Papierowe urządzenia do izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Summary

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), małych błoniastych cząsteczek uwalnianych z komórek, z zaledwie 10 μl próbek surowicy. Takie podejście pozwala obejść potrzebę ultrawirowania, wymaga tylko kilku minut czasu na oznaczenie i umożliwia izolację EV od próbek o ograniczonej objętości.

Abstract

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), błoniaste cząsteczki uwalniane z różnych typów komórek, mają duży potencjał do zastosowań klinicznych. Zawierają kwas nukleinowy i białko i są coraz częściej uznawane za środek komunikacji międzykomórkowej wykorzystywany zarówno przez komórki eukariontyczne, jak i prokariotowe. Jednak ze względu na ich niewielkie rozmiary, obecne protokoły izolacji pojazdów elektrycznych są często czasochłonne, kłopotliwe i wymagają dużych objętości próbek oraz drogiego sprzętu, takiego jak ultrawirówka. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy papierową platformę immunoaffinity do rozdzielania podgrup EV, która jest łatwa, wydajna i wymaga objętości próbki już od 10 μl. Próbki biologiczne można pipetować bezpośrednio do papierowych stref testowych, które zostały chemicznie zmodyfikowane cząsteczkami wychwytującymi, które mają wysokie powinowactwo do określonych markerów powierzchniowych EV. Walidujemy test za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), papierowych testów immunoenzymatycznych (P-ELISA) i analizy transkryptomu. Te papierowe urządzenia umożliwią badanie pojazdów elektrycznych w warunkach klinicznych i badawczych, aby pomóc w lepszym zrozumieniu funkcji pojazdów elektrycznych w zdrowiu i chorobie.

Introduction

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to heterogeniczne błoniaste cząstki o rozmiarach od 40 nm do 5 000 nm i są aktywnie uwalniane przez wiele typów komórek poprzez różne drogi biogenezy^1-9. Zawierają unikalne i wyselekcjonowane podzbiory DNA, RNA, białek i markerów powierzchniowych z komórek rodzicielskich. Ich udział w różnych procesach komórkowych, takich jak komunikacja międzykomórkowa¹⁰, modulacja odporności¹¹, angiogeneza¹², przerzuty12, chemooporność¹³ i rozwój chorób oczu⁹, jest coraz bardziej rozpoznawalny i wzbudził duże zainteresowanie ich przydatnością w zastosowaniach diagnostycznych, prognostycznych, terapeutycznych i biologii podstawowej.

EVs można klasycznie klasycznie klasyfikować jako egzosomy, mikropęcherzyki, ciała apoptotyczne, onkosomy, ektosomy, mikrocząsteczki, telerosomy, prostatosomy, kardiosomy i weksosomy itd., w zależności od ich biogenezy lub pochodzenia komórkowego. Na przykład egzosomy powstają w ciałach wielopęcherzykowych, podczas gdy mikropęcherzyki powstają w wyniku pączkowania bezpośrednio z błony komórkowej, a pęcherzyki apoptotyczne pochodzą z komórek apoptotycznych lub nekrotycznych. Jednak nomenklatura jest nadal niedostatecznie dopracowana, częściowo z powodu braku dokładnego zrozumienia i scharakteryzowania pojazdów elektrycznych. Opracowano kilka metod oczyszczania EV, w tym ultrawirowanie¹⁴, ultrafiltracja¹⁵, kulki magnetyczne¹⁶, wytrącanie polimerów^17-19 i techniki mikroprzepływowe^20-22. Najczęstsza procedura oczyszczania pojazdów elektrycznych obejmuje serię wirowania i/lub filtracji w celu usunięcia dużych zanieczyszczeń i innych zanieczyszczeń komórkowych, a następnie końcowe ultrawirowanie z dużą prędkością, proces, który jest kosztowny, żmudny i niespecyficzny^14,23,24. Niestety, technologiczna potrzeba szybkiej i niezawodnej izolacji pojazdów elektrycznych o zadowalającej czystości i wydajności nie została jeszcze zaspokojona.

