Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Podsumowanie

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Streszczenie

Zdolność komórek do migracji jest kluczowa w wielu różnych funkcjach komórek przez całe życie, od rozwoju embrionalnego i gojenia się ran po przerzuty nowotworów i nowotworów. Pomimo intensywnych wysiłków badawczych, podstawowe biochemiczne i biofizyczne zasady migracji komórek nadal nie są w pełni poznane, zwłaszcza w fizjologicznie istotnych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach. W tym miejscu opisujemy test in vitro zaprojektowany w celu umożliwienia ilościowego badania zachowań związanych z migracją komórek 3D. Metoda wykorzystuje zdolność mechanosensoryczną komórki i skłonność do migracji do wcześniej niezajętej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Jako układ modelowy wykorzystujemy inwazję wysoce inwazyjnych komórek raka piersi, MDA-MB-231, w żelach kolagenowych. Rozprzestrzenianie się populacji komórek i dynamika migracji poszczególnych komórek w ciągu tygodni hodowli mogą być monitorowane za pomocą obrazowania żywych komórek i analizowane w celu wyodrębnienia danych o rozdzielczości czasowo-przestrzennej. Co więcej, metodę tę można łatwo dostosować do różnych macierzy zewnątrzkomórkowych, oferując w ten sposób prosty, ale skuteczny sposób badania roli czynników biofizycznych w mikrośrodowisku na migrację komórek.

Wprowadzenie

Migracja komórek odgrywa kluczową rolę w różnych reakcjach fizjologicznych, takich jak rozwój embrionalny, hemostaza i odpowiedź immunologiczna, a także w procesach patologicznych, takich jak choroby naczyniowe, stany zapalne i rak¹. Analiza czynników biochemicznych i biofizycznych leżących u podstaw migracji komórek ma zatem fundamentalne znaczenie nie tylko dla zrozumienia podstawowych zasad funkcjonowania komórek, ale także dla rozwoju różnych zastosowań biomedycznych, takich jak inżynieria tkankowa, leki przeciwprzerzutowe i opracowywanie leków przeciwzapalnych. Ponieważ obserwacja in vivo jest wyzwaniem technicznym, wiele wysiłków skupiono na rekapitulacji migracji komórek in vitro.

Metody in vitro do badania migracji komórek zostały w dużej mierze zaprojektowane do testów na dwuwymiarowych (2D) powierzchniach, w szczególności do testów zadrapań lub gojenia się ran². Takie testy oferują prostą konfigurację eksperymentalną, łatwe obrazowanie żywych komórek i dostarczają przydatnych informacji na temat różnych mechanizmów biochemicznych leżących u podstaw migracji komórek. Jednak testy te nie uwzględniają architektury i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które są krytycznymi aspektami w zrozumieniu migracji in vivo. Ostatnio coraz bardziej docenia się fakt, że model hodowli 3D, często w matrycach na bazie kolagenu³, stanowi platformę, która lepiej przypomina sytuację in vivo. Rzeczywiście, komórki wykazują dynamikę migracji, która różni się od tej na powierzchniach 2D, zwłaszcza ze względu na różną wymiarowość środowiska⁴. Ponadto właściwości biofizyczne i mechaniczne macierzy wrażliwie wpływają na migrację komórek⁵, w tym w kontekście inwazji komórek nowotworowych⁶.

Tutaj prezentujemy metodę badania migracji komórek 3D w ECM z właściwościami biofizycznymi, które można łatwo zmieniać w zależności od warunków przygotowania. Komórki są zasiane w "wewnętrznym żelu" i pozwala im się uciec i zaatakować początkowo bezkomórkowy "żel zewnętrzny". Metoda opiera się na zdolności komórki do rozpoznawania obecności i skłonności do migracji do regionów wolnych od komórek w zewnętrznym żelu, co jest ściśle związane z mechanodetekcją komórki7. W tym badaniu wykorzystujemy sieci kolagenowe jako ECM zaatakowane przez wysoce inwazyjne komórki raka piersi, MD-MBA-231. Właściwości mechaniczne i mikrostrukturę zarówno żeli wewnętrznych, jak i zewnętrznych można dostroić⁸ i scharakteryzować⁹ w celu uzyskania fizjologicznie istotnych warunków. Rekonstrukcja i analiza śladów komórkowych pozwala na szczegółowe ilościowe badanie zachowań migracyjnych w przestrzeni czasowej zarówno na poziomie populacji, jak i na poziomie poszczególnych komórek. Co ważne, konfiguracja koncentrycznego systemu żelowego naśladuje topologię tkanek in vivo, z którą borykają się migrujące komórki, zwłaszcza atakujące komórki nowotworowe, oferując w ten sposób ważny wgląd w fizyczne mechanizmy migracji komórek i przerzutów.

