Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52724

⸱

27 września 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Team "Early Stages of Parkinson's Disease" of the Jean-Pierre Aubert Research Center, INSERM UMR-S1172, CHRU Lille, University of Lille 1 and Lille 2, 2Team "Signal Division Regulation", CNRS UMR 8576, University of Lille 1

W tym artykule

Podsumowanie

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Streszczenie

Synteza białek jest podstawowym procesem ekspresji genów, wpływającym na różne procesy biologiczne, zwłaszcza adaptację do warunków środowiskowych. Etap inicjacji, który polega na złożeniu podjednostek rybosomalnych w kodonie inicjacyjnym mRNA, obejmował czynnik inicjacyjny, w tym eIF4G1. Wady w tym ograniczającym tempo etapie translacji są związane z różnymi zaburzeniami. Aby zbadać potencjalne konsekwencje takiej deregulacji, oocyty Xenopus laevis stanowią atrakcyjny model o wysokim stopniu zachowania podstawowych mechanizmów komórkowych i molekularnych w stosunku do człowieka. Ponadto podczas dojrzewania mejotycznego oocyty są tłumione transkrypcyjnie, a wszystkie niezbędne białka są tłumaczone z wcześniej istniejących, matczynych mRNA. Ten niedrogi model umożliwia doskonałą integrację egzogennego mRNA z efektywną translacją. Poniżej opisano protokół oceny translacji z czynnikiem będącym przedmiotem zainteresowania (tutaj eIF4G1) przy użyciu przechowywanego matczynego mRNA, które jako pierwsze są poliadenylowane i ulegają translacji podczas dojrzewania oocytów jako odczyt fizjologiczny. Najpierw mRNA syntetyzowane przez transkrypcję in vitro plazmidów będących przedmiotem zainteresowania (tutaj eIF4G1) są wstrzykiwane do oocytów i określa się kinetykę dojrzewania oocytów za pomocą wykrywania rozpadu pęcherzyków zarodkowych. Badanym celem mRNA matki jest kinaza białkowa seryny/treoniny mos. Jego poliadenylacja i późniejsza translacja są badane wraz z ekspresją i fosforylacją białek kaskady sygnalizacyjnej mos biorącej udział w dojrzewaniu oocytów. Zaproponowano również zmiany w obecnym protokole w celu wykazania wad translacyjnych, aby podkreślić jego ogólne zastosowanie. W świetle pojawiających się dowodów na to, że nieprawidłowa synteza białek może być zaangażowana w patogenezę zaburzeń neurologicznych, taki model daje możliwość łatwej oceny tego upośledzenia i zidentyfikowania nowych celów.

Wprowadzenie

Białka są niezbędnymi elementami życia komórkowego, a więc w większej skali organizmu. Zapewniają one większość funkcji komórkowych, w tym strukturę, transport, katalizę reakcyjną, regulację, ekspresję genów itp. Ich ekspresja jest wynikiem złożonego mechanizmu translacji umożliwiającego przekształcenie mRNA w białko. Translacja jest poddawana różnym kontrolom w celu adaptacji i regulacji ekspresji genów zgodnie z potrzebami komórki, podczas rozwoju i różnicowania, starzenia się, stresów fizjologicznych lub objawów patologicznych.

Translacja jest podzielona na 3 fazy (inicjacja, wydłużenie i zakończenie) i prezentuje 3 systemy translacji inicjacyjnej, aby odpowiedzieć na te potrzeby: zależne od kapu, niezależne od czapeczki poprzez struktury wewnętrznego segmentu wejściowego rybosomu (IRES) i wzmacniacze translacji niezależne od czapeczki (CITE).

Większość eukariotycznych mRNA ulega translacji w sposób zależny od czapeczki za pośrednictwem kapu 7-metyloguanozyny 5'-trifosforanu, który służy jako cecha rozpoznawcza podczas syntezy białek. Ta czapeczka wiąże się z eIF4E, składnikiem kompleksu eIF4F z eIF4G1 i eIF4A. W połączeniu z innymi partnerami, takimi jak białko wiążące poli(A) (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNAMet, te czynniki inicjacji translacji umożliwiają krążenie mRNA i poprawiają jego dostępność do kompleksu form 43S do momentu rozpoznania kodonu inicjacji AUG1. Wydarzenie to odpowiada końcowi inicjacji tłumaczenia, tj. pierwszemu krokowi tłumaczenia.