Opracowaliśmy papierowe urządzenie do immunoaffinity, które zapewnia prosty, oszczędzający czas i koszty, a jednocześnie skuteczny sposób izolowania i charakteryzowania podgrup EVs²². Papier celulozowy pocięty na określony kształt można układać i laminować za pomocą dwóch arkuszy z tworzywa sztucznego z zarejestrowanymi otworami przelotowymi. W przeciwieństwie do ogólnej strategii określania granicy płynów w urządzeniach na bazie papieru poprzez drukowanie hydrofobowego wosku lub polimerów^25-27, te laminowane wzory papieru są odporne na wiele cieczy organicznych, w tym etanol. Papierowe strefy testowe są modyfikowane chemicznie, aby zapewnić stabilne i gęste pokrycie cząsteczek wychwytujących (np. przeciwciał specyficznych dla celu), które mają wysokie powinowactwo do określonych markerów powierzchniowych w podgrupach EV. Próbki biologiczne mogą być pipetowane bezpośrednio do papierowych stref testowych, a oczyszczone EV są zatrzymywane po etapach płukania. Charakterystykę izolowanych EV można przeprowadzić za pomocą SEM, ELISA i analizy transkryptomicznej.

Protocol

Ogólny schemat procedury operacyjnej przedstawiono na rysunku 1. Stosując praktyki etyczne, pobraliśmy próbki krwi od zdrowych osób i uzyskaliśmy próbki cieczy wodnistej od pacjentów za pośrednictwem Szpitala Ogólnego Weteranów Taichung (TCVGH), Taichung, Tajwan zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez IRB (IRB TCVGH No. CF11213-1).

1. Produkcja urządzeń papierowych

1. Pociąć bibułę chromatograficzną na okręgi o średnicy 5 mm, aby uzyskać taki sam układ, jak 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania. Ułóż te kawałki papieru na kanapie dwoma arkuszami polistyrenu z zarejestrowanymi otworami przelotowymi i laminatem.
2. Zmodyfikuj urządzenia papierowe za pomocą metody koniugacji chemicznej opisanej w poniższych krokach²⁸.
   1. Urządzenia papierowe należy traktować plazmą tlenową (100 mW, 1% tlenu, 30 sekund) w komorze plazmowej.
      UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z 3-merkaptopropylotrimetoksysilanem i estrem N-γ-maleimidobutyryloksysukcynimidu (GMBS), ponieważ są one zarówno wrażliwe na wilgoć, jak i toksyczne. Nosić rękawice ochronne i unikać wdychania lub kontaktu ze skórą i oczami. Trzymaj butelkę bulionową szczelnie zamkniętą i pozwól jej zrównoważyć się do RT przed otwarciem, aby uniknąć kondensacji wody. Alternatywnie, otwórz butelkę z zapasem w wypełnionej azotem torbie lub pudełku na rękawiczki. Porcję rozlać do małych fiolek, aby uniknąć częstego otwierania butelki podstawowej.
   2. Natychmiast inkubować urządzenia papierowe poddane działaniu substancji w 4% (v/v) roztworze 3-merkaptopropylotrimetoksysilanu w etanolu (200 proof) przez 30 minut.
   3. Wypłukać urządzenia papierowe etanolem i inkubować je z 0,01 μmol/ml GMBS w etanolu przez 15 minut.
   4. Spłukać etanolem (200 proof) i inkubować urządzenia papierowe z 10 μg/ml roztworu awidyny w buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. W razie potrzeby przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 4 tygodni.
3. Zwilżyć każdą papierową strefę testową 10 μl PBS zawierającymi 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 3 × 10 minut, a następnie wykryć 10 μl biotynylowanych cząsteczek wychwytujących przez 3 × 10 minut. Stosować przeciwciało anty-CD63 (20 μg/ml w PBS zawierające 1% (w/v) BSA i 0,09% (w/v) azydku sodu) lub aneksynę V (1:20, v/v w buforze wiążącym aneksynę V) jako cząsteczki wychwytujące.
4. Wypłukać niezwiązane przeciwciało anty-CD63 lub cząsteczki aneksyny V za pomocą 10 μl odpowiedniego PBS zawierającego 1% (w/v) BSA lub wiążące roztwory buforowe aneksyny V odpowiednio przez 3 × 1 minutę.