Protokół

1. Zbiór komórek

1. Wyjąć komórki MD-MBA-231 z inkubatora ustawionego na 37 °C i 5% CO₂. Oddzielić komórki od płytki do hodowli tkanek, używając 0,5% roztworu Trypsyny-EDTA. W przypadku komórek hodowanych w kolbie T25 należy zużyć 1 ml roztworu Trypsyny-EDTA.
2. Zbić komórki w stożkowej probówce 15 ml poprzez wirowanie przy 200 × g przez 4 min, odessać nadosad i resuspendować komórki w 5 ml pożywki hodowlanej.
3. Oznaczyć gęstość komórek, ρ, za pomocą hemocytometru.
   Uwaga: W celu przygotowania wewnętrznego żelu z zasianymi komórkami, zawiesina komórkowa zostanie później rozcieńczona 10-krotnie, aby osiągnąć końcową gęstość zasiewu. W związku z tym wymagana jest 10-krotnie skoncentrowana zawiesina komórkowa.
4. Obliczyć objętość pożywki wymaganą do uzyskania 10-krotnego stężenia komórek:
   
   Uwaga: Dla komórek MD-MBA-231 zalecana jest końcowa gęstość zasiewu komórek, c_final, na poziomie około 2 × 10⁶ komórek/ml, co zostało zastosowane w niniejszym protokole. W przypadku innych typów komórek można zastosować inne gęstości zasiewu.
5. Ponownie zbić komórki w stożkowej probówce 15 ml poprzez wirowanie przy 200 × g przez 4 min i odessać nadosad.
6. Dokładnie resuspendować komórki w wymaganej ilości (V_medium obliczonej w kroku 1.3) bezserwatkowej pożywki do hodowli komórkowej, aby zminimalizować tworzenie się aglomeratów komórkowych.
   Uwaga: Czerwień fenolowa wykazuje autofluorescencję i może zakłócać obrazowanie fluorescencyjne/refleksyjne. W celu uzyskania najlepszej jakości obrazu można rozważyć zastosowanie pożywki bez czerwieni fenolowej.

2. Przygotowanie roztworów kolagenu

1. Należy przygotować roztwór Collagen stock, bufor 10× PBS oraz wodę Milli-Q H₂wodę, 0,1 M NaOH oraz kilka probówek do mikrowirówki. Wszystkie odczynniki należy przechowywać w lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu, oraz zachować warunki sterylne.
2. Urównoważyć sterylną szalkę z szklanym dnem poprzez jej uprzednie ogrzanie w 37 °C inkubator
   Uwaga: Wszystkie objętości w niniejszym protokole zostały zoptymalizowane dla szalki z szklanym dnem o średnicy dołka 12 mm. W przypadku zastosowania innego rodzaju szalki należy odpowiednio dostosować objętości.
3. Oblicz objętość wymaganą do przygotowania 50 µl 2,4 mg/ml roztworu kolagenu do żelu wewnętrznego (roztwór I), w zależności od stężenia roztworu stokowego kolagenu.
   Uwaga: Można zastosować również inne stężenia kolagenu dla żelu wewnętrznego.
4. W środowisku sterylnym (zazwyczaj w komorze z laminarnym przepływem powietrza), powoli dodać 5 µl dodaj 10× bufor PBS do wymaganej ilości roztworu zapasu kolagenu (obliczonej w kroku 2.3), delikatnie mieszając ruchem wirowym. Należy uważać, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza.
5. Dostosuj pH mieszaniny do wartości 7,4 za pomocą 0,1 M NaOH, korzystając z skalibrowanego pH-metru. Jako przybliżoną wytyczną przyjmij około 5 µl aby zbliżyć pH do wartości 7,4 (ilość zależy od stężenia i pH roztworu stokowego).
   Uwaga: Należy pamiętać, że objętości stosowane w tym kroku są zbyt małe, aby można było użyć standardowego pH-metru. Należy zastosować jeden z poniższych sposobów:
   1. Przygotować roztwory kolagenu dla wielu próbek. Dostosować pH całej partii roztworu za pomocą standardowego pH-metru, a następnie rozdzielić roztwory kolagenu pomiędzy poszczególne próbki.
   2. Alternatywnie można dostosować pH roztworu kolagenu o większej objętości (i.e., objętość umożliwiająca zastosowanie standardowego pH-metru). Odnotować ilość NaOH niezbędną do uzyskania docelowego pH. Zmniejszyć objętości i zastosować odpowiednią ilość NaOH w eksperymencie. Potwierdzić wartość pH za pomocą papierka lakmusowego.
   3. W przeciwnym razie należy użyć mikroelektrody pH, aby dokładniej dostosować pH niewielkich ilości roztworu.
6. Dopełnić roztwór do objętości 45 µl przy użyciu H₂O. Wszystkie etapy należy przeprowadzać w lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu.