Translacja niezależna od czapki jest używana przez kodowanie mRNA dla niezbędnych białek w warunkach stresu, które indukują na przykład proliferację komórek i apoptozę. Mechanizm ten obejmuje struktury drugorzędowe w nieulegającym translacji regionie mRNA 5' (UTR) zwanym IRES, karboksylowo-końcowym końcu eIF4G1 związanym z eIF4A i kompleksem 43S. Wiązanie tego kompleksu preinicjacyjnego 43S z IRES inicjuje translację niezależną od czapeczki bez potrzeby stosowania czynnika eIF4E2,3.

Na koniec, inny mechanizm translacji, który wciąż nie jest dobrze poznany, wspiera tę niezależną od czapeczki aktywność translacyjną w warunkach stresu za pośrednictwem struktur CITE zlokalizowanych w mRNA UTR 4.

Poprzez te różne sposoby translacji, różniące się etapami inicjacji, translacja odgrywa kluczową rolę w homeostazie komórkowej i każda zmiana w jednym z tych procesów wpłynęłaby na organizm z małymi lub dużymi efektami. Rzeczywiście, inicjacja jest krokiem ograniczającym szybkość regulującym prawidłowe procesy translacji mRNA do białek, a zatem jest celem licznych punktów kontrolnych i regulacyjnych5. Niezależnie od tego, czy chodzi o te ostatnie, czy o składniki tych procesów, jeśli jeden z nich okaże się wadliwy, zaburzy ustaloną równowagę w komórce, a tym samym może doprowadzić do stanów patologicznych. W tym kontekście, mutacje w czynnikach translacyjnych są zaangażowane w kilka zaburzeń, w tym zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak "leukoencefalopatia ze zanikającą istotą białą" (podjednostka eIF2B1-5)6, w zespole Walcotta-Rallisona (EIF2AK3 genu kodującego PERK)7, potencjalnie w chorobie Parkinsona (eIF4G1 p.R1205H)8. Dlatego ważne jest prowadzenie badań komórkowych i molekularnych tych zmutowanych białek, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat rozwoju choroby i ogólnego procesu inicjacji translacji.

Aby przeprowadzić te badania, konieczne jest wybranie najbardziej odpowiednich modeli do obserwacji konsekwencji tych mutacji. Oocyty Xenopus laevis są szczególnie dobrze przystosowane ze względu na swoje właściwości fizjologiczne i biochemiczne: synchroniczność fizjologiczną (zablokowana w fazie G2 cyklu komórkowego), wysoką zdolność syntezy białek (200-400 ng/dobę/oocyt), dużą liczbę pobranych oocytów od tego samego zwierzęcia (800-1000 oocytów/samicę) oraz wielkość komórek (1,2-1,4 mm średnicy), co ułatwia ich manipulację. Mikroiniekcję oocytów Xenopus ze zsyntetyzowanym mRNA można łatwo wykonać w celu przeanalizowania etapów translacji. Z tego punktu widzenia ma to inne zalety. Biorąc pod uwagę szybkość progresji mejozy i translacji po mikroiniekcji mRNA (~ 24 godziny), oocyt Xenopus reprezentuje szybki system w porównaniu z odtworzonymi systemami komórkowymi (ekstrahowanymi z E. coli, kiełków pszenicy lub retikulocytów królika...), w których mRNA ulega translacji ze zmniejszoną szybkością translacji i z mniejszą prędkością. Tak więc skutki mutacji wprowadzonej w mRNA będą szybko obserwowalne i łatwo zbadane w kilku oocytach. Kolejną zaletą oocytów Xenopus jest to, że matczyne mRNA są utajone, a translacja białek jest blokowana przed stymulacją progesteronu. Dodanie progesteronu jest zatem dobrym sposobem kontrolowania indukcji translacji. Poliadenylacja cytoplazmatyczna nie zachodzi podczas oogenezy. Rozpoczyna się podczas dojrzewania oocytów w oocytach stymulowanych progesteronem w kolejności czasowej i trwa przez cały wczesny rozwój i może być wykorzystany do badania różnych etapów translacji.