2. Pobieranie i przetwarzanie próbek surowicy i cieczy wodnistej

1. Kolekcja serum.
   1. Zebrać 10 ml krwi obwodowej przez nakłucie żyły do probówek do separacji surowicy i delikatnie odwrócić probówkę pięć razy. Ustaw rurkę w pozycji pionowej i odczekaj 30 minut.
   2. Wirować przy 1 200 × g przez 15 minut. Przenieść surowicę z wierzchniej warstwy do czystej probówki i ponownie odwirować przy 3 000 × g przez 30 minut.
   3. Przepuścić supernatant przez filtr 0,8 μm. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
2. Pobieranie cieczy wodnistej: pobierać próbki cieczy wodnistej od pacjentów zdiagnozowanych przez okulistę bezpośrednio podczas zabiegów inwazyjnych i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

3. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

1. Próbki należy umieścić w każdej strefie testowej na papierze z szybkością 5 μl/min.
2. Spłukać niezwiązane EV 10 μl odpowiedniego PBS zawierającego 1% (w/v) BSA lub roztwory buforu wiążącego anektynę V przez 3 × 1 minutę dla urządzeń papierowych funkcjonalizowanych odpowiednio przeciwciałem anty-CD63 lub cząsteczkami aneksyny V. Wykonaj następujące dalsze testy.

4. Przykład testu 1: Skanowanie elektromikrofotografii

1. Utrwal EV uchwycone na funkcjonalizowanej strefie testowej na papierze za pomocą 10 μl 0,5× utrwalacza Karnovsky'ego przez 10 minut.
2. Przepłukać próbki dużą ilością PBS przez 2 × 5 minut.
3. Odwodnić próbki kolejno 35% etanolem przez 10 minut, 50% etanolem przez 2 × 10 minut, 70% etanolem przez 2 × 10 minut, 95% etanolem przez 2 × 10 minut i 100% etanolem przez 4 × 10 minut.
4. Krytyczne suszenie i napylanie próbek pokryć palladem/złotem i zbadać za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego działającego przy niskim napięciu przyspieszenia elektronów (~ 5 kV).

5. Przykład testu 2: Test ELISA na papierze

1. Dodać 5 μl roztworu zawierającego pierwszorzędowe przeciwciało anty-CD9 w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS do każdej strefy testowej zawierającej wychwycone EV. Odczekaj 1 min.
2. Przepłukać próbki 30 ml PBS, wstrząsając z prędkością 100 obr./min przez 30 sekund.
3. Dodać 5 μl roztworu zawierającego przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczeniu 1:1 000 w PBS i odczekać 1 minutę.
4. Przepłukać próbki 30 ml PBS, wstrząsając z prędkością 100 obr./min przez 30 sekund.
5. Dodać 5 μl podłoża kolorymetrycznego zawierającego stosunek objętościowy nadtlenku wodoru 1:1 i 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) i zeskanować za pomocą skanera biurkowego.

6. Przykład testu 3: Izolacja RNA

1. Zanurzyć próbki w 35 μl środka do izolacji RNA na bazie poliwinylopirolidonu i 265 μl buforu do lizy/wiązania w celu lizy wychwyconych EV. Wiruj energicznie.
2. Do lizatu dodać 30 μl homogenatu znajdującego się w zestawie izolacyjnym. Energicznie wirować i umieszczać na lodzie na 10 minut.
3. Ekstrahować RNA za pomocą rozdzielania kwasem fenolowo-chloroformowym opisanym w poniższych krokach.
   1. Pobrać 330 μl chloroformu fenolowego z dolnej warstwy butelki i dodać do homogenatu/lizatu. Wiruj energicznie.
   2. Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut. Przenieść fazę wodną (górną) do czystej probówki i zanotować usuniętą objętość.
4. Wytrącić całkowity RNA ze 100% etanolem o objętości 1,25 razy większej niż objętość fazy wodnej usuniętej w poprzednim etapie i zebrać RNA w roztworze elucyjnym podgrzanym do 95 °C.
5. Zagęścić i dalej oczyścić RNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA zgodnie z protokołem producenta.

