Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Białka są niezbędnymi elementami życia komórkowego, a więc w większej skali organizmu. Zapewniają one większość funkcji komórkowych, w tym strukturę, transport, katalizę reakcyjną, regulację, ekspresję genów itp. Ich ekspresja jest wynikiem złożonego mechanizmu translacji umożliwiającego przekształcenie mRNA w białko. Translacja jest poddawana różnym kontrolom w celu adaptacji i regulacji ekspresji genów zgodnie z potrzebami komórki, podczas rozwoju i różnicowania, starzenia się, stresów fizjologicznych lub objawów patologicznych.

Translacja jest podzielona na 3 fazy (inicjacja, wydłużenie i zakończenie) i prezentuje 3 systemy translacji inicjacyjnej, aby odpowiedzieć na te potrzeby: zależne od kapu, niezależne od czapeczki poprzez struktury wewnętrznego segmentu wejściowego rybosomu (IRES) i wzmacniacze translacji niezależne od czapeczki (CITE).

Większość eukariotycznych mRNA ulega translacji w sposób zależny od czapeczki za pośrednictwem kapu 7-metyloguanozyny 5'-trifosforanu, który służy jako cecha rozpoznawcza podczas syntezy białek. Ta czapeczka wiąże się z eIF4E, składnikiem kompleksu eIF4F z eIF4G1 i eIF4A. W połączeniu z innymi partnerami, takimi jak białko wiążące poli(A) (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA^Met, te czynniki inicjacji translacji umożliwiają krążenie mRNA i poprawiają jego dostępność do kompleksu form 43S do momentu rozpoznania kodonu inicjacji AUG¹. Wydarzenie to odpowiada końcowi inicjacji tłumaczenia, tj. pierwszemu krokowi tłumaczenia.

Translacja niezależna od czapki jest używana przez kodowanie mRNA dla niezbędnych białek w warunkach stresu, które indukują na przykład proliferację komórek i apoptozę. Mechanizm ten obejmuje struktury drugorzędowe w nieulegającym translacji regionie mRNA 5' (UTR) zwanym IRES, karboksylowo-końcowym końcu eIF4G1 związanym z eIF4A i kompleksem 43S. Wiązanie tego kompleksu preinicjacyjnego 43S z IRES inicjuje translację niezależną od czapeczki bez potrzeby stosowania czynnika eIF4E^2,3.

Na koniec, inny mechanizm translacji, który wciąż nie jest dobrze poznany, wspiera tę niezależną od czapeczki aktywność translacyjną w warunkach stresu za pośrednictwem struktur CITE zlokalizowanych w mRNA UTR ⁴.

Poprzez te różne sposoby translacji, różniące się etapami inicjacji, translacja odgrywa kluczową rolę w homeostazie komórkowej i każda zmiana w jednym z tych procesów wpłynęłaby na organizm z małymi lub dużymi efektami. Rzeczywiście, inicjacja jest krokiem ograniczającym szybkość regulującym prawidłowe procesy translacji mRNA do białek, a zatem jest celem licznych punktów kontrolnych i regulacyjnych⁵. Niezależnie od tego, czy chodzi o te ostatnie, czy o składniki tych procesów, jeśli jeden z nich okaże się wadliwy, zaburzy ustaloną równowagę w komórce, a tym samym może doprowadzić do stanów patologicznych. W tym kontekście, mutacje w czynnikach translacyjnych są zaangażowane w kilka zaburzeń, w tym zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak "leukoencefalopatia ze zanikającą istotą białą" (podjednostka eIF2B1-5)⁶, w zespole Walcotta-Rallisona (EIF2AK3 genu kodującego PERK)⁷, potencjalnie w chorobie Parkinsona (eIF4G1 p.R1205H)⁸. Dlatego ważne jest prowadzenie badań komórkowych i molekularnych tych zmutowanych białek, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat rozwoju choroby i ogólnego procesu inicjacji translacji.

