Pomiar maksymalnej siły izometrycznej generowanej przez przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych

Summary

Analiza właściwości kurczliwych chemicznie skórowanych lub przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych oferuje potężny sposób oceny funkcji mięśni na poziomie pojedynczej komórki mięśniowej. W tym artykule przedstawiamy ważną i wiarygodną technikę przygotowania i badania przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych in vitro.

Abstract

Analiza właściwości kurczliwych chemicznie skórowanych lub przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych oferuje potężny sposób oceny funkcji mięśni na poziomie pojedynczej komórki mięśniowej. Badania pojedynczych włókien mięśniowych są przydatne zarówno w naukach podstawowych, jak i badaniach klinicznych. W przypadku badań podstawowych, pomiary kurczliwości pojedynczych włókien mięśniowych pozwalają na zbadanie podstawowych mechanizmów wytwarzania siły oraz analizę funkcji mięśni w kontekście manipulacji genetycznych. Klinicznie badania pojedynczych włókien mięśniowych dostarczają użytecznych informacji na temat wpływu urazów i chorób na funkcjonowanie mięśni i mogą być wykorzystane do zrozumienia patologii mięśniowych. W tym artykule wideo przedstawiamy kroki wymagane do przygotowania i wyizolowania pojedynczego segmentu włókien mięśni szkieletowych, przymocowania go do aparatury do pomiaru siły, aktywacji w celu wytworzenia maksymalnej siły izometrycznej i oszacowania jego pola przekroju poprzecznego w celu normalizacji wytwarzanej siły.

Introduction

Podstawową funkcją mięśni szkieletowych jest generowanie siły. Siła mięśniowa jest wywoływana in vivo poprzez złożoną sekwencję zdarzeń, która obejmuje potencjały czynnościowe nerwów ruchowych, przekaźnictwo nerwowo-mięśniowe, potencjały czynnościowe włókien mięśniowych, uwalnianie wewnątrzkomórkowego wapnia oraz aktywację systemu białek regulatorowych i kurczliwych. Ponieważ generowanie siły jest ostatecznym wynikiem tej sekwencji, deficyt siły może być spowodowany awarią jednego lub więcej pojedynczych kroków. Kluczową cechą preparatu z włókien przepuszczalnych jest to, że eliminuje on większość etapów wymaganych do wytworzenia siły in vivo, pozostawiając tylko funkcje regulacyjne i kurczliwe związane z aparatem miofibrylarnym. Badacz przejmuje kontrolę nad dostarczaniem aktywującego wapnia i energii (ATP) i jest nagradzany uproszczonym systemem, który umożliwia ocenę izolowanych struktur regulacyjnych i kurczliwych w ich natywnej konfiguracji. Pomiary siły przy użyciu przepuszczalnych włókien mięśni szkieletowych są zatem cenne przy ocenie zmian w funkcjonowaniu mięśni obserwowanych in vivo. Na przykład użyliśmy tej techniki do scharakteryzowania zdolności generowania siły przez włókna myszy z niedoborem miostatyny¹ oraz do oceny przyczyny utrzymującego się osłabienia mięśni po przewlekłym zerwaniu stożka rotatorów^2,3.

Nowoczesna metodologia włókien przepuszczalnych może być śledzona we wczesnych wpływowych badaniach^4,5 i jest obecnie używana przez wiele grup badawczych. Chociaż techniki te zostały opisane w literaturze, nie zostały one jeszcze przedstawione w formie wideo. Celem tego artykułu jest zilustrowanie zaktualizowanej, ważnej i wiarygodnej techniki pomiaru maksymalnej zdolności generowania siły przez pojedyncze włókna z chemicznie przepuszczalnych próbek mięśni szkieletowych. Aby to osiągnąć, pojedynczy segment włókna (określany tutaj jako "włókno") jest ekstrahowany ze wstępnie przepuszczalnej wiązki włókien i umieszczany w komorze doświadczalnej zawierającej roztwór relaksujący, którego cechą definiującą jest stężenie wapnia <10 nM. Włókno jest następnie podłączane z jednej strony do przetwornika siły, a z drugiej do regulatora długości. Gdy włókno jest utrzymywane na optymalnej długości sarkomeru, jest przenoszone do roztworu aktywującego, który ma stężenie wapnia wystarczające do wywołania maksymalnej aktywacji, a tym samym maksymalnej izometrycznej siły skurczu. Dane dotyczące siły są pozyskiwane, przechowywane i analizowane za pomocą komputera osobistego.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt lub ludzi powinny być wykonywane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Michigan (UCUCA) oraz Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Centrum Medycznego Uniwersytetu Michigan zatwierdziły wszystkie procedury na zwierzętach i ludziach opisane w tym artykule.

1. Wykonaj roztwór zapasów do preparowania i przechowywania

Uwaga: Końcowe woluminy określone w poniższych instrukcjach można dowolnie skalować w górę lub w dół.

1. Do zlewki o pojemności 1 000 ml dodać 800 ml wody dejonizowanej (ASTM Typ 1). Delikatnie mieszając, dodaj wszystkie związki wymienione w tabeli 1 do wody dejonizowanej i pozwól im się rozpuścić. pkt. pkt. pkt. Pokój pkt. zł Pokój pkt. pkt.

   związek	Pożądane stężenie (M)	Formuła Waga (g/mol)	Dodać do 1 L (g)
   K-propionian	0,250	112,17	Godzina 28.040
   Imidazol	0,040	68,08	2.720
   EGTA (EGTA)	0,010	380,40	3.800
   MgCl2•6H2O	0,004	203,31	0,813

Tabela 1: Składniki roztworu podstawowego do preparacji i przechowywania.

2. Doprowadzić do końcowej objętości 1 000 ml wodą dejonizowaną. Należy pamiętać, że w tym czasie nie ma potrzeby pH roztworu. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.

2. Stwórz rozwiązanie do przechowywania

1. Aby przygotować 200 ml roztworu do przechowywania, należy rozpocząć od 100 ml roztworu podstawowego do preparowania i przechowywania w zlewce o pojemności 250 ml. Dodać wystarczającą ilość Na₂H₂ATP, aby doprowadzić końcowe stężenie trifosforanu adenozyny (ATP) do 2 mM. Doprowadzić do końcowej objętości 200 ml glicerolem. Dostosuj do pH 7,00 za pomocą wodorotlenku potasu (KOH). Przechowywać roztwór do przechowywania w temperaturze -20 °C.
   Uwaga: Ze względu na lepki charakter glicerolu dokładne dozowanie objętościowe może być trudne. Z tego powodu zazwyczaj dodajemy wagowo glicerol (100 ml glicerolu waży około 126 g).