3. Tworzenie koncentrycznej hodowli żelowej

1. Wyjąć z inkubatora wstępnie ogrzaną szalkę z szklanym dnem (patrz krok 2.2).
2. Do roztworu I dodać 5 µl 10-krotnie skoncentrowanej zawiesiny komórek (przygotowanej w kroku 1.5). Dokładnie resuspender, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Mieszanina ma obecnie objętość 50 µl i zawiera końcowe stężenie kolagenu (2.4 mg/ml) oraz gęstość komórek (c_final = 2 × 10⁶ cells/ml).
3. Powoli dodać 20 µl zawierającego komórki roztworu I do centrum dołka, tak aby utworzyła się kropla w kształcie kopuły (Rycina 1A). Na tym etapie należy unikać powstawania pęcherzyków. Jeśli powstanie pęcherzyk, należy go ostrożnie, lecz szybko przebić lub odessać końcówką pipety. Ostrożnie umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze, aby pozwolić na polimeryzację wewnętrznego żelu przez 45 min.
4. Przygotować roztwór O (dla zewnętrznego, acellularnego żelu kolagenowego) około 15 min przed końcem tego etapu inkubacji.
   Uwaga: Warunki żelu zewnętrznego można modyfikować pod kątem stężenia kolagenu i pH polimeryzacji, aby uzyskać sieci o różnych mikrostrukturach¹⁰. W niniejszym protokole skupiono się na żelu kolagenowym o stężeniu 1.5 – 4.0 mg/ml polimeryzowanym przy pH 7.4.
   1. Na podstawie stężenia roztworu stokowego kolagenu obliczyć objętość wymaganą do przygotowania 200 µl roztworu kolagenu O o końcowym stężeniu.
5. Do wymaganej ilości roztworu stokowego kolagenu (obliczonej w kroku 3.4) powoli dodać 20 µl 10× buforu PBS, delikatnie mieszając ruchem wirowym. Dostosować pH mieszaniny do końcowego pH za pomocą 0.1 M NaOH przy użyciu skalibrowanego pH-metru. Patrz uwaga do kroku 2.5 dotycząca regulacji pH.
6. Dopełnić roztwór do końcowej objętości 200 µl za pomocą H₂O. Wszystkie kroki należy wykonywać w lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu.
7. Wyjąć szalkę z inkubatora po 45 min polimeryzacji żelu wewnętrznego (patrz krok 3.3). Ostrożnie dodać 180 µl roztworu O na wierzch żelu wewnętrznego, tak aby roztwór całkowicie go przykrył i wypełnił dołek (Rycina 1B).
   1. Wykonać ten krok ostrożnie, nie mieszając roztworu, co mogłoby prowadzić do niejednorodnej orientacji włókien w żelu zewnętrznym. Należy uważać, aby nie dotknąć żelu wewnętrznego końcówką pipety oraz unikać powstawania pęcherzyków lub kieszonek powietrznych. Jeśli powstanie pęcherzyk, należy go ostrożnie, lecz szybko przebić lub odessać końcówką pipety. Ostrożnie umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze, aby pozwolić na polimeryzację żelu zewnętrznego.
8. Wyjąć szalkę z inkubatora po 45 min polimeryzacji. Żel powinien być w tym momencie już dość ścięty, choć wciąż może odkleić się od powierzchni dna przy gwałtownym obchodzeniu się z nim.
   1. Ostrożnie wlać do szalki 2 ml ogrzanej pożywki do hodowli komórek (Rycina 1C). Upewnić się, że żel jest całkowicie zanurzony w pożywce. Wymieniać pożywkę co 2 – 3 dni przez cały czas trwania hodowli.