Aby przeprowadzić te badania, konieczne jest wybranie najbardziej odpowiednich modeli do obserwacji konsekwencji tych mutacji. Oocyty Xenopus laevis są szczególnie dobrze przystosowane ze względu na swoje właściwości fizjologiczne i biochemiczne: synchroniczność fizjologiczną (zablokowana w fazie G2 cyklu komórkowego), wysoką zdolność syntezy białek (200-400 ng/dobę/oocyt), dużą liczbę pobranych oocytów od tego samego zwierzęcia (800-1000 oocytów/samicę) oraz wielkość komórek (1,2-1,4 mm średnicy), co ułatwia ich manipulację. Mikroiniekcję oocytów Xenopus ze zsyntetyzowanym mRNA można łatwo wykonać w celu przeanalizowania etapów translacji. Z tego punktu widzenia ma to inne zalety. Biorąc pod uwagę szybkość progresji mejozy i translacji po mikroiniekcji mRNA (~ 24 godziny), oocyt Xenopus reprezentuje szybki system w porównaniu z odtworzonymi systemami komórkowymi (ekstrahowanymi z E. coli, kiełków pszenicy lub retikulocytów królika...), w których mRNA ulega translacji ze zmniejszoną szybkością translacji i z mniejszą prędkością. Tak więc skutki mutacji wprowadzonej w mRNA będą szybko obserwowalne i łatwo zbadane w kilku oocytach. Kolejną zaletą oocytów Xenopus jest to, że matczyne mRNA są utajone, a translacja białek jest blokowana przed stymulacją progesteronu. Dodanie progesteronu jest zatem dobrym sposobem kontrolowania indukcji translacji. Poliadenylacja cytoplazmatyczna nie zachodzi podczas oogenezy. Rozpoczyna się podczas dojrzewania oocytów w oocytach stymulowanych progesteronem w kolejności czasowej i trwa przez cały wczesny rozwój i może być wykorzystany do badania różnych etapów translacji.

Poliadenylacja mRNA mos jest jedną z pierwszych i należy wraz z Aurora A/Eg2, mRNA Histone-Like B4 do klasy genów "wczesnego dojrzewania", jak zdefiniowano w Charlesworth et al. (2004)⁹. Indukcja translacyjna "późnego" mRNA, takiego jak cyklina A1 i cyklina B1, następuje w czasie rozpadu pęcherzyków rozrodczych (GVBD). MRNA Mos koduje kinazę białkową serynowo-treoninę. Jego translacja jest kluczowa, ponieważ indukuje kaskadę kinazy MAP, która pośrednio aktywuje dojrzewanie oocytów. Rzeczywiście, w odpowiedzi na progesteron, poliadenylacja mRNA mos jest wzmacniana w procesie obejmującym białka regulatorowe Aurora A / Eg2 i inne białka wiążące RNA z 3'UTR mRNA mos. Ta zwiększona poliadenylacja mRNA mos prowadzi do wzrostu poziomu białka mos, co z kolei aktywuje MEK1. Proces ten pośredniczy w aktywacji kinazy regulowanej sygnalizacją zewnątrzkomórkową 2 (ERK2) (ryc. 1). Ta kaskada sygnalizacyjna może następnie wywołać czynniki promujące dojrzewanie fazy M, kompleks utworzony przez cyklinę B i kinazę Cdc2, i ostatecznie doprowadzić do wznowienia mejozy.

Dlatego w oocytach Xenopus laevis, badanie matczynego mRNA, takiego jak mos, może być łatwo wykorzystane do sprawdzenia ich translatowalności z kilkoma punktami końcowymi, od ich efektywnej poliadenylacji do translacji kilku składników sygnalizacyjnych mos, w tym również do określenia wskaźnika GVBD. System ten jest zatem interesujący dla oceny pierwszych konsekwencji mutacji w czynnikach inicjacji translacji bez ingerencji nowo transkrybowanego mRNA lub wydajności transfekcji, co często występuje w badaniach nad komórkami eukariotycznymi.

Tutaj ustalany jest protokół, w którym zmutowane mRNA eIF4G1 są mikrowstrzykiwane do oocytów Xenopus laevis i testowana jest translacja mRNA matki. W przypadku defektu progresji GVBD stwierdza się poliadenylację mRNA mos, która jest niezbędna do progresji przez cykl komórek mejotycznych oocytu oraz do późniejszej translacji mRNA wczesnej i późnej klasy. Fosforylacja Aurora A/Eg2 i ERK jest również badana w celu potwierdzenia konsekwencji deregulacji mos. W związku z tym oocyty Xenopus stanowią prosty sposób analizy różnych etapów translacji mRNA.

Wszystkie eksperymenty Xenopus zostały przeprowadzone w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu Lille 1 zgodnie z zasadami wytycznych Rady Wspólnoty Europejskiej (86/609/EWG) dotyczących eksperymentów na zwierzętach laboratoryjnych. Protokół dotyczący zwierząt został zatwierdzony przez lokalną instytucjonalną komisję rewizyjną (Comité d'Ethique en Experimentation Animale Nord-Pas-De-Calais, CEEA 07/2010).