3. Wykonaj rozwiązanie do analizy

1. Aby przygotować 200 ml roztworu preparacyjnego, należy rozpocząć od 100 ml roztworu podstawowego do rozwarstwiania i przechowywania w zlewce o pojemności 250 ml.
2. Dodać wystarczającą ilość Na₂H₂ATP, aby doprowadzić końcowe stężenie ATP do 2 mM. Dostosuj pH do 7,00 za pomocą KOH. Doprowadzić końcową objętość do 200 ml wodą dejonizowaną. Podwielokrotność w objętości 2,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Zrób roztwór do preparowania za pomocą Brij 58

Uwaga: Brij 58 to niejonowy detergent, który rozbija (przepuszcza) dwuwarstwy lipidowe.

1. Aby przygotować 200 ml roztworu preparacyjnego za pomocą Brij 58, należy rozpocząć od 200 ml roztworu preparacyjnego w zlewce o pojemności 250 ml. Delikatnie mieszając, dodać 1 g Brij 58 (0,5% w/v) do roztworu preparacyjnego i pozostawić do rozpuszczenia. Podwielokrotność w objętości 2,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Twórz rozwiązania testowe

Uwaga: Poniższy tekst został zaczerpnięty z Moisescu i Thieleczek 1978 (6). Zobacz Dyskusja, aby uzyskać dodatkowe uwagi na temat przygotowywania rozwiązań testowych.

1. Przygotuj trzy oddzielne zlewki o pojemności 1 000 ml oznaczone jako "Relaksujące", "Wstępnie aktywujące" i "Aktywujące". Do każdej zlewki dodać 400 ml wody dejonizowanej.
2. Dodać związki wskazane w tabeli 2 do odpowiedniej zlewki, a następnie podgrzać roztwory do temperatury między 70 °C a 80 °C. Utrzymywać temperaturę roztworu 70-80 °C przez 30 minut, ciągle mieszając.
   Uwaga: Temperatura 70-80 °C pomaga w eliminacji kwasu węglowego powstałego w wyniku reakcji węglanu wapnia z EGTA w roztworze aktywującym. Roztwór relaksujący i roztwory wstępnie aktywujące są traktowane w taki sam sposób, jak roztwór aktywujący, aby zachować spójność.

zł pkt. jedn. pkt. jedn. jedn. pkt. pkt. pkt. zł pkt. Prętów Prętów pkt. pkt. TGL TGL pkt.

		RELAKSUJĄCE ROZWIĄZANIE		ROZWIĄZANIE PRZED AKTYWACJĄ		AKTYWACJA ROZWIĄZANIA
związek	Formuła Waga (g/mol)	Pożądane stężenie (mM)	Wymagana masa (g)	Pożądane stężenie (mM)	Wymagana masa (g)	Pożądane stężenie (mM)	Wymagana masa (g)
HEPES (kwas)	238,30	90,0	10,724	90,0	10,724	godz. 90.00	10,724
MgO	Godzina 40,31	Rozdział 10.3	0,208	8,5	0,171	Klasa 8.12	0,164
EGTA (kwas)	380,40	52,0	9.890			Godzina 52.00	9.890
HDTA (kwas)	348,36			50,0	8,709
EmisjaCO3	100,10					Godzina 50.00	2,503

Tabela 2: Relaksujące, wstępnie aktywujące i aktywujące składniki rozwiązania.

3. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i dodać wystarczającą ilość NaN₃/KOH, aby doprowadzić końcowe stężenie NaN₃ do 1 mM.
   UWAGA: NaN₃ (azydek sodu) jest trujący. Zapoznaj się z chemiczną kartą charakterystyki przed użyciem tej substancji chemicznej.
   1. Aby przygotować 100 ml 100 mM roztworu azydku sodu, dodać 0,65 g NaN₃ do 10 ml 1 N KOH. Doprowadzić do końcowej objętości 100 ml z wodą dejonizowaną.
4. Dostosuj pH do około 7,10 za pomocą KOH.
5. Postępując zgodnie z krokiem 5.4, dodać wystarczającą ilość Na₂H₂ATP, aby doprowadzić końcowe stężenie ATP do 8 mM i wystarczającą ilość Na₂CrP, aby doprowadzić końcowe stężenie fosfatanu kreatyny (CrP) do 10 mM.
6. Doprowadzić każdy roztwór do końcowej objętości 500 ml za pomocą wody dejonizowanej. Schłodzić lub podgrzać roztwory do temperatury, w której będą przeprowadzane eksperymenty, a następnie użyć KOH, aby doprowadzić pH do 7,10, utrzymując tę temperaturę.
7. Dodać roztwór relaksujący do zlewki zawierającej roztwór wstępnej aktywacji w taki sposób, aby końcowy roztwór wstępnej aktywacji stanowił 1 część roztworu relaksującego w 500 roztworze wstępnej aktywacji. Podwielokrotność w objętości 2,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Zrób pętle do szwów

1. Zacznij od pasma niesterylnego nici nylonowego z monofilamentu USP 10-0.
2. Użyj kleszczy, aby utworzyć pętlę z pasmem za pomocą techniki podwójnego węzła z góry. Zmniejsz rozmiar węzła do około 750 μm średnicy. Średnicę pętli można ocenić pod mikroskopem za pomocą oznaczeń siatki okularowej.
3. Użyj nożyczek do mikropreparacji, aby usunąć nadmiar szwów, pozostawiając tylko pętlę i małe (500 μm) ogonki po obu stronach. Przykład gotowej pętli pokazano na rysunku 1.
4. Powtarzaj kroki 6.2-6.3, aż zostaną wykonane 4 użyteczne pętle. Przechowuj pętle na szalce Petriego pokrytej elastomerem silikonowym do wykorzystania w przyszłości.
   Uwaga: Dla każdego testowanego włókna wymagane są cztery pętle do szwów.

7. Próbka pakietu

Uwaga: Poniższe kroki opisują procedurę dzielenia oryginalnej próbki na mniejsze eksperymentalne 'wiązki', z których ostatecznie zostaną wyodrębnione i przetestowane pojedyncze włókna. Przez cały czas z próbką należy obchodzić się ostrożnie. Na potrzeby tego opisu instrukcje będą wydawane tak, jakby badacz był praworęczny.