Poliadenylacja mRNA mos jest jedną z pierwszych i należy wraz z Aurora A/Eg2, mRNA Histone-Like B4 do klasy genów "wczesnego dojrzewania", jak zdefiniowano w Charlesworth et al. (2004)9. Indukcja translacyjna "późnego" mRNA, takiego jak cyklina A1 i cyklina B1, następuje w czasie rozpadu pęcherzyków rozrodczych (GVBD). MRNA Mos koduje kinazę białkową serynowo-treoninę. Jego translacja jest kluczowa, ponieważ indukuje kaskadę kinazy MAP, która pośrednio aktywuje dojrzewanie oocytów. Rzeczywiście, w odpowiedzi na progesteron, poliadenylacja mRNA mos jest wzmacniana w procesie obejmującym białka regulatorowe Aurora A / Eg2 i inne białka wiążące RNA z 3'UTR mRNA mos. Ta zwiększona poliadenylacja mRNA mos prowadzi do wzrostu poziomu białka mos, co z kolei aktywuje MEK1. Proces ten pośredniczy w aktywacji kinazy regulowanej sygnalizacją zewnątrzkomórkową 2 (ERK2) (ryc. 1). Ta kaskada sygnalizacyjna może następnie wywołać czynniki promujące dojrzewanie fazy M, kompleks utworzony przez cyklinę B i kinazę Cdc2, i ostatecznie doprowadzić do wznowienia mejozy.

Dlatego w oocytach Xenopus laevis, badanie matczynego mRNA, takiego jak mos, może być łatwo wykorzystane do sprawdzenia ich translatowalności z kilkoma punktami końcowymi, od ich efektywnej poliadenylacji do translacji kilku składników sygnalizacyjnych mos, w tym również do określenia wskaźnika GVBD. System ten jest zatem interesujący dla oceny pierwszych konsekwencji mutacji w czynnikach inicjacji translacji bez ingerencji nowo transkrybowanego mRNA lub wydajności transfekcji, co często występuje w badaniach nad komórkami eukariotycznymi.

Tutaj ustalany jest protokół, w którym zmutowane mRNA eIF4G1 są mikrowstrzykiwane do oocytów Xenopus laevis i testowana jest translacja mRNA matki. W przypadku defektu progresji GVBD stwierdza się poliadenylację mRNA mos, która jest niezbędna do progresji przez cykl komórek mejotycznych oocytu oraz do późniejszej translacji mRNA wczesnej i późnej klasy. Fosforylacja Aurora A/Eg2 i ERK jest również badana w celu potwierdzenia konsekwencji deregulacji mos. W związku z tym oocyty Xenopus stanowią prosty sposób analizy różnych etapów translacji mRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty Xenopus zostały przeprowadzone w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu Lille 1 zgodnie z zasadami wytycznych Rady Wspólnoty Europejskiej (86/609/EWG) dotyczących eksperymentów na zwierzętach laboratoryjnych. Protokół dotyczący zwierząt został zatwierdzony przez lokalną instytucjonalną komisję rewizyjną (Comité d'Ethique en Experimentation Animale Nord-Pas-De-Calais, CEEA 07/2010).