1. Postępowanie z oocytami

1. Przygotować roztwór znieczulający: rozpuścić 1 g sproszkowanego sulfonianu metanu trikainy w 1 litrze sterylnej wody.
2. Zanurz samicę Xenopus laevis w tym roztworze, przykryj zlewkę, aby uniknąć ucieczki i odczekaj około 45 minut, aż zwierzę zostanie całkowicie uspokojone (bez żadnej reakcji na uszczypnięcie nogi).
3. Umyj żabę mydłem i spłucz wodą z kranu, a następnie połóż zwierzę na grzbiecie na czystej folii aluminiowej.
4. Zacisnąć skórę bocznej części brzucha i na poziomie jajników za pomocą kleszczy. Wykonaj nacięcie o długości około 1 cm nożyczkami oczyszczonymi przed użyciem etanolem 70%. Upewnij się, że przekrój jest wystarczająco głęboki i sięga do leżącej pod nim ściany brzucha, aby umożliwić wycięcie tkanki jajnikowej, w której znajduje się kilka oocytów w różnych stadiach rozwoju.
5. Wyciąć płatki jajników, umyć je 4 razy na szalce Petriego (50 mm) z pożywką ND96 (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 5 mM HEPES dostosowanymi do pH 7,4 z NaOH, uzupełnionymi 50 μg/ml streptomycyny/penicyliny, 225 μg/ml pirogronianu sodu, 30 μg/ml inhibitora trypsyny sojowej, 1 μl/ml tetracykliny) w celu usunięcia wszelkich śladów krwi i zanieczyszczeń.
   Uwaga: Tetracyklina pozwala na optymalną konserwację i dobrą regenerację po zabiegu mikroiniekcji.
6. Przechowywać je na przykrytej szalce Petriego, zanurzonej w pożywce w temperaturze 14 °C, pozwalając na ich przechowywanie przez tydzień.
7. Zszyj ścianę brzucha i skórę wchłanialną nicią weterynaryjną i igłą do szycia (konieczne będą 3 lub 4 szwy).
8. Umieść zwierzę w zlewce bez wody i zwilż skórę wodą z kranu, aż żaba znów zacznie się poruszać. Przykryj zlewkę, aby zapobiec ucieczce.
9. Ostrożnie oddziel płaty jajników w pożywce w grupach od 5 do 10 oocytów, używając 2 par kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym o 10-krotnym powiększeniu. Selekcjonować oocyty w VI stadium. Można je rozpoznać po i) ich kształcie i kolorze z brązowym pigmentowanym słupkiem zwierzęcym i żółtym słupkiem wegetatywnym oddzielonym przezroczystym paskiem, ii) ich rozmiarem wyższym niż 1,2 mm średnicy¹⁰.
10. Inkubować wybrane oocyty w roztworze kolagenazy (1 mg/ml kolagenazy A z Clostridium histolyticum, rozpuszczonej w ND96 bez tetracykliny) na szalce Petriego pod delikatnym mieszaniem przez 45 minut, aby ułatwić opróżnienie oocytów (kolagenaza trawi połączenia oocyt/komórki pęcherzykowe). Przepłukać oocyty 3 lub 4 razy pożywką ND96 o temperaturze 14 °C.
    Uwaga: Nie należy inkubować oocytów krócej lub dłużej niż 45 minut ze względu na ryzyko zniszczenia białek powierzchniowych oocytów i spowodowania słabej żywotności. Leczenie kolagenazą może wywołać samoistną GVBD.
11. Inkubować oocyty w pożywce przez 3-4 godziny. Usunąć komórki pęcherzykowe za pomocą cienkiej pęsety pod lornetką i utrzymywać je w temperaturze 19 °C w pożywce ND96.

