Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Podsumowanie

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Streszczenie

Zdolność komórek do migracji jest kluczowa w wielu różnych funkcjach komórek przez całe życie, od rozwoju embrionalnego i gojenia się ran po przerzuty nowotworów i nowotworów. Pomimo intensywnych wysiłków badawczych, podstawowe biochemiczne i biofizyczne zasady migracji komórek nadal nie są w pełni poznane, zwłaszcza w fizjologicznie istotnych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach. W tym miejscu opisujemy test in vitro zaprojektowany w celu umożliwienia ilościowego badania zachowań związanych z migracją komórek 3D. Metoda wykorzystuje zdolność mechanosensoryczną komórki i skłonność do migracji do wcześniej niezajętej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Jako układ modelowy wykorzystujemy inwazję wysoce inwazyjnych komórek raka piersi, MDA-MB-231, w żelach kolagenowych. Rozprzestrzenianie się populacji komórek i dynamika migracji poszczególnych komórek w ciągu tygodni hodowli mogą być monitorowane za pomocą obrazowania żywych komórek i analizowane w celu wyodrębnienia danych o rozdzielczości czasowo-przestrzennej. Co więcej, metodę tę można łatwo dostosować do różnych macierzy zewnątrzkomórkowych, oferując w ten sposób prosty, ale skuteczny sposób badania roli czynników biofizycznych w mikrośrodowisku na migrację komórek.

Wprowadzenie

Migracja komórek odgrywa kluczową rolę w różnych reakcjach fizjologicznych, takich jak rozwój embrionalny, hemostaza i odpowiedź immunologiczna, a także w procesach patologicznych, takich jak choroby naczyniowe, stany zapalne i rak¹. Analiza czynników biochemicznych i biofizycznych leżących u podstaw migracji komórek ma zatem fundamentalne znaczenie nie tylko dla zrozumienia podstawowych zasad funkcjonowania komórek, ale także dla rozwoju różnych zastosowań biomedycznych, takich jak inżynieria tkankowa, leki przeciwprzerzutowe i opracowywanie leków przeciwzapalnych. Ponieważ obserwacja in vivo jest wyzwaniem technicznym, wiele wysiłków skupiono na rekapitulacji migracji komórek in vitro.

Metody in vitro do badania migracji komórek zostały w dużej mierze zaprojektowane do testów na dwuwymiarowych (2D) powierzchniach, w szczególności do testów zadrapań lub gojenia się ran². Takie testy oferują prostą konfigurację eksperymentalną, łatwe obrazowanie żywych komórek i dostarczają przydatnych informacji na temat różnych mechanizmów biochemicznych leżących u podstaw migracji komórek. Jednak testy te nie uwzględniają architektury i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które są krytycznymi aspektami w zrozumieniu migracji in vivo. Ostatnio coraz bardziej docenia się fakt, że model hodowli 3D, często w matrycach na bazie kolagenu³, stanowi platformę, która lepiej przypomina sytuację in vivo. Rzeczywiście, komórki wykazują dynamikę migracji, która różni się od tej na powierzchniach 2D, zwłaszcza ze względu na różną wymiarowość środowiska⁴. Ponadto właściwości biofizyczne i mechaniczne macierzy wrażliwie wpływają na migrację komórek⁵, w tym w kontekście inwazji komórek nowotworowych⁶.

