Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i przeszczep różnych wiekowych mysich przeszczepów grasicy.

14.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52709

⸱

13 maja 2015

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten raport zawiera szczegółowy opis przeszczepiania mysiej thymi od myszy dawców w różnym wieku pod torebkę nerkową mysich biorców z niedoborem odporności. Celem tego podejścia jest modelowanie rozwoju limfocytów T i zdarzeń selekcji grasicy in vivo.

Streszczenie

Mechanizmy regulujące skuteczność selekcji grasiczy pozostają niejasno określone. Przedstawiona metoda pozwala na przeprowadzenie analiz in vivo rozwoju i selekcji limfocytów T specyficznych dla antygenów własnych i obcych. Podejście to polega na wszczepieniu przeszczepów grasicy pochodzących od różnych myszy w różnym wieku biorcom scid z niedoborem odporności. W stosunkowo krótkim czasie biorcy są w pełni odtwarzani za pomocą limfocytów T pochodzących z wszczepionego przeszczepu grasicy. Tylko tymocyty wysiewające grasicę w czasie izolacji podlegają selekcji i przekształcają się w dojrzałe limfocyty T. W związku z tym można ocenić zmiany w charakterze i swoistości przeszczepionych limfocytów T w funkcji zależnych od wieku zdarzeń grasicy. Chociaż do udanego przeszczepu grasicy wymagana jest wiedza techniczna, metoda ta zapewnia unikalną strategię badania in vivo szerokiego zakresu patologii, które są spowodowane lub wynikiem nieprawidłowej funkcji grasicy i/lub homeostazy.

Wprowadzenie

Grasica jest organem, w którym zachodzą krytyczne zdarzenia w rozwoju limfocytów T1. Rezydujące tymocyty, po rearanżacji receptora limfocytów T (TCR) α i genów β, przechodzą szereg interakcji z komórkami limfoskopalnymi i prezentującymi antygen (APC) w obszarach korowych i rdzeniowych grasicy2. Selekcja grasiczo-dodatnia odbywa się za pośrednictwem komórek nabłonka grasicy korowej (TEC) w celu wytworzenia tymocytów, które rozpoznają peptydy antygenowe w kontekście cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej gospodarza (MHC) klasy I i II2-3. Późniejsza selekcja ujemna grasicy pociąga za sobą oczyszczanie z autoreaktywnych tymocytów, napędzane przez interakcję z rdzeniastym TEC lub komórkami dendrytycznymi (DC), które prezentują peptydy pochodzące z własnych białek związanych przez cząsteczki MHC klasy I i II3. Efektem końcowym tych procesów jest stworzenie puli dojrzałych limfocytów T CD4+ i CD8+, zdolnych do reagowania na szerokie spektrum obcych antygenów, wykazując przy tym minimalną reaktywność na własne białka4.

Na skuteczność zdarzeń selekcji grasicy wpływa wiele czynników, w tym dojrzewanie grasicy, częstotliwość TEC rdzeniastego i korowego, skład podzbioru DC grasicy oraz źródło prekursorów grasicy3. Warto zauważyć, że nieprawidłowa selekcja grasicy może powodować patologieautoimmunologiczne5 lub patologie z niedoborem odporności, które wynikają odpowiednio z upośledzonej selekcji negatywnej lub pozytywnej. Zdarzenia molekularne regulujące selekcję grasicy są jednak słabo poznane. Podejścia in vitro, takie jak reagregacja hodowli narządów grasicy (RTOC)6, okazały się przydatne do analizy podstawowych zdarzeń związanych z selekcją grasicy, ale nie są w stanie w pełni podsumować dynamiki trwających zdarzeń in vivo. W rezultacie, to podejście oparte na przeszczepie grasicy zostało opracowane, aby lepiej badać zdarzenia selekcji tymocytów in vivo7.