2. Przygotowanie syntezy mRNA

1. Linearyzować 5 μg następujących plazmidów przez trawienie enzymatyczne przy użyciu enzymu PmeI.
   UWAGA: pcDNA6.2/V5-DEST zawierający 1599 aminokwasów eIF4G1 cDNA typu dzikiego (eIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2/V5-DEST zawierający dominujący ujemny cDNA eIF4G1 (eIF4G1-DN) z mutacjami c.2105T>G c.2106A>C, c.2120->G, c.2122T>A, 2125T>- i c.2126T>G w obszarze oddziaływania między eIF4G1 i eIF4E w pozycji 612 do 618 odpowiedniego białka zaburzającego oddziaływanie między eIF4G1 i eIF4E⁸, pcDNA6.2/C-EmGFP zawierający acetylotransferazę chloramfenikolu (GFP). Przygotować 2 mieszaniny dla każdego z 3 plazmidów: pierwsza zawiera enzym PmeI, a druga bez enzymu jako kontrolę.
2. Wytrącić plazmidowe DNA za pomocą klasycznej procedury etanolowej i ponownie zawiesić go w 20 μl H₂O bez nukleaz.
3. Określ jego stężenie za pomocą spektrofotometru. Stężenie powinno być większe niż 150 ng/μl do transkrypcji cRNA.
4. Uruchomić 1 μl próbek i ich kontroli z 5 μl buforu ładującego na 0,8% żelu agarozowym, aby zweryfikować linearyzację plazmidu.
5. Użyj zestawu do transkrypcji in vitro i oczyszczania cRNA zgodnie z instrukcjami producenta. Transkrybowane cRNA są ponownie zawieszane w 20 μl H₂O, wolnego od nukleaz. W razie potrzeby próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C.
6. Przygotować bufor migracyjny MOPS 10X zawierający 0,2 M MOPS (pH 7,0), 20 mM octanu sodu i 10 mM EDTA (pH 8,0). Sterylizuj roztwór za pomocą filtra 0,45 μm. Przechowywać roztwór chroniony przed światłem w temperaturze pokojowej, aby uniknąć utleniania roztworu.
7. Wyczyść zbiornik do elektroforezy kolejno NaOH, HCl i dokładnie przepłucz podwójnie przefiltrowaną wodą w celu uzyskania O/N, aby uniknąć RNazy i zapobiec degradacji RNA.
8. Odlać 1,5% żel agarozowy zawierający MOPS i formaldehyd. Ogrzewać aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy i pozostawić do ostygnięcia do temperatury 55 °C. Pod wyciągiem dodać 0,1 objętości MOPS 10X, 6,6% formaldehydu i 4 μg bromku etydyny (10 mg/ml). Wlej żel pod wyciąg i odczekaj około 1 godziny, aż żel stwardnieje.
   Uwaga: Formaldehyd i bromek etydyny są toksyczne.
9. Przygotować próbki do migracji w probówce o pojemności 0,2 ml zawierającej 1 μl cRNA, 8,8% formaldehydu, 60% formamidu i 0,1 objętości MOPS 10X. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 70 °C i umieścić probówki na lodzie na 10 minut. Odwirować próbki przez kilka sekund przy 5 000 x g. Dodać 2 μl buforu ładującego żel.
   Uwaga: Formamid jest toksyczny.
10. Uruchom próbki przez 20 minut przy napięciu 90 V. Namocz żel w wolnym od nukleaz_H2OO / N, aby odbarwić żel przed analizą w celu sprawdzenia jakości cRNA.
11. Oznaczyć stężenie cRNA za pomocą spektrofotometru i przechowywać je w temperaturze -80 °C.