4. Obrazowanie żywych komórek

1. Przeprowadzić obrazowanie za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w funkcję długoterminowego obrazowania żywych komórek. Urządzenie powinno posiadać wbudowaną komorę inkubacyjną z kontrolą temperatury (37 °C) i stężenia CO₂ (5%). Włączyć mikroskop i rozgrzać stolik co najmniej 1 hr przed rozpoczęciem eksperymentu.
   Uwaga: Należy użyć obiektywu o dużej odległości roboczej, aby zoptymalizować obserwację i lokalizację komórek w żelach 3D.
2. Inkubować żel w medium zawierającym 5 µl fluorescencyjnego barwnika do śledzenia komórek przez 30 min, aby umożliwić dokładną lokalizację komórek w systemie 3D. Następnie usunąć niezwiązany barwnik poprzez trzykrotne przemycie 1× PBS. Po tym czasie dodać do naczynia medium hodowlane.
3. Wyjąć naczynie z inkubatora i umieścić je na stoliku mikroskopu (Rysunek 1D).
   Uwaga: Obrazowanie żywych komórek może teoretycznie rozpocząć się bezpośrednio po polimeryzacji żelu zewnętrznego. Jednak na tym etapie komórki w żelu wewnętrznym nie zdążyły się jeszcze rozprzestrzenić. Aby zbadać migrację pierwszych komórek, które wniknęły do żelu zewnętrznego, obrazowanie żywych komórek można rozpocząć 24 hr (w zależności od typu komórek) po zainicjowaniu hodowli. Jako orientacyjną wskazówkę: w przypadku większości komórek z żelu wewnętrznego potrzeba około 12 - 14 dni hodowli, aby wniknęły one do żelu zewnętrznego.
4. Wybrać objętości widzenia (Volumes of View, VoV) w obszarach żelu zewnętrznego otaczających żel wewnętrzny. Po 24 hr inkubacji populacja komórek rozprzestrzeni się, przekroczy granicę między żelem wewnętrznym a zewnętrznym i zacznie wnikać do żelu zewnętrznego.
   1. W ramach VoV należy uwzględnić obszary żelu bezpośrednio sąsiadujące z granicą żeli, obszary pośrednie oraz obszary bliskie obrzeżom żelu zewnętrznego⁷. Należy wykluczyć obszary znajdujące się w odległości mniejszej niż 50 µm od powierzchni dolnej i bocznych, a także od górnej części żelu, aby uniknąć możliwych efektów brzeżnych. Każdy VoV ma zazwyczaj wymiary 647 × 647 × 100 µm³ (odpowiednio w kierunkach x, y i z), z odstępem 5 µm w stosie z (z-stack).
5. Upewnić się, że tryby obrazowania, kanały/filtry, czasy ekspozycji i rozdzielczości obrazów zostały prawidłowo wybrane. W celu bezznacznikowego obrazowania sieci kolagenowej należy równocześnie z obrazowaniem żywych komórek w czasie (time-lapse) stosować konfokalną mikroskopię refleksyjną.
6. Wykonać obrazy próbne, wykreślić histogramy intensywności i dostosować wzmocnienie (gain) oraz przesunięcie (offset), aby uzyskać wystarczający sygnał i uniknąć nasycenia, upewniając się, że histogram mieści się między zerem a maksymalną intensywnością. Nie zmieniać tych ustawień przez cały czas trwania eksperymentu.
7. Wyonać obrazy time-lapse wybranych VoV z odstępem czasu Δt wynoszącym 10 min przez 8 hrs (lub dłużej, jeśli jest to konieczne).

