Przeciąganie łap: nowatorska, czuła analiza testu cylindra myszy

Podsumowanie

Klasyczna analiza asymetrii kończyn przednich w teście cylindrycznym jest rutynowo używana do oceny deficytów behawioralnych u szczurów po urazie mózgu lub udarze; jednak nie wykrywa stałych deficytów u myszy. Badanie to pokazuje, że ilościowe określenie zachowania polegającego na ciągnięciu łapami jest bardziej czułą analizą uszkodzenia mózgu u myszy.

Streszczenie

Test cylindryczny jest rutynowo stosowany do przewidywania ogniskowego uszkodzenia niedokrwiennego kory ruchowej kończyn przednich u gryzoni. Po umieszczeniu w cylindrze gryzonie eksplorują, podnosząc i dotykając ścianek cylindra łapami kończyn przednich w celu podparcia postawy. Po niedokrwiennym uszkodzeniu kory czuciowo-ruchowej kończyny przedniej szczury w większym stopniu polegają na nieuszkodzonej łapie kończyny przedniej w celu wsparcia postawy, co skutkuje mniejszą liczbą dotknięć dotkniętą łapą, co nazywa się asymetrią kończyn przednich. W przeciwieństwie do tego, ogniskowe uszkodzenie niedokrwienne w mózgu myszy nie powoduje porównywalnych stałych deficytów asymetrii kończyn przednich. Podczas gdy deficyty asymetrii kończyn przednich są rzadko obserwowane, myszy wykazują nowe zachowanie po udarze zwane "przeciąganiem łap". Przeciąganie łapą to tendencja myszy do przeciągania dotkniętej chorobą łapy wzdłuż ściany cylindra, zamiast bezpośrednio odpychać się od ściany podczas zsiadania z tylnego siedzenia do pozycji czworonożnej. Wcześniej wykazaliśmy, że ciągnięcie łapami jest bardzo wrażliwe na małe korowe urazy niedokrwienne kory ruchowej kończyn przednich. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół analizy przeciągania łapy. Definiujemy, czym jest przeciąganie łapą i pokazujemy, jak określić ilościowo zachowanie związane z przeciąganiem łapą. Test butelkowy jest prostym i niedrogim testem do przeprowadzenia i nie wymaga wstępnego treningu ani strategii deprywacji żywności. Wykorzystując analizę przeciągania łapy z testem cylindrycznym, wypełnia niszę w przewidywaniu uszkodzeń niedokrwiennych kory mózgowej, takich jak zakrzepica i niedokrwienie wywołane endoteliną-1 (ET-1) – dwa modele, które zyskują na popularności i powodują mniejsze urazy ogniskowe niż niedrożność tętnicy środkowej mózgu. Wreszcie, pomiar zachowania polegającego na ciągnięciu łapami w teście cylindrycznym pozwoli na badania funkcjonalnej regeneracji po urazie kory mózgowej przy użyciu szerokiej kohorty transgenicznych szczepów myszy, w przypadku których wcześniejsza analiza asymetrii kończyn przednich nie wykryła stałych deficytów.