Tutaj prezentujemy metodę badania migracji komórek 3D w ECM z właściwościami biofizycznymi, które można łatwo zmieniać w zależności od warunków przygotowania. Komórki są zasiane w "wewnętrznym żelu" i pozwala im się uciec i zaatakować początkowo bezkomórkowy "żel zewnętrzny". Metoda opiera się na zdolności komórki do rozpoznawania obecności i skłonności do migracji do regionów wolnych od komórek w zewnętrznym żelu, co jest ściśle związane z mechanodetekcją komórki7. W tym badaniu wykorzystujemy sieci kolagenowe jako ECM zaatakowane przez wysoce inwazyjne komórki raka piersi, MD-MBA-231. Właściwości mechaniczne i mikrostrukturę zarówno żeli wewnętrznych, jak i zewnętrznych można dostroić⁸ i scharakteryzować⁹ w celu uzyskania fizjologicznie istotnych warunków. Rekonstrukcja i analiza śladów komórkowych pozwala na szczegółowe ilościowe badanie zachowań migracyjnych w przestrzeni czasowej zarówno na poziomie populacji, jak i na poziomie poszczególnych komórek. Co ważne, konfiguracja koncentrycznego systemu żelowego naśladuje topologię tkanek in vivo, z którą borykają się migrujące komórki, zwłaszcza atakujące komórki nowotworowe, oferując w ten sposób ważny wgląd w fizyczne mechanizmy migracji komórek i przerzutów.

Protokół

1. Zbieranie komórek

1. Uzyskać komórki MD-MBA-231 z inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .} Odłącz komórki od płytki do hodowli tkankowej za pomocą 0,5% roztworu trypsyny-EDTA. Użyć 1 ml roztworu trypsyny-EDTA do hodowli komórek w kolbie T25.
2. Osadzać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie przy 200 × g przez 4 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki hodowlanej.
3. Policz gęstość komórek, ρ, za pomocą hemocytometru.
   Uwaga: Aby przygotować wewnętrzny żel z nasionami komórek, zawiesina komórek zostanie później rozcieńczona o 10× aby osiągnąć ostateczną gęstość wysiewu komórek. Dlatego wymagana jest 10× skoncentrowana zawiesina komórek.
4. Obliczyć objętość pożywki wymaganą do osiągnięcia stężenia 10× komórek:
   
   Uwaga: Końcowa gęstość wysiewu komórek, c_końcowa, wynosząca około 2 × 10⁶ komórek/ml jest zalecana dla komórek MD-MBA-231 i jest stosowana w tym protokole. Inne gęstości wysiewu można również badać dla innych typów komórek.
5. Ponownie osadzać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie przy 200 × g przez 4 minuty i odsysać supernatant.
6. Ponownie zawiesić komórki w wymaganej ilości (_pożywka V obliczona w kroku 1.3) pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy, aby zminimalizować zlepianie się komórek.
   Uwaga: Czerwień fenolowa jest autofluorescencyjna i może zakłócać obrazowanie fluorescencyjne/refleksyjne. W celu uzyskania najlepszej jakości obrazu można rozważyć użycie podłoża wolnego od czerwieni fenolowej.

2. Przygotowanie roztworów kolagenowych

1. Otrzymać podstawowy roztwór kolagenu, bufor 10× PBS, Milli-Q H₂O, 0,1 M NaOH i kilka probówek do mikrowirówek. Trzymaj wszystko na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu i utrzymać sterylny stan.
2. Zrównoważyć sterylne naczynie ze szklanym dnem, podgrzewając je wstępnie w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
   Uwaga: Wszystkie objętości w tym protokole zostały zoptymalizowane pod kątem naczynia ze szklanym dnem i dołkiem 12 mm. Jeśli używany jest inny typ naczynia, odpowiednio dostosuj głośność.
3. Obliczyć wymaganą objętość potrzebną do przygotowania 50 μl 2,4 mg/ml roztworu kolagenu do żelu wewnętrznego (roztworu I) na podstawie stężenia wyjściowego kolagenu.
   Uwaga: Można również stosować inne stężenia kolagenu do żelu wewnętrznego.
4. W sterylnym środowisku (zazwyczaj kaptur bezpieczeństwa biologicznego) powoli dodawać 5 μl buforu 10× PBS do wymaganej ilości roztworu podstawowego kolagenu (obliczonej w kroku 2.3), delikatnie obracając. Uważaj, aby nie tworzyć się pęcherzyków powietrza.
5. Dostosować pH mieszaniny do 7,4 za pomocą 0,1 M NaOH za pomocą skalibrowanego pH-metru. Jako przybliżoną wskazówkę użyj około 5 μl, aby zbliżyć pH do 7,4 (ilość różni się w zależności od stężenia i pH).
   Uwaga: Należy pamiętać, że objętości objęte tym krokiem są zbyt małe, aby można było użyć standardowego pH-metru. Użyj jednej z następujących sztuczek:
   1. Przygotuj roztwory kolagenu dla wielu próbek. Dostosuj pH luzem za pomocą standardowego pH-metru i rozprowadź roztwory kolagenu po próbkach.
   2. Alternatywnie, dostosuj pH roztworu kolagenu w większej objętości (i.e., objętość, która pozwala na użycie standardowego pH-metru). Zwróć uwagę na ilość NaOH potrzebną do doprowadzenia pH do końcowego pH. Zmniejsz objętości i użyj odpowiedniej ilości NaOH do eksperymentu. Potwierdź wartość pH za pomocą papierka lakmusowego.
   3. W przeciwnym razie użyj mikroelektrody pH, aby dokładniej dostosować pH małych ilości.
6. Doprowadzić roztwór do objętości 45 μl za pomocą_H2O. Wykonać wszystkie czynności na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu.

