Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo indukowanej nikotyną sygnalizacji wapnia i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52730

⸱

24 czerwca 2015

 ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Science, Stony Brook University

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy genowo-chimeryczny preparat brzusznego obwodu hipokamp – półleżący in vitro, który umożliwia bezpośrednie obrazowanie na żywo w celu analizy presynaptycznych mechanizmów transmisji synaptycznej za pośrednictwem nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR). Preparat ten zapewnia również pouczające podejście do badania pre- i postsynaptycznych mechanizmów plastyczności synaptycznej.

Streszczenie

Trwałe wzmocnienie sygnalizacji aksonalnej i zwiększone uwalnianie neuroprzekaźników poprzez aktywację pre-synaptycznych nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR) jest ważnym mechanizmem neuromodulacji przez acetylocholinę (ACh). Trudności w dostępie do sondowania mechanizmów sygnalizacyjnych w nienaruszonych aksonach i zakończeniach nerwowych zarówno in vitro, jak i in vivo ograniczyły postęp w badaniu presynaptycznych składników plastyczności synaptycznej. Tutaj wprowadzamy genowo-chimeryczne przygotowanie obwodu brzusznego hipokampa (vHipp)-półleżącego (nAcc) in vitro, które umożliwia bezpośrednie obrazowanie na żywo w celu analizy zarówno pre-, jak i postsynaptycznych składników transmisji, przy jednoczesnej selektywnej różnicowaniu profilu genetycznego neuronów pre- i postsynaptycznych. Pokazujemy, że projekcje z mikroplasterków vHipp, jako presynaptyczne wejście aksonalne, tworzą wiele, niezawodnych synaps glutaminergiczny z celami postsynaptycznymi, rozproszonymi neuronami z nAcc. Wykrywana jest presynaptyczna lokalizacja różnych podtypów nAChR, a presynaptyczna transmisja synaptyczna za pośrednictwem sygnalizacji nikotynowej jest monitorowana przez jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie żywych komórek. Preparat ten zapewnia również informacyjne podejście do badania pre- i postsynaptycznych mechanizmów glutaminergicznego plastyczności synaptycznej in vitro.

Wprowadzenie

Cholinergiczna modulacja pobudliwości obwodów przyczynia się do fundamentalnych aspektów poznania, a zmieniona modulacja cholinergiczna jest cechą zaburzeń neurodegeneracyjnych i neuropsychiatrycznych, w tym choroby Alzheimera, choroby Parkinsona, schizofrenii i uzależnień1-4. Ustalonym mechanizmem cholinergicznego ułatwiania przekaźnictwa synaptycznego w OUN jest bezpośrednia aktywacja nAChR zlokalizowanych w miejscach presynaptycznych. Aktywacja tych receptorów presynaptycznych prowadzi do zwiększenia wewnątrzkomórkowego Ca2+ ([Ca2+]i) w zakończeniach presynaptycznych – zarówno bezpośrednio, ze względu na stosunkowo wysoką przewodność wapniową niektórych podtypów nAChR, jak i pośrednio, poprzez wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne5, zwiększając w ten sposób uwalnianie neuroprzekaźników. W rzeczywistości aktywacja presynaptycznych nAChR została powiązana ze zmianami w uwalnianiu szerokiej gamy neuroprzekaźników, w tym glutaminianu, GABA, ACh i dopaminy6-10. Chociaż proces ten był badany pośrednio przy użyciu metod elektrofizjologicznych w różnych synapsach, optyczne reportery [Ca2 +] i recykling pęcherzyków synaptycznych pozwalają na bardziej bezpośredni i czasowo precyzyjny pomiar zjawisk presynaptycznych.