Wprowadzenie

Celem strategii regeneracji neuronów jest zademonstrowanie zarówno naprawy tkanek, jak i funkcjonalnego odzyskiwania. Powrót do zdrowia funkcjonalnego jest zazwyczaj oceniany za pomocą testów behawioralnych, które mierzą deficyty funkcjonalne, w tym przypadku dotyczące umiejętności motorycznych, które są związane z uszkodzeniem określonych obszarów mózgu. Urazowe uszkodzenie mózgu lub niedokrwienne uszkodzenie czuciowo-ruchowego obszaru kończyny przedniej kory mózgowej można wykazać za pomocą szeregu testów behawioralnych. Jeden z takich testów, test cylindryczny, jest szeroko stosowany u szczurów do oceny deficytów funkcjonalnych w aktywności kończyn przednich¹. Test charakteryzuje się niskimi kosztami konfiguracji, wymagającym jedynie cylindra, kamery i stołu z przezroczystym blatem. Jest łatwy do podania, ponieważ opiera się na naturalnym zachowaniu eksploracyjnym gryzoni, więc nie jest wymagane wstępne szkolenie i pozbawianie jedzenia lub nagrody. Pomimo tych licznych zalet, test cylindryczny jest niedostatecznie wykorzystywany do oceny deficytów kończyn przednich u myszy po ogniskowych urazach kory czuciowo-ruchowej kończyn przednich, co przypisujemy analizie zachowania myszy w teście cylindrycznym. Asymetria kończyn przednich jest klasyczną miarą analizy w teście cylindrycznym. Po umieszczeniu w cylindrze gryzonie w naturalny sposób eksplorują ściany cylindra, opierając się na tylnych kończynach i dotykając ścianek cylindra łapami kończyn przednich, aby zachować równowagę postawy. Liczba dotknięć łapą ściany każdą kończyną przednią jest łatwa do oszacowania, filmując gryzonie podczas tej eksploracji cylindra. Asymetria kończyn przednich występuje, gdy dotknięta chorobą łapa kończyny przedniej ma mniej dotknięć ścianą niż niedotknięta łapa kończyny przedniej i wskazuje na uszkodzenie przeciwległej kory czuciowo-ruchowej. U szczurów wstrzyknięcia dokorowe środka zwężającego naczynia krwionośne, endoteliny (ET-1), do kory czuciowo-ruchowej kończyny przedniej powoduje ogniskową zmianę niedokrwienną, która powoduje deficyty behawioralne w przeciwległej kończynie przedniej. Deficyty w używaniu kończyn przednich po przeciwnej stronie są łatwo wykrywane jako zmiany w asymetrii kończyn przednich w teście cylindrycznym u szczurów^1-3. Jednak w przeciwieństwie do szczurów, zmiany w asymetrii kończyn przednich są zmienne i mniej spójne u myszy po porównywalnych wstrzyknięciach ET-1^4-6. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską analizę zachowania kończyn przednich w teście cylindrycznym – analizę zachowania polegającego na przeciąganiu łap. Wcześniej wykazaliśmy, że analiza ciągnięcia łapami jest bardziej czułą miarą uszkodzenia kory czuciowo-ruchowej kończyn przednich u myszy niż klasyczna analiza asymetrii kończyn przednich i dlatego ma zastosowanie do różnych modeli ogniskowych uszkodzeń kory mózgowej.

Badanie, w jaki sposób przednia łapa styka się ze ścianą cylindra po niedokrwiennym uszkodzeniu kory czuciowo-ruchowej kończyny przedniej, ujawniło nowe zachowanie u myszy - przeciąganie łap⁴. Przeciąganie łapą występuje, gdy mysz staje na tylnych nogach, aby zbadać ścianę cylindra, a następnie przeciąga dotkniętą (przeciwstawną) łapę wzdłuż ściany cylindra w kierunku linii środkowej lub w dół ściany, podczas gdy jej nienaruszona przednia łapa zapewnia podparcie postawy przy ścianie. Przeciąganie łapą rzadko występuje u nieuszkodzonych myszy, dlatego pojawienie się przeciągania łapą jest pozytywnym wskaźnikiem uszkodzenia kory czuciowo-ruchowej kończyn przednich⁴. Wcześniej określiliśmy ilościowo zachowanie ciągnięcia łapami u myszy po niedokrwiennym uszkodzeniu kory czuciowo-ruchowej kończyn przednich kończyn przednich i wykazaliśmy utrzymujące się zachowanie ciągnięcia łapami u myszy do dwóch tygodni po udarze⁴. Tutaj pokazujemy, że ciągnięcie łapami utrzymuje się do czterech tygodni po udarze. Analiza zachowań związanych z przeciąganiem łap stanowi nowatorskie i czułe narzędzie do oceny ogniskowego uszkodzenia niedokrwiennego kory czuciowo-ruchowej kończyn przednich u myszy. Niedroga konfiguracja, łatwość podawania i ocenianie sprawiają, że jest to proste, ale użyteczne narzędzie do szybkiej oceny deficytów behawioralnych kończyn przednich u myszy.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Memorial of Newfoundland zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Myszy

1. Użyj dorosłych myszy. W tym badaniu wykorzystano dorosłe samce myszy FVBN (n=10) w wieku 2-4 miesięcy. Myszy domowe w odwróconym cyklu światła i ciemności o godzinie 12:12 i zapewniają standardową karmę dla gryzoni i wodę ad libitum.