3. Mikroiniekcja syntetyzowanego RNA i stymulacja dojrzewania oocytów

1. Przygotuj niezbędny sprzęt do mikroiniekcji oocytów. Użyj ściągacza do mikropipet, aby wyciągnąć małą szklaną kapilę. Pod mikroskopem stereoskopowym oderwij koniec naczynia włosowatego pęsetą, aby uzyskać koniec. Napełnij mikropipetę kapilarną olejem mineralnym za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z filtrem miliporowym 0,45 μm na przeciwległym końcu. Zamontuj mikropipetę na pipecie do mikroiniekcji. Wybierz dokładną mikropipetę skalibrowaną przez producenta, aby zapewnić dobrą dokładność, gdy jest używana z odpowiednią szklaną kapilarą.
2. Wykonać mikroiniekcję 1-2 godziny po odmuleniu, co jest niezbędnym opóźnieniem do odzyskania oocytów na oocytach utrzymywanych w temperaturze 14 °C. Użyj szalek Petriego z dnem zeskrobanym kleszczami, aby stworzyć adhezyjną powierzchnię dla oocytów i wypełnij je pożywką ND96.
3. Ułożyć oocyty wzdłuż zeskrobanego pasa na szalce Petriego, umożliwiając kolejne wstrzykiwanie oocytów za pomocą mikropipety kapilarnej pod kątem 45 °C.
4. Wstrzyknąć w strefę równikową oocytu, poniżej pigmentowanego obszaru zwierzęcia, aby uzyskać optymalną dyfuzję próbek w cytoplazmie. Wkładaj tylko najcieńszą część końcówki kapilarnej na głębokość około 150-200 μm.
5. Wstrzyknąć 30 ng cRNA uzyskanego odpowiednio z różnych plazmidów w objętości 60 nl do pierwszego oocytu. Po wstrzyknięciu odczekaj 5-10 sekund przed usunięciem końcówki kapilarnej, aby uniknąć ucieczki próbki (Rysunek 2A).
   Uwaga: Nie przekraczać 120 nl. Wstrzykiwać tak wolno, jak to możliwe. Zalecana jest kontrola wodą destylowaną.
6. Przesuń ręcznie szalkę Petriego, aby wstrzyknąć następny oocyt.
   Uwaga: Upewnij się, że końcówka nie jest zatkana, generując mały impuls z roztworu kąpieli po 2 do 3 mikroiniekcjach.
7. Przenieść wstrzyknięte oocyty do 24 dołków (10 oocytów / basenik) wypełnionych 3 ml świeżej pożywki ND96 i pozostawić je w temperaturze 19 °C.
8. Inkubować oocyty w ND96 z progesteronem (PG) (2 μg/ml) w celu wywołania dojrzewania mejotycznego (GVBD) w temperaturze 19°C, 15 godzin lub 4 godzin po mikrowstrzyknięciu poliadenylowanych cRNA uzyskanych odpowiednio z pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 i pcDNA6.2 / C-EmGFP stosowanych jako kontrola (Figura 2A).
   Uwaga: Jednoczesne wstrzyknięcie markera fluorescencyjnego z cRNA jest dobrym narzędziem do zapewnienia, że cRNA zostało wstrzyknięte i pozostało w oocycie. Wykonaj takie wstępne eksperymenty przy użyciu interesującego cRNA ze znacznikiem GFP.
9. Mikroiniekcja, jak w #3,5 różnych proporcjach (1:3; 2:2; 3:1) poliadenylowanych cRNA eIF4G1-WT i eIF4G1-DN w celu zbadania efektu translacji cRNA eIF4G1-WT na zmutowany fenotyp (Figura 2D).

4. Określenie rozpadu pęcherzyków zarodkowych

1. Policz liczbę dojrzałych oocytów po stymulacji PG, obserwując obecność białej plamki na czarnym biegunie zwierzęcia za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Powtarzaj liczenie co godzinę aż do dwudziestej czwartej godziny (Rysunek 2B, 2C).

5. Analiza Western Blot (WB)

1. Homogenizować grupę 10 oocytów ruchami w przód i w tył za pomocą końcówki mikropipety, w temperaturze 4 °C w 200 μl w następującym buforze: 50 mM Hepes, pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05% SDS, 5 mM MgCl₂, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 10 mg/ml leupeptyny, 10 mg/ml aprotyniny, 10 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej, 10 mg/ml benzamidyny, 1 mM PMSF, 1 mM wanadan sodu.
2. Odwirować próbki przez 15 minut przy 10 000 x g w celu usunięcia frakcji lipidowej (górna faza) i membranowej (dolna faza). Zebrać frakcję cytoplazmatyczną, przechowywać podwielokrotność w celu określenia stężenia białka i uzupełnić pozostałą część za pomocą Laemmli lub buforu do próbek Bis-Tris (1:1).
   Uwaga: Żele Bis-Tris i bufor ładujący mają bardziej neutralne pH, które chroni białka przed hydrolizą
3. Podgrzewać 20 μg próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Załadować każdą próbkę do dołków żelu akrylamidowego. Umieść żel w zbiorniku z odpowiednim buforem.
4. Wykonać elektroforezę przez 1 godzinę przy napięciu 200 V.
5. Zrealizuj WB w TBS pH 8,0 (Tris HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1%, zawierający 10% albuminy surowicy bydlęcej) za pomocą koziego anty-Aurora A/Eg2 (1:3,000, 2 godz.) lub za pomocą króliczego anty-Aurora A/Eg2-P (1:1,000, O/N w 4 °C), mysiego anty-ERK2 (1:3,000, 2 godz.), koziego anty-ERK2-P (Tyr204) (1:3,000, 2 godz.), króliczego anty-mos (1:5,000, 4 godz.), królicze przeciwciała anty-GFP (1:3 000, 2 godz.). Użyj przeciwciał mysich anty-V5 (1:10 000, 2 godz.) i króliczych anty-Rsk (1:1 000, 2 godz.) (jako kontrole obciążenia).
6. Przemyć membranę 3 razy przez 10 minut w TBS-Tween i inkubować przez 1 godzinę z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym peroksydazą chrzanową przeciwko myszom, królikom lub kozom (IgM) w rozcieńczeniach odpowiednio 1:5 000, 1:7 500 i 1:5 000.
7. Wykonaj 3 płukania po 10 minut w TBS-Tween i wykryj kompleksy antygen-przeciwciała za pomocą zaawansowanego systemu wykrywania ECL.

