Artykuł metodologiczny

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52742

⸱

24 czerwca 2015

 ,  , 
1Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Streszczenie

Zachowanie jest kontrolowane przez układ nerwowy. Obrazowanie wapnia jest prostą metodą u przezroczystego nicienia Caenorhabditis elegans do pomiaru aktywności neuronów podczas różnych zachowań. Aby skorelować aktywność neuronalną z zachowaniem, zwierzę nie powinno być unieruchomione, ale powinno być w stanie się poruszać. Wiele zmian w zachowaniu zachodzi w długich skalach czasowych i wymaga rejestrowania przez wiele godzin zachowania. Powoduje to również konieczność hodowli robaków w obecności pożywienia. W jaki sposób można hodować robaki i obrazować ich aktywność neuronalną w długich skalach czasowych? Obrazowanie w mikrokomorze agarozowej (AMI) zostało wcześniej opracowane do hodowli i obserwacji małych larw, a obecnie zostało przystosowane do badania wszystkich etapów życia od wczesnego stadium L1 do stadium dorosłego C. elegans. AMI może być wykonywany na różnych etapach życia C. elegans. Długoterminowe obrazowanie wapnia uzyskuje się bez unieruchamiania zwierząt dzięki zastosowaniu krótkich, zewnętrznie wyzwalanych ekspozycji w połączeniu z zapisem z kamery za pomocą urządzenia zwielokrotniającego ładunek elektronowy (EMCCD). Pomniejszanie lub skanowanie może zwiększyć skalę tej metody, aby zobrazować do 40 robaków równolegle. W ten sposób opisano metodę obrazowania zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych na wszystkich etapach życia C. elegans.

Wprowadzenie

Caenorhabditis elegans został ustanowiony jako modelowy system do badania zachowania1. Ze względu na jego podatność na genetykę, można badać molekularne i komórkowe mechanizmy leżące u podstaw zachowania. Wiele zachowań występuje w długich skalach czasowych. Do obserwacji ruchliwych zwierząt w długich skalach czasowych można zastosować dwa główne podejścia. Pierwszym podejściem jest podążanie za zwierzęciem podczas ruchu za pomocą zautomatyzowanego stolika lub kamery2-8, a drugim jest ograniczenie ruchu do zakresu, który jest co najmniej tak mały, jak pole widzenia kamery9-14. Obie metody mają swoje zalety. Śledzenie pozwala śledzić zwierzę na długich dystansach przestrzennych, ale ogranicza liczbę zwierząt, które można dostrzec w jednym eksperymencie. Ograniczenie przemieszczania się zwierząt pozwala na zwiększenie skali obserwacji do wielu osobników w tym samym czasie przy użyciu tablic ograniczonych przedziałów.

Ponieważ nicienie są przezroczyste, obrazowanie fluorescencyjne na żywo może być wykonywane nieinwazyjnie15. Obrazowanie wapnia zapewnia funkcjonalny odczyt aktywności komórek pobudliwych i jest ustalane dla C. elegans16-20. Wapń dostaje się do komórki przez kanały w błonie komórkowej, które otwierają się po depolaryzacji. W ten sposób wapń działa jako wskaźnik aktywności neuronalnej. Czujniki wapnia można podzielić na dwie główne klasy: czujniki ratiometryczne i nieratiometryczne. Obie klasy wykorzystują zmiany konformacyjne białek wiążących wapń indukowane podczas wiązania wapnia. Czujniki ratiometryczne zawierają dwa białka fluorescencyjne. Kiedy białko fluorescencyjne o niższej długości fali jest wzbudzane, część energii świetlnej jest przekazywana do białka fluorescencyjnego o wyższej długości fali w funkcji ich odległości w procesie zwanym transferem energii rezonansu fluorescencyjnego lub transferem energii rezonansu Förstera (FRET)21. Czujniki nieratiometryczne są oparte na kołowo permutowanym GFP i wykorzystują odgaszanie fluoroforu spowodowane wiązaniem wapnia22. Każda klasa ma swoje zalety. Podczas gdy czujniki ratiometryczne są mniej wrażliwe na artefakty ruchu lub ekspresji, czujniki nieratiometryczne mają zazwyczaj większy zakres dynamiki. Zarówno czujniki ratiometryczne, jak i nieratiometryczne były przydatne do badania aktywności komórek pobudliwych u C. elegans16-20,23,24.