2. Materiały wymagane do testu cylindra

1. Zaopatrz się w stół z przezroczystym blatem, aby sfilmować test cylindra. Wymiary stołu nie mają znaczenia, blat musi być z pleksi lub szkła, a pod stołem musi być wystarczająco dużo miejsca, aby umieścić lustro. Pozwala to na filmowanie myszy od dołu. Użyj lustra pod stołem, aby odbić obraz przez cylinder. Alternatywnie użyj odwróconej kamery, jeśli jest dostępna. Wymiary stołu użytego w tym protokole to 54 x 56 x 66,5 cm (szer. x dł. x wys.) z blatem o wymiarach 51 x 51 cm (szer. x dł.).
2. Zdobądź lustro. Wymiary lustra użytego w tym protokole to 34 x 58cm (szer. x dł.).
3. Zaopatrz się w przezroczysty/pleksiszklany cylinder, w którym mysz będzie mogła działać. Wymiary cylindra użytego w tym protokole to 17,5 cm wysokości, 8,8 cm średnicy wewnętrznej, 9,5 cm średnicy zewnętrznej przy grubości ścianki 0,35 cm. W przypadku bardziej aktywnych odmian myszy może być wymagany wyższy cylinder.
4. Umieść cylinder na blacie stołu i sfilmuj odbicie w lustrze poniżej.
5. Wymagana jest kamera wideo i statyw. Nagrywaj filmy z prędkością około 650 Kb/s, czyli około 190 Mb na 5 minut filmu cylindrycznego. Upewnij się, że kamera ma funkcję zoomu, aby upewnić się, że cylinder obejmuje całe pole view.
   UWAGA: Kamera wideo używana w tym protokole to Sony DCR-SR42, 40-krotny zoom optyczny, 2,000-krotny zoom cyfrowy, 680 kpix, która wykorzystuje wideo z przeplotem NTSC o standardowej rozdzielczości.)
6. Zaopatrz się w oprogramowanie do analizy – odtwarzacz multimedialny z obsługą wideo i modulacją prędkości odtwarzania. Odtwarzacz multimedialny używany w tym protokole to VLC Media Player v2.1.2.
7. Zaopatrz się w komputer z systemem operacyjnym zdolnym do uruchomienia odtwarzacza multimedialnego i monitora.
8. Wymagane jest elektroniczne przechowywanie filmów. Pobieraj filmy na zewnętrzny dysk twardy lub kopiuj je na płyty DVD w celu długoterminowego przechowywania.
   UWAGA: Przy 190 MB na film 84 sesje zmieszczą się na karcie SD o pojemności 16 GB, a 168 sesji zmieści się na karcie SD o pojemności 32 GB. Ze względu na stosunkowo niską cenę nośników SD i niepewność co do tego, ile czasu niektóre myszy potrzebują na ukończenie 20 tylnych części, zalecana jest karta o pojemności 32 GB. W obecnym badaniu filmy zostały skopiowane z kamery na zewnętrzny dysk twardy o pojemności 2 TB, a następnie ponownie skopiowane na płyty DVD jako kopia zapasowa.