6. Test poliadenylacji

1. Pobrać próbkę 5 oocytów na stan w 1,5 ml. Umyj je 1 ml PBS 1X bez nukleaz (pH 7,4). Poniższe kroki zostaną wykonane pod wyciągiem.
2. Ekstrakcja RNA przy użyciu klasycznej procedury organicznej (patrz instrukcje producenta).
3. Odzyskać RNA przez odwirowanie (10 000 x g) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i wysuszyć RNA na powietrzu przez 10 minut.
4. Zawiesić osad RNA w 30 μl H₂O wolnym od nukleaz.
5. Weź 15 μl próbek do nowej probówki i dodaj 85 μl H₂O. Oczyść te próbki, aby poprawić ich jakość na kolumnie krzemionki zgodnie z instrukcjami producenta. Eluuj RNA za pomocą 30 μl H₂O wolnego od nukleaz
6. Uruchom 1 μl próbek z 5 μl buforu ładującego na 0,8% żelu agarozowym, aby sprawdzić integralność RNA.
7. Określić stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
8. Przygotować 2 mieszaniny ligacyjne na każdy warunek (tj. eIF4G1-WT, eIF4G1-DN i kontrolę_H2O) z następującymi odczynnikami: 10 U ligazy RNA, 0,1 objętość buforu 10X, 1 mM ATP, 10% PEG8000 50%, 0,1 μg startera P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3')¹¹ i doprowadzić końcową objętość do 10 μl za pomocą H₂ bez nukleazO. Dodać do pierwszej mieszaniny RNA uzyskane z oocytów bez stymulacji PG, a do drugiej mieszaniny RNA uzyskane z oocytów stymulowanych PG.
9. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie przez 20 minut w temperaturze 65 °C w celu inaktywacji enzymu.
10. Użyj zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA (RT). Przygotować mieszaninę RT na probówkę: 0,1 objętości buforu 10X RT, 0,1 μg startera P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTTTT)¹⁰, 4 mM mieszaniny dNTP, 50 U odwrotnej transkryptazy i uzupełnić H_2Obez nukleaz do końcowej objętości 10 μl. Dodać 10 μl uzyskanej wcześniej reakcji podwiązania. Wykonać RT w warunkach opisanych przez producenta.
11. Przygotować mieszaninę reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) na probówkę: 0,1 objętość buforu 10X, 1,5 mM MgCl₂, 133 μM mieszanina dNTP, 0,2 μM specyficzny starter, 0,2 μM starter P2, 0,025 μM polimeraza Taq, 1 μl cDNA i uzupełnić H₂O bez nukleaz do końcowej objętości 50 μl. Wykonaj PCR w następujących warunkach: 50 °C przez 2 min, 95 °C przez 10 min, [95 °C przez 1 min, 56 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 30 sekund]*40 cykli, 72 °C przez 10 min⁹. Konkretne startery są następujące: mos, GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histone-like B4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyklina A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cyklina B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT⁹.
12. Przygotuj 3% żel agarozowy. Dodać do każdego produktu PCR 10 μl buforu ładującego. Uruchom żel z 10 μl próbek pod napięciem 110 V, aby uzyskać optymalną migrację. Analizuj żel po 10 i 20 minutach, aby zaobserwować zmianę wielkości odzwierciedlającą długość ogona poli(A), a tym samym dojrzewanie RNA, co jest warunkiem wstępnym ich translacji.

Kinetyczne dojrzewanie oocytów Xenopus i określenie procentowej zawartości oocytów GVBD po 24 godzinach stymulacji PG (Ryc. 2B, 2C):

W celu zbadania translacyjnych konsekwencji mutacji eIF4G1-DN, odpowiedź na PG w oocytach Xenopus laevis mikrowstrzykniętych cRNA eIF4G1-DN jest porównywana z eIF4G1-WT i innymi warunkami kontrolnymi (H2O, GFP). Kontrole umożliwiają ocenę częstości występowania mikroiniekcji oocytów niezależnie od charakteru wstrzykniętego cRNA lub nadekspresji eIF4G1.