5. Śledzenie komórek i analiza danych

1. Przeprowadzić ilościowe postprocesowanie obrazów ze stosu z, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazów.
   1. Przeprowadzić segmentację obrazów time-lapse, aby automatycznie wyznaczyć trójwymiarowe pozycje komórek w układzie (x,y,z,t).
   2. W każdej klatce ręcznie sprawdzić dokładność lokalizacji i usunąć wyniki fałszywie dodatnie wynikające z obecności detrytów komórkowych oraz wypustek komórkowych, które mogły zostać błędnie zidentyfikowane jako komórki. Wykluczyć komórki proliferujące z analizy oraz rozdzielić nakładające się lub połączone komórki na odrębne obiekty.
2. Wygenerować trójwymiarowe ścieżki przemieszczania się komórek w czasie na podstawie współrzędnych komórek (x,y,z,t) uzyskanych w poprzednim kroku, łącząc położenie każdej komórki w sekwencji czasowej.
3. Wyeliminować szum losowy i systemowy poprzez usunięcie ścieżek krótszych niż progowa długość ścieżki (zazwyczaj 20 min).
4. Jeśli jest to konieczne, skorygować dryft próbki poprzez odjęcie całkowitego przemieszczenia wypadkowego od ścieżek.
5. Obliczyć przemieszczenie komórki, , oraz dystans migracji komórki, , na podstawie zaobserwowanych trajektorii komórek, gdzie wektor reprezentuje trójwymiarowe położenie komórki w czasie, a n jest całkowitą liczbą punktów czasowych.
   1. Obliczyć prędkość komórki jako S = d/(n • Δt), gdzie Δt jest odstępem czasu między klatkami. Obliczyć kierunkowość (lub persistencję) migracji komórek, korzystając ze wzoru P = Δd/d. Ta prosta miara persistencji oznacza, że dla P = 0 przemieszczenie wypadkowe wynosi zero, a dla P = 1 trajektoria jest linią prostą.

Wyniki

Przedstawiony tutaj test żelu koncentrycznego został przeprowadzony przykładowo z wykorzystaniem wysoce inwazyjnych komórek raka piersi MDA-MB-231, przy zastosowaniu wewnętrznego żelu kolagenowego o stężeniu 2,4 mg/ml i gęstości zasiewu komórek = 2 × 10⁶ komórek/ml. Jak pokazano na Rysunku 2, zazwyczaj po kilku dniach hodowli komórki przekroczyły granicę między żelem wewnętrznym a zewnętrznym i zaczęły naciekać żel zewnętrzny. Populacja komórek rozprzestrzeniała się głównie promieniście na zew...

Dyskusja

W tym protokole opisujemy test in vitro w celu zbadania zachowania migracyjnego 3D komórek w środowiskach macierzowych, które topologicznie przypominają ECM napotkane in vivo. Istnieją trzy główne zalety tego testu w porównaniu z innymi obecnie dostępnymi metodami. Po pierwsze, test ten pozwala na jednoczesne badanie mechanizmów migracji komórek zarówno na poziomie populacji, jak i na poziomie poszczególnych komórek. Otwiera to możliwości badania zbiorowej migracji komórek¹³, która do tej por...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator do hodowli komórkowych	Fisher Scientific Pte Ltd	Model: 371, S/No 318854-6055
Mikroskop konfokalny	Nikon A1R		Odwrócony konfokalny laserowy mikroskop skaningowy wyposażony w komorę inkubatora
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Life Technologies	10082-147
Fluorescencyjny barwnik CellTracker CMTMR	Life Technologies	C2927
Naczynie ze szklanym dnem	IWAKI Cell Biology	3931-035	Naczynie o średnicy 35 mm ze szklanym dnem o średnicy 12 mm
Hemocytometr	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Improved)
Mikroprocesorowy pH-metr	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Collagen	Advanced BioMatrix	#5010-D	Kolagen bydlęcy typu I rozpuszczalny w kwasie (pH fabryczne ~ 2)
Soczewka obiektywu	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8,2-6,9mm, NA 0,45.
Penicylina-Streptomycyna	Life Technologies	15140-122
pH-metr	Sartorius	S/No 29153352	Podstawowy pH-metr PB-11
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054