Results

Zdolność urządzenia papierowego do skutecznego izolowania podgrup EV zależy od jego czułego i specyficznego rozpoznawania znaczników powierzchni EV. Stabilną modyfikację włókien papierowych za pomocą cząsteczek wychwytujących uzyskuje się dzięki zastosowaniu chemii awidyny-biotyny, jak opisano w innym miejscu^28-30. Skuteczność koniugacji chemicznej i metody fizsorpcji ocenia się za pomocą odczytów opartych na fluorescencji. Papierowe strefy testowe przygotowuje się zgodnie z krokiem 1 protokołu, z wyjątkiem cz...

Discussion

Najważniejszymi krokami dla pomyślnej izolacji podgrup pęcherzyków zewnątrzkomórkowych są: 1) dobry wybór papieru; 2) stabilne i wysokie pokrycie cząsteczek wychwytujących na powierzchni włókien papieru; 3) właściwe obchodzenie się z próbkami; oraz 4) ogólna praktyka higieny laboratoryjnej.

Porowate materiały zostały wykorzystane w wielu niedrogich i niewymagających użycia sprzętu testach. Mogą charakteryzować się regulowanym rozmiarem porów, wszechstronną funkcjonalnością, niskim kosztem i wy...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bibuła chromatograficzna	GE Healthcare Life Sciences	3001-861	Whatman® Papier celulozowy klasy 1
(3-merkaptopropylo) trimetoksysilan	Sigma Aldrich	175617	Ta substancja chemiczna reaguje z wodą i wilgocią i powinna być stosowana w wypełnionej azotem torbie na rękawice. Unikać kontaktu z oczami i skórą. Nie wdychać oparów ani wdychać oparów.
Etanol	Fisher Scientific	BP2818	Absolut, 200 Proof, klasa biologii molekularnej
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	BioShop Canada Inc.	ALB001	Często określany jako frakcja Cohna V.
N-γ-maleimidobutyryloksy sukcynimidu (GMBS)	Pierce Biotechnology	22309	GMBS jest środkiem sieciującym aminę do sulfhydrylu. GMBS jest wrażliwy na wilgoć.
Avidin	Pierce Biotechnology	31000	NeutrAwidyna ma 4 miejsca wiązania biotyny, a jej wartość pI wynosi 6,3, co jest bardziej neutralne niż natywna awidyna
Biotynylowany mysz anty-ludzki anty-CD63	Ancell	215-030	klon AHN16.1/46-4-5
biotynylowana aneksyna V	BD Biosciences	556418	Annxin V ma wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny (PS)
Pierwotnej anty-CD9 i wtórnej przeciwciało	System Biosciences	EXOAB-CD9A-1	Przeciwciałem drugorzędowym jest chrzanowo sprzężone z peroksydacją chrzanu
Probówki do separacji surowicy	BD Biosciences	367991	Aktywator skrzepu i żel do separacji surowicy
Aneksyna V bufor	wiążący BD Biosciences	556454	10x; przed użyciem rozcieńczyć do 1x.
Zestaw odczynników do substratów TMB	BD Biosciences	555214	Zestaw zawiera nadtlenek wodoru i 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB)
[nagłówek]
Zestaw do izolacji RNA	Life Technologies	AM1560	MirVana Pomoc
w izolacji RNA na bazie poliwinylopirolidonu	Life Technologies	AM9690	Środek do izolacji roślinnego RNA zawiera poliwinylopirolidon (PVP), który wiąże się z polisacharydami.
Zestaw do czyszczenia RNA	Qiagen Inc.	74004	Zestaw do oczyszczania RNA MinElute przeznaczony jest do oczyszczania do 45  μ g RNA.
Komora plazmowa	March Instruments	PX-250
Skaningowy mikroskop elektronowy	Hitachi Sp. z o.o.	S-4300
	Hewlett-Packard Company	Photosmart B110	Wykonano 8-bitowe kolorowe obrazy. Można również korzystać z aparatów fotograficznych i smartfonów.
System rejestracji obrazu	J& H Technology Co	GeneSys G:BOX Chemi-XX8	wykonano 16-bitowe obrazy fluroscecji. Można również stosować mikroskopy fluroscecyjne.