1. Pobrać badaną próbkę i przenieść ją do obiektu, w którym odbędzie się sekcja.
   Uwaga: Metody biopsji tkanek będą się różnić w zależności od modelu eksperymentalnego i projektu badania. Tam, gdzie to możliwe, perfuzja mięśni powinna być utrzymana aż do czasu biopsji.
2. Jeżeli próbka ma być przeniesiona między miejscem zbioru a miejscem preparacji, należy ją przetransportować w fiolce zawierającej schłodzony roztwór preparacyjny, podczas gdy jest przechowywana na lodzie.
3. Przygotuj 5 cm szalkę Petriego pokrytą elastomerem silikonowym ze schłodzonym roztworem preparacyjnym i dwoma lub trzema kołkami montażowymi na owady (średnica 100 μm, stal nierdzewna).
4. Przenieść próbkę do naczynia. Upewnij się, że próbka pozostaje zanurzona, dodając w razie potrzeby więcej roztworu preparacyjnego.
5. Zbadaj próbkę pod mikroskopem i manipuluj nią, aby wyrównać osie podłużne włókien w kierunku prawego ramienia badacza (ryc. 2). Następnie zakotwicz próbkę w naczyniu, przypinając ją w rogach.
   Uwaga: W tym czasie należy wykorzystać pozostałą tkankę łączną jako punkty zakotwiczenia, ponieważ zmaksymalizuje to wykorzystanie próbki i zachowa integralność włókien. Wiązka może być lekko napięta, aby pomóc w określeniu marginesów między włóknami.
6. Trzymając kleszcze w lewej ręce i nożyczki do mikropreparowania w prawej, zacznij delikatnie preparować wiązkę wzdłuż podłużnych brzegów między włóknami
   Uwaga: W zależności od całkowitej długości, należy go dalej podzielić na wiele mniejszych wiązek.
7. Upewnij się, że wymiary wiązki wynoszą około 0,5-1 mm szerokości i ≥3 mm długości. Oceń wymiary za pomocą mikroskopu z oznaczeniami siatki w okularze lub umieszczając linijkę pod naczyniem.
8. Usuń i wyrzuć wszelkie tkanki, które zostały uszkodzone przez kleszcze lub szpilki w wyniku procesu preparacji.
9. Powtarzać ten proces do momentu wycięcia wystarczającej liczby wiązek lub do wyczerpania próbki.
   Uwaga: Liczba wiązek, które można uzyskać, będzie zależeć od wielu czynników, w tym wielkości i stanu początkowej próbki, morfologii mięśnia i umiejętności badacza.

8. Przepuszczalność włókien

1. Przenieść wiązki z roztworu preparacyjnego do fiolki zawierającej 2,5 ml świeżego, schłodzonego roztworu preparacyjnego z dodatkiem niejonowego detergentu "Brij 58" (0,5% m/v). Inkubować na lodzie przez 30 minut, od czasu do czasu delikatnie mieszając. Upewnij się, że wiązki pozostają zanurzone przez cały czas inkubacji.
2. Pod koniec 30-minutowej inkubacji przenieść wiązki do fiolki zawierającej świeży roztwór preparacyjny (nie Brij 58) i delikatnie i krótko wymieszać w celu usunięcia resztek detergentu.

9. Przygotuj pakiety do przechowywania

1. Przenieść wiązki do fiolki zawierającej schłodzony roztwór do przechowywania i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.

10. Zestawy sklepowe

1. Następnego dnia należy przygotować pojemnik do przechowywania, odporny na temperaturę -80 °C, z wystarczającą ilością pojedynczych stożkowych probówek z nakrętką o pojemności 0,5 ml, aby pomieścić wszystkie wiązki otrzymane podczas procesu preparowania (jedna wiązka na probówkę). Każda stożkowa probówka powinna być wypełniona 200-400 μl świeżego roztworu do przechowywania.
2. Przenieś wiązki do indywidualnie oznaczonych stożkowych probówek. Upewnij się, że wiązka nie jest przyklejona do boku stożkowej rurki lub nie unosi się na powierzchni roztworu. Zakryć stożkowe probówki i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do dnia badania.

11. Przygotuj aparaturę doświadczalną

Uwaga: Niestandardowe urządzenie składa się ze stolika, w którym znajduje się kontroler długości i przetwornik siły, system ruchomych komór i 10-krotny mikroskop preparacyjny. Mikrometryczne instalacje napędowe pozwalają na precyzyjną manipulację powierzchniami mocowania włókien. Wzory dyfrakcji laserowej służą do oszacowania długości sarkomeru. Dane generowane podczas eksperymentowania są rejestrowane na komputerze osobistym. Patrz rysunek 3, aby zapoznać się z obrazami z adnotacjami przedstawiającymi konfigurację eksperymentalną.

1. Rozmrozić po jednej fiolce z roztworów relaksujących, wstępnie aktywujących i aktywujących i utrzymywać na lodzie. Należy pamiętać, że ATP i CrP są labilnymi związkami, które należy utrzymywać w niskich temperaturach.
2. Przygotować mikroskop, aparaturę testującą i powiązany komputer do użycia.
3. Napełnij pierwszą komorę doświadczalną roztworem relaksującym. W naszej aparacie pierwsza komora zawiera pryzmaty, które pozwalają badaczowi na sfotografowanie włókna z boku. Napełnij drugą komorę doświadczalną roztworem wstępnie aktywującym, a trzecią roztworem aktywującym.
4. Wyreguluj temperaturę tak, aby wyświetlacz termometru w komorze wskazywał 15 °C. Nawlecz dwie przygotowane pętle szwów na powierzchnie mocujące ze stali nierdzewnej, wystające zarówno z przetwornika siły, jak i regulatora długości (rysunek 5A).

12. Ekstrakt z przepuszczalnego pojedynczego włókna

1. Rozmrozić interesujący Cię pakiet włókien i przenieść na pokrytą elastomerem silikonowym szalkę Petriego ze świeżym, schłodzonym roztworem relaksującym. Zabezpiecz wiązkę kołkami na obu końcach i upewnij się, że jest zanurzona.
2. Za pomocą kleszczy chwyć włókno na jednym końcu i zacznij płynnie wyciągać je wzdłuż jego osi podłużnej.
   Uwaga: Ściskające uszkodzenie końca włókna spowodowane przez kleszcze nie stanowi obecnie problemu, ponieważ właściwości skurczowe w tym obszarze nie zostaną przetestowane. Należy jednak zachować ostrożność podczas ekstrakcji włókien z wiązki, ponieważ zrosty między włóknami a macierzą zewnątrzkomórkową mogą powodować nadmierne napięcie, co ostatecznie prowadzi do uszkodzeń spowodowanych rozciąganiem. Należy zauważyć, że wśród mięśni istnieje znaczna zmienność w stopniu, w jakim włókna przylegają do otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej. Włókna, co do których istnieje podejrzenie, że zostały uszkodzone przez takie rozciąganie, należy wyrzucić.
3. Użyj żyletki lub skalpela, aby zmodyfikować końcówkę pipety, jak pokazano na rysunku (Rysunek 4). Wprowadź błonnik do końcówki wraz z niewielką ilością relaksującego roztworu. Przenieś pojedyncze włókno z płytki Petriego pokrytej elastomerem silikonowym do komory doświadczalnej, która zawiera roztwór relaksujący.

