowiedzią siły z „skokiem”, takim jak ten przedstawiony na Rysunku 10A, oraz częściowe lub pełne przerwanie włókna, co prowadzi do odpowiedzi siły, która gwałtownie wraca w stronę zera lub do zera (zerwanie), podczas gdy włókno wciąż jest zanurzone w roztworze aktywującym (Rysunek 10B). Jeśli podczas eksperymentu dojdzie do poślizgu, przerwania lub zerwania, włókno należy odrzucić, a dane wykluczyć, choć prowadzenie rejestru uszkodzeń włókien może być również informacyjne11. Innym negatywnym wynikiem, który może wystąpić, jest przedwczesna aktywacja włókna podczas przebywania w roztworze przedaktywującym (Rysunek 10C). Częściowa aktywacja w roztworze przedaktywującym sugeruje znaczną kontaminację między studzienkami (t.j. niezamierzoną zwiększenie stężenia wapnia w studzience przedaktywującej). W takim przypadku wszystkie kąpiele należy odessać i dokładnie wypłukać wodą dejonizowaną. Zaleca się również osuszenie powierzchni oddzielających komory, ponieważ wilgoć lub kondensacja w tych obszarach mogą prowadzić do podsiąkania roztworu między kąpielami. Decyzja o włączeniu lub wykluczeniu danych będzie ostatecznie zależeć od celu eksperymentu i powinna zostać zatem rozważona podczas projektowania badania.

Zwinięty drut pod mikroskopem, prezentujący strukturę cienkiej warstwy, skala 250 µm, do analizy materiałowej.
Rycina 1: Pętla szwy (monofilamentowa szew nylonowy 10-0).

Konfiguracja eksperymentu mikroskopowego, technik laboratoryjny używa mikromanipulatora do precyzyjnej analizy próbki.
Rysunek 2: Disekcja wiązki. Pęseta znajduje się w lewej ręce, nożyczki do mikrodysekcji w prawej ręce. Czerwona linia wskazuje korzystną orientację nadgarstka i nożyczek względem osi podłużnych włókien.

Układ mikroskopowy do badania optycznego z regulowanymi stolikami i aparaturą do mocowania próbek.
Rycina 3: (A) Aparatura pomiarowa z opisanymi elementami. (a) Komory eksperymentalne z przezroczystym dnem. (b) Kontroler długości. (c) Przetwornik siły. (d) Źródło światła. (e) Mikrometryczny napęd x-y-z kontrolera długości z wyświetlaczem cyfrowym. (f) Mikrometryczny napęd stolika z wyświetlaczem cyfrowym. (g) Mikrometryczny napęd x-y-z przetwornika siły. (h) Platforma dla kalibrowanego ekranu celu dyfrakcji laserowej. (i) Stół wibroizolacyjny. (B) Widok zbliżony komór eksperymentalnych. (j) Powierzchnia mocowania ze stali nierdzewnej wystająca z kontrolera długości. (k) Powierzchnia mocowania ze stali nierdzewnej wystająca z przetwornika siły. (l) Pryzmat do widoku bocznego. (m) Obudowa modułów chłodzenia termoelektrycznego. (n) Termopara do pomiaru temperatury w komorze.

Obraz z mikroskopu przedstawiający geometrię dyszy, widok z góry i z boku; skala 1 mm, analiza precyzyjnego instrumentu.
Rysunek 4: Zmodyfikowany końcówka do pipety 100 µl użyta do przeniesienia włókna z naczynia do sekcji do komory eksperymentalnej.

Proces autotomii w mikroskali; odrywanie włókna; układ eksperymentalny; analiza separacji mechanicznej.
Rysunek 5: Montaż pojedynczego włókna w aparaturze eksperymentalnej. (A) Przygotowane pętle szewne nawleczone na stalowe powierzchnie mocujące. (B) Włókno przeniesione do komory eksperymentalnej. (C) Włókno zakotwiczone do stalowych powierzchni mocujących za pomocą pierwszej pary pętli szewnych z usunięciem nadmiaru nici. (D) Druga para pętli szewnych nawleczona nad pierwszą parą pętli i zawiązana na miejscu.

Układ mikroskopii z wzbudzeniem optycznym do analizy DNA z wyrównaniem lasera i detekcją spektroskopową.
Rysunek 6: Długość sarkomeru jest oceniana poprzez projekcję wzoru interferencyjnego lasera na skalibrowany ekran docelowy. (a) Źródło laserowe. (b) Lustro. (c) Ekran docelowy. (d) Wzór interferencyjny lasera.

