Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Synteza białek jest podstawowym procesem ekspresji genów, wpływającym na różne procesy biologiczne, zwłaszcza adaptację do warunków środowiskowych. Etap inicjacji, który polega na złożeniu podjednostek rybosomalnych w kodonie inicjacyjnym mRNA, obejmował czynnik inicjacyjny, w tym eIF4G1. Wady w tym ograniczającym tempo etapie translacji są związane z różnymi zaburzeniami. Aby zbadać potencjalne konsekwencje takiej deregulacji, oocyty Xenopus laevis stanowią atrakcyjny model o wysokim stopniu zachowania podstawowych mechanizmów komórkowych i molekularnych w stosunku do człowieka. Ponadto podczas dojrzewania mejotycznego oocyty są tłumione transkrypcyjnie, a wszystkie niezbędne białka są tłumaczone z wcześniej istniejących, matczynych mRNA. Ten niedrogi model umożliwia doskonałą integrację egzogennego mRNA z efektywną translacją. Poniżej opisano protokół oceny translacji z czynnikiem będącym przedmiotem zainteresowania (tutaj eIF4G1) przy użyciu przechowywanego matczynego mRNA, które jako pierwsze są poliadenylowane i ulegają translacji podczas dojrzewania oocytów jako odczyt fizjologiczny. Najpierw mRNA syntetyzowane przez transkrypcję in vitro plazmidów będących przedmiotem zainteresowania (tutaj eIF4G1) są wstrzykiwane do oocytów i określa się kinetykę dojrzewania oocytów za pomocą wykrywania rozpadu pęcherzyków zarodkowych. Badanym celem mRNA matki jest kinaza białkowa seryny/treoniny mos. Jego poliadenylacja i późniejsza translacja są badane wraz z ekspresją i fosforylacją białek kaskady sygnalizacyjnej mos biorącej udział w dojrzewaniu oocytów. Zaproponowano również zmiany w obecnym protokole w celu wykazania wad translacyjnych, aby podkreślić jego ogólne zastosowanie. W świetle pojawiających się dowodów na to, że nieprawidłowa synteza białek może być zaangażowana w patogenezę zaburzeń neurologicznych, taki model daje możliwość łatwej oceny tego upośledzenia i zidentyfikowania nowych celów.
Wprowadzenie
Białka są niezbędnymi elementami życia komórkowego, a więc w większej skali organizmu. Zapewniają one większość funkcji komórkowych, w tym strukturę, transport, katalizę reakcyjną, regulację, ekspresję genów itp. Ich ekspresja jest wynikiem złożonego mechanizmu translacji umożliwiającego przekształcenie mRNA w białko. Translacja jest poddawana różnym kontrolom w celu adaptacji i regulacji ekspresji genów zgodnie z potrzebami komórki, podczas rozwoju i różnicowania, starzenia się, stresów fizjologicznych lub objawów patologicznych.
Translacja jest podzielona na 3 fazy (inicjacja, wydłużenie i zakończenie) i prezentuje 3 systemy translacji in....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty Xenopus zostały przeprowadzone w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu Lille 1 zgodnie z zasadami wytycznych Rady Wspólnoty Europejskiej (86/609/EWG) dotyczących eksperymentów na zwierzętach laboratoryjnych. Protokół dotyczący zwierząt został zatwierdzony przez lokalną instytucjonalną komisję rewizyjną (Comité d'Ethique en Experimentation Animale Nord-Pas-De-Calais, CEEA 07/2010).
1. Postępowanie z oocytami
- Przygotować roztwór znieczulający: rozpuścić 1 g sproszkowanego sulfonianu metanu trikainy w 1 litrze sterylnej wody.