Ten protokół opisuje przeszczepianie thymi od nowonarodzonych i dorosłych myszy dawców do myszy biorców z niedoborem odporności. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów regulujących pozytywną i negatywną selekcję grasicy, a także produkcję grasicy różnych podzbiorów limfocytów T podczas ontogenezy. Ostatnio podejście to zostało wykorzystane do wykazania, że skuteczność selekcji grasicy jest ograniczona wcześnie po urodzeniu u myszy, co prowadzi do zwiększonego rozwoju autoreaktywnych limfocytów T i zmniejszonego repertuaru limfocytów T specyficznego dla obcych antygenów7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania na myszach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill, a cała opieka nad zwierzętami była zgodna z wytycznymi IACUC.

1. Przygotowanie noworodka i dorosłego Thymi

  1. Przygotuj wszystkie odczynniki i sprzęt przed eutanazją myszy dawców.
  2. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie lub innymi odpowiednimi metodami. Wszystkie zabiegi chirurgiczne muszą być wykonywane pod kapturem z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylne warunki i uniknąć zanieczyszczenia. Zbierz narzędzia potrzebne do ekstrakcji thymi od myszy dawców.
  3. Napełnij naczynie o średnicy 60 mm sterylnym 1x PBS (pH 7,4) i umieść na lodzie wewnątrz okapu. Będzie on używany do krótkiego przechowywania thymi wyciętej od myszy dawców przed przeszczepem.
  4. Zgodnie z wytycznymi etycznymi, nowonarodzone myszy dawcy należy poddać eutanazji przez dekapitację, a dorosłe myszy dawców przez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
  5. Do usunięcia grasicy: Połóż mysz w pozycji grzbietowej leżącej na sterylnym chłonnym ręczniku papierowym i spryskaj 70% etanolem przed wykonaniem nacięcia.
  6. Odsłoń jamę brzuszną i klatkę piersiową, wykonując nacięcie w linii środkowej skóry. Zawiń skórę na klatce piersiowej i kończynach przednich, aby odsłonić jamę piersiową.
  7. Wykonaj dwa boczne nacięcia przez przeponę i klatkę piersiową, aby odsłonić górne śródpiersie i przednią jamę piersiową. Grasica powinna być widoczna jako dwa białe płaty znajdujące się bezpośrednio nad sercem i przylegające do niego.
  8. Rozerwij tkankę łączną otaczającą grasicę cienkimi kleszkami, uważając, aby nie naruszyć kapsułki. Przytrzymując klatkę piersiową kleszczami, użyj drugiej pary kleszczy, aby wydobyć dwa płaty grasicy, umieszczając zakrzywione kleszcze pod narządem i ciągnąc pionowo. Można to zrobić za pomocą lunety preparacyjnej do ekstrakcji thymi od nowonarodzonych myszy.
  9. Umieścić grasicę w naczyniu o średnicy 60 mm zawierającym sterylny 1x PBS (pH 7,4) na lodzie i oddzielić płaty grasicy, przecinając przesmyk łączny. Usuń wszelkie zanieczyszczenia z płatów grasicy, upewniając się, że nie uszkodzisz kapsułki, i pokrój grasicę na odpowiednią liczbę odcinków do przeszczepu.
  10. Nie należy manipulować thymi uzyskaną od nowonarodzonych myszy.
    UWAGA: Używany dla maksymalnie dwóch myszy biorcy (1 płat na odbiorcę).
  11. Przeszczep thymi uzyskaną od dorosłych myszy maksymalnie 4-6 myszom biorcy. Za pomocą kleszczy ostrożnie chwyć jeden dorosły płat grasicy, jak pokazano na rycinie 1, pokrój grasicę na trzy równe części za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  12. Powtórz kroki 1.3-1.4 dla każdej myszy dawcy. W celu ograniczenia czasu ekspozycji tych grasic należy przygotować jednorazowo 1 grasicę dawcy.