3. Tworzenie koncentrycznej kultury żelu

1. Wyjmij wstępnie podgrzane naczynie ze szklanym dnem (patrz krok 2.2) z inkubatora.
2. Dodać 5 μl 10× skoncentrowanej zawiesiny komórkowej (przygotowanej w kroku 1.5) do roztworu I. Dokładnie zawiesić. Uważaj, aby nie tworzyć się pęcherzyków powietrza. Mieszanina ma teraz objętość 50 μl i zawiera końcowe stężenie kolagenu (2,4 mg/ml) oraz gęstość komórek (c_final = 2 × 10⁶ komórek/ml).
3. Dodać powoli 20 μl roztworu zawierającego komórkę I do środka studzienki, tak aby utworzyła kropelkę w kształcie kopuły (ryc. 1A). Na tym etapie należy uważać, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Jeśli utworzy się bąbel, ostrożnie, ale szybko spróbuj go rozerwać lub wyssać za pomocą końcówki pipety. Delikatnie umieść naczynie z powrotem w inkubatorze, aby wewnętrzny żel mógł polimeryzować przez 45 minut.
4. Przygotować roztwór O (dla zewnętrznego, bezkomórkowego żelu kolagenowego) około 15 minut przed końcem tego etapu inkubacji.
   Uwaga: Stan zewnętrznego żelu może być zróżnicowany pod względem stężenia kolagenu i pH polimeryzacji, aby uzyskać sieci o różnych mikrostrukturach¹⁰. W tym protokole skoncentruj się na żelu kolagenowym 1,5 – 4,0 mg / ml spolimeryzowanym o pH 7,4.
   1. Na podstawie stężenia wyjściowego kolagenu obliczyć wymaganą objętość potrzebną do przygotowania 200 μl roztworu kolagenu O o końcowym stężeniu.
5. Powoli dodawać 20 μl buforu 10× PBS do wymaganej ilości roztworu podstawowego kolagenu (obliczonej w kroku 3.4), delikatnie obracając. Dostosować pH mieszaniny do końcowego pH za pomocą 0,1 M NaOH za pomocą skalibrowanego pH-metru. Patrz uwaga do kroku 2.5 dotycząca regulacji pH.
6. Doprowadzić roztwór do końcowej objętości 200 μl za pomocą_H2O. Wykonaj wszystkie czynności na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu.
7. Wyjąć szalkę z inkubatora po 45 minutach polimeryzacji żelu wewnętrznego (patrz krok 3.3). Delikatnie dodać 180 μl roztworu O na wierzch żelu wewnętrznego, tak aby roztwór całkowicie pokrył żel wewnętrzny i wypełnił studzienkę (ryc. 1B).
   1. Wykonaj ten krok ostrożnie, nie mieszając roztworu, co może prowadzić do niejednorodnej orientacji włókien w żelu zewnętrznym. Należy uważać, aby nie dotykać wewnętrznego żelu końcówką pipety i nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza lub kieszeni powietrznych. Jeśli utworzy się bąbel, ostrożnie, ale szybko spróbuj go rozerwać lub wyssać za pomocą końcówki pipety. Delikatnie umieść naczynie z powrotem w inkubatorze, aby zewnętrzny żel uległ polimeryzacji.
8. Wyjmij naczynie z inkubatora po 45 minutach polimeryzacji. W tym momencie żel powinien być już dość zestalony, chociaż nadal może oderwać się od dolnej powierzchni, jeśli jest traktowany nieostrożnie.
   1. Delikatnie wlej 2 ml podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych do naczynia (ryc. 1C). Upewnij się, że żel jest całkowicie zanurzony w podłożu. Pożywkę należy odświeżać co 2 – 3 dni przez cały okres hodowli.