1. Postępowanie z oocytami

  1. Przygotować roztwór znieczulający: rozpuścić 1 g sproszkowanego sulfonianu metanu trikainy w 1 litrze sterylnej wody.
  2. Zanurz samicę Xenopus laevis w tym roztworze, przykryj zlewkę, aby uniknąć ucieczki i odczekaj około 45 minut, aż zwierzę zostanie całkowicie uspokojone (bez żadnej reakcji na uszczypnięcie nogi).
  3. Umyj żabę mydłem i spłucz wodą z kranu, a następnie połóż zwierzę na grzbiecie na czystej folii aluminiowej.
  4. Zacisnąć skórę bocznej części brzucha i na poziomie jajników za pomocą kleszczy. Wykonaj nacięcie o długości około 1 cm nożyczkami oczyszczonymi przed użyciem etanolem 70%. Upewnij się, że przekrój jest wystarczająco głęboki i sięga do leżącej pod nim ściany brzucha, aby umożliwić wycięcie tkanki jajnikowej, w której znajduje się kilka oocytów w różnych stadiach rozwoju.
  5. Wyciąć płatki jajników, umyć je 4 razy na szalce Petriego (50 mm) z pożywką ND96 (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES dostosowanymi do pH 7,4 z NaOH, uzupełnionymi 50 μg/ml streptomycyny/penicyliny, 225 μg/ml pirogronianu sodu, 30 μg/ml inhibitora trypsyny sojowej, 1 μl/ml tetracykliny) w celu usunięcia wszelkich śladów krwi i zanieczyszczeń.
    Uwaga: Tetracyklina pozwala na optymalną konserwację i dobrą regenerację po zabiegu mikroiniekcji.
  6. Przechowywać je na przykrytej szalce Petriego, zanurzonej w pożywce w temperaturze 14 °C, pozwalając na ich przechowywanie przez tydzień.
  7. Zszyj ścianę brzucha i skórę wchłanialną nicią weterynaryjną i igłą do szycia (konieczne będą 3 lub 4 szwy).
  8. Umieść zwierzę w zlewce bez wody i zwilż skórę wodą z kranu, aż żaba znów zacznie się poruszać. Przykryj zlewkę, aby zapobiec ucieczce.
  9. Ostrożnie oddziel płaty jajników w pożywce w grupach od 5 do 10 oocytów, używając 2 par kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym o 10-krotnym powiększeniu. Selekcjonować oocyty w VI stadium. Można je rozpoznać po i) ich kształcie i kolorze z brązowym pigmentowanym słupkiem zwierzęcym i żółtym słupkiem wegetatywnym oddzielonym przezroczystym paskiem, ii) ich rozmiarem wyższym niż 1,2 mm średnicy10.
  10. Inkubować wybrane oocyty w roztworze kolagenazy (1 mg/ml kolagenazy A z Clostridium histolyticum, rozpuszczonej w ND96 bez tetracykliny) na szalce Petriego pod delikatnym mieszaniem przez 45 minut, aby ułatwić opróżnienie oocytów (kolagenaza trawi połączenia oocyt/komórki pęcherzykowe). Przepłukać oocyty 3 lub 4 razy pożywką ND96 o temperaturze 14 °C.
    Uwaga: Nie należy inkubować oocytów krócej lub dłużej niż 45 minut ze względu na ryzyko zniszczenia białek powierzchniowych oocytów i spowodowania słabej żywotności. Leczenie kolagenazą może wywołać samoistną GVBD.
  11. Inkubować oocyty w pożywce przez 3-4 godziny. Usunąć komórki pęcherzykowe za pomocą cienkiej pęsety pod lornetką i utrzymywać je w temperaturze 19 °C w pożywce ND96.

2. Przygotowanie syntezy mRNA

  1. Linearyzować 5 μg następujących plazmidów przez trawienie enzymatyczne przy użyciu enzymu PmeI.
    UWAGA: pcDNA6.2/V5-DEST zawierający 1599 aminokwasów eIF4G1 cDNA typu dzikiego (eIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2/V5-DEST zawierający dominujący ujemny cDNA eIF4G1 (eIF4G1-DN) z mutacjami c.2105T>G c.2106A>C, c.2120->G, c.2122T>A, 2125T>- i c.2126T>G w obszarze oddziaływania między eIF4G1 i eIF4E w pozycji 612 do 618 odpowiedniego białka zaburzającego oddziaływanie między eIF4G1 i eIF4E8, pcDNA6.2/C-EmGFP zawierający acetylotransferazę chloramfenikolu (GFP). Przygotować 2 mieszaniny dla każdego z 3 plazmidów: pierwsza zawiera enzym PmeI, a druga bez enzymu jako kontrolę.
  2. Wytrącić plazmidowe DNA za pomocą klasycznej procedury etanolowej i ponownie zawiesić go w 20 μl H2O bez nukleaz.
  3. Określ jego stężenie za pomocą spektrofotometru. Stężenie powinno być większe niż 150 ng/μl do transkrypcji cRNA.
  4. Uruchomić 1 μl próbek i ich kontroli z 5 μl buforu ładującego na 0,8% żelu agarozowym, aby zweryfikować linearyzację plazmidu.
  5. Użyj zestawu do transkrypcji in vitro i oczyszczania cRNA zgodnie z instrukcjami producenta. Transkrybowane cRNA są ponownie zawieszane w 20 μl H2O, wolnego od nukleaz. W razie potrzeby próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. Przygotować bufor migracyjny MOPS 10X zawierający 0,2 M MOPS (pH 7,0), 20 mM octanu sodu i 10 mM EDTA (pH 8,0). Sterylizuj roztwór za pomocą filtra 0,45 μm. Przechowywać roztwór chroniony przed światłem w temperaturze pokojowej, aby uniknąć utleniania roztworu.
  7. Wyczyść zbiornik do elektroforezy kolejno NaOH, HCl i dokładnie przepłucz podwójnie przefiltrowaną wodą w celu uzyskania O/N, aby uniknąć RNazy i zapobiec degradacji RNA.
  8. Odlać 1,5% żel agarozowy zawierający MOPS i formaldehyd. Ogrzewać aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy i pozostawić do ostygnięcia do temperatury 55 °C. Pod wyciągiem dodać 0,1 objętości MOPS 10X, 6,6% formaldehydu i 4 μg bromku etydyny (10 mg/ml). Wlej żel pod wyciąg i odczekaj około 1 godziny, aż żel stwardnieje.
    Uwaga: Formaldehyd i bromek etydyny są toksyczne.
  9. Przygotować próbki do migracji w probówce o pojemności 0,2 ml zawierającej 1 μl cRNA, 8,8% formaldehydu, 60% formamidu i 0,1 objętości MOPS 10X. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 70 °C i umieścić probówki na lodzie na 10 minut. Odwirować próbki przez kilka sekund przy 5 000 x g. Dodać 2 μl buforu ładującego żel.
    Uwaga: Formamid jest toksyczny.
  10. Uruchom próbki przez 20 minut przy napięciu 90 V. Namocz żel w wolnym od nukleazH2OO / N, aby odbarwić żel przed analizą w celu sprawdzenia jakości cRNA.
  11. Oznaczyć stężenie cRNA za pomocą spektrofotometru i przechowywać je w temperaturze -80 °C.