- Zanurz samicę Xenopus laevis w tym roztworze, przykryj zlewk....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Kinetyka dojrzewania oocytów Xenopus i oznaczenie procentowego udziału oocytów z GVBD po 24 h stymulacji PG (Rysunki 2B, 2C):
W celu zbadania konsekwencji translacyjnych mutacji eIF4G1-DN, odpowiedź na PG w oocytach Xenopus laevis po mikroiniekcji cRNA eIF4G1-DN porównuje się z odpowiedźmi dla eIF4G1-WT oraz w innych warunkach kontrolnych (H2O, GFP). Kontrole te pozwalają ocenić wpływ mikroiniekcji oocytów niezależnie od charakteru wstrzykniętego c.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Translacja jest mechanizmem zaangażowanym w fizjopatologię wielu zaburzeń człowieka, w tym kilku chorób neurodegeneracyjnych. Na przykład w chorobie Parkinsona kilka doniesień sugerowało upośledzenie translacji związane z mutacjami dziedzicznymi8,12,13.
Dostępnych jest kilka modeli komórkowych do badania translacji. W tym przypadku, w celu zbadania konsekwencji translacyjnych mutacji w eIF4G1, która działa jako dominująca mutacja ujemna, zmniejszając interakcję między partnerami eIF.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez grant z INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH dziękuje za wsparcie ze strony Fondation de France i pragnie podziękować IRCL, Pr. Sonenbergowi za dar plazmidów V5, dr Dissous (Instytut Pasteura, Lille) za dar przeciwciał anty-GFP, UMS 3387 (Uniwersytet w Rennes), gdzie zakupiono oocyty Xenopus oraz dr Taymans (JPArc, Lille) za krytyczną lekturę tekstu rękopisu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Obchodzenie się z oocytami | metanu trikainy | Sandoz | MS-222 |
| Kleszcze | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycyna/penicylina | Sigma | 781 | |
| Pirogronian sodu | Sigma | P2256 | |
| Inhibitor trypsyny sojowej | Sigma | T9128 | |
| Tetracyklina | Sigma | T7660 | |
| Weterynarz wchłanialna nić Vicryl | Johnson& Johson Intl | JV1205 | |
| Kolagenaza A | Diagnostyka Roche | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Przygotowanie syntetycznego DNA mRNA |
| /RNAzy wolnego od H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Octan sodu | Merck | 6268 | |
| Absolutny etanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Bromek etydyny 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| Zestaw mMESSAGE mMACHINE | Ambion firmy Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyd 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamid | Fluka | 47671 | |
| Żel Doc Imager | Biorad | ||
| Pipet oocytów ze 100 8-calowymi szklanymi naczyniami włosowatymi | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | mikroiniekcja |
| Szkło wymienne 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 &mikro; m filtr | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma | A4612 | |
| leupeptyna | Sigma | L8511 | |
| aprotynina | Sigma | A1153 | |
| benzamidyna | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| wanadan sodu | Sigma | S6508 | |
| Laemmli bufor | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 dołków | Life Technologies | NP0323BOX | |
| elektroforeza SDS-PAGE, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 i -1096 | |
| poziomy półsuchy system bibuły | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Metanol | VWR | 20846-292 | |
| Pąsek Czerwony (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anty-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anty-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anty-Eg2 | Święty Mikołaj Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anty-Eg2-P | Sygnalizacja komórkowa | C39D8 | |
| anty-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anty-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anty-RSK | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anty-MOS | Santa Cruz Biotechnology | SC-86 | |
| przeciwciało drugorzędowe znakowane peroksydazą chrzanową anty-mysiego | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Przeciwciało drugorzędowe znakowane peroksydazą chrzanową przeciw królikowi | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| Przeciwciało drugorzędowe znakowane peroksydazą chrzanową | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Zaawansowany system | wykrywania ECLAmershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | test poliadenylacji |
| TRIZOL (odczynnik do lizy Qiazolu) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Izopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini zestaw | Qiagen | 74106 | |
| Bufor RTL | Qiagen | 79216 | |
| Zestaw DNAzy wolnych od RNAzy | Qiagen | 79254 | |
| Startery | Eurogentec | ||
| T4 Ligaza RNA 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| c-DNA o dużej pojemności | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Polimeraza Taq | Life Technologies | 10342020 |
Bibliografia
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol C....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