Kinetyczne dojrzewanie 10 oocytów charakteryzujące się warunkami kontroli mikroiniekcji (H2, O i GFP) jest podobne do WT, a liczba poddawanych GVBD jest bardzo zbliżona do siebie po 12 i 24 godzinach od stymulacji PG (Rysunek 2B). Po 24 godzinach dojrzewanie oocytów osiąga 95,7% dla WT, 97,1% dlaH2Oi 97,5% dla GFP (ryc. 2C). Tak więc mikroiniekcjeH2Olub kontrolnych cRNA lub cRNA eIF4G1 mają niewielki wpływ na uwalnianie mejozy oocytów. I odwrotnie, 8 godzin po stymulacji PG liczba oocytów, którym mikrowstrzyknięto cRNA eIF4G1-DN poddawane GVBD, jest opóźniona w porównaniu z cRNA eIF4G1-WT (Figura 2B). Uwalnianie mejozy eIF4G1-DN w porównaniu z oocytami eIF4G1-WT znacznie zmniejsza się o 85,8% i 77,4% odpowiednio po 12 godzinach i 24 godzinach od stymulacji PG (ryc. 2C). Warto również zauważyć, że po 13 godzinach od stymulacji PG liczba dojrzałych oocytów osiąga maksimum dla wszystkich warunków z wyjątkiem eIF4G1-DN, dla którego maksimum osiąga się dopiero po 20 godzinach od stymulacji PG. Zatem obecność mutacji eIF4G1-DN prowadzi do gorszego uwalniania mejozy oocytów w porównaniu z eIF4G1-WT.

Przywrócenie dojrzewania oocytów w obecności eIF4G1-DN dzięki eIF4G1-WT (Rysunek 2D):

Aby określić, czy mikroiniekcja cRNA eIF4G1-DN upośledza czy blokuje dojrzewanie oocytów, różne proporcje cRNA eIF4G1-WT i eIF4G1-DN są współmikrowstrzykiwane. W tych warunkach obserwuje się wzrost dojrzewania oocytów wraz ze wzrostem poziomu cRNA eIF4G1-WT i spadkiem cRNA eIF4G1-DN. Podczas gdy dojrzewanie obserwuje się w 17,5% oocytów po jednej dawce cRNA eIF4G1-DN, odsetek ten osiąga 76,7% przy jednoczesnej mikroiniekcji 3 dawek cRNA eIF4G1-WT, a obecność jednej dawki cRNA eIF4G1-WT prowadzi do 95% dojrzewania oocytów. Eksperyment ten pokazuje, że wada dojrzewania oocytów Xenopus z mikroiniekcją eIF4G1-DN nie jest nieodwracalna i może być częściowo przywrócona.

Białka sygnalizacyjne ekspresji mos obserwowane na WB jako wskaźnik zdolności translacyjnej przed i po stymulacji PG (Rysunek 2E):

Poziom białka znacznika V5 w oocytach wyrażających eIF4G1-WT i eIF4G1-DN jest podobny, co odzwierciedla podobną skuteczność mikroiniekcji. Poziom białka Rsk stosowanego do kontroli obciążenia białka jest również podobny we wszystkich warunkach przed i po stymulacji PG. Ekspresja białka GFP jest również obecna w oocytach mikroiniekowanych cRNA GFP stymulowanych lub nie PG. Dane te wskazują, że mikroiniekcja i nadekspresja eF4G1 nie zaburzają translacji GFP. Jednak nie jest wykrywalna ekspresja białka GFP przed i po stymulacji PG w oocytach wykazujących ekspresję eIF4G1-DN. Zgodnie z oczekiwaniami, przy braku stymulacji PG nie wykrywa się endogennej ekspresji mos. Ponadto ekspresję mos obserwuje się w warunkach kontrolnych eIF4G1-WT iH2Opo stymulacji PG zgodnie z wcześniejszymi wynikami pokazującymi, że nadekspresja eIF4G1-WT ma niewielkie konsekwencje dla endogennego mos16. I odwrotnie, po stymulacji PG zauważalny jest znaczny spadek ekspresji mos.

Testowana jest również ekspresja białek niektórych składników kaskady sygnalizacyjnej mos. Na przykład białko Aurora A/Eg2 działa przed indukcją mos i nie obserwuje się deregulacji jego białka ani jego fosforylowanej formy indukowanej po stymulacji PG. I odwrotnie, deregulację fosforylacji ERK2 indukowaną przez mos obserwuje się w obecności eIF4G1-DN.

Te wyniki sugerowały, że na endogenną ekspresję mos RNA do białka i aktywację ERK2 zależną od mos wpływa ekspresja eIF4G1-DN.

poliadenylacja mRNA (Rysunek 2F):

Przetestowano poliadenylację kilku mRNA (mos, Cyklina A1, Cyklina B1 i B4 podobna do histonów) niezbędnych do odzyskania mejozy oocytów Xenopus. Przeprowadzone badanie pozwala określić, czy po stymulacji PG występuje wzrost wielkości amplimeru odpowiadający długości ogona poli(A) mRNA. Rzeczywiście, przy stymulacji PG dodanie ogona poli(A) obserwuje się we wszystkich warunkach, w tym w mutacji eIF4G1-DN.