2. Implantacja grasicy pod torebką nerkową

  1. Zmontuj wstępnie wysterylizowany sprzęt wymieniony w Tabeli 1. W trakcie zabiegu należy stosować odpowiednią technikę aseptyczną, aby zapobiec narażeniu biorców przeszczepów na kontakt ze skażonymi narzędziami lub odczynnikami.
  2. Przed przeszczepem należy zważyć i oznaczyć każdą mysz biorcę.
  3. Ustaw mikroskop preparacyjny i obwód znieczulenia w okapie z przepływem laminarnym.
  4. Za pomocą elektrycznej maszynki do golenia ogol lewą stronę myszy biorcy i upewnij się, że wokół obszaru użytego do wykonania nacięcia nie pozostały żadne włosy.
  5. Włącz waporyzator izofluorowy i znieczul mysz dawką 1-2%. Upewnij się, że należy znieczulić pacjenta przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego, sprawdzając, czy nie ma odruchu po uszczypnięciu palca
    6. .
  6. Po odpowiednim znieczuleniu myszy nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu i przygotuj mysz do przeszczepu w następujący sposób:
  7. Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym w prawej bocznej pozycji leżącej, tak aby ogolona strona była skierowana do góry. Zaczynając od środka pola operacyjnego, dozuj okrężnymi ruchami za pomocą jednorazowej pipety transferowej 70% etanolu, a następnie powidonu-jodu (betadyny). Powtórz zabieg etanolem/betadyną 3 razy przed wykonaniem nacięcia.
  8. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj 1-2 cm nacięcie boku bezpośrednio nad nerką.
  9. Za pomocą średnich kleszczy chwyć tkankę łączną przylegającą do nerki i delikatnie unieś nerkę tak, aby leżała na szczycie mięśni. Aby nerka była odsłonięta i znajdowała się na miejscu nad mięśniami, należy włożyć jedno ramię średnich kleszczy pod nerkę, zwracając szczególną uwagę, aby nie naruszyć kości biodrowej nerki.
  10. Aby zapobiec wysuszeniu tkanek, należy przepłukać nerkę sterylnym 1x PBS (pH 7,4) podczas każdego etapu, aż do zakończenia manipulacji nerką i torebką nerkową.
  11. Za pomocą cienkich kleszczy ściśnij i podnieś kapsułkę w pobliżu krawędzi nerki najbardziej dystalnej do nadnerczy, aby oddzielić ją od nerki.
  12. Użyj igły o rozmiarze 18, aby wykonać nacięcie wystarczająco duże, aby wprowadzić przygotowany kawałek grasicy dawcy (ryc. 2A). Upewnij się, że nacięcie torebki jest jak najmniejsze, aby zapobiec przemieszczeniu przeszczepu w czasie.
  13. Trzymając torebkę odciągniętą od nerki, użyj drugiej pary cienkich kleszczy, aby wprowadzić przeszczep pod kapsułkę i popchnąć grasicę jak najdalej do przodu od nacięcia torebki (ryc. 2B).
  14. Usuń kleszcze spod nerki i delikatnie przywróć nerkę z powrotem na miejsce przez nacięcie.
  15. Zamknij mięśnie, zszywając ścianę otrzewnej i nakładając betadynę po zamknięciu. Po zakończeniu szycia przyłóż klipsy do ran, aby zamknąć skórę właściwą i nałóż betadynę na okolicę.
  16. Umieść mysz z powrotem w klatce, która została ogrzana za pomocą lampy grzewczej.
  17. Monitoruj każdą mysz pooperacyjną, aż odzyska pełną przytomność i mobilność, i nie umieszczaj myszy, które nie wyzdrowiały po znieczuleniu, w klatce z innymi zwierzętami.
  18. W razie potrzeby należy leczyć myszy lekami przeciwbólowymi pooperacyjnymi. Podawaj myszom pooperacyjne leki przeciwbólowe, takie jak paracetamol, w wodzie do picia w stężeniu 1,6 mg/ml.
  19. Powtórz kroki 2.3-2.9 dla każdej myszy odbiorcy.
  20. Upewnij się, że myszy powrócą do normalnej aktywności w ciągu 1 godziny po operacji. Monitoruj pooperacyjną masę ciała, zdolności motoryczne, a także picie i karmienie każdej myszy, aby określić powikłania powstałe w wyniku zabiegu przeszczepu.
    UWAGA: Pooperacyjna utrata masy ciała w porównaniu z masą ciała sprzed operacji, a także zaburzenia ruchomości lub niejedzenie lub picie mogą wskazywać na powikłania.
