Artykuł metodologiczny

Usuwanie pierwiastków śladowych przez nanocząstki tlenku miedzi z wody upustowej z odzysku uranu in situ i jej wpływ na żywotność komórek

DOI:

10.3791/52715

⸱

21 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Physical Therapy, Department of Orthopedics & Rehabilitation, University of New Mexico, 2Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 3School of Pharmacy, University of Wyoming, 4Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 5Center for Environmental Medicine, Colorado State University, 6College of Pharmacy, California Northstate University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja wody odpływowej (PBW) została potraktowana nanocząstkami tlenku miedzi (CuO-NPs) i oceniono toksyczność komórkową w hodowanych komórkach ludzkich. Celem tego protokołu było zintegrowanie rodzimej próbki środowiskowej z formatem hodowli komórkowej oceniającym zmiany toksyczności spowodowane traktowaniem CuO-NP.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odzysk in situ (ISR) jest dominującą metodą ekstrakcji uranu w Stanach Zjednoczonych. Podczas ISR uran jest wypłukiwany ze złoża rudy i ekstrahowany w procesie wymiany jonowej. Powstała woda upustowa (PBW) zawiera zanieczyszczenia, takie jak arsen i inne metale ciężkie. Próbki PBW z aktywnej instalacji uranowej ISR poddano działaniu nanocząstek tlenku miedzi (CuO-NP). Leczenie CuO-NP PBW zmniejszyło priorytetowe zanieczyszczenia, w tym arsen, selen, uran i wanad. PBW nietraktowany i traktowany CuO-NP zastosowano jako płynny składnik pożywki do wzrostu komórek, a zmiany żywotności określono za pomocą testu MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy) w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK 293) i ludzkiego raka wątrobowokomórkowego (Hep G2). Leczenie CuO-NP wiązało się z poprawą żywotności komórek HEK i HEP. Ograniczenia tej metody obejmują rozcieńczanie PBW przez składniki pożywek wzrostowych oraz podczas regulacji osmolalności, a także niezbędną regulację pH. Metoda ta jest ograniczona w szerszym kontekście ze względu na efekty rozcieńczenia i zmiany pH PBW, które jest tradycyjnie lekko kwaśne; metoda ta może mieć szersze zastosowanie w ocenie uzdatniania CuO-NP w bardziej neutralnych wodach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Około 20% dostaw energii elektrycznej w USA pochodzi z energii jądrowej i, częściowo na podstawie krajowych zachęt do zwiększenia niezależności energetycznej, oczekuje się, że moc jądrowa USA wzrośnie 1. Oczekuje się, że światowy wzrost energetyki jądrowej również będzie kontynuowany, przy czym znaczna część wzrostu będzie miała miejsce poza Stanami Zjednoczonymi 2. W 2013 r. 83% amerykańskiego uranu było importowane, ale w USA istnieje 952 544 ton metrycznych rezerw (3,4). W 2013 r. pojawiło się 7 nowych wniosków o instalację i 14 wniosków o ponowne uruchomienie/rozbudowę między Wyoming, Nowym Meksykiem i Nebraską 5. W Stanach Zjednoczonych uran jest wydobywany głównie w procesach odzyskiwania in situ (ISR) 6. ISR powoduje mniejsze naruszenie gleby i pozwala uniknąć tworzenia hałd osadowych, które mogą uwalniać zanieczyszczenia środowiskowe 7. ISR wykorzystuje roztwory utleniające na bazie wody do wypłukiwania uranu z podziemnego złoża rudy, po czym uran jest ekstrahowany z odcieku w procesie wymiany jonowej 8. Aby utrzymać ujemny bilans wodny w złożu rudy, część odcieku, zwana wodą upustową z produkcji (PBW), jest odprowadzana. Część PBW jest odkażana za pomocą odwróconej osmozy (RO) i ponownie wprowadzana do procesu wydobywczego, ale PBW może również mieć korzystne zastosowania przemysłowe lub rolnicze, jeśli toksyczne zanieczyszczenia zostaną zredukowane do dopuszczalnych poziomów określonych przez stanowe agencje regulacyjne dla wód powierzchniowych i gruntowych 9. Obecnie większość zakładów produkujących uran ISR wykorzystuje RO do usuwania zanieczyszczeń z PBW. Jednak przetwarzanie RO jest energochłonne i wytwarza toksyczną solankę odpadową, która wymaga regulowanej utylizacji.

Istnieje wiele metod dekontaminacji wody, w tym adsorbenty, membrany i wymiana jonowa. Spośród nich adsorpcja jest najczęściej stosowana, a ostatnie osiągnięcia w syntezie nanocząstek zwiększyły możliwości procesów odkażania wody na bazie adsorbentów 10. Nanocząstki tlenku miedzi (CuO-NPs) wcześniej nie były szeroko badane na uranu ISR PBW, ale w ostatnich badaniach usuwania zanieczyszczeń z wód gruntowych stwierdzono, że CuO-NP mają unikalne właściwości, w tym nie wymagają etapów uzdatniania przed lub po wodzie (np. dostosowanie pH lub potencjału redoks) i dobrze sprawdzają się w różnych składach wody (np. w różnych pH, stężeniach soli, lub jony konkurujące) 11. Ponadto CuO-NP są łatwo regenerowane poprzez ługowanie wodorotlenkiem sodu (NaOH), po czym zregenerowane CuO-NP mogą być ponownie wykorzystane. Szczegóły dotyczące możliwości filtrowania cuO-NP metali śladowych z wód naturalnych zostały wcześniej opublikowane 11–14.

Chociaż przydatne do uzdatniania wody, nanocząsteczki tlenku metalu mogą być toksyczne dla organizmów żywych, ale zakres toksyczności zależy częściowo od charakterystyki i składników nanocząsteczek 10,15,16. Dlatego ważne jest, aby przed zastosowaniem w terenie badać jednoczesne usuwanie zanieczyszczeń i toksyczność nanocząstek. W obecnym badaniu określono zdolność CuO-NP do usuwania priorytetowych zanieczyszczeń PBW (w tym arsenu, selenu, wanadu i uranu) oraz oceniono wpływ leczenia CuO-NP na cytotoksyczność PBW.

PBW został pobrany z aktywnego zakładu uranowego ISR i wykorzystany do określenia skuteczności leczenia CuO-NP w priorytetowym usuwaniu zanieczyszczeń. Oceniano również cytotoksyczność PBW przed i po leczeniu CuO-NP. PBW jest złożoną mieszaniną geologiczną (przemysłowo-środowiskową) i zarówno National Institute of Environmental Health and Science (NIEHS), jak i Agencja ds. Substancji Toksycznych i Rejestru Chorób (ASTDR) kładą nacisk na badanie toksyczności mieszanin istotnych dla środowiska, w tym mieszanin występujących w naturze lub środowisku przemysłowym, a także promują badania in vitro w celu nadania priorytetu substancjom chemicznym do dalszych badań in vivo 17–19. Badania nad przewlekłym narażeniem na mieszaniny o niskiej dawce są trudne, ponieważ przewlekłe narażenie na mieszaninę o niskiej dawce nie daje oczywistych skutków, przynajmniej nie w krótkim czasie, w którym przeprowadza się większość badań laboratoryjnych. Podobnie, większość badań in vitro mieszanin chemicznych wystawia komórki na działanie określonej laboratoryjnie mieszaniny 2 lub więcej metali 20,21. Badania te dostarczają informacji wyjściowych, ale uproszczone mieszaniny nie odtwarzają złożonych oddziaływań antagonistycznych i synergicznych, które mogą wystąpić w natywnej próbce środowiskowej, w której obecny jest pełen zakres składników mieszaniny.

Celem tego badania było zbadanie alternatywnych procesów usuwania zanieczyszczeń dla PBW oraz ocena wpływu leczenia (CuO-NP) na cytotoksyczność PBW przy użyciu hodowanych komórek ludzkich. Wyniki mogą przynieść korzyści przemysłowi uranowemu poprzez opracowanie bardziej wydajnych lub przyjaznych dla środowiska metod usuwania zanieczyszczeń. Badanie to dostarcza pierwszych dowodów na to, że redukcja priorytetowych zanieczyszczeń w PBW przez CuO-NPs zmniejsza cytotoksyczność w komórkach ssaków 22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki zostały pobrane w budynku przetwarzania ciekłego uranu w zakładzie ISR w Wyoming.

1. Woda upustowa produkcji (PBW)

  1. Pobrać dwa rodzaje próbek wody z zakładu uranowego ISR: PBW i wodę z odwróconej osmozy (RO). Pobrać PBW z kranu monitorującego po procesie wymiany jonowej, ale przed dekontaminacją metodą odwróconej osmozy. Pobrać próbki RO po odkażeniu PBW za pomocą odwróconej osmozy.
    UWAGA: Lixiviant jest transportowany rurociągami z wielu pól wiertniczych do budynku przetwarzania ciekłego uranu, gdzie jest zbierany w kolumnie i przygotowywany do wymiany jonowej. Około 1-3% płynu po wymianie jonowej jest usuwane z obiegu i określane jako woda z wyciekiem produkcyjnym (PBW). PBW jest ponownie wykorzystywany w procesach wydobywczych lub odkażany/demineralizowany za pomocą filtracji RO.
  2. Próbki wody należy pobierać w butelkach z polietylenu o wysokiej gęstości (HDPE) z zerową przestrzenią nad wodą zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi dotyczącymi pobierania i analizy próbek Departamentu Jakości Środowiska Wyoming (WYDEQ) 23.
  3. Mierz temperaturę i pH na miejscu i transportuj próbki na lodzie, aby utrzymać je w chłodzie.
  4. Przechowywać PBW w temperaturze 4 °C. Roztwór PBW należy przechowywać w chłodnym miejscu do czasu dodania minimalnej ilości skoncentrowanej pożywki Eagle (EMEM-10x) podczas przygotowywania pożywki zgodnie z instrukcjami zawartymi w poniższym protokole.
    UWAGA: PBW jest utlenionym roztworem, który wytrąca się, jeśli pozwoli mu się zamarznąć lub ogrzać do temperatury pokojowej. Po rozcieńczeniu roztwór PBW jest na tyle rozcieńczony, że nie wytrąca się po podgrzaniu do temperatury 37 °C przed nałożeniem na komórki i podczas inkubacji.

2. Przygotowanie nanocząstek CuO (CuO-NPs)

  1. Połączyć czysty roztwór etanolowy zawierający 250 ml 0,2 M CuCl2 • 2H2O, 250 ml 0,4 M wodorotlenku sodu (NaOH) i 5 g glikolu polietylenowego (PEG) w kolbie okrągłodennej z kulkami ze szkła borokrzemianowego o średnicy sześciu mm.
  2. Umieść roztwór w zmodyfikowanej kuchence mikrofalowej i pozwól mu reagować pod chłodnicą zwrotną pod ciśnieniem otoczenia przez 10 minut przy 20% mocy (odstępy 6 sekund włączenia, 24 sekundy wyłączenia).
  3. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej (20 °C), a następnie zdekantować do stożkowych probówek o pojemności 50 ml, pozostawiając szklane kulki.
  4. Odwirować roztwór w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml przy 1 000 x g przez 30 minut, zdekantować, a następnie przepłukać CuO-NPs sekwencją 300 ml gorącej wody (60-65 °C), 100 ml etanolu i 100 ml acetonu.
  5. Wysuszyć CuO-NPs do temperatury pokojowej (20 °C) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml.
  6. Zeskrob CuO-NP z ich tubek do moździerza. Przykryj CuO-NPs folią aluminiową i podgrzej CuO-NPs do 110 °C w piekarniku, aby usunąć pozostały płyn. Połącz CuO-NP w jedną partię i zważ CuO-NPs.
    UWAGA: Przygotowanie CuO-NP i oczyszczanie CuO-NP PBW przeprowadzono w Laboratorium Jakości Wody Nauk o Ekosystemach i Zarządzania, University of Wyoming. Synteza CuO-NP przebiegała zgodnie z procedurą Martinsona i Reddy'ego (2009) 11.

3. Leczenie PBW za pomocą CuO-NPs

  1. Dodać 50 mg (1 mg/ml) CuO-NP do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie 50 ml PBW. Uszczelnij rurkę i reaguj przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 250 obr./min.
  2. Odwirować probówki z próbkami o masie 250 x g przez 30 minut, a następnie przefiltrować supernatant za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm. Zmiana prędkości i czasu wirówki może zależeć od nanocząstki, aby zapewnić, że CuO-NP staną się zwarte w probówce wirówkowej.

4. Analiza elementarna

  1. Przygotować próbki PBW niepoddane działaniu substancji (kontrolnej) i poddane działaniu CuO-NP do analizy elementarnej w następujący sposób.
  2. Zakwasić podwielokrotności (40 ml) PBW poddanego działaniu CuO-NP i niepoddanego działaniu substancji kwasem azotowym klasy metali śladowych do pH 2,0. Analizuj zakwaszone podwielokrotności PBW dla kationów za pomocą spektroskopii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS), jak opisano w Reddy i Roth (2012) 13.
  3. Przygotować niezakwaszone podwielokrotności (20 ml) PBW poddanego działaniu CuO-NP i niepoddanych działaniu substancji i przeanalizować niezakwaszone podwielokrotności anionów metodą chromatografii jonowej (IC), jak opisano w Reddy i Roth (2012) 13.
    UWAGA: Podwielokrotności zostały przeanalizowane przez Departament Usług Analitycznych Rolnictwa Wyoming, Laramie WY 82070. Opis procedury IC i ICPMS można znaleźć w Reddy i Roth, (2012) 13.

5. Przygotowanie pożywek do hodowli komórkowych za pomocą PBW

  1. W badaniach żywotności należy użyć dwóch roztworów pożywek kontrolnych (EMEM-1x i pożywki RO+) i ośmiu roztworów pożywek testowych PBW (po cztery stężenia pożywek niepoddanych działaniu PBW i CuO-NP). Przegląd rozwiązań jest następujący:
    1. Do kontroli EMEM-1x należy zakupić minimalną niezbędną pożywkę Eagle (EMEM-1x) z już dodanymi L-glutaminą i wodorowęglanem sodu. Dodaj płodową surowicę bydlęcą (FBS) i antybiotyki zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: EMEM-1x jest kupowany w postaci rozcieńczonej do stężenia odpowiedniego dla wzrostu komórek i zawierającej L-glutaminę i wodorowęglan sodu. EMEM-1x wymaga dodania płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz mieszanki antybiotyków penicyliny i streptomycyny (50 j.m./ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny). EMEM-1x jest stosowany jako pożywka kontrolna, ponieważ jest to zalecana przez producenta pożywka wzrostowa dla obu typów komórek użytych w tym badaniu. Skoncentrowany EMEM-10x rozcieńcza się wodą RO z zakładu lub PBW nieoczyszczonym lub PBW poddanym działaniu CuO-NP w celu wytworzenia roztworów testowych. Skoncentrowany EMEM-10x po zakupie nie zawiera L-glutaminy ani wodorowęglanu sodu, więc są one dodawane jako dodatek do płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz mieszanki antybiotyków penicyliny i streptomycyny.
    2. Do rozwiązania sterowania odwróconą osmozą należy użyć wody RO pobranej z obiektu ISR. Używaj tego samego protokołu, co pożywki testowe PBW, zastąp tylko 100% wodą RO z obiektu ISR zamiast PBW. Do rozcieńczenia roztworu nieoczyszczonego i poddanego działaniu CuO-NP należy użyć RO lub ultraczystej wody z laboratorium.
    3. Rozcieńczyć PBW niepoddane działaniu substancji do czterech badanych stężeń przed zmieszaniem ze składnikami pożywki do hodowli komórkowych. Przygotować cztery różne stężenia nieoczyszczonych roztworów PBW, mieszając nieoczyszczony PBW z RO (z laboratorium) w następujących kombinacjach: 100% (czysty PBW + bez wody RO), 75% (187,5 ml PBW + 62,5 ml wody RO), 50% (125 ml PBW + 125 ml wody RO) lub 25% (62,5 ml PBW + 187,5 ml wody RO).
    4. Rozcieńczyć PBW poddane działaniu CuO-NP do czterech badanych stężeń przed zmieszaniem ze składnikami pożywki do hodowli komórkowych. Przygotować cztery różne stężenia roztworów PBW poddanych działaniu CuO-NP, mieszając PBW (wstępnie poddane działaniu 1 mg/ml CuO-NP przez 30 min) z RO (z laboratorium) w następujących kombinacjach: 100% (czysty PBW traktowany CuO-NP + bez wody RO), 75% (187,5 ml PBW poddanego działaniu CuO-NP + 62,5 ml wody RO), 50% (125 ml PBW poddanego działaniu CuO-NP + 125 ml wody RO) lub 25% (62,5 ml PBW poddanego działaniu CuO-NP + 187,5 ml wody RO).
  2. Przygotować 250 ml pożywki RO+, pożywki PBW niepoddanej działaniu substancji niepoddanej działaniu substancji i pożywki PBW+ poddanej działaniu CuO-NP o zagęszczeniu, dodając 25 ml stężonego EMEM-10x do 190 ml 100% RO i 100%, 75%, 50% lub 25% wstępnie przygotowanych stężeń PBW niepoddanych działaniu substancji lub pożywki poddanych działaniu CuO-NP, utworzonych w krokach 6.1.3 i 6.1.4.
  3. Dostosuj pH każdego roztworu do 7,4 za pomocą NaOH lub HCl.
  4. Uzupełnij każde stężenie PBW bez traktowania i pożywki POW poddanej działaniu CuO-NP, a także pożywki RO+ z następującymi składnikami wzorcowymi: 25 ml (10%) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2,5 ml L-glutaminy, 0,55 g NaHCO3 i 1,25 ml Pen/Strep (50 j.m./ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny).
  5. Dostosuj osmolalność każdego stężenia pożywki PBW + poddanej działaniu substancji niepoddanej działaniu substancji chemicznej, pożywki PBW + poddanej działaniu CuO-NP i pożywki RO+ do 290-310 mOSM/kg, dodając wodę RO i zmierz za pomocą osmometru.
  6. Przefiltruj każdy roztwór za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ze względu na niewielkie różnice w ilości wody RO używanej do regulacji osmolalności, należy zmieniać stężenia końcowych mediów w zakresie 5%, przy czym stężenia nieoczyszczonych mediów PBW + wynoszą 56%, 44%, 29% i 16,5%, a stężenia mediów PBW + poddane działaniu CuO-NP wynoszą 53%, 45%, 30% i 17%.

6. Żywotność komórek

UWAGA: Biorąc pod uwagę, że nerki i wątroba są narządami docelowymi dla toksyczności metali ciężkich, zastosuj metody testowania ludzkich embrionalnych komórek nerkowych (HEK293) (HEK) i ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego (HepG2) (HEP) 24-26.

  1. Przygotuj kulturę komórek HEK i HEP 2-3 dni przed posiewem 96-dołkowych płytek użytych w eksperymencie zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Zmierzyć żywotność komórek za pomocą testu bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-2,5-difenylotetrazolowego (MTT).
    UWAGA: Protokół testu MTT został zmodyfikowany w stosunku do Meerloo i in. (2011) 27.
    1. Otrzymywanie MTT w postaci proszku. Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu uzupełnienia stężenia podstawowego 50 mg/ml. Mieszaj roztwór przez 2 godziny, a następnie przefiltruj za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm i podziel na 1,5 ml probówki do zamrażania. Chronić probówki przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Usunąć komórki HEK i HEP z szalek hodowlanych za pomocą trypsyny, odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut i zdekantować trypsynę. Dodać 5 ml PBS i wymieszać komórki, aby uzyskać roztwór jednokomórkowy. Następnie nałóż 20 μl roztworu pojedynczej komórki do hemocytometru, aby uzyskać liczbę komórek na mililitr roztworu. Ponownie odwirować komórki przy 1 000 x g przez 5 minut i zdekantować PBS użyty do przepłukania komórek. Dodać odpowiednią ilość EMEM-1x, aby dostosować stężenie komórek do 500 komórek/100 μl (100 μl/studzienkę).
  4. Napełnij studzienki obwodowe płytki 200 μl PBS w celu kontroli parowania.
  5. Komórki nasienne o gęstości 500 komórek/studzienkę dodając 100 μl do każdej studzienki, z wyjątkiem studzienek obwodowych (które nie są pokryte komórkami).
    UWAGA: Gęstość wysiewu dla komórek HEK i HEP opiera się na eksperymentalnych krzywych wzrostu, które pozwalają na osiągnięcie szczytu wzrostu około 4-5 dni. Przygotuj krzywe wzrostu dla wszystkich linii komórkowych, aby oszacować gęstość wysiewu.
  6. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, pozwalając im na regenerację (utworzenie ścisłych zrostów z płytką) przed wykonaniem podstawowych odczytów gęstości komórek MTT.
  7. Wykonać podstawowe odczyty MTT gęstości komórek, usuwając pożywkę wysiewającą z pierwszej kolumny (bez obwodu) i dodając 100 μl MTT (5 mg/ml w pożywce) do studzienek na 1 godzinę.
  8. Po godzinie usuń MTT i dodaj 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO), aby rozpuścić formazan MTT wytwarzany przez żywe komórki (20 min).
  9. Odczytaj gęstość optyczną (OD) pierwszej kolumny przy długości fali absorpcji 570 nm, aby uzyskać odczyt linii podstawowej.
    1. Użyj odczytów bazowych, aby upewnić się, że wszystkie płytki zostały prawidłowo wysiane i że komórki rosną konsekwentnie między płytkami. Usunąć DMSO z badanej kolumny przed inkubacją przez następne 24 godziny.
      UWAGA: Jeśli DMSO zostanie pozostawiony na noc w płycie, będzie on pobierał wilgoć z sąsiedniej kolumny, powodując zmniejszenie objętości nośnika.
  10. Podgrzać roztwory badane (tj. roztwory pożywek PBW EMEM-1x, RO, PBW niepoddane działaniu substancji i roztwory PBW poddane działaniu CuO-NP) do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
  11. Usunąć podłoże wysiewające z pozostałej części płytki (nie uwzględniając obwodu ani pierwszej kolumny, która została użyta do odczytu linii podstawowej) i zastąpić 100 μl EMEM-1x, RO+pożywki, niepoddanych działaniu PBW+pożywki o stężeniach lub stężeń pożywki PBW+ poddanych działaniu CuO-NP (jeden roztwór na płytkę). Inkubować komórki w ich stężeniach testowych lub roztworach kontrolnych przez łącznie siedem dni (dni 2-8).
    UWAGA: W sumie 10 płytek: 1 EMEM-1x, 1 pożywka RO+, 1 z każdym stężeniem pożywki PBW + niepoddanej działaniu substancji (56%, 44%, 29% i 16,5%) oraz jedna płytka z każdym stężeniem pożywki PBW + potraktowanej CuO-NP (53%, 45%, 30% i 17%) na eksperyment na linię komórkową.
  12. Każdego dnia po odczycie linii bazowej MTT usunąć roztwory kontrolne i testowe (wymienione w uwadze do ppkt 6.11) z następnej kolumny odpowiedniej płytki (np. pożywki testowe dnia 2 i kontrolne usuwa się z rzędu 3, studzienki B-G; Dzień 3: rząd 4, dołki B-G itp.) i powtórzyć protokół MTT zgodnie z opisem w krokach 6.7-6.9 powyżej.
  13. Powtarzaj protokół codziennie przez siedem dni. Uśrednij wyniki OD dla każdego rzędu (6 dołków) i podaj je w czasie, aby wygenerować siedmiodniową krzywą wzrostu.
  14. Aby ocenić wpływ chelatacji miedzi na żywotność komórek w pożywkach PBW + traktowanych CuO-NP, postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co powyżej, z wyjątkiem dodania 100 μM D-penicylaminy w celu kontroli i przetestowania roztworów przed dodaniem roztworów do odpowiednich płytek. Wykonuj analizę danych za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów naukowych.

7. Modelowanie geochemiczne

  1. Pobierz darmowe oprogramowanie Visual MINTEQ w wersji 3.0/3.1 z następującej strony internetowej http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/.
    UWAGA: Visual MINTEQ to darmowy model równowagi chemicznej do obliczania specjacji metali, równowagi rozpuszczalności, sorpcji itp. dla wód naturalnych. Ponadto służy do przewidywania specjacji jonów, aktywności jonów, kompleksów jonowych i wskaźników nasycenia, które są porównywane ze stężeniem pierwiastków przed i po obróbce (wyniki spektroskopii mas) w celu zbadania możliwych mechanizmów usuwania pierwiastków 28.
  2. Otwórz program i wprowadź do programu dane spektroskopii mas z kroku 4, w tym pH, zasadowość i stężenia różnych pierwiastków.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę, że wody gruntowe są utleniane podczas procesu ekstrakcji uranu in situ, jako wsad należy używać utlenionych form arsenu, wanadu i uranu.

8. Stężenie hamujące 50 (IC50)

  1. Obliczyć IC50 dla stężeń pożywek PBW+ niepoddanych działaniu substancji i CuO-NP, najpierw uśredniając żywotność (średnie OD) w dniu 5 trzech oddzielnych serii.
  2. Odejmij średnie wartości żywotności w piątym dniu stężeń PBW+ pożywki niepoddanych działaniu substancji i podanych działaniu CuO-NP od średnich stężeń EMEM-1x w piątym dniu, aby obliczyć różnice w żywotności. Następnie podziel różnice w żywotności przez średnią żywotność w dniu 5 w EMEM i pomnóż przez 100, aby uzyskać procentowe zahamowanie.
  3. Odejmij procentową inhibicję od 100 (żywotność EMEM-1x), aby uzyskać procent żywotności dla każdego stężenia PBW+ pożywki niepoddanej działaniu substancji i traktowanej CuO-NP.
  4. Wprowadź dane do oprogramowania do tworzenia wykresów naukowych, ustawiając EMEM-1x na stężenie jeden i procentową żywotność 100; przekształć wszystkie stężenia w skalę logarytmiczną (X = Log (X)) i wykonaj regresję nieliniową z analizą dopasowania najmniejszych kwadratów.

9. Analiza danych

  1. Porównaj stężenia pierwiastków w PBW niepoddanym działaniu substancji i PBW poddanym działaniu CuO-NP za pomocą dwustronnego, sparowanego testu T Studenta.
  2. Oblicz obszary pod krzywą (AUC), korzystając z danych krzywej wzrostu zebranych w ciągu siedmiu dni i przeanalizuj wariancję za pomocą analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (ANOVA), a następnie porównania post hoc Tukeya między wszystkimi grupami (n = 3).
  3. Oblicz IC50, używając danych z piątego dnia krzywej wzrostu zarówno dla roztworów PBW+ pożywki niepoddanych działaniu substancji niepoddanej działaniu substancji chemicznej, jak i roztworów PBW+ poddanych działaniu CuO-NP (opisanych powyżej). Wartości P wynoszące <0,05 są uważane za znaczące.
    UWAGA: Do celów analizy statystycznej wartości spektroskopii mas wynoszące połowę granicy wykrywalności przypisano stężeniom jonów poniżej tej granicy 29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stężenia składników PBW i pH w PBW niepoddanym działaniu substancji i CuO-NP są podane w Tabeli 1. Martinson i Reddy (2009) podali, że punkt zerowego ładunku CuO-NP szacuje się na 9,4 ± 0,4. Biorąc pod uwagę, że pH PBW wynosiło 7,2-7,4, w tych warunkach woda oddaje protony do CuO-NPs, powodując dodatni ładunek powierzchni nanocząstek, co pozwala na adsorpcję ujemnie naładowanych gatunków. Leczenie CuO-NP usunęło priorytetowe zanieczyszczenia z PBW, w tym arsen, selen, uran i wanad (Tabela 1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzednie badania wykazały, że CuO-NP usuwają arsen z wód gruntowych 11,13,30,31. Badanie to potwierdza te wcześniejsze ustalenia, a także informuje, że CuO-NP usuwają dodatkowe zanieczyszczenia z PBW. Badanie to potwierdza również wcześniejsze doniesienia, że CuO-NP są skuteczne w usuwaniu arsenu, pomimo obecności innych zanieczyszczeń i potencjalnych konkurencyjnych jonów 11. Modelowanie specjacji przewidywało, że 97% gatunków wanadu w PBW jest naładowanych ujemnie, co pozwala na adsorpcję do CuO...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Rogerowi Hopperowi i Laboratorium Usług Analitycznych Departamentu Rolnictwa Wyoming za analizę spektroskopii mas naszych próbek. Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność Szkole Farmacji Uniwersytetu Wyoming za umożliwienie nam nagrania tego protokołu w ich laboratoriach. Chcielibyśmy również podziękować Theodore O. and Dorothy S. King Endowed Professorship Agreement za ich asystenturę dla absolwentów (SC), University of Wyoming za wsparcie Graduate Assistantship (JRS) oraz Science Posse (NSF GK-12 Project # 084129) za stypendium dydaktyczne (JRS). Chcielibyśmy również podziękować firmie Uranium One za umożliwienie nam pobrania próbek i pomoc w razie pytań. Prace te były wspierane przez School of Energy Resources na Uniwersytecie Wyoming.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CuCl2Sigma203149
Kulki ze szkła borokrzemianowegoVWR26396-6396 mm
Kwas azotowyFisherA509-P500Gatunek metalu śladowego
0,45 i #956; m filtr strzykawkowyFisherSLHA 033S S
10x EMEMFisherBW12-684F
Surowica bydlęcaATCC30-2020
L-glutaminaFisherBP379-100
NaHCO3SigmaS5761
Penicylina/StreptomycynaATCC30-2300
0,22 μ m Filtr próżniowyFisher09-740-28C
HEK293ATCCCRL-1573
HEPG2ATCCHB-8065
TrypsynaSigmaSV3003101
MTTSigmaM2128
D-penicylaminaFisherICN15180680
96-dołkowe płytkiFisher07-200-92
DMSOFisherD12814
Spectra Max 190Molecular Devices
Visual MINTEQ wersja 3.0KTH Royal Institute of Technology
ICP-MSAgilentSzczegóły dotyczące instrumentów, modeli i limitów wykrywalności zostały opublikowane w Reddy et al., 2013.
IC DIONEX DX 500DionexSzczegółowe informacje na temat instrumentów, modeli i granic wykrywalności zostały opublikowane w Reddy et al., 2013.
InkubatorVWR VWR
płodu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. What is the status of the U.S. nuclear industry? Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/energy_in_brief/article/nuclear_industry.cfm (2014).
  2. International Energy Outlook. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/forecasts/archive/ieo11/pdf/0484%282011%29.pdf (2011).
  3. Uranium Marketing Annual Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/marketing/ (2014).
  4. Domestic Uranium Production Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.gov/uranium/production/annual/ (2014).
  5. Uranium Recovery. Washington (DC): U.S. United States Nuclear Regulatory Commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/materials/uranium-recovery/license-apps/ur-projects-list-public.pdf (2014).
  6. U.S. Uranium Reserves Estimates. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). , Available from: http://www.eia.doe.gov/cneaf/nuclear/page/reserves/ures.html (2010).
  7. The Future of Uranium Production in Wyoming: A Public Forum on In-Situ Recovery. Washington (DC): Meridian Institute. , Available from: http://www.uwyo.edu/ser/_files/docs/conferences/2010/uraniumforum/ser_uranium_forum_final_report.pdf (2010).
  8. Generic Environmental Impact Statement for In-Situ Leach Uranium Milling Facilities Washington (DC): U.S. Nuclear Regulatory commission (US). , Available from: http://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/nuregs/staff/sr1910/v1/ (2012).
  9. Wyoming surface water quality standards. Cheyenne (WY): State of Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://soswy.state.wy.us/Rules/RULES/6547.pdf (2011).
  10. Qu, X., Alvarez, P., Li, Q. Applications of nanotechnology in water and wastewater treatment. Water Research. 47 (12), 3931-3946 (2013).
  11. Martinson, C., Reddy, K. Adsorption of arsenic(III) and arsenic(V) by cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336 (2), 401-411 (2009).
  12. Reddy, K., McDonald, K., King, H. A novel arsenic removal process for water using cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 397, 96-102 (2013).
  13. Reddy, K., Roth, T. Arsenic Removal from Natural Groundwater Using Cupric Oxide. Ground Water. 51 (1), 83-91 (2012).
  14. Zhang, G., Ren, Z., Zhang, X., Chen, J. Nanostructured iron(III)-copper(II) binary oxide: a novel adsorbent for enhanced arsenic removal from aqueous solutions. Water Research. 47 (12), 4022-4031 (2013).
  15. Ali, I. New generation adsorbents for water treatment. Chemical Reviews. 112 (10), 5073-5091 (2012).
  16. Zhang, Q. CuO nanostructures: Synthesis, characterization, growth mechanisms, fundamental properties, and applications. Progress in Materials Science. 60, 208-337 (2014).
  17. Schmidt, C. TOX 21: new dimensions of toxicity testing. Environmental health perspectives. 117 (8), 348-353 (2009).
  18. Firestone, M., Kavlock, R., Zenick, H., Kramer, M. The U.S. Environmental Protection Agency Strategic Plan for Evaluating the Toxicity of Chemicals. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 139-162 (2010).
  19. Guidance Manual for the Assessment of Joint Toxic Action of Chemical Mixtures [Internet]. Atlanta (GA); Agency for Toxic Substance and Disease Registry (US). , Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/interactionprofiles/IP-ga/ipga.pdf (2014).
  20. Bae, D., Gennings, C., Carter, W., Yang, R., Campain, J. Toxicological interactions among arsenic, cadmium, chromium, and lead in human keratinocytes. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 63 (1), 132-142 (2001).
  21. Whittaker, M. Exposure to Pb, Cd, and As mixtures potentiates the production of oxidative stress precursors: 30-day, 90-day, and 180-day drinking water studies in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 254 (2), 154-166 (2011).
  22. Schilz, J. Investigating the ability of cupric oxide nanoparticles to adsorb metal contaminants from uranium in-situ recovery (ISR) production bleed water and assessing the associated changes in cytotoxicity. , University of Wyoming. Laramie, WY. Available from: ProQuest UMI, Ann Arbor, MI (2014).
  23. Manual of Standard Operating Procedures for Sample Collection and Analysis. Cheyenne (WY): Wyoming Department of Environmental Quality (US). , Available from: http://deq.state.wy.us/wqd/watershed/downloads/qa/4-1089.pdf (2011).
  24. Florea, A., Splettstoesser, F., Büsselberg, D. Arsenic trioxide (As2O3) induced calcium signals and cytotoxicity in two human cell lines SY-5Y neuroblastoma and 293 embryonic kidney (HEK). Toxicology and Applied Pharmacology. 220 (3), 292-301 (2007).
  25. Mao, W. Cadmium induces apoptosis in human embryonic kidney (HEK) 293 cells by caspase-dependent and -independent pathways acting on mitochondria. Toxicology in Vitro. 21 (3), 343-354 (2007).
  26. Tchounwou, P., Yedjou, C., Patlolla, A., Sutton, D. Heavy Metal Toxicity and the Environment. Molecular, Clinical and Environmental Toxicology. 101, 133-164 (2012).
  27. Meerloo, J., Kaspers, G., Cloos, J. Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay. Cancer Cell Culture. 731, 237-245 (2011).
  28. Gustafsson, J. Visual MINTEQ. , Royal Institute of Technology. Stockholm, Sweden. (2010).
  29. Hallab, N., Caicedo, M., McAllister, K., Skipor, A., Amstutz, H., Jacobs, J. Asymptomatic prospective and retrospective cohorts with metal-on-metal hip arthroplasty indicate acquired lymphocyte reactivity varies with metal ion levels on a group basis. Journal of Orthopaedic Research. 31 (2), 173-182 (2013).
  30. Goswami, A., Raul, P., Purkait, M. Arsenic adsorption using copper (II) oxide nanoparticles. Chemical Engineering Research and Design. 90 (9), 1387-1396 (2011).
  31. Pillewan, P., Mukherjee, S., Roychowdhury, T., Das, S., Bansiwal, A., Rayalu, S. Removal of As(III) and As(V) from water by copper oxide incorporated mesoporous alumina. Journal of Hazardous Materials. 186 (1), 367-375 (2011).
  32. Kroll, A. Cytotoxicity screening of 23 engineered nanomaterials using a test matrix of ten cell lines and three different assays. Particle and fibre toxicology. 8 (9), 1-19 (2011).
  33. Fahmy, B., Cormier, S. Copper oxide nanoparticles induce oxidative stress and cytotoxicity in airway epithelial cells. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 23 (7), 1365-1371 (2009).
  34. Radike, M. Distribution and accumulation of a mixture of arsenic, cadmium, chromium, nickel and vanadium in mouse small intestin, kidney, pancreas, and femur following oral administration in water or feed. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 65 (23), 2029-2052 (2002).
  35. Barbier, O., Jacquillet, G., Tauc, M., Cougnon, M., Poujeol, P. Effect of heavy metals on, and handling by, the kidney. Nephron. Physiology. 99 (4), 105-110 (2005).
  36. Zheng, X., Watts, G., Vaught, S., Gandolfi, A. Low-level arsenite induced gene expression in HEK293 cells. Toxicology. 187 (1), 39-48 (2003).
  37. Li, Z., Piao, F., Liu, S., Wang, Y., Qu, S. Subchronic exposure to arsenic trioxide-induced oxidative DNA damage in kidney tissue of mice. Experimental and Toxicologic Pathology. 62 (5), 543-547 (2010).
  38. Farombi, E., Akintunde, J., Nzute, N., Adedara, I., Arojojoye, O. Municipal landfill leachate induces hepatotoxicity and oxidative stress in rats. Toxicology and Industrial Health. 28 (6), 532-541 (2011).
  39. Das, N. Arsenic exposure through drinking water increases the risk of liver and cardiovascular diseases in the population of West Bengal. India. BMC public health. 12 (1), 639-648 (2012).
  40. Valko, M., Morris, H., Cronin, M. Metals, toxicity and oxidative stress. Current Medicinal Chemistry. 12 (10), 1161-1208 (2005).
  41. Horie, M. Protein Adsorption of Ultrafine Metal Oxide and Its Influence on Cytotoxicity toward Cultured Cells. Chemical Research in Toxicology. 22 (3), 543-553 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Woda z purge produkcjitest ywotno ci kom rekusuwanie arsenuodzysk uranukom rki HEK 293kom rki Hep G2test MTTregulacja osmolalno ciregulacja pH

Powiązane artykuły