Presynaptyczna lokalizacja nAChR została przekonująco zademonstrowana dzięki bezpośredniemu immuno-złotemu znakowaniu nAChR na poziomie mikroskopu elektronowego (EM)11,12. Kilka innych technik zostało również wykorzystanych do pośredniego rozwiązania problemu lokalizacji nAChR, w tym wykrywanie lokalizacji chimer białkowych podjednostki nAChRs w hodowanych neuronach13,14, elektrofizjologiczny zapis prądów nAChR w zakończeniach synaptycznych15,16, monitorowanie zmian wywołanych nikotyną w [Ca2 +] i w synaptycznych zakończeniach nerwowych za pomocą obrazowania żywych komórek17oraz pośrednie monitorowanie uwalniania neuroprzekaźników w terminalu synaptycznym za pomocą technik obrazowania żywych komórek ze wskaźnikami fluorescencyjnymi, w tym egzocytozy pęcherzyków synaptycznych oglądanej za pomocą styrylowych amfipatycznych barwników FM (FM1-43 i FM4-64) lub synapto-pHluorin oraz za pomocą specyficznych reporterów neuroprzekaźników fluorescencyjnych, takich jak CNiFER dla ACh i iGluSnFr dla glutaminianu18–20. Ogólnie rzecz biorąc, obecne podejścia do identyfikacji presynaptycznej lokalizacji nAChR są skomplikowane i wymagają specjalnych systemów i technik, aby umożliwić wiarygodną identyfikację i fizjologiczne monitorowanie aktywności presynaptycznej.

Tutaj opisujemy protokoły i sprzęt do systemu kohodowli in vitro obwodu brzusznego hipokampa (vHipp) – jądra półleżącego (nAcc), który zapewnia bezpośredni dostęp do identyfikacji i analizy zarówno pre-, jak i postsynaptycznych komponentów transmisji synaptycznej. Pokazujemy przykłady presynaptycznej lokalizacji nAChR i obrazowania żywych komórek sygnalizacji Ca2 + za pośrednictwem nAChR i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż aksonów vHipp. Naturalnym (i prostym) rozszerzeniem przedstawionego tu protokołu jest przygotowanie kontaktów pre- i postsynaptycznych złożonych z neuronów o różnych genotypach. W ten sposób można bezpośrednio ocenić udział danego produktu genowego w pre- i/lub postsynaptycznych mechanizmach modulacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Publikacje NIH nr 80-23, poprawione 2012), a badania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt dla Badań na Uniwersytecie Stony Brook (#1618 i #1792).

1. vHipp-nAcc Synaptyczne Kokultury

  1. Myszy ofiarne (dzień po urodzeniu 0 - 3, z transgenicznej linii myszy typu dzikiego (WT) lub α7 nAChR) z CO2. Odetnij głowę każdemu szczeniakowi i zachowaj ogon w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu genotypowania post facto. Wykonaj następujące czynności w wysterylizowanym kapturze.
  2. Usuń górną część czaszki nożyczkami i kleszczami, aby odsłonić cały mózg. Zaczynając od miejsca, w którym kora mózgowa oddziela się od siebie doogonowo, uzyskaj przekrój koronalny, który zawiera tylną korę, w tym vHipp5,21 pod mikroskopem preparacyjnym.
  3. Wypreparuj paski tkanki vHipp zawierające region CA1-subiculum zgodnie z rozwijającym się atlasem mózgu myszy22 (ryc. 1A). Przenieść do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm zawierającego zimne pożywki (4 °C), pokroić w małe cienkie plasterki (około 100 μm × 100 μm mikroplasterki).
  4. Wstępnie inkubować szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 12 mm pokrytych poli-D-lizyną/lamininą w 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych z pożywką hodowlaną (~ 500 μl) przez co najmniej 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Usunąć podłoże przed posiewem mikroplastrów.
  5. Płytka z polerowaną ogniowo pipetą Pasteura na środku szkiełka nakrywkowego z minimalną ilością podłoża (~ 50 μl, zawierające ~ 20 sztuk mikroplastrów) w celu ułatwienia mocowania eksplantatów. Płytki vHipp mikroplastry pochodzące od pojedynczego zwierzęcia (genotyp +/+ lub -/- transgenicznej linii α7) na każdym szkiełku nakrywkowym.
  6. Po tym, jak eksplantaty osiądą na szkiełku nakrywkowym, delikatnie dodaj dodatkowe podłoża (~ 100 μl) przy ścianie, tak aby poziom podłoża był wystarczająco wysoki, aby całkowicie pokryć eksplantaty na obrzeżach, ale nie te w środku szkiełka nakrywkowego.
  7. Po inkubacji O/N w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 należy rozproszyć neurony nAcc od 18 dnia embrionalnego do 1 dnia po urodzeniu myszy WT i dodać do eksplantatów.
    1. Wypreparuj tkanki nAcc zgodnie z rozwijającym się atlasemmózgu myszy 20 (ryc. 1B).
    2. Pokrój na małe kawałki (około 500 μm × 500 μm mikroplasterki) i przenieś do probówki o pojemności 15 ml.
    3. Traktować 0,25% trypsyną (2 ml) przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Umyć kawałki tkanki trzykrotnie zimnym środkiem myjącym (5 ml, 4 °C), a następnie raz przemyć w zimnej pożywce hodowlanej (5 ml, 4 °C). Pozostawić zawiesinę na 5 minut na każdym etapie płukania, a następnie ostrożnie wylać supernatant.
    4. Dysocjację komórek przez delikatne rozcieranie w 2 ml pożywki hodowlanej za pomocą lekko wypolerowanej pipety Pasteura.
    5. Przenieść zawiesinę komórek do innej probówki o pojemności 15 ml i odwirować z prędkością 2 000 x prędkość obrotową przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce w stężeniu 1 ml na 6 młodych. Rozproszyć komórki, kilkakrotnie delikatnie pipetując w pożywce za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura.
    6. Dodać 0,25 ml rozproszonych komórek nAcc do każdego szkiełka nakrywkowego z eksplantatami vHipp.
    7. Utrzymuj kultury w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Umieść płytki hodowlane na zwilżonych sterylnych gazikach, aby mechanicznie ustabilizować i utrzymać wilgotność, ułatwiając tworzenie synaps.