4. Obrazowanie żywych komórek

1. Wykonaj obrazowanie za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w funkcję długoterminowego obrazowania żywych komórek. Zawierają wbudowaną komorę inkubacyjną z kontrolą temperatury (37 °C) i CO₂ (5%). Włącz mikroskop i rozgrzej stage co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu.
   Uwaga: Użyj soczewki obiektywowej o dużej odległości roboczej, aby zoptymalizować obserwację i lokalizację komórek w żelach 3D.
2. Inkubować żel w pożywce zawierającej 5 μl fluorescencyjnego barwnika śledzącego komórki przez 30 minut, aby umożliwić dokładną lokalizację komórek w systemie 3D. Następnie usuń niezwiązany barwnik, przemywając go trzykrotnie 1× PBS. Następnie dodaj pożywkę do hodowli komórkowych do naczynia.
3. Wyjmij naczynie z inkubatora i umieść je na stoliku mikroskopu (Rysunek 1D).
   Uwaga: Obrazowanie żywych komórek można rozpocząć w zasadzie zaraz po polimeryzacji żelu zewnętrznego. Jednak w tym momencie komórki w wewnętrznym żelu jeszcze się nie rozprzestrzeniły. Aby zbadać migrację pierwszych komórek, które zaatakowały zewnętrzny żel, obrazowanie żywych komórek można rozpocząć 24 godziny (w zależności od typu komórki) po zainicjowaniu hodowli. Z grubsza można powiedzieć, że potrzeba około 12 - 14 dni hodowli, aby większość komórek w żelu wewnętrznym dostała się do żelu zewnętrznego.
4. Wybierz Objętości widoku (VoV) w regionach w zewnętrznym żelu otaczających wewnętrzny żel. Po 24 godzinach inkubacji populacja komórek rozprzestrzeni się, przekroczy granicę faz między wewnętrznym i zewnętrznym żelem i zacznie atakować żel zewnętrzny.
   1. W przypadku VoV uwzględnij regiony żelu bezpośrednio obok granicy faz żelu, regiony pośrednie i regiony blisko obrzeża zewnętrznego żelu⁷. Wyklucz obszary znajdujące się bliżej niż 50 μm od dolnej i bocznych powierzchni, a także od górnej części żelu, aby uniknąć możliwych efektów krawędziowych. Każdy VoV zazwyczaj mierzy 647 × 647 × 100 μm³ (odpowiednio w kierunkach x, y i z), z interwałem 5 μm w stosie z.
5. Upewnij się, że tryby obrazowania, kanały/filtry, czasy ekspozycji i rozdzielczości obrazu są prawidłowo wybrane. Aby obrazować sieć kolagenową bez znaczników, należy użyć konfokalnej mikroskopii refleksyjnej jednocześnie podczas obrazowania poklatkowego żywych komórek.
6. Weź przykładowe obrazy, wykreśl histogramy intensywności i dostosuj wzmocnienia i przesunięcia, aby zaobserwować wystarczający sygnał i uniknąć nasycenia, upewniając się, że histogram leży między zerem a maksymalną intensywnością. Nie zmieniaj tych ustawień przez cały czas trwania eksperymentu.
7. Wykonaj zdjęcia poklatkowe wybranych VoV, z przedziałem czasowym Δt wynoszącym 10 minut przez 8 godzin (lub dłużej, jeśli to konieczne).