13. Zamontuj pojedynczy światłowód

Uwaga: Na rysunku 5 można zobaczyć opis krok po kroku.

1. Prowadząc delikatnie kleszczami, usuń włókno z końcówki pipety i zakotwicź je w regulatorze długości (po lewej) za pomocą pierwszej pętli do szwów.
   1. Podczas zaciskania pętli za pomocą kleszczy wykonuj pojedynczy, płynny ruch. Upewnij się, że na obu końcach szwu zastosowano równe i przeciwne napięcie.
   2. Pierwszą pętlę należy zawiązać w odległości około 1 mm do 2 mm od końca powierzchni mocującej regulator długości.
2. Manipuluj drugim końcem światłowodu w kierunku przetwornika siły (po prawej) i zabezpiecz światłowód, stosując tę samą procedurę. Usuń nadmiar szwu za pomocą nożyczek do mikropreparacji (ryc. 5C).
3. Umieść włókno pod niewielkim napięciem, zwiększając odległość między ramieniem regulatora długości i przetwornika siły za pomocą napędu mikrometru o współrzędnych x (rysunek 3A).
4. Przeciągnij drugą pętlę na pierwszą i zakotwicz włókno w punkcie w odległości 0,2 mm od końca powierzchni mocowania przetwornika siły (rysunek 5D).
   1. Usuń nadmiar szwów za pomocą nożyczek do mikropreparacji.
5. Proces przyłączania włókien może spowodować utratę roztworu z komory. W razie potrzeby dodaj więcej relaksującego roztworu, aby upewnić się, że powierzchnia roztworu jest płaska (ani wklęsła, ani wypukła). Płaska powierzchnia jest ważna przy ocenie długości sarkomeru za pomocą dyfrakcji laserowej.
6. Ustaw włókno równolegle do ścian bocznych komory doświadczalnej, regulując położenie regulatora długości w kierunku osi y.
7. Zbadaj światłowód za pomocą pryzmatu view z boku i dostosuj położenie regulatora długości w kierunku osi z, aż światłowód będzie równoległy do podłogi komory.
   Uwaga: Ustawienie światłowodu równolegle do podłogi komory można osiągnąć bez pryzmatów komory, skupiając się najpierw na jednym końcu światłowodu, a następnie, bez regulacji ostrości mikroskopu, ustawiając ostrość na drugim końcu światłowodu za pomocą napędu mikrometrycznego w osi z.
8. Jeśli włókno jest w jakikolwiek sposób wykrzywione, skręcone lub uszkodzone w wyniku procesu montażu, włókno należy wyrzucić i dołączyć nowe włókno.

14. Ustaw optymalną długość sarkomeru

1. Gdy światłowód zostanie prawidłowo ustawiony w komorze, włóż skalibrowany ekran docelowy do przedniej części mikroskopu i ustaw go nad pierwszą komorą doświadczalną.
   Uwaga: Ekran docelowy jest kalibrowany przy użyciu standardowego równania siatki, λ = SL sinθ, gdzie SL to długość sarkomeru, θ to kąt dyfrakcji między wiązkami dyfrakcyjnymi od 0° do 1°, a λ to długość fali lasera.
2. Włącz laser i dostosuj położenie stolika tak, aby laser przechodził przez środek światłowodu.
   UWAGA: Skoncentrowane światło lasera może być szkodliwe dla wzroku. Nigdy nie próbuj wizualizować światłowodu przez mikroskop, gdy laser jest włączony.
3. Ustaw światłowód w stosunku do wiązki laserowej, aby załamać światło lasera i obserwuj wzór zakłóceń na skalibrowanym ekranie celu (rysunek 6). Wyłącz światła, aby wyraźniej zobrazować ten wzór.
   Uwaga: Jeśli przy prawidłowym ustawieniu wiązki laserowej nie widać wzoru zakłóceń, sugeruje to, że składniki miofibrylarne włókna są nieprawidłowe/uszkodzone i że włókno należy wymienić na nowe.
4. Aby ustawić długość sarkomeru, zwiększ lub zmniejsz napięcie włókna za pomocą regulatora długości napędu mikrometrycznego osi x, aż na ekranie docelowym zostanie zaobserwowany żądany odstęp między światłem dyfrakcyjnym.
   Uwaga: Optymalna długość włókna sarkomerowego będzie zależeć od gatunku zwierzęcia, od którego uzyskano próbkę. Powszechnie przyjmuje się, że długość sarkomeru wynosząca 2,7 μm jest optymalna przy ocenie włókien z tkanki ludzkiej^7,8.
5. Po ustaleniu optymalnej długości sarkomeru zmierz odległość między dwoma najbardziej wewnętrznymi szwami. Najłatwiej jest to osiągnąć za pomocą cyfrowego odczytu na napędzie mikrometrycznym, który steruje ruchem osi X komory. Ustawić komorę tak, aby pionowy krzyż nitkowy okularu był wyrównany na najbardziej wewnętrznej granicy najbardziej wewnętrznego szwu i wyzeruj odczyt cyfrowy na napędzie mikrometrycznym.
6. Przesuń stolik wzdłuż osi x względem mikroskopu, aż dotrze do drugiego najbardziej wewnętrznego szwu. Cyfrowy wyświetlacz wskaże długość włókna. Wartość tę należy zapisać jako długość włókna, L_f.
   Uwaga: Należy rozumieć, że odległość między dwoma najbardziej wewnętrznymi szwami określi funkcjonalną długość ocenianej tkanki kurczliwej. Badacz powinien dążyć do spójności w tym wymiarze (tj. L_f) w ramach serii eksperymentów.