2. Immunocytochemia

  1. Utrwal kultury (5 - 7 dni in vitro) w 4% paraformaldehydzie/4% sacharozy/PBS (~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 20 min, RT).
  2. Kultury przepuszczalne należy przepuszczać za pomocą 0,25% Triton X-100/ PBS (~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 5 min, RT).
  3. Blokuj hodowle z 10% normalną surowicą osła w PBS (~ 500 μl na szkiełko nakrywkowe, 30 min, RT) przed barwieniem przeciwciał. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi O/N w temperaturze 4 °C. Stosować następujące przeciwciała pierwszorzędowe: anty-nAChRs (α4-ECD 1:500; anty-α5 podjednostek, 1:500), przeciwpęcherzykowy transporter glutaminianu 1 (1:250), anty-GAD65 (1:100).
  4. Wypłukać przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą PBS (3 razy/~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 5 min), a następnie inkubować kultury w przeciwciałach drugorzędowych skoniugowanych z Alexa 488 (~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 1:500) lub Alexa 594 (~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 1:500) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  5. Inkubować kultury w αBgTx sprzężone z Alexa 594 (~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 1:1,000 w pożywce hodowlanej) przez 45 minut w temperaturze 37 °C przed utrwaleniem w celu znakowania powierzchni α7*nAChRs.
  6. Zamontuj i uszczelnij szkiełka nakrywkowe.
  7. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektywy planapochromatyczne (20X z 0,8 NA lub 63X olej z 1,4 NA) i kamerę CCD.