Rysunek 1. Schematyczny przegląd aktywacji kaskadowej MAPK. Po stymulacji hormonalnej przez PG zachodzą szybkie zmiany w aktywności kilku enzymów, w tym enzymów szlaku Aurora A/Eg2 i CPEB. Hiperfosforylacja Aurora A/Eg2 prowadzi do fosforylacji CPEB (Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding protein). Fosforylowany CPEB rozpoznaje CPE (cytoplazmatyczny element poliadenylacji) na 3'UTR mRNA mos, rekrutuje CPSF (czynnik specyficzności dla rozszczepienia i poliadenylacji) i aktywuje poliadenylację mRNA przez PAP (polimerazę poli(A)). Stymulacja PG sprzyja również sukcesywnie fosforylacji maskiny poprzez działanie PKA i cdk1, dysocjację Maskin/eIF4E oraz asocjację eIF4E/eIF4G1. eIF4G1 rekrutuje partnerów do inicjacji translacji, w tym PABP, który współdziała z eIF4G1 i rozpoznaje ogon poli(A). Po zsyntetyzowaniu mos aktywuje MEK/MAPKK poprzez fosforylację, która z kolei aktywuje ERK2/MAPK poprzez fosforylację. Ta tak zwana kaskada MAPK bierze udział w procesach mejotycznych poprzez kontrolowanie kinetyki wejścia w fazę M, morfogenezy wrzeciona i hamowanie syntezy DNA. Kaskada jest osadzona w dodatniej pętli sprzężenia zwrotnego, która podtrzymuje syntezę białek. Należy zauważyć, że mos nie jest jedynym białkiem, które ma zostać zsyntetyzowane w celu aktywacji GVBD; tj. Cyklina B musi zostać przetłumaczona w celu osiągnięcia dojrzałości.

Ryc. 2. Mutacja eIF4G1-DN wpływa na dojrzewanie i translację oocytów u Xenopus laevis. RNA pochodzące z plazmidów kodujących znakowane V5 białka eIF4G1 (WT i DN) są mikrowstrzykiwane do oocytów Xenopus laevis. Po 15 godzinach dojrzewanie oocytów jest stymulowane przez progesteron (PG) (eksperymenty przeprowadzono co najmniej 3 razy i przedstawiono reprezentatywne wyniki). (A) Schematyczny przegląd protokołu eksperymentu. Wstrzyknięcia cRNA eIF4G1 i/lub GFP są reprezentowane przez groty strzał przed stymulacją PG. Próbki do analiz RNA i białek uzyskano w 2 punktach czasowych (stymulacja PG i na końcu kinetyki GVBD). (B) Dojrzewanie kinetyczne 10 oocytów charakteryzujących się GVBD bada się w ciągu 24 godzin po stymulacji PG. Opóźnienie dojrzewania oocytów obserwuje się w oocytach z mikroiniekcją cRNA eIF4G1-DN w porównaniu z oocytami, którym podano mikroiniekcję cRNA eIF4G1-WT. (C) Odsetek dojrzałych oocytów 24 godziny po stymulacji PG (n=4; *p<0,05). Zmniejszenie dojrzewania oocytów obserwuje się u osób, którym mikroiniekcjowano cRNA eIF4G1-DN w porównaniu z cRNA eIF4G1-WT. (D) Ocena fenotypu odwrócenia oocytów, którym mikroiniekcjowano zmutowane cRNA eIF4G1-DN i cRNA eIF4G1-WT, wykazująca, że maszyneria translacyjna jest nadal funkcjonalna po dodaniu eIF4G1-WT do mutanta. (E) Białka są ekstrahowane z oocytów, a ich poziomy określa się za pomocą analizy immunoblottingowej. Obserwuje się zaburzenia fosforylacji ERK2, mos i ekspresji GFP w warunkach eIF4G1-DN. (F) Poliadenylacja mRNA mos, cykliny A1, cykliny B1 i histonopodobnego B4 z oocytów stymulowanych lub nie PG obserwowana po amplifikacji i migracji PCR na 3% żelu agarozowym. Po stymulacji PG wykrywa się wzrost wielkości poliadenylacji >100 dla wszystkich warunków. Pierwszy pas odpowiada drabinie.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.