Podczas długoterminowego obrazowania fluorescencyjnego, eksperymentator będzie musiał poradzić sobie z kilkoma potencjalnymi wyzwaniami: 1. Zakłócenie zachowania przez światło wzbudzenia: Robaki są wrażliwe na światło wzbudzające fluorescencji o krótkiej długości fali i unikają światła z zakresu od fioletowego do niebieskiego, które jest używane do obrazowania wapnia25,26. Robaki reagują albo do tyłu, albo do przodu,25,26. W związku z tym należy kontrolować ilość światła. 2. Wybielanie białka czujnika fluorescencyjnego: Często wybielanie białka fluorescencyjnego utrudnia długotrwałe obrazowanie. Zazwyczaj jednak natężenie światła, które jest potrzebne do zaobserwowania bielenia, jest wyższe niż natężenie światła, które powoduje niepokojący wpływ na zachowanie zwierząt. Tak więc wybielanie jest tylko teoretycznym problemem w tego typu obrazowaniu wapnia. 3. Robaki wewnątrz mikrokomór nie są nieruchome i poruszają się stale podczas czuwania, a obrazy mogą wydawać się rozmyte, jeśli robak nie jest unieruchomiony. Wszystkie te wyzwania można rozwiązać, stosując ekstremalnie krótkie czasy naświetlania przy niskim natężeniu światła. Można to osiągnąć za pomocą bardzo czułej kamery EMCCD z krótkimi czasami naświetlania i zewnętrznym wyzwalaniem diody elektroluminescencyjnej (LED). Aby wystawić robaki na działanie światła oświetleniowego tak krótko, jak to możliwe (tylko w czasie ekspozycji kamery), dioda LED jest wyzwalana zewnętrznie za pomocą sygnału logiki tranzystor-tranzystor (TTL), który kamera emituje podczas ekspozycji, co skutkuje oświetleniem robaka dokładnie na czas, w którym chip aparatu jest odsłonięty. Oznacza to również, że układ EMCCD będzie ciemny podczas odczytu danych, co jest optymalne dla wydajności odczytu tego chipa.

Wcześniej, mikrokomory agarozowe zostały opracowane do długoterminowego obrazowania fluorescencyjnego larw C. elegans 9. W tym miejscu opisano, w jaki sposób mikrokomory agarozowe mogą być wykorzystywane do długoterminowego obrazowania wapnia dla dowolnego etapu życia C. elegans, jak można przeprowadzić obrazowanie wapnia i jak można rozszerzyć tę metodę w celu równoległego oznaczania wielu pojedynczych robaków.