3. Eksperymentalna konfiguracja testu cylindra

1. Przymocuj lustro pod stołem pod kątem 45 stopni do blatu. Zrób to za pomocą dwóch wsporników przymocowanych do nóg stołu, aby podeprzeć odpowiednio górną i dolną część lustra. Położenie nawiasów jest zaznaczone w widoku stołu z boku (Rysunek 1A) i widoku stołu z przodu (Rysunek 1B).
2. Umieść cylinder na środku stołu. Narysuj cztery równoodległe linie w miejscu, w którym cylinder znajduje się na stole, za pomocą czarnego znacznika (Sharpie), aby cylinder można było podnieść i przywrócić do tej samej pozycji (Rysunek 2). Narysowanie ich na spodniej stronie przezroczystego blatu pozwala na czyszczenie blatu między testami na zwierzętach bez rozpuszczania tuszu markera.
3. Zamocuj aparat i statyw. Skieruj aparat na lustro tak, aby obraz patrzył bezpośrednio przez lufę cylindra. Upewnij się, że cała wewnętrzna ścianka cylindra jest widoczna i nie jest zasłonięta przez podstawę (Rysunek 3). Zobacz widok z boku na konfigurację, w tym względny kąt ustawienia kamery i lusterka, z góry (Rysunek 4A) i z poziomu stołu, w tym z podnoszeniem myszy (Rysunek 4B).
4. Przygotuj karty z wskazówkami, aby zidentyfikować każdą mysz przed filmowaniem. Upewnij się, że karty zazwyczaj zawierają numer identyfikacyjny każdej myszy, punkt czasowy testu (np. 3 dni po zabiegu) oraz datę sesji filmowania. Nie dołączaj grupy leczonej do karty sygnału, aby upewnić się, że eksperymentator jest zaślepiony.
5. Film w standardowych warunkach oświetlenia wewnętrznego, ponieważ ten poziom światła jest wymagany, aby wyraźnie widzieć ruchy myszy wokół cylindra.
   UWAGA: Jeśli to możliwe, filmowanie w ciemności za pomocą kamery z czerwonym światłem może wystarczyć, jednak najpierw należy sprawdzić, czy dotknięcia i przeciągnięcia łapą są wyraźnie widoczne do oceny ilościowej.

4. Wykonanie

1. Rozpocznij filmowanie. Wyświetl odpowiednią kartę sygnatury myszy przed obiektywem aparatu.
2. Opuść mysz do cylindra z otwartej góry natychmiast po sfilmowaniu karty cue.
3. Rozpocznij filmowanie myszy. W tym czasie zminimalizuj hałas, ponieważ myszy mogą stracić zainteresowanie eksploracją, jeśli zostaną zaskoczone.
4. Obserwuj myszy z tyłu, aby zbadać cylinder. Nagrywaj wideo, aż mysz wykona co najmniej dwadzieścia tylnych ruchów.
   UWAGA: Tył występuje, gdy obie przednie łapy tracą kontakt z podłogą, a mysz staje na tylnych łapach.
5. Przetrzyj blat i cylinder odpowiednim roztworem czyszczącym między każdą myszą, aby zdezynfekować i usunąć zapachy myszy.
6. Zamrożenie ma miejsce, gdy myszy przestają eksplorować i pozostają cicho siedzące na czworakach przez około 5 minut. Jeśli myszy zamarzną przed pojawieniem się dwudziestu odosobnień, może być konieczne wyjęcie ich z cylindra na 10-20 minut przed wznowieniem testu. Jeśli myszy nie wykonają dwudziestu rearów, są usuwane z badania.
   UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że myszy nigdy nie musiały być wykluczane z powodu niezbadania cylindra.