Schemat optyczny mikroskopu; równania: CSA=ΣAᵢ/5, Σπaᵢbᵢ/5; analiza światłowodowa.

Obraz mikroskopowy, widoki włókna z góry i z boku, podkreślające segmenty strukturalne w skali 100µm.
Rycina 7: (A) Wyznaczanie pola przekroju poprzecznego włókna przy optymalnej długości sarkomeru (człowiek = 2.7 µm). Przy założeniu eliptycznego przekroju poprzecznego, CSA jest obliczane dla każdego z pięciu miejsc wzdłuż środkowej sekcji włókna, a średnia z pięciu poszczególnych pomiarów jest raportowana jako CSA włókna. 2a reprezentuje średnicę w widoku z góry i jest jedną osią elipsy, 2b reprezentuje średnicę w widoku z boku i jest drugą osią elipsy. (B) Reprezentatywne obrazy włókien ilustrujące każdy z pięciu odpowiadających im pomiarów średnicy wykonanych zarówno w widoku z góry, jak i z boku.

Wykres skurczu włókien mięśniowych; Typ 1 vs Typ 2a; pomiar siły; kPa; czas w sekundach.
Rycina 8: Reprezentatywne zapisy siły z włókien mięśnia vastus lateralis zdrowego człowieka. (A) Włókno typu 1 (CSA: 5710 µm2, Fo: 0.89 mN i sFo: 156 kPa). (B) Włókno typu 2a (CSA: 9510 µm2, Fo: 1.66 mN i sFo: 174 kPa). Typ ciężkiego łańcucha miozyny włókien określono za pomocą rozdziału elektroforetycznego i technik barwienia srebrem22.

schemat równowagi statycznej; analiza siła-długość; wykres napięcie-przemieszczenie; badanie mechaniki
Rycina 9: Obliczenie maksymalnej siły aktywnej (Fo). (a) Powiększony widok odpowiedzi siłowej włókna podczas ruchu kontrolera długości wywołującego luz, zainicjowanego w roztworze preaktywującym. FP to siła wymagana do utrzymania długości sarkomeru 2.7 µm przy włóknie w spoczynku. (b) Powiększony widok ruchu kontrolera długości wywołującego luz. Należy zauważyć, że Fo = FT– FP.

Wykres siły w funkcji czasu pokazujący odpowiedź mechaniczną przy naprężeniu 50 kPa, schematy A, B, C.
Rysunek 10: (A) Ześlizgnięcie się pętli szwu, objawiające się „skokiem” w przebiegu siły podczas jej wzrostu. Należy upewnić się, że pętle są zabezpieczone przed aktywacją włókna. (B) Przerwanie włókna podczas aktywacji. Może wynikać z niskiej integralności włókna lub zbyt agresywnego traktowania włókna podczas umieszczania pętli szwu. (C) Przedwczesna częściowa aktywacja włókna spowodowana zanieczyszczeniem komory przedaktywacyjnej jonami Ca2+.

Dyskusja

Oceny właściwości skurczowych przepuszczalnych pojedynczych włókien mięśni szkieletowych są wykorzystywane do badania funkcji mięśni w wielu różnych kontekstach. Przykłady obejmują badania, w których oceniano wpływ starzenia się12, ćwiczeń10,13,14, lotów kosmicznych15, urazów2,3,16, leczenia farmakologicznego17,18, chorób19 i manipulacji genetycznych20,21 na strukturę i funkcję włókien. Ze względu na możliwość bezpośredniej oceny zdolności skurczowej miofibryli w ich natywnej konfiguracji, technika ta stanowi atrakcyjną platformę, na podstawie której można zrozumieć funkcję miofibrylarną bez potencjalnie zakłócających efektów, które występują, gdy transmisja sygnału nerwowo-mięśniowego i wywołane wzbudzeniem uwalnianie wapnia są uwzględnione w badanym systemie. Ponadto testy funkcjonalne pojedynczych włókien mogą być stosowane w celu uzupełnienia wyników identyfikacji białek kurczliwych, takich jak te uzyskane za pomocą immunohistochemii lub elektroforezy żelowej + western blot22.