15. Oszacuj pole przekroju poprzecznego (CSA)

1. Utrzymuj światłowód w pozycji L_f i użyj kamery zamontowanej na mikroskopie, aby uchwycić obraz środkowej części światłowodu w dużym powiększeniu zarówno z góry, jak i z boku. Obrazy z boku można rejestrować za pomocą pryzmatu umieszczonego z boku komory.
   Uwaga: Podczas przełączania między widokiem z góry i z boku ważne jest, aby przesuwać mikroskop tylko w kierunku y, aby upewnić się, że dwa obrazy są "w rejestrze", a zatem pokazują dwa różne widoki tego samego odcinka światłowodu.
2. W tym momencie należy wykonać pomiary, aby znormalizować siłę bezwzględną w dalszej części badania. Techniki uzyskiwania tych pomiarów są opisane później i zilustrowane na rysunkach 7A i 7B.

16. Wywołaj skurcz izometryczny

Uwaga: Podczas gdy dane generowane podczas tych eksperymentów mogą być zbierane i interpretowane bez użycia komputera, korzystne jest oprogramowanie, które pozwala na pozyskiwanie, wyświetlanie, przechowywanie i analizę reakcji siły. Niestandardowe oprogramowanie LabVIEW stworzone przez nasze laboratorium umożliwia te funkcje, jak również możliwość projektowania "ciągów ruchu", które zarządzają działaniem regulatora długości podczas eksperymentu.

1. Upewnić się, że temperatura roztworów relaksujących, wstępnie aktywujących i aktywujących jest stabilna i wynosi 15 °C.
2. Za pomocą oprogramowania sterującego komorą przenieś włókno do komory zawierającej roztwór wstępnej aktywacji i inkubuj tam przez 3 minuty
   Uwaga: Roztwór wstępnej aktywacji jest słabo buforowany dla Ca²⁺, co powoduje bardzo szybką aktywację i rozwój siły po wprowadzeniu światłowodu do roztworu aktywującego.
3. Gdy w roztworze wstępnej aktywacji pozostało 10 sekund, a długość włókna utrzymuje się na poziomie L_f, ustal zerowy poziom siły w zapisie eksperymentalnym.
   Uwaga: Ruch "Znajdź siłę zero" regulatora długości ujawnia poziom przetwornika siły, który odpowiada zerowej sile (tj. włókno na krótko staje się luźne w wyniku ruchu). Siła bierna to różnica między tym zerem a poziomem siły tuż przed ruchem zerowania przetwornika.
4. Pod koniec 3 minut przenieś włókno do komory zawierającej roztwór aktywujący i pozwól, aby wytworzyła się maksymalna siła izometryczna, o czym świadczy plateau siły, które jest poprzedzone szybkim wzrostem.
5. Po osiągnięciu maksymalnej siły izometrycznej należy użyć regulatora długości, aby zidentyfikować wyjście przetwornika siły, które odpowiada zerowej sile w komorze zawierającej roztwór aktywujący.
   Uwaga: Jest to konieczne, ponieważ wyjście przetwornika siły, które odpowiada sile zerowej, jest na ogół różne dla każdej komory wypełnionej roztworem.
6. Po osiągnięciu drugiego plateau siły, włókno należy wciągnąć z powrotem do komory zawierającej roztwór relaksujący. Testy zostały zakończone. Aby przetestować wiele włókien podczas jednej sesji, odessaj wszystkie roztwory i dodaj nowe, schłodzone roztwory.
   Uwaga: Protokoły rowerowe Brennera powinny być brane pod uwagę przy wywoływaniu maksymalnych skurczów przez dłuższy czas. Wykazano, że protokół ten zachowuje właściwości strukturalne i mechaniczne w maksymalnie aktywowanym włóknie⁹.

Results

Zdrowe, chemicznie przepuszczalne pojedyncze włókna powinny wyglądać na jednolite w kształcie i mieć stałe odstępy między prążkami, gdy są oglądane pod dużym powiększeniem. Włókna, które są nieelastyczne podczas manipulowania kleszczami lub mają oczywiste uszkodzenia strukturalne, należy wyrzucić.

Cyfrowe obrazy w dużym powiększeniu, wykonane podczas kroku 15, są analizowane pod kątem 5 sparowanych pomiarów średnicy wzdłuż środkowej części światłowodu. Światłowód CSA jest szacowany przy założeniu eliptycznego przekroju poprzecznego i uśrednieniu 5 indywidualnych pomiarów CSA, jak pokazano na rysunku 7A. Rysunek 7B służy również do zilustrowania, w jaki sposób wymiary włókien w jednym widoku mogą się znacznie różnić w porównaniu z sparowanymi wymiarami w drugim widoku (tj. przekroje poprzeczne nie są, ogólnie rzecz biorąc, okrągłe).

Reprezentatywne ślady siły z ludzkich wolnych i szybkich włókien są pokazane odpowiednio na rysunkach 8A i 8B. Napięcie wyjściowe przetwornika siły jest rejestrowane podczas testu i przekształcane na siłę (mN) za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy danych (LabVIEW). Rysunek 9 ilustruje podejście zastosowane do oceny maksymalnej siły czynnej (F_o), która jest obliczana poprzez odjęcie siły potrzebnej do utrzymania włókna na optymalnej długości sarkomeru w stanie relaksu (siła bierna, F_P), od największej siły izometrycznej powstającej podczas maksymalnej aktywacji włókna (siła całkowita, F_T). Ponieważ moc wyjściowa przetwornika siły, która odpowiada zerowej sile, jest na ogół różna dla każdej z różnych komór kąpielowych, na krótko rozluźniamy włókno zarówno w roztworach wstępnych, jak i aktywujących, aby uchwycić poziom siły zerowej w zapisie eksperymentalnym. Normalizacja maksymalnej siły czynnej przez światłowód CSA służy do generowania bardziej informacyjnej wartości siły właściwej (sF_o). Ponieważ bierze pod uwagę CSA włókna, sF_o zapewnia miarę zdolności do generowania siły wewnętrznej aparatu kurczliwego włókna, umożliwiając w ten sposób funkcjonalne porównania między włóknami o różnych rozmiarach. Należy jednak zauważyć, że pomiary CSA nie są w stanie rozróżnić proporcji włókna zajmowanego przez włókna kurczliwe w stosunku do proporcji zajmowanej przez inne struktury subkomórkowe.

Typowe cechy zdrowych, dorosłych włókien od Claflin et al. 2011¹⁰ dla człowieka, Mendias et al. 2011¹ dla myszy i Gumucio et al. 2012² dla szczurów przedstawiono w tabeli 3. Wszystkie dane przedstawione w tabeli 3 zostały wygenerowane przy użyciu technik opisanych w tym artykule.

TGL TGL TGL szt.