Protokół

1. Instrumenty, podłoża hodowlane i potrawy

  1. Użyj mikroskopu, który jest w stanie utrzymać ostrość próbki i jest wyposażony w automatyczny stolik. Zbuduj grzejnik pokrywowy na zamówienie lub kup rozwiązanie komercyjne. Skonfiguruj system kamer LED-EMCCD, w którym ekspozycja kamery wyzwala oświetlenie LED za pomocą sygnału TTL, korzystając z instrukcji producenta.
    Uwaga: Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Dyskusja.
  2. Znaczki z polidimetylosiloksanu (PDMS):
    1. Wyprodukuj pieczątki PDMS w zakładzie mikrofluidycznym lub zleć produkcję znaczków PDMS komercyjnej odlewni. Aby skorzystać z komercyjnej odlewni, wyślij plik autocad do firmy i określ głębokość (na przykład 15 μm) urządzenia. Po dostarczeniu z odlewni pokrój chip PDMS na 16 stempli za pomocą skalpela.
    2. Przyklej każdy pojedynczy stempel do szkiełka za pomocą plazmy powietrznej. W celu klejenia należy wystawić zarówno stempel PDMS, jak i szkiełko na działanie plazmy powietrznej przez około 1 minutę (przy najwyższych ustawieniach plazmy na poziomie 0,5 mbar). Upewnij się, że powierzchnie do klejenia są skierowane do góry podczas obróbki plazmowej. Następnie umieść stempel PDMS na szkiełku podstawowym.
  3. Weź dolne naczynie o długości 3,5 cm i wytnij kwadratową powierzchnię 18 x 18 mm od środka dna naczynia za pomocą frezarki pionowej i ostrych noży obrotowych. Używaj niskiej prędkości obrotowej noża i powolnego podawania, aby zapobiec topnieniu tworzywa sztucznego pod wpływem ciepła wytwarzanego przez tarcie. Przygotuj kilka potraw na raz.
    Uwaga: Dolne naczynie może być wielokrotnie używane po eksperymencie, jeśli zostanie oczyszczone po namoczeniu w czystym etanolu O/N.
  4. Agarozy:
    1. Rozpuścić 3 g agarozy o wysokiej temperaturze topnienia w 100 ml S-Basal (5,85 g NaCl, 1 gK2HPO4, 6 gKH2PO4, 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu),H2Odo 1 l, sterylizować w autoklawie) przez gotowanie. Porcje rozpuszczonej agarozy należy rozmieścić w probówkach Eppendorfa o pojemności 2 ml i przechowywać. Przygotuj również partię agarozy o niskiej temperaturze topnienia dokładnie w taki sam sposób, jak agarozę o wysokiej temperaturze topnienia.
    2. Przed użyciem umieścić 3 podwielokrotności agarozy o wysokiej temperaturze topnienia na bloku grzewczym w temperaturze 95 - 98 °C. Przed użyciem umieścić jedną podwielokrotność agarozy o niskiej temperaturze topnienia na bloku grzewczym w temperaturze 95 - 98 °C, aż się stopi, a następnie na bloku grzewczym w temperaturze 30 - 35 °C.

2. Wybór zwierząt

  1. Hoduj robaki o niskiej gęstości na wysianych płytkach NGM, aby uzyskać czyste zwierzęta. Upewnij się, że jedzenia jest dużo i tylko kilka zwierząt na talerzu.
  2. W celu zobrazowania larw L1 przenieś około 30 jaj zawierających zarodki w stadium precla na świeżą płytkę NGM z nasionami. W celu przeniesienia późniejszych stadiów larwalnych lub dorosłego C. elegans, przenieś około 30 robaków na świeżo wysianą płytkę NGM.