Jedną z podstawowych funkcji mięśni szkieletowych jest wytwarzanie siły. W związku z tym sFo, miara wewnętrznej zdolności układu skurczowego do generowania siły, jest bardzo interesująca dla fizjologów mięśni. Wiarygodne szacunki sFo wymagają dokładnych pomiarów zarówno włókna CSA, jak i Fo. Ponieważ włókna na ogół nie są ani okrągłe w przekroju, ani jednolite w CSA na całej swojej długości, należy zachować dużą ostrożność przy szacowaniu CSA. W tym celu pomiary wykonuje się w kilku miejscach na całej długości światłowodu i w każdym miejscu z dwóch perspektyw oddalonych od siebie o 90°. Wiarygodne pomiary Fo wymagają zwrócenia uwagi na kilka szczegółów, w tym uwzględnienie siły biernej, dostosowanie długości sarkomeru w celu maksymalizacji nakładania się grubych i cienkich włókien, zastosowanie roztworu aktywującego o stężeniu wapnia, które powoduje maksymalną aktywację, utrzymanie pożądanej temperatury eksperymentalnej i utrzymanie optymalnych warunków przechowywania (temperatura i czas trwania) włókien przed dniem eksperymentu.

Chociaż przedstawione tutaj kroki opisują procedurę oceny maksymalnej siły izometrycznej, często pożądana jest ocena innych ważnych cech funkcjonalnych włókien mięśni szkieletowych. Można to osiągnąć poprzez rozszerzenie protokołu eksperymentalnego o dodatkowe mechaniczne manipulacje włóknem. Na przykład pomiar prędkości, z jaką światłowód zwarla się pod wpływem szeregu różnych obciążeń, pozwala na wyznaczenie zależności siła-prędkość, z której można obliczyć zależności siła-moc i prędkość-moc10,23,24. Dodatkowo, prędkość nieobciążonego skracania można określić za pomocą "testu luzu"25, który polega na zastosowaniu serii etapów skracania powodujących luz i pomiarze czasu wymaganego przez włókno do usunięcia luzu. Innym parametrem kinetycznym, który jest często zgłaszany, jest ktr, stała szybkości przebudowy siły po zaburzeniu mechanicznym, które tymczasowo odłącza wszystkie mosty poprzeczne26. Wreszcie, związek między stężeniem wapnia a wytwarzaniem siły czynnej ("zależność siła-pCa") jest często interesujący18 i można go określić, wystawiając włókno na działanie szeregu roztworów o stężeniach wapnia w zakresie od poniżej progu aktywacji układu skurczowego do tych wystarczających do wywołania maksymalnej aktywacji, a tym samym maksymalnej siły (Fo).

Chociaż wiele z wymienionych urządzeń jest potrzebnych do oceny kurczliwości pojedynczych włókien, inne urządzenia nie są absolutnie konieczne. Regulator długości, na przykład, jest niezbędny dla każdego protokołu eksperymentalnego, który wymaga szybkiego lub precyzyjnego wydłużenia lub skrócenia włókna, ale nie jest absolutnie konieczny do oceny maksymalnej siły izometrycznej (chociaż zerowy poziom siły w rejestrze siły musi być nadal zidentyfikowany w jakiś sposób). Pryzmaty, które umożliwiają obserwację światłowodu z boku, choć przydatne do oceny pola przekroju poprzecznego, nie są absolutnie konieczne przy ustawianiu światłowodu w komorze doświadczalnej. Ponadto można zastosować alternatywne sposoby wystawiania włókna na działanie różnych roztworów eksperymentalnych, w tym opracowanie ręcznie obsługiwanego systemu komór lub pojedynczej komory, która pozwala na szybkie napełnianie i opróżnianie roztworów. Wreszcie, podczas gdy subfizjologiczne temperatury doświadczalne, takie jak 15 °C, są powszechnie stosowane w celu poprawy odtwarzalności pomiarów mechanicznych1,2,3,5,8,12,17,27, możliwe jest wygenerowanie ważnych danych w innych temperaturach23,28, o ile uwzględni się wpływ temperatury na właściwości roztworu (stężenie wapnia, pH itp.).