3. Fuzja pęcherzykowa na bazie FM1-43

  1. Utrzymuj hodowle (5 - 7 dni in vitro) w komorze obrazowania, zamontuj komorę na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem. Ciągły perfuzja (1 ml/min) z koktajlem HBS w temperaturze pokojowej.
  2. Zatrzymaj perfuzję i załaduj kultury za pomocą 10 μM FM1-43 w 56 mM K+ ACSF (~500 μl) przez 90 sekund (barwienie), zmyj zewnętrzny barwnik przez 15 minut za pomocą Ca2+ free HBS zawierającego ADVASEP-7 (0,1 mM), aby usunąć FM1-43 związany z błoną.
  3. Stymulować kultury za pomocą 56 mM K+ ACSF (~500 μl) bez FM1-43 przez 120 sekund (odbarwienie), ponownie załadować kultury za pomocą FM1-43 w tych samych warunkach i ponownie przemywać za pomocą Ca2+ free HBS zawierającego ADVASEP-7 przez 15 min.
  4. Rejestruj obrazy fluorescencyjne FM1-43 za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem wyposażonym w obiektyw planapochromatyczny (60X woda o 1,4 NA, wzbudzenie 488 nm, emisja 530 nm) i rejestruj obrazy za pomocą kamery CCD.
  5. Zbierz wyjściowe obrazy fluorescencji FM1-43 (co 2 s przez 1 min) jako kontrolę przed nikotyną; zastosuj nikotynę (1 μM) przez szybką perfuzję (2 ml / min) przez 1 minutę, a następnie wypłucz nikotynę koktajlem HBS. Rób zdjęcia poklatkowe przed, w trakcie i po aplikacji nikotyny co 2 sekundy przez 5 minut.
  6. Określ ilościowo intensywność fluorescencji FM1-43 przed (barwienie F) i po (barwienie F) zastosowaniu nikotyny w każdym bulionie synaptycznym.
  7. Obliczyć całkowitą ilość uwalnialnej fluorescencji FM1-43 wzdłuż aksonów vHipp, określając ilościowo różnicę intensywności fluorescencji FM1-43 przed i po zastosowaniu nikotyny (ΔF =barwienie F-Fodbarwienie). Przeanalizuj frakcję spadku intensywności fluorescencji po nikotynie za pomocą następującego równania:F spadek% =barwienie ΔF/F.

4. Obrazowanie wapnia

  1. Szybko przepłukać kultury (5 - 7 dni in vitro) normalnym HBS, a następnie załadować kultury 5 μM wskaźnikiem Fluo-4 Ca2+ (ester AM) i 0,02% Pluronic F-127 w HBS (2 ml) przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Wypłukać roztwór Fluo-4 HBS (3 razy/5 min). Umieścić kultury z powrotem w inkubatorze (37 °C / 5% CO2 ) przez co najmniej 30 minut.
  3. Utrzymuj hodowle w tej samej komorze obrazowania i w tych samych warunkach, jak opisano w sekcji fuzji pęcherzykowej opartej na FM1-43 (patrz krok 3.1).
  4. Zbieraj obrazy fluorescencyjne Fluo-4 projekcji aksonalnych z mikrowarstw vHipp za pomocą obiektywu planapochromatycznego (60X woda z 1,4 NA, wzbudzenie 488 nm, emisja 530 nm) i kamery CCD.
  5. Zbierz wyjściowe obrazy fluorescencji Fluo-4 (co 10 sekund przez 2 minuty) jako kontrolę przed nikotyną, zastosuj nikotynę (1 μM) przez szybką perfuzję (2 ml / min) przez 1 minutę, a następnie wypłucz nikotynę koktajlem HBS. Rób zdjęcia poklatkowe przed, w trakcie i po aplikacji nikotyny co 10 sekund przez 30 minut.
  6. Zapisz wszystkie klatki surowych obrazów fluorescencji fluo-4, wyeksportuj jako serię obrazów w formacie TIFF w celu dalszej analizy.
  7. Zbierz zintegrowaną intensywność fluorescencji fluo-4 wzdłuż aksonów vHipp przed i po aplikacji nikotyny.
  8. Znormalizuj zintegrowaną intensywność fluorescencji za pomocą następującego równania: ΔF/F0 = (F-F0)/F0, gdzie F0 to zintegrowana intensywność fluorescencji sprzed nikotyny z korektą tła, a F jest zintegrowaną intensywnością fluorescencji wzdłuż aksonów vHipp w każdym punkcie czasowym po zastosowaniu nikotyny. Analizuj i wykreślaj znormalizowaną zintegrowaną intensywność fluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowany preparat składa się z chimerycznych kokultur genetycznych obwodów vHipp–nAcc in vitro. Projekcje wychodzące z mikropłatków vHipp, stanowiące presynaptyczny wkład aksonalny, mogą tworzyć kontakty synaptyczne z celami postsynaptycznymi, którymi są rozproszone neurony nAcc. Nikotyna wywołała trwałe (≥ 30 min) ułatwienie transmisji glutaminergicznej z neuronów nAcc unerwionych przez aksony vHipp21 oraz przedłużone sygnalizowanie wapniowe wzdłuż aksonów vHipp5 za pośrednictwem presyn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany preparat do współhodowli rekapituluje brzuszne obwody hipokampa-półleżącego in vitro. Preparat ten pozwala na stosunkowo proste i wiarygodne badanie profili przestrzennych i czasowych, za pomocą których aktywacja presynaptycznych nAChR wywołuje zwiększoną transmisję glutaminergiczną5, 21.