3. Mikroiniekcja syntetyzowanego RNA i stymulacja dojrzewania oocytów

  1. Przygotuj niezbędny sprzęt do mikroiniekcji oocytów. Użyj ściągacza do mikropipet, aby wyciągnąć małą szklaną kapilę. Pod mikroskopem stereoskopowym oderwij koniec naczynia włosowatego pęsetą, aby uzyskać koniec. Napełnij mikropipetę kapilarną olejem mineralnym za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z filtrem miliporowym 0,45 μm na przeciwległym końcu. Zamontuj mikropipetę na pipecie do mikroiniekcji. Wybierz dokładną mikropipetę skalibrowaną przez producenta, aby zapewnić dobrą dokładność, gdy jest używana z odpowiednią szklaną kapilarą.
  2. Wykonać mikroiniekcję 1-2 godziny po odmuleniu, co jest niezbędnym opóźnieniem do odzyskania oocytów na oocytach utrzymywanych w temperaturze 14 °C. Użyj szalek Petriego z dnem zeskrobanym kleszczami, aby stworzyć adhezyjną powierzchnię dla oocytów i wypełnij je pożywką ND96.
  3. Ułożyć oocyty wzdłuż zeskrobanego pasa na szalce Petriego, umożliwiając kolejne wstrzykiwanie oocytów za pomocą mikropipety kapilarnej pod kątem 45 °C.
  4. Wstrzyknąć w strefę równikową oocytu, poniżej pigmentowanego obszaru zwierzęcia, aby uzyskać optymalną dyfuzję próbek w cytoplazmie. Wkładaj tylko najcieńszą część końcówki kapilarnej na głębokość około 150-200 μm.
  5. Wstrzyknąć 30 ng cRNA uzyskanego odpowiednio z różnych plazmidów w objętości 60 nl do pierwszego oocytu. Po wstrzyknięciu odczekaj 5-10 sekund przed usunięciem końcówki kapilarnej, aby uniknąć ucieczki próbki (Rysunek 2A).
    Uwaga: Nie przekraczać 120 nl. Wstrzykiwać tak wolno, jak to możliwe. Zalecana jest kontrola wodą destylowaną.
  6. Przesuń ręcznie szalkę Petriego, aby wstrzyknąć następny oocyt.
    Uwaga: Upewnij się, że końcówka nie jest zatkana, generując mały impuls z roztworu kąpieli po 2 do 3 mikroiniekcjach.
  7. Przenieść wstrzyknięte oocyty do 24 dołków (10 oocytów / basenik) wypełnionych 3 ml świeżej pożywki ND96 i pozostawić je w temperaturze 19 °C.
  8. Inkubować oocyty w ND96 z progesteronem (PG) (2 μg/ml) w celu wywołania dojrzewania mejotycznego (GVBD) w temperaturze 19°C, 15 godzin lub 4 godzin po mikrowstrzyknięciu poliadenylowanych cRNA uzyskanych odpowiednio z pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 i pcDNA6.2 / C-EmGFP stosowanych jako kontrola (Figura 2A).
    Uwaga: Jednoczesne wstrzyknięcie markera fluorescencyjnego z cRNA jest dobrym narzędziem do zapewnienia, że cRNA zostało wstrzyknięte i pozostało w oocycie. Wykonaj takie wstępne eksperymenty przy użyciu interesującego cRNA ze znacznikiem GFP.
  9. Mikroiniekcja, jak w #3,5 różnych proporcjach (1:3; 2:2; 3:1) poliadenylowanych cRNA eIF4G1-WT i eIF4G1-DN w celu zbadania efektu translacji cRNA eIF4G1-WT na zmutowany fenotyp (Figura 2D).