5. Ocena testu cylindra za pomocą analizy przeciągania łapą

1. Odtwarzaj wideo z szybkością od 0,25x do 0,67x normalną, w zależności od tego, jak szybko mysz bada cylinder. Użyj odtwarzacza multimedialnego, który oferuje wolniejsze prędkości odtwarzania.
2. Określ ilościowo całkowitą liczbę dotknięć łapą. Dotknięcie łapą występuje, gdy mysz cofa się (Rysunek 5A), dotyka boku cylindra (Rysunek 5B), a następnie zsiada z niego obiema łapami jednocześnie (Rysunek 5C) i ląduje (Rysunek 5D). Łapa może, ale nie musi, stykać się ze ścianką cylindra pełną dłonią, ale musi wystąpić pewien kontakt ze ścianką cylindra. Oceń dotyk łapy, licząc, ile razy mysz dotyka (bez względu na to, jak krótko) ze ścianą cylindra jedną lub obiema przednimi łapami, stojąc na tylnych kończynach.
   Należy pamiętać, że kontakt ze ścianką cylindra jest liczony jako "dotyk łapy" lub "przeciąganie łapą" tylko wtedy, gdy mysz znajduje się w pozycji tylnej – stoi na tylnych kończynach z obiema przednimi łapami poza blatem. Jeśli mysz pozostaje w postawie 3-punktowej – obie tylne kończyny i jedna przednia łapa na blacie stołu i przechodzi do dotykania ściany wolną łapą – nie jest to liczone jako dotyk łapy. Myszy mogą stanąć dęba i dotknąć ścianki cylindra jedną przednią łapą, co jest liczone jako dotyk łapy. Uwaga: mysz może również poruszać ciałem wokół cylindra podczas cofania, nawiązując więcej niż dwa kontakty. Kontakty te są zliczane – jeden dla każdego dotknięcia lewej przedniej łapy i jeden dla każdego dotknięcia prawej przedniej łapy.
3. Określ ilościowo liczbę przeciągnięć łapą. Ciągnięcie łapą różni się od normalnego dotykania łapą.
   1. Jeśli łapa zetknie się ze ścianką cylindra z całkowicie otwartą dłonią (ryc. 6B), powoli odejdzie od ściany, często z lekkim drżeniem. Ruch rozpoczyna się od tego, że palce ciągną się po ściance cylindra w kierunku przyśrodkowym lub w dół (Rysunek 6C), zanim całkowicie opadną (Rysunek 6D). Mysz następnie zsiada z wierzchowca z nienaruszoną łapą (Rysunek 6E), zanim wyląduje na czworakach (Rysunek 6F). Jest to uważane za przeciąganie łapą i powinno być liczone w zestawieniu.
   2. Jeśli łapa nie styka się ze ścianką cylindra z całkowicie otwartą dłonią, ociera się o ściankę cylindra palcami, zanim spadnie ze ścianki cylindra. Podobnie mysz może przeciągnąć łapą po ściance cylindra, ale nie zwolnić jej całkowicie przed zejściem z wierzchowca. Są one zarówno uważane za przeciąganie łapą, jak i dotknięcia i powinny być liczone jako oba w zestawieniu.
   3. Łapa może również ciągnąć się wzdłuż ścianki cylindra, podczas gdy mysz bada cylinder. W takim przypadku łapa będzie podążać za skrętem tułowia myszy, gdy bada ona lewo lub prawo od swojej pierwotnej pozycji (Rysunek 7A-D) przed zejściem z wierzchowca (Rysunek 7E). Nie jest to uważane za przeciąganie łapą, ponieważ zależy to od losowego wyboru kierunku eksploracji przez mysz i nie zależy od tego, która półkula korowa została uszkodzona.
4. Przeciąganie łapą jest wyrażone jako procent przeciągnięć łapą na całkowitą liczbę dotknięć łapą podczas sesji. Wyraź liczbę pociągnięć łapą jako procent całkowitej liczby kontaktów łapą dla każdej kończyny przedniej z osobna.
5. Dotknięcia skutkujące przeciągnięciem łapą liczą się jednocześnie jako przeciągnięcie łapą i dotknięcie. Tak więc, jeśli mysz przeciąga łapą za każdym razem, gdy jej łapa styka się ze ścianką cylindra, procent przeciągania łapy jest wyrażony jako 100%.

6. Dodatkowe propozycje projektów eksperymentalnych

1. Aby zminimalizować zmienne dodatkowe:
   1. Przetestuj myszy o tej samej porze w każdym dniu testowym. Przetestuj myszy podczas ich cyklu budzenia. Utrzymywanie myszy w 12-godzinnym cyklu światła wstecznego ułatwia wydajność.
   2. Myszy mogą niechętnie eksplorować cylinder, jeśli są zestresowane hałasem lub nowym środowiskiem. Testowanie myszy w pomieszczeniu, w którym trzymają zwierzęta lub w pomieszczeniu, z którym zostały zaznajomione, zmniejsza stres. Może się to zdarzyć, jeśli w pomieszczeniu jest głośno, jeśli mysz została popchnięta przed wejściem do cylindra lub z powodu przyzwyczajenia.
      UWAGA: Badanie należy przeprowadzić raz przed manipulacją eksperymentalną, aby służyło jako odczyt bazowy. Po manipulacji, dni testowania zależą od uznania eksperymentatora, chociaż zaleca się unikanie nadmiernej liczby ekspozycji na cylinder w krótkim okresie czasu.
   3. Myszy mogą stać się niechętne do wychowywania się po 6-7 ekspozycjach na cylinder. W obecnym badaniu myszy były testowane w cylindrze łącznie siedem razy, przed niedokrwieniem oraz w dniach 1, 3, 7, 14, 21 i 28 po operacji><. UWAGA: W tym badaniu użyliśmy szczepu myszy FVBN. Wcześniej testowaliśmy myszy C57Bl/6 w cylindrze i zaobserwowaliśmy zachowanie ciągnięcia łap po urazie niedokrwiennym ET-1 (dane nie pokazane). Myszy C57BL/6 były bardziej aktywne niż myszy FVBN podczas odchowu i często wskakiwały na krawędź cylindra przed wyjściem na zewnątrz. Wyższe cylindry powinny być używane, jeśli myszy próbują uciec, skacząc.