Skład roztworów testowych jest jednym z najbardziej krytycznych aspektów opisanych tutaj technik włókien przepuszczalnych. Zagadnienia dotyczące kompozycji rozwiązania są złożone i wykraczają poza zakres tego artykułu. Rozwiązania opisane w kroku 5 sekcji protokołu zostały zaprojektowane z naciskiem na szybką aktywację światłowodu przepuszczalnego po jego przejściu z roztworów wstępnych do aktywujących przy zachowaniu stałej siły jonowej, składu kationowego i osmolarności6,29. Inne podejścia do kompozycji roztworów zostały zastosowane ze znaczącym powodzeniem przez inne grupy badawcze i zazwyczaj wykorzystują opublikowane stałe wiązania i narzędzia obliczeniowe27,30,31. Stężenia jonów wapnia w różnych roztworach aktywujących są szczególnie ważne w badaniach obejmujących submaksymalną aktywację, takich jak ocena siły pCa. W przypadku eksperymentów, w których włókna są w pełni aktywowane, takich jak te opisane tutaj, stężenie wapnia w roztworze aktywującym zazwyczaj przekracza komfortowy margines wymagany do osiągnięcia maksymalnej siły, co sprawia, że jego dokładna wiedza jest mniej krytyczna. Dodanie fosforanu kreatyny jest ważne dla buforowania wewnątrzmiofibrylarnych wahań ATP i ADP, które w przeciwnym razie byłyby związane z aktywnością skurczową. Kinaza kreatynowa jest niezbędna do katalizowania transferu fosforanów z fosforanu kreatyny do ADP. W warunkach eksperymentalnych, które skutkują wysokimi wskaźnikami obrotu ATP, w tym pracy w wysokich temperaturach lub mierzeniu szybkiego skracania włókien szybkich32, kinaza kreatynowa musi zostać dodana do roztworu w celu uzupełnienia endogennej kinazy kreatynowej, która pozostaje związana z błonnikiem. W przypadku mniej wymagających warunków eksperymentalnych system regeneracji ATP jest mniej krytyczny27.

Ograniczenia techniki przepuszczalnego pojedynczego włókna są następujące. Dane wygenerowane przez te testy określają właściwości kurczliwe specyficznej jednostki miofibrylarnej, która została przyłączona do aparatury doświadczalnej. W związku z tym wychwytuje to tylko niewielką część całego włókna wielojądrowego, z którego uzyskano segment, który z kolei stanowi niewielki ułamek całkowitej liczby włókien w mięśniu. Badacze powinni zatem dokładnie rozważyć pobieranie próbek wymaganych do poparcia wszelkich wniosków wyciągniętych z eksperymentów. Dodatkowo, ocena wpływu interwencji treningu fizycznego na funkcję włókien zakłada, że oceniane włókna były rzeczywiście rekrutowane podczas treningu. Chociaż protokół próbuje naśladować naturalne środowisko wewnątrzkomórkowe włókna, proces przenikania sarcolemmy jest niespecyficzny i koniecznie pozwala rozpuszczalnym składnikom wewnątrzkomórkowym swobodnie dyfundować do roztworów kąpielowych. Kolejną konsekwencją przepuszczalności błony jest zmiana równowagi osmotycznej objawiająca się pęcznieniem objętości włókien33. Pęcznienie włókien zwiększa odległość między włóknami aktyny i miozyny, co skutkuje zmniejszoną wrażliwością układu miofilamentów na wapń34,35, ale może być odwrócone przez wprowadzenie dużych, osmotycznie aktywnych związków34. Ostatnim ograniczeniem, które należy wziąć pod uwagę, jest konsekwencja techniki stosowanej do mocowania włókien do aparatury doświadczalnej. Wymaga to niezmiennie zniekształcenia relacji przestrzennych w systemie żarników w punktach mocowania i w ich pobliżu, z towarzyszącymi deficytami funkcjonalnymi. W szczególności obszary włókna w punktach mocowania i przylegające do nich są funkcjonalnie naruszone, a tym samym przyczyniają się do sztucznej elastyczności szeregowej systemu pomiarowego.

Podsumowując, opisaliśmy sposób, za pomocą którego można ocenić zdolność do generowania siły przez chemicznie przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych in vitro. Chociaż w tym artykule skupiono się na ocenie maksymalnej zdolności generowania siły izometrycznej przez włókna ludzkich mięśni szkieletowych, podejście eksperymentalne może być modyfikowane i rozszerzane w celu określenia różnych parametrów kinetycznych i relacji między różnymi gatunkami, ssakami lub innymi.