Hodowle kologiczne definiuje się jako wzrost różnych określonych typów komórek w jednym naczyniu, które mogą zapewnić warunki fizjologiczne in vitro , aby wykazać funkcję<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Yehui Qin i Mallory Myers za wsparcie techniczne. Dziękujemy również dr Sigismundowi Huckowi za dostarczenie nam przeciwciała anty-α4-ECD. Praca ta jest wspierana przez grant National Institutes of Health NS22061 dla L. W. R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Pożywki hodowlane (50 ml)
Neurobasal GIBCO1088802248 ml
Suplementy B-27GIBCO0080085-SA1 ml
Penicylina-StreptomycynaGIBCO10908-0100,5 ml
Suplement GlutaMAXGIBCO35050-0610,5 ml
Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)GIBCO15140-12220 ng/ml
2. środki myjące (HBSS, 100 ml)
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej GIBCO14175-09599 ml
HEPES ( 1M)GIBCO15630-1301 ml
3. Sól fizjologiczna buforowana HEPES  (HBS)    pH=7,3
NaClSigmaS9888 135 mM
KClSigmaP9333 5 mM
MgCl2SigmaM8266 1 mM
CaCl2,SigmaC1016 2 mM
HEPESSigmaH3375 10 mM
Sigma glukozyG0350500 10 mM
4. HBS Koktajl do obrazowania na żywo pH=7.3
NaClSigmaS9888 135 mM
KClSigmaP9333 5 mM
MgCl2SigmaM8266 1 mM
CaCl2,SigmaC1016 2 mM
HEPESSigmaH3375 10 mM
Sigma glukozyG0350500 10 mM
tetrodotoksyna Tocris10782 &mikro; M
bicucullineTocris13110 µ M
D-AP-5Tocris10550 & mikro; M
CNQXTocris104520 & mikro; M
LY341495Tocris120910 & mikro; M
5. Nie zawiera wapnia  HBS    pH=7,3
NaClSigmaS9888 135 mM
KClSigmaP9333 5 mM
MgCl2SigmaM8266 1 mM
HEPESSigmaH3375 10 mM
Sigma glukozyG0350500 10 mM
6. 56 mM Potas ACSF pH=7,4
NaClSigmaS9888119 mM
KClSigmaP933356 mM
MgSO4.7HSigmaM18801,3 mM
CaCl2SigmaC10162,5 mM
NaH2PO4SigmaS82821 mM
NaHCO3SigmaS576126,2 mM
Sigma glukozyG0350500 10 mM

Bibliografia

  1. Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
  2. Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
  3. Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
  4. Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
  5. Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719(2013).
  6. McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
  7. Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
  8. Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
  9. Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
  10. Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911(2011).
  11. Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
  12. Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
  13. Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
  14. Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  15. Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
  16. Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
  17. Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
  18. Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  19. Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
  20. St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
  21. Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
  22. Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , CRC Press. New York. (1998).
  23. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  24. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
  25. Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
  26. Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
  27. Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie żywych komórekkonfokalny mikroskop z dyskiem wirującymnikotynowe receptory acetylocholinypreparacja chimer genetycznychobwód brzusznego hipokampa i jądra półleżącegobarwienie FM 1-43wskaźnik wapnia FluoFour
Obrazowanie na żywo indukowanej nikotyną sygnalizacji wapnia i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.