	Człowiek (obszerny boczny)				Mouse Panie przewodniczący, panie i panowie!	Rat (infraspinatus)
	Mężczyzna		Kobieta		mężczyzna	mężczyzna
	Wpisz 1	Wpisz 2a	Wpisz 1	Wpisz 2a	(nie wpisane)	(nie wpisane)
CSA (μm2)	Nr tel. 4880 - 6900	Nr art. 5270 - 8380	Nr tel. 3870 - 5470	Nr kat. 4010 - 5610	Lata 1850 - 3080	Nr kat. 5290 - 8010
Fo (mN)	0,79 - 1,17	1,02 - 1,54	0,64 - 0,97	0,71 - 1,07	0,14 - 0,25	0,55 - 0,97
sFo (kPa)	142 - 182	165 - 210	Księga 156 - 193	172 - 214	67 - 94	od 102 do 131
n	129 Rozdział 129	160	Rozdział 149	Rozdział 207	37	94 Rozdział 94

Tabela 3. Typowe cechy zdrowych, dorosłych włókien mięśni obszernych^{bocznych 10} człowieka, mięśni prostownika długiego palca myszy¹ i mięśnia podgrzebieniowego^{szczura 2}. Optymalne długości sarkomerów ustalono na 2,7 μm dla włókien ludzkich^7,8 i 2,5 μm zarówno dla włókien myszy (36,37), jak i szczurów (38). Eksperymentalne zakresy_{L f} (25ⁱ 75^kwartyla) wynosiły 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm i 1,32-1,59 mm odpowiednio dla człowieka, myszy i szczura. Pokazane zakresy wskazują 25. i 75. kwartyl, a n to liczba badanych włókien.

Najczęstsze problemy napotykane podczas testów obejmują poślizg pętli szwów, który skutkuje reakcją siły z "zaczepem", takim jak ten pokazany na rysunku 10A, oraz częściowe lub pełne rozdarcie włókna, co skutkuje reakcją siły, która gwałtownie powraca w kierunku lub do (złamania) zera, podczas gdy włókno jest nadal zanurzone w roztworze aktywującym (Rysunek 10B). Jeśli podczas eksperymentu dojdzie do poślizgnięcia, rozdarcia lub pęknięcia, światłowód powinien zostać wyrzucony, a dane wykluczone, chociaż prowadzenie rejestru awarii światłowodów może być również^pouczające. Innym negatywnym skutkiem, który można napotkać, jest przedwczesna aktywacja włókna w roztworze wstępnie aktywującym (ryc. 10C). Częściowa aktywacja w roztworze wstępnie aktywującym sugeruje znaczne zanieczyszczenie dołek krzyżowy (tj. niezamierzony wzrost stężenia wapnia w studzience wstępnej). W takim przypadku wszystkie kąpiele należy zassać i dobrze spłukać wodą dejonizowaną. Zaleca się również suszenie powierzchni dzielących między komorami, ponieważ wilgoć lub kondensacja w tych obszarach może prowadzić do przesiąkania roztworu między kąpielami. Decyzja o włączeniu lub wykluczeniu danych będzie ostatecznie zależała od ukierunkowania eksperymentu i dlatego powinna być brana pod uwagę przy projektowaniu badania.

Rysunek 1: Pętla do szwów (szew nylonowy 10-0 monofilamentowy).

Rysunek 2: Rozwarstwienie wiązki. Kleszcze są w lewej ręce, nożyczki do mikrodysekcji są w prawej ręce. Czerwona linia wskazuje korzystną orientację nadgarstka i nożyczek z podłużnymi osiami włókien.

Rysunek 3: (A) Aparatura badawcza z oznaczonymi elementami. (a) Komory doświadczalne z przeźroczystym dnem. b) Regulator długości. (c) Przetwornik siły. (d) Źródło światła. e) Napęd mikrometryczny x-y-z z regulatorem długości z wyświetlaczem cyfrowym. (f) Stolikowy napęd mikrometryczny z wyświetlaczem cyfrowym. g) Napęd mikrometryczny przetwornika siły x-y-z. h) Platforma do kalibrowanego ekranu tarczy dyfrakcyjnej laserowej. (i) Tabela izolacji drgań. (B) Zbliżenie na komory doświadczalne. j) Powierzchnia mocująca ze stali nierdzewnej wystająca z regulatora długości. k) Powierzchnia mocująca ze stali nierdzewnej wystająca z przetwornika siły. (l) Pryzmat boczny. m) Obudowa termoelektrycznych modułów chłodzących. n) Termopara do podawania temperatury w komorze.

Ilustracja 4: Zmodyfikowana końcówka pipety o pojemności 100 μl używana do przenoszenia włókna z naczynia preparacyjnego do komory doświadczalnej.

Rysunek 5: Montaż pojedynczego włókna światłowodowego na aparaturze doświadczalnej. (A) Przygotowane pętle do szwów nawleczone na powierzchnie mocujące ze stali nierdzewnej. (B) Włókno przeniesione do komory doświadczalnej. (C) Włókno zakotwiczone w powierzchniach mocujących ze stali nierdzewnej za pomocą pierwszej pary pętli do szwów z usuniętym nadmiarem szwu. (D) Druga para pętli do szwów nawleczona na wierzch pierwszej pętli szwów i zawiązana na miejscu.

Rysunek 6: długość sarkomeru jest oceniana poprzez rzutowanie wzorca interferencji lasera na skalibrowany ekran tarczy. (a) Źródło lasera. (b) Lustro. (c) Ekran docelowy. (d) Wzór interferencji laserowej.

Rysunek 7: (A) Określenie pola przekroju poprzecznego włókien przy optymalnej długości sarkomeru (człowiek = 2,7 μm). Zakładając przekrój eliptyczny, CSA oblicza się dla każdego z pięciu miejsc wzdłuż odcinka środkowego światłowodu, a średnią z pięciu pojedynczych pomiarów podaje się jako włókno CSA. 2a reprezentuje średnicę widoku z góry i jest jedną osią elipsy, 2b reprezentuje średnicę widoku z boku i jest drugą osią elipsy. (B) Reprezentatywne obrazy włókien ilustrujące każdy z pięciu odpowiadających im pomiarów średnicy wykonanych zarówno w widoku z góry, jak i z boku.

Ryc. 8: Reprezentatywne ślady siły ze zdrowych włókien mięśniowych obszernych bocznych człowieka. (A) Włókno typu 1 (CSA: 5710 μm², F_o: 0,89 mN i sF_o: 156 kPa). (B) Włókno typu 2a (CSA: 9510 μm², F_o: 1,66 mN i sF_o: 174 kPa). Typ ciężkiego łańcucha miozyny włókien określono za pomocą technik separacji elektroforetycznej i barwienia srebrem²².

Rysunek 9: Obliczanie maksymalnej siły czynnej (F_o). (a) Rozszerzony widok reakcji siły światłowodu podczas indukującego luz ruchu regulatora długości zainicjowanego w roztworze wstępnie aktywującym. F_P jest siłą wymaganą do utrzymania długości sarkomeru wynoszącej 2,7 μm przy spoczynku włókna. (b) Rozszerzony widok ruchu powodującego luz regulatora długości. Zauważ, że F_o = F_T– F_P.

Rysunek 10: (A) Poślizg pętli szwów, o czym świadczy "zaczepienie" śladu siły podczas narastania siły. Sprawdź, czy pętle są bezpieczne przed aktywacją światłowodu. (B) Przerwanie włókna podczas aktywacji. Może to być spowodowane słabą integralnością włókien lub agresywną obróbką włókien podczas zakładania pętli szwów. (C) Przedwczesna częściowa aktywacja włókien z powodu zanieczyszczenia komory przed aktywacją Ca²⁺.

Discussion

Oceny właściwości skurczowych przepuszczalnych pojedynczych włókien mięśni szkieletowych są wykorzystywane do badania funkcji mięśni w wielu różnych kontekstach. Przykłady obejmują badania, w których oceniano wpływ starzenia się¹², ćwiczeń^10,13,14, lotów kosmicznych¹⁵, urazów^2,3,16, leczenia farmakologicznego^17,18, chorób¹⁹ i manipulacji genetycznych^20,21 na strukturę i funkcję włókien. Ze względu na możliwość bezpośredniej oceny zdolności skurczowej miofibryli w ich natywnej konfiguracji, technika ta stanowi atrakcyjną platformę, na podstawie której można zrozumieć funkcję miofibrylarną bez potencjalnie zakłócających efektów, które występują, gdy transmisja sygnału nerwowo-mięśniowego i wywołane wzbudzeniem uwalnianie wapnia są uwzględnione w badanym systemie. Ponadto testy funkcjonalne pojedynczych włókien mogą być stosowane w celu uzupełnienia wyników identyfikacji białek kurczliwych, takich jak te uzyskane za pomocą immunohistochemii lub elektroforezy żelowej + western blot²².

Jedną z podstawowych funkcji mięśni szkieletowych jest wytwarzanie siły. W związku z tym sF_o, miara wewnętrznej zdolności układu skurczowego do generowania siły, jest bardzo interesująca dla fizjologów mięśni. Wiarygodne szacunki sF_o wymagają dokładnych pomiarów zarówno włókna CSA, jak i F_o. Ponieważ włókna na ogół nie są ani okrągłe w przekroju, ani jednolite w CSA na całej swojej długości, należy zachować dużą ostrożność przy szacowaniu CSA. W tym celu pomiary wykonuje się w kilku miejscach na całej długości światłowodu i w każdym miejscu z dwóch perspektyw oddalonych od siebie o 90°. Wiarygodne pomiary F_o wymagają zwrócenia uwagi na kilka szczegółów, w tym uwzględnienie siły biernej, dostosowanie długości sarkomeru w celu maksymalizacji nakładania się grubych i cienkich włókien, zastosowanie roztworu aktywującego o stężeniu wapnia, które powoduje maksymalną aktywację, utrzymanie pożądanej temperatury eksperymentalnej i utrzymanie optymalnych warunków przechowywania (temperatura i czas trwania) włókien przed dniem eksperymentu.

Chociaż przedstawione tutaj kroki opisują procedurę oceny maksymalnej siły izometrycznej, często pożądana jest ocena innych ważnych cech funkcjonalnych włókien mięśni szkieletowych. Można to osiągnąć poprzez rozszerzenie protokołu eksperymentalnego o dodatkowe mechaniczne manipulacje włóknem. Na przykład pomiar prędkości, z jaką światłowód zwarla się pod wpływem szeregu różnych obciążeń, pozwala na wyznaczenie zależności siła-prędkość, z której można obliczyć zależności siła-moc i prędkość-moc^10,23,24. Dodatkowo, prędkość nieobciążonego skracania można określić za pomocą "testu luzu"²⁵, który polega na zastosowaniu serii etapów skracania powodujących luz i pomiarze czasu wymaganego przez włókno do usunięcia luzu. Innym parametrem kinetycznym, który jest często zgłaszany, jest k_tr, stała szybkości przebudowy siły po zaburzeniu mechanicznym, które tymczasowo odłącza wszystkie mosty poprzeczne²⁶. Wreszcie, związek między stężeniem wapnia a wytwarzaniem siły czynnej ("zależność siła-pCa") jest często interesujący¹⁸ i można go określić, wystawiając włókno na działanie szeregu roztworów o stężeniach wapnia w zakresie od poniżej progu aktywacji układu skurczowego do tych wystarczających do wywołania maksymalnej aktywacji, a tym samym maksymalnej siły (F_o).

Chociaż wiele z wymienionych urządzeń jest potrzebnych do oceny kurczliwości pojedynczych włókien, inne urządzenia nie są absolutnie konieczne. Regulator długości, na przykład, jest niezbędny dla każdego protokołu eksperymentalnego, który wymaga szybkiego lub precyzyjnego wydłużenia lub skrócenia włókna, ale nie jest absolutnie konieczny do oceny maksymalnej siły izometrycznej (chociaż zerowy poziom siły w rejestrze siły musi być nadal zidentyfikowany w jakiś sposób). Pryzmaty, które umożliwiają obserwację światłowodu z boku, choć przydatne do oceny pola przekroju poprzecznego, nie są absolutnie konieczne przy ustawianiu światłowodu w komorze doświadczalnej. Ponadto można zastosować alternatywne sposoby wystawiania włókna na działanie różnych roztworów eksperymentalnych, w tym opracowanie ręcznie obsługiwanego systemu komór lub pojedynczej komory, która pozwala na szybkie napełnianie i opróżnianie roztworów. Wreszcie, podczas gdy subfizjologiczne temperatury doświadczalne, takie jak 15 °C, są powszechnie stosowane w celu poprawy odtwarzalności pomiarów mechanicznych^{1,2,3,5,8,12,17,27}, możliwe jest wygenerowanie ważnych danych w innych temperaturach^23,28, o ile uwzględni się wpływ temperatury na właściwości roztworu (stężenie wapnia, pH itp.).

Skład roztworów testowych jest jednym z najbardziej krytycznych aspektów opisanych tutaj technik włókien przepuszczalnych. Zagadnienia dotyczące kompozycji rozwiązania są złożone i wykraczają poza zakres tego artykułu. Rozwiązania opisane w kroku 5 sekcji protokołu zostały zaprojektowane z naciskiem na szybką aktywację światłowodu przepuszczalnego po jego przejściu z roztworów wstępnych do aktywujących przy zachowaniu stałej siły jonowej, składu kationowego i osmolarności^6,29. Inne podejścia do kompozycji roztworów zostały zastosowane ze znaczącym powodzeniem przez inne grupy badawcze i zazwyczaj wykorzystują opublikowane stałe wiązania i narzędzia obliczeniowe^27,30,31. Stężenia jonów wapnia w różnych roztworach aktywujących są szczególnie ważne w badaniach obejmujących submaksymalną aktywację, takich jak ocena siły pCa. W przypadku eksperymentów, w których włókna są w pełni aktywowane, takich jak te opisane tutaj, stężenie wapnia w roztworze aktywującym zazwyczaj przekracza komfortowy margines wymagany do osiągnięcia maksymalnej siły, co sprawia, że jego dokładna wiedza jest mniej krytyczna. Dodanie fosforanu kreatyny jest ważne dla buforowania wewnątrzmiofibrylarnych wahań ATP i ADP, które w przeciwnym razie byłyby związane z aktywnością skurczową. Kinaza kreatynowa jest niezbędna do katalizowania transferu fosforanów z fosforanu kreatyny do ADP. W warunkach eksperymentalnych, które skutkują wysokimi wskaźnikami obrotu ATP, w tym pracy w wysokich temperaturach lub mierzeniu szybkiego skracania włókien szybkich³², kinaza kreatynowa musi zostać dodana do roztworu w celu uzupełnienia endogennej kinazy kreatynowej, która pozostaje związana z błonnikiem. W przypadku mniej wymagających warunków eksperymentalnych system regeneracji ATP jest mniej krytyczny²⁷.

Ograniczenia techniki przepuszczalnego pojedynczego włókna są następujące. Dane wygenerowane przez te testy określają właściwości kurczliwe specyficznej jednostki miofibrylarnej, która została przyłączona do aparatury doświadczalnej. W związku z tym wychwytuje to tylko niewielką część całego włókna wielojądrowego, z którego uzyskano segment, który z kolei stanowi niewielki ułamek całkowitej liczby włókien w mięśniu. Badacze powinni zatem dokładnie rozważyć pobieranie próbek wymaganych do poparcia wszelkich wniosków wyciągniętych z eksperymentów. Dodatkowo, ocena wpływu interwencji treningu fizycznego na funkcję włókien zakłada, że oceniane włókna były rzeczywiście rekrutowane podczas treningu. Chociaż protokół próbuje naśladować naturalne środowisko wewnątrzkomórkowe włókna, proces przenikania sarcolemmy jest niespecyficzny i koniecznie pozwala rozpuszczalnym składnikom wewnątrzkomórkowym swobodnie dyfundować do roztworów kąpielowych. Kolejną konsekwencją przepuszczalności błony jest zmiana równowagi osmotycznej objawiająca się pęcznieniem objętości włókien³³. Pęcznienie włókien zwiększa odległość między włóknami aktyny i miozyny, co skutkuje zmniejszoną wrażliwością układu miofilamentów na wapń^34,35, ale może być odwrócone przez wprowadzenie dużych, osmotycznie aktywnych związków³⁴. Ostatnim ograniczeniem, które należy wziąć pod uwagę, jest konsekwencja techniki stosowanej do mocowania włókien do aparatury doświadczalnej. Wymaga to niezmiennie zniekształcenia relacji przestrzennych w systemie żarników w punktach mocowania i w ich pobliżu, z towarzyszącymi deficytami funkcjonalnymi. W szczególności obszary włókna w punktach mocowania i przylegające do nich są funkcjonalnie naruszone, a tym samym przyczyniają się do sztucznej elastyczności szeregowej systemu pomiarowego.

Podsumowując, opisaliśmy sposób, za pomocą którego można ocenić zdolność do generowania siły przez chemicznie przepuszczalne włókna mięśni szkieletowych in vitro. Chociaż w tym artykule skupiono się na ocenie maksymalnej zdolności generowania siły izometrycznej przez włókna ludzkich mięśni szkieletowych, podejście eksperymentalne może być modyfikowane i rozszerzane w celu określenia różnych parametrów kinetycznych i relacji między różnymi gatunkami, ssakami lub innymi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka do hodowli polistyrenu z nakrętką	Fisher Scientific	14-956-3D
Mikrowirówka z nakrętką 0,5 ml	Fisher Scientific	02-681-334
Nasadki do mikrowirówek 0,5 ml z o-ringiem	Fisher Scientific	02-681-358
Kriobox do mikrowirówek	Fisher Scientific	5055-5005
pH-metr	Mettler-Toledo	FE20
szalka Petriego	Fisher Scientific	08-757-11YZ
Niesterylny szew 10-0 monofilament	Ashaway Line Sznurek	S30002
Szpilki do owadów	Fine Science Tools	26002-10
Kleszcze - Dumont #5	Fine Science Tools	11251-20
Nożyczki do mikropreparacji	Fine Science Tools	15000-08
Mikroskop stereoskopowy	Leica Microsystems	Napędy
	Hannifin	3936M
Termometr	Physitemp	BAT-12
Cyrkulator kąpieli wodnej	Neslab Instruments	RTE-111
Regulator temperatury	Aplha Omega Instruments	Seria 800
Oprogramowanie LabVIEW	National Instruments-Computer
	System zróżnicowanych
komór	Aurora	Scientific 802D
Regulator długości	Aurora Scientific	312C
Przetwornik siły	Aurora Scientific	403A
Odczynniki
K-proprionate	TCI America	P0510
Imadizole	Sigma-Aldrich	I0125
MgCl2• 6H20	Sigma-Aldrich	M2670
Brij 58	Sigma-Aldrich	P5884
EGTA (kwas)	Sigma-Aldrich	E0396
Na2H2ATP• 0.56H2O	Sigma-Aldrich	A7699
Glicerol	Sigma-Aldrich	G6279
HEPES (kwas)	Sigma-Aldrich	H7523
MgO	Sigma-Aldrich	529699
HDTA (kwas)	TCI America	D2019
CaCO3	Sigma-Aldrich	C4830
NaN3	Sigma-Aldrich	S8032
KOH (1 N)	Sigma-Aldrich	35113
HCL (1 N)	Sigma-Aldrich	318949
Na2CrP• 4H2O	Sigma-Aldrich	P7936
Norma pH 10	Fisher Scientific	SB115
Norma pH 7	Fisher Scientific	SB107