4. Określenie rozpadu pęcherzyków zarodkowych

  1. Policz liczbę dojrzałych oocytów po stymulacji PG, obserwując obecność białej plamki na czarnym biegunie zwierzęcia za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Powtarzaj liczenie co godzinę aż do dwudziestej czwartej godziny (Rysunek 2B, 2C).

5. Analiza Western Blot (WB)

  1. Homogenizować grupę 10 oocytów ruchami w przód i w tył za pomocą końcówki mikropipety, w temperaturze 4 °C w 200 μl w następującym buforze: 50 mM Hepes, pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05% SDS, 5 mM MgCl2, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 10 mg/ml leupeptyny, 10 mg/ml aprotyniny, 10 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej, 10 mg/ml benzamidyny, 1 mM PMSF, 1 mM wanadan sodu.
  2. Odwirować próbki przez 15 minut przy 10 000 x g w celu usunięcia frakcji lipidowej (górna faza) i membranowej (dolna faza). Zebrać frakcję cytoplazmatyczną, przechowywać podwielokrotność w celu określenia stężenia białka i uzupełnić pozostałą część za pomocą Laemmli lub buforu do próbek Bis-Tris (1:1).
    Uwaga: Żele Bis-Tris i bufor ładujący mają bardziej neutralne pH, które chroni białka przed hydrolizą
  3. Podgrzewać 20 μg próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Załadować każdą próbkę do dołków żelu akrylamidowego. Umieść żel w zbiorniku z odpowiednim buforem.
  4. Wykonać elektroforezę przez 1 godzinę przy napięciu 200 V.
  5. Zrealizuj WB w TBS pH 8,0 (Tris HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1%, zawierający 10% albuminy surowicy bydlęcej) za pomocą koziego anty-Aurora A/Eg2 (1:3,000, 2 godz.) lub za pomocą króliczego anty-Aurora A/Eg2-P (1:1,000, O/N w 4 °C), mysiego anty-ERK2 (1:3,000, 2 godz.), koziego anty-ERK2-P (Tyr204) (1:3,000, 2 godz.), króliczego anty-mos (1:5,000, 4 godz.), królicze przeciwciała anty-GFP (1:3 000, 2 godz.). Użyj przeciwciał mysich anty-V5 (1:10 000, 2 godz.) i króliczych anty-Rsk (1:1 000, 2 godz.) (jako kontrole obciążenia).
  6. Przemyć membranę 3 razy przez 10 minut w TBS-Tween i inkubować przez 1 godzinę z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym peroksydazą chrzanową przeciwko myszom, królikom lub kozom (IgM) w rozcieńczeniach odpowiednio 1:5 000, 1:7 500 i 1:5 000.
  7. Wykonaj 3 płukania po 10 minut w TBS-Tween i wykryj kompleksy antygen-przeciwciała za pomocą zaawansowanego systemu wykrywania ECL.