  21. Monitoruj rekonstytucję limfocytów T we krwi obwodowej przez krwawienie myszy przez nacięcie ogona, a następnie oddzielenie limfocytów za pomocą pożywki do separacji komórek limfolitów zgodnie ze specyfikacjami producenta. Dokonaj charakterystyki limfocytów T poprzez barwienie limfocytów fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami specyficznymi dla markerów komórek T CD3, CD4 i CD8, a także żywym martwym dyskryminatorem, takim jak fluorescencyjnie aktywowany ester sukcynimidylu8. Analizę, jak pokazano na rysunku 3, można przeprowadzić poprzez bramkowanie na singletach, żywych komórkach i komórkach CD3-dodatnich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sukces tej procedury zależy od minimalnego urazu chirurgicznego oraz dokładnego umieszczenia przeszczepu pod torebką nerkową. Przeszczep grasicy należy pociąć, aby uzyskać fragmenty grasicy o odpowiedniej wielkości do późniejszej transplantacji, jak pokazano na Rysunku 1. Postępując zgodnie ze schematem na Rysunku 1, do udanej transplantacji podtorebkowej z powtarzalnymi wynikami przyjmowania komórek T można wykorzystać grasicę myszy noworodkowych lub dorosłych. Jak wspomniano, właściwe ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zdarzenia regulujące dobór grasicy są słabo poznane. Ostatnie badania wykazały ontogenne zmiany w efektywności selekcji. Połączenie tego podejścia z różnymi transgenicznymi myszami dawcami i biorcami grasicy jeszcze bardziej ułatwi badania mające na celu zidentyfikowanie zdarzeń i parametrów regulujących selekcję grasicy. W szczególności przeszczep grasicy jest stosowany w leczeniu i leczeniu limfocytów T i zaburzeń grasicy obserwowanych na przykład u niemowląt z atymią pozbawionych funkcjonalnych limfocytów T oraz u pac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze otrzymane od National Institutes of Health (1R01AI083269).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alkohol etylowy Decon Laboratories2705HC
PBSGIBCO14190-144pH 7,4
Roztwór betadyny ProduktyPurdue67618-150-17
BDrozmiarze 18 Szwy305195
(1,0 metryczne)EthiconJ493G18" (45cm)
Klipsy do ran AUTOCLIP (9mm)Clay Adams® Marka427631
Pipeta transferowaFisher Scientific13-711-20Sterylna, jednorazowa
mysz anty-CD3 AbeBioscience11-0031-85Klon: 1452C11
Mysz anty-CD4 AbeBioscience48-0042-82Klon: RM4-5
Mysz anty-CD8 AbeBioscience25-0081-82Klon: 53-6.7
LancetMedipointGoldenrod 4mm
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethyloammonium SaltInvitrogenP30253
96-dołkowe okrągłe płytki polipropylenowe Corning3365
1,2 ml polipropylenowe rurki klastroweCorning4401
5 ml polipropylenowe probówki okrągłodenneBD352002
40uM Nylon Cell SitkoFalcon352340
16% roztwór paraformaldehydu,usługi mikroskopii elektronowej15710Niebezpieczna
maść optyczna PuralubeFisher Scientific NC0138063
LimfolitCedarlaneCL5030
Naczynie do hodowli komórkowych 60 mmCorning43019660 mm x 15 mm, sterylne
Igła o klasy EM

Bibliografia

  1. Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
  2. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
  3. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
  4. Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
  5. Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
  6. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
  7. He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
  8. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  9. Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
  10. Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
  11. Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
  12. Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
  13. Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042(2012).
  14. Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
  15. Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62(2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przeszczepianie graftu grasiczegoizolacja grasicy mysiejimplantacja pod torebkę nerkianaliza cytometrycznaocena przyjęcia się limfocytów Tmyszy biorcze z niedoborem odpornościbadanie selekcji grasiczejchirurgiczne rozmieszczenie graftureconstitucja obwodowych limfocytów Tzależne od wieku zdarzenia grasicze
Izolacja i przeszczep różnych wiekowych mysich przeszczepów grasicy.
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.