Oświadczenia

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu jest sponsorowany przez Aurora Scientific

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez następujące źródła finansowania: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do hodowli polistyrenu z nakrętkąFisher Scientific 14-956-3D
Mikrowirówka z nakrętką 0,5 mlFisher Scientific 02-681-334
Nasadki do mikrowirówek 0,5 ml z o-ringiemFisher Scientific 02-681-358
Kriobox do mikrowirówekFisher Scientific 5055-5005
pH-metrMettler-ToledoFE20
szalka PetriegoFisher Scientific 08-757-11YZ
Niesterylny szew 10-0 monofilamentAshaway Line SznurekS30002
Szpilki do owadówFine Science Tools26002-10
Kleszcze - Dumont #5Fine Science Tools11251-20
Nożyczki do mikropreparacjiFine Science Tools15000-08
Mikroskop stereoskopowyLeica MicrosystemsNapędy
Hannifin3936M
TermometrPhysitempBAT-12
Cyrkulator kąpieli wodnej Neslab InstrumentsRTE-111
Regulator temperaturyAplha Omega InstrumentsSeria 800
Oprogramowanie LabVIEWNational Instruments-Computer
System zróżnicowanych
komórAuroraScientific 802D
Regulator długościAurora Scientific312C
Przetwornik siłyAurora Scientific403A
Odczynniki
K-proprionateTCI AmericaP0510
ImadizoleSigma-AldrichI0125
MgCl2• 6H20Sigma-AldrichM2670
Brij 58Sigma-AldrichP5884
EGTA (kwas)Sigma-AldrichE0396
Na2H2ATP• 0.56H2OSigma-AldrichA7699
GlicerolSigma-AldrichG6279
HEPES (kwas)Sigma-AldrichH7523
MgOSigma-Aldrich529699
HDTA (kwas)TCI AmericaD2019
CaCO3Sigma-AldrichC4830
NaN3Sigma-AldrichS8032
KOH (1 N)Sigma-Aldrich35113
HCL (1 N)Sigma-Aldrich318949
Na2CrP• 4H2OSigma-AldrichP7936
Norma pH 10Fisher ScientificSB115
Norma pH 7Fisher ScientificSB107
mikrometryczne MZ8 Parker

Bibliografia

  1. Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation. J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).
  2. Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy. J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).
  3. Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears. J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).
  4. Moss, R. L. Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths. J Physiol. 292, 177-192 (1979).
  5. Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers. Biophys J. 53, 935-946 (1988).
  6. Moisescu, D. G., Thieleczek, R. Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution. J Physiol. 275, 241-262 (1978).
  7. Walker, S. M., Schrodt, G. R. I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human. Anat Rec. 178, 63-81 (1974).
  8. Gollapudi, S. K., Lin, D. C. Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers. J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).
  9. Brenner, B. Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers. Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).
  10. Claflin, D. R., et al. Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).
  11. Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).
  12. Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).
  13. Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. What do single-fiber studies tell us about exercise training. Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).
  14. Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).
  15. Trappe, S. Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology. J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).
  16. Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics. J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).
  17. Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
  18. Russell, A. J., et al. Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases. Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).
  19. Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).
  20. Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice. J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).
  21. Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).
  22. Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system. Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).
  23. Hill, A. V. The heat of shortening and the dynamic constants of muscle. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).
  24. Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence. J Physiol. 495, 573-586 (1996).
  25. Edman, K. A. The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres. J Physiol. 291, 143-159 (1979).
  26. Brenner, B., Eisenberg, E. Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution. PNAS. 83, 3542-3546 (1986).
  27. Moss, R. L. The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit. J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).
  28. Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle. Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).
  29. Ashley, C. C., Moisescu, D. G. Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils. J Physiol. 270, 627-652 (1977).
  30. Godt, R. E. Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration. J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).
  31. Fabiato, A., Fabiato, F. Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells. Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).
  32. Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles). Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).
  33. Godt, R. E., Maughan, D. W. Swelling of skinned muscle fibers of the frog. Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).
  34. Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers. Biophys J. 64, 187-196 (1993).
  35. Millman, B. M. The filament lattice of striated muscle. Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).
  36. Edman, K. A. Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers. J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).
  37. Phillips, S. K., Woledge, R. C. A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle. Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).
  38. Stephenson, D. G., Williams, D. A. Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat. J Physiol. 333, 637-653 (1982).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja pojedynczego w knaregulacja d ugo ci sarkomeruaktywacja wapniempomiar si yobliczanie pola powierzchni przekroju poprzecznegopermeabilizacja chemicznainterferometria laserowaprzygotowanie p tli szewskiej
Pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.