6. Test poliadenylacji

  1. Pobrać próbkę 5 oocytów na stan w 1,5 ml. Umyj je 1 ml PBS 1X bez nukleaz (pH 7,4). Poniższe kroki zostaną wykonane pod wyciągiem.
  2. Ekstrakcja RNA przy użyciu klasycznej procedury organicznej (patrz instrukcje producenta).
  3. Odzyskać RNA przez odwirowanie (10 000 x g) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i wysuszyć RNA na powietrzu przez 10 minut.
  4. Zawiesić osad RNA w 30 μl H2O wolnym od nukleaz.
  5. Weź 15 μl próbek do nowej probówki i dodaj 85 μl H2O. Oczyść te próbki, aby poprawić ich jakość na kolumnie krzemionki zgodnie z instrukcjami producenta. Eluuj RNA za pomocą 30 μl H2O wolnego od nukleaz
  6. Uruchom 1 μl próbek z 5 μl buforu ładującego na 0,8% żelu agarozowym, aby sprawdzić integralność RNA.
  7. Określić stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
  8. Przygotować 2 mieszaniny ligacyjne na każdy warunek (tj. eIF4G1-WT, eIF4G1-DN i kontrolęH2O) z następującymi odczynnikami: 10 U ligazy RNA, 0,1 objętość buforu 10X, 1 mM ATP, 10% PEG8000 50%, 0,1 μg startera P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3')11 i doprowadzić końcową objętość do 10 μl za pomocą H2 bez nukleazO. Dodać do pierwszej mieszaniny RNA uzyskane z oocytów bez stymulacji PG, a do drugiej mieszaniny RNA uzyskane z oocytów stymulowanych PG.
  9. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie przez 20 minut w temperaturze 65 °C w celu inaktywacji enzymu.
  10. Użyj zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA (RT). Przygotować mieszaninę RT na probówkę: 0,1 objętości buforu 10X RT, 0,1 μg startera P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTTTT)10, 4 mM mieszaniny dNTP, 50 U odwrotnej transkryptazy i uzupełnić H2Obez nukleaz do końcowej objętości 10 μl. Dodać 10 μl uzyskanej wcześniej reakcji podwiązania. Wykonać RT w warunkach opisanych przez producenta.
  11. Przygotować mieszaninę reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) na probówkę: 0,1 objętość buforu 10X, 1,5 mM MgCl2, 133 μM mieszanina dNTP, 0,2 μM specyficzny starter, 0,2 μM starter P2, 0,025 μM polimeraza Taq, 1 μl cDNA i uzupełnić H2O bez nukleaz do końcowej objętości 50 μl. Wykonaj PCR w następujących warunkach: 50 °C przez 2 min, 95 °C przez 10 min, [95 °C przez 1 min, 56 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 30 sekund]*40 cykli, 72 °C przez 10 min9. Konkretne startery są następujące: mos, GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histone-like B4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyklina A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cyklina B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT9.
  12. Przygotuj 3% żel agarozowy. Dodać do każdego produktu PCR 10 μl buforu ładującego. Uruchom żel z 10 μl próbek pod napięciem 110 V, aby uzyskać optymalną migrację. Analizuj żel po 10 i 20 minutach, aby zaobserwować zmianę wielkości odzwierciedlającą długość ogona poli(A), a tym samym dojrzewanie RNA, co jest warunkiem wstępnym ich translacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kinetyka dojrzewania oocytów Xenopus i oznaczenie procentowego udziału oocytów z GVBD po 24 h stymulacji PG (Rysunki 2B, 2C):

W celu zbadania konsekwencji translacyjnych mutacji eIF4G1-DN, odpowiedź na PG w oocytach Xenopus laevis po mikroiniekcji cRNA eIF4G1-DN porównuje się z odpowiedźmi dla eIF4G1-WT oraz w innych warunkach kontrolnych (H2O, GFP). Kontrole te pozwalają ocenić wpływ mikroiniekcji oocytów niezależnie od charakteru wstrzykniętego c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Translacja jest mechanizmem zaangażowanym w fizjopatologię wielu zaburzeń człowieka, w tym kilku chorób neurodegeneracyjnych. Na przykład w chorobie Parkinsona kilka doniesień sugerowało upośledzenie translacji związane z mutacjami dziedzicznymi8,12,13.

Dostępnych jest kilka modeli komórkowych do badania translacji. W tym przypadku, w celu zbadania konsekwencji translacyjnych mutacji w eIF4G1, która działa jako dominująca mutacja ujemna, zmniejszając interakcję między partnerami eIF...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant z INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH dziękuje za wsparcie ze strony Fondation de France i pragnie podziękować IRCL, Pr. Sonenbergowi za dar plazmidów V5, dr Dissous (Instytut Pasteura, Lille) za dar przeciwciał anty-GFP, UMS 3387 (Uniwersytet w Rennes), gdzie zakupiono oocyty Xenopus oraz dr Taymans (JPArc, Lille) za krytyczną lekturę tekstu rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Obchodzenie się z oocytamimetanu trikainySandozMS-222
KleszczeMoriaDumont MC40
Streptomycyna/penicylinaSigma781
Pirogronian soduSigmaP2256
Inhibitor trypsyny sojowejSigmaT9128
TetracyklinaSigmaT7660
Weterynarz wchłanialna nić VicrylJohnson& Johson IntlJV1205
Kolagenaza ADiagnostyka Roche10103586001
PmeINew England BiolabsR0560SPrzygotowanie syntetycznego DNA mRNA
/RNAzy wolnego od H2OLife Technologies10977
Octan soduMerck6268
Absolutny etanolSigma02854
Nano DropThermo Scientific
TBE 10XEppendorf0032006.507
Bromek etydyny 10 mg/mlLife Technologies15585-011
Zestaw mMESSAGE mMACHINEAmbion firmy Life TechnologiesAM1344
MOPSSigmaM1254
EDTAFluka03609
AgaroseLife Technologies16500-500
Formaldehyd 37%Merck1.04003.1000
FormamidFluka47671
Żel Doc ImagerBiorad
Pipet oocytów ze 100 8-calowymi szklanymi naczyniami włosowatymiDrummond Scientific Company3-000-510-Xmikroiniekcja
Szkło wymienne 8"Drummond Scientific Company3-000-210-G8
0,45 &mikro; m filtrMilliporeSLHA025NB
ProgesteroneSigmaP0130
HepesSigmaH3375Western Blot
NaClSigmaS5886
SDSBiorad161-0301
MgCl2SigmaA3294
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA4612
leupeptynaSigmaL8511
aprotyninaSigmaA1153
benzamidynaSigmaB6506
PMSFSigmaP7626
wanadan soduSigmaS6508
Laemmli buforBiorad161-0737
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 dołkówLife TechnologiesNP0323BOX
elektroforeza SDS-PAGE, mini-Protean TGXBiorad456-1036 i -1096
poziomy półsuchy system bibułyW.E.P. Compagny
GlycineBiorad161-0718
Tris-HClBiorad161-0719
Hybond ECL MembraneAmersham Life Science10401180
MetanolVWR20846-292
Pąsek Czerwony (0,5%)SigmaP3504
Tween 20SigmaP2287
anty-GFPLife TechnologiesA11122
anty-V5Santa Cruz Biotechnologysc-58052
anty-Eg2Święty Mikołaj Cruz Biotechnologysc-27884
anty-Eg2-PSygnalizacja komórkowaC39D8
anty-ERK2Santa Cruz Biotechnologysc-1647
anty-ERK2-P (Tyr204)Santa Cruz Biotechnologysc-7976
anty-RSKSanta Cruz Biotechnologysc-231
anty-MOSSanta Cruz BiotechnologySC-86
przeciwciało drugorzędowe znakowane peroksydazą chrzanową anty-mysiegoSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Przeciwciało drugorzędowe znakowane peroksydazą chrzanową przeciw królikowiSanta Cruz Biotechnologysc-2812
Przeciwciało drugorzędowe znakowane peroksydazą chrzanowąSanta Cruz Biotechnologysc-2378
Zaawansowany systemwykrywania ECLAmershan Life ScienceRPN2135
PBS 1xSigmaP4417test poliadenylacji
TRIZOL (odczynnik do lizy Qiazolu)Qiagen79306
ChloroformSigma31998-8
IzopropanolSigma278475-1L
RNeasy mini zestawQiagen74106
Bufor RTL Qiagen79216
Zestaw DNAzy wolnych od RNAzyQiagen79254
StarteryEurogentec
T4 Ligaza RNA 1 New England BiolabsM0204S
c-DNA o dużej pojemnościApplied Biosystems, Life Technologies4368813
Polimeraza TaqLife Technologies10342020
Zestaw do odwrotnej transkrypcji

Bibliografia

  1. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  2. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
  3. Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
  4. Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
  5. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  6. Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
  7. Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
  8. Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
  9. Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
  10. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
  11. Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
  12. Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
  13. Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2, Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
  14. Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
  15. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449(2012).
  16. Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
  17. Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
  18. Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
  19. Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
  20. Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
  21. Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
  22. Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
  23. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
  24. Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138(2013).
  25. Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
  26. Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

inicjacja translacjidojrzewanie oocytówrozpad pęcherzyka zarodkowegoWestern blotpoliadenylacja mRNAkaskada sygnalizacyjna Mosstymulacja progesteronemmutacja eIF4G1mikroiniekcja kapilarna
Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.