5. Śledzenie komórek i analiza danych

1. Przeprowadź ilościowe przetwarzanie końcowe obrazu z obrazów z-stack za pomocą odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu.
   1. Podziel obrazy poklatkowe na segmenty, aby automatycznie wybrać pozycje komórek 3D w (x,y,z,t).
   2. Dla każdej klatki ręcznie sprawdź dokładność lokalizacji i usuń fałszywe alarmy spowodowane szczątkami komórek i wystającymi elementami komórkowymi, które mogły zostać pomylone z komórkami. Usuń komórki proliferacyjne z analizy i podziel nakładające się lub połączone komórki na odrębne obiekty.
2. Wygeneruj poklatkowe ścieżki komórek 3D ze współrzędnych komórki (x,y,z,t) uzyskanych w poprzednim kroku, łącząc lokalizację każdej komórki w sekwencji czasowej.
3. Wyeliminuj szumy losowe i systemowe, usuwając ścieżki krótsze niż progowa długość ścieżki (zwykle 20 minut).
4. Skorygować dryft próbki, odejmując w razie potrzeby całkowite przemieszczenia netto od torów.
5. Oblicz przemieszczenie komórki, , oraz odległość migracji komórki, , od obserwowanych trajektorii komórek, gdzie jest wektorem reprezentującym lokalizację 3D komórki w czasie i jest całkowitą liczbą punktów czasowych.
   1. Oblicz prędkość komórki jako S = d/(n • Δt), gdzie Δt to odstęp czasu między klatkami. Oblicz kierunkowość (lub trwałość) migracji komórek za pomocą P = Δd/d. Ta prosta miara trwałości oznacza, że dla P = 0 przemieszczenie netto wynosi zero, a dla P = 1 trajektoria jest prostą linią kierunkową.

Wyniki

Prezentowany tutaj test koncentrycznego żelu został przeprowadzony przy użyciu wysoce inwazyjnych komórek raka piersi, MDA-MB-231, z wewnętrznym żelem kolagenowym 2,4 mg/ml i gęstością wysiewu komórek = 2 × 10⁶ komórek/ml, jako przykład. Jak pokazano na rysunku 2, zazwyczaj po kilku dniach hodowli komórki naruszyły wewnętrzną-zewnętrzną granicę faz żelu i zaczęły atakować zewnętrzny żel. Populacja komórek rozprzestrzeniała się głównie promieniście na zewnątrz.

Warun...

Dyskusja

W tym protokole opisujemy test in vitro w celu zbadania zachowania migracyjnego 3D komórek w środowiskach macierzowych, które topologicznie przypominają ECM napotkane in vivo. Istnieją trzy główne zalety tego testu w porównaniu z innymi obecnie dostępnymi metodami. Po pierwsze, test ten pozwala na jednoczesne badanie mechanizmów migracji komórek zarówno na poziomie populacji, jak i na poziomie poszczególnych komórek. Otwiera to możliwości badania zbiorowej migracji komórek¹³, która do tej por...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator do hodowli komórkowych	Fisher Scientific Pte Ltd	Model: 371, S/No 318854-6055
Mikroskop konfokalny	Nikon A1R		Odwrócony konfokalny laserowy mikroskop skaningowy wyposażony w komorę inkubatora
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Life Technologies	10082-147
Fluorescencyjny barwnik CellTracker CMTMR	Life Technologies	C2927
Naczynie ze szklanym dnem	IWAKI Cell Biology	3931-035	Naczynie o średnicy 35 mm ze szklanym dnem o średnicy 12 mm
Hemocytometr	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Improved)
Mikroprocesorowy pH-metr	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Collagen	Advanced BioMatrix	#5010-D	Kolagen bydlęcy typu I rozpuszczalny w kwasie (pH fabryczne ~ 2)
Soczewka obiektywu	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8,2-6,9mm, NA 0,45.
Penicylina-Streptomycyna	Life Technologies	15140-122
pH-metr	Sartorius	S/No 29153352	Podstawowy pH-metr PB-11
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054