3. Przygotowanie mikrokomór agarozowych

  1. Przygotowanie dania:
    1. Weź plastikowe naczynie z kwadratowym otworem o wymiarach 18 x 18 mm na dole i umieść je do góry nogami z otworem skierowanym do góry. Zamknij otwór, umieszczając na otworze kawałek dwustronnej taśmy klejącej o wymiarach 20 x 20 mm. Odwróć naczynie tak, aby taśma klejąca znajdowała się na dnie i umieść naczynie na twardej powierzchni. Odetnij otwór za pomocą skalpela.
    2. Za pomocą pipety P1000 wlej do naczynia 2 ml 3% agarozy o wysokiej temperaturze topnienia w S-Basal. Umieść agarozę w obszarze otaczającym otwór i pozwól mu zastygnąć. Poczekaj, aż agaroza stwardnieje.
    3. Odwróć naczynie i odklej folię ochronną zakrywającą dwustronną taśmę klejącą, tak aby lepka strona pozostała na naczyniu i została odsłonięta.
      Uwaga: W rezultacie cienki pierścień taśmy klejącej otoczy zewnętrzną stronę otworu. Agaroza służy jako zbiornik wilgoci, który później otacza próbkę.
  2. Odlewanie mikrokomór:
    1. Powierzchnię PDMS należy narazić na formowanie plazmą powietrzną przez 20 - 60 sek.
      Uwaga: Ta obróbka plazmowa sprawia, że powierzchnia PDMS staje się hydrofilowa, co zapobiega zatrzymywaniu pęcherzyków powietrza i zapewnia ostrzejsze wydruki.
    2. Zbuduj dwie przekładki o równej wysokości, układając w stos 5 - 9 szkiełek. Umieść równolegle do ich dłuższych boków pierwszy stos przekładek, następnie pojedynczy szkiełko podstawowe, a następnie ponownie stos przekładek. Umieść szklane szkiełko zawierające stempel PDMS prostopadle w poprzek przekładek. Wyreguluj wysokość przekładek tak, aby między powierzchnią formowania stempla PDMS a pojedynczym szkiełkiem była przestrzeń około 1,5 mm.
    3. Umieść kroplę gorącej cieczy agarozy o wysokiej temperaturze topnienia na pojedynczym szklanym szkiełku w pobliżu stempla PDMS i szybko wsuń stempel PDMS pionowo do ciekłej agarozy. Niech agaroza stężeje. Sprawdź, czy ma nieprzezroczysty wygląd, co zwykle zajmuje około 2 minut. Zdejmij stempel pionowo jednym ruchem.
      Uwaga: Wygodne jest sklejenie prowadnic dystansowych za pomocą dwustronnej taśmy klejącej. Pionowy ruch stempla zapobiega uwięzieniu pęcherzyków powietrza w agarozie.
  3. Przenieś jaja lub robaki razem z bakteriami OP50 na agarozę za pomocą cienkiego platynowego drucianego szpikulca. Rozprowadź jedno jajko lub jednego robaka na komorę razem z jedzeniem za pomocą rzęsy. Napełnij około 30 jajek na jedną podkładkę agarozową.
  4. Płytę agarozową zawierającą wypełnione mikrokomory pokrój na kwadrat o wymiarach około 15 x 15 mm, tak aby ładnie pasowała do otworu naczynia. Podnieś kwadratową płytę agarozy za pomocą kleszczy i połóż ją do góry nogami na szklanym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 20 x 20 mm. Po upuszczeniu nie podnoś go ponownie ani nie przesuwaj, ponieważ może to spowodować wypchnięcie bakterii i robaków z ich komór.
  5. Montaż anteny:
    1. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na otworze plastikowego naczynia. Delikatnie dociśnij szklane szkiełko nakrywkowe do pierścienia wykonanego z dwustronnej taśmy klejącej. Uważaj, aby nie stłukć szkła.
    2. Odwróć naczynie do góry nogami i za pomocą pipety P1000 wypełnij szczelinę między płytą agarową zawierającą mikrokomory a zbiornikiem agarozy płynem o niskiej temperaturze topnienia schłodzonym do około 30 °C. Poczekaj, aż agaroza zastygnie.
    3. Zamknij naczynie pokrywką. W przypadku mikroskopów odwróconych należy używać podgrzewanej pokrywy. W przypadku mikroskopów pionowych użyj normalnej pokrywy i uszczelnij naczynie Parafilmem.
  6. Po zakończeniu przygotowywania mikrokomór sprawdź je pod mikroskopem stereoskopowym. Prawidłowe wypełnienie ma kluczowe znaczenie. Zobacz Dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje.

4. Obrazowanie wapnia

  1. Należy stosować transgeniczne szczepy wykazujące ekspresję genetycznie kodowanych czujników wapnia, takie jak HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)])27.
  2. Użyj mikroskopu złożonego wyposażonego w epifluorescencję o szerokim polu widzenia. Podłącz wyjście TTL kamery EMCCD do wejścia TTL diody LED, tak aby za każdym razem, gdy kamera nagrywa klatkę, próbka będzie oświetlona. Użyj czasu naświetlania około 5 ms. Użyj wzmocnienia EM w zakresie 50 - 300.
  3. Określ film seryjny trwający 24 godziny, w którym każdy robak jest obrazowany co 15 - 30 minut, najpierw przez 20 sekund za pomocą DIC, następnie przez 20 sekund za pomocą fluorescencji GFP, aby zarejestrować GCaMP, a