7. Chirurgia endoteliny-1 i pomiary objętości zawału

1. Wykonaj operację Endothelin-1 i pomiary objętości zawału zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami⁴ . Aby celować w korę ruchową kończyn przednich kończyn przednich, każda mysz powinna otrzymać trzy wstrzyknięcia ET-1 w następujących współrzędnych: (i) +0,7 przednia tylna (AP)/1,5 przyśrodkowo-boczna (ml)/-1,2 grzbietowo-brzuszna (DV), (ii) +0,4 AP/1,25 ml/- 1,2 DV i (iii) +0,1 AP/1,75 ml/-1,2 DV⁴ .

8. Analiza statystyczna

1. Dwukierunkowa analiza wariancji powtarzanych miar (ANOVA) jest zalecana w celu przeanalizowania procentu przeciągania łap dla dotkniętych i niedotkniętych łap w różnych punktach czasowych.

Wyniki

Wcześniej wykazaliśmy, że zachowanie polegające na przeciąganiu łapy pojawia się po ogniskowym uszkodzeniu niedokrwiennym kory sensorimotorycznej kończyny przedniej i jest pozytywnym wskaźnikiem uszkodzenia⁴. W celu wywołania zmiany niedokrwiennej zastosowano wewnątrzkorowe iniekcje ET-1 do kory sensorimotorycznej kończyny przedniej (Rycina 8A,B). W niniejszym badaniu sprawdzono, czy zachowanie polegające na przeciąganiu łapy utrzymuje się dłużej niż 14 dni po urazie, co mogłoby umożliwić jego...

Dyskusja

Kluczowe punkty, które należy ustalić przy ilościowym określaniu zachowania polegającego na przeciąganiu łapami w teście cylindrycznym, są następujące: i) ilościowe określenie liczby pociągnięć łapą w stosunku do całkowitej liczby dotknięć łapą dla każdej łapy przed uszkodzeniem mózgu w celu ustalenia punktu odniesienia; ii) określić ilościowo liczbę pociągnięć łapą w stosunku do całkowitej liczby dotknięć łapą dla każdej łapy po urazie niedokrwiennym; oraz iii) rozróżniać między przeciąganiem łapy a bocznym ruchem łapy ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
		pleksi	17,5 cm wysokości, 9,5 cm średnicy zewnętrznej, 8,8 cm średnicy wewnętrznej, grubość ścianki 0,35 cm (lub 3,5 mm)
stół			54x56x66,5 cm (szerokość x długość x wysokość), blat stołu to arkusz pleksi o wymiarach 51x51 cm.
lustro			34x58 cm lustrzana
kamera wideo	Sony	DCR-SR42	Kamera wideo z wbudowaną pamięcią, funkcją SD, 40-krotnym zoomem optycznym
komputer		Dell Optiplex 760	Procesor: Intel, 3,0 GHz, pamięć 4,00 GB (RAM)
monitor komputerowy	Samsung	S22C350H
Excel (Microsoft Office Professional Plus)	Microsoft	v14.0.7106.5003
VLC Media Player	Video LAN	v2.1.2	Odtwarzacz multimedialny z modulacją prędkości odtwarzania i obsługą wideo
Zewnętrzny dysk twardy	Western Digital	WDBAAU0020HBK-01	2 TB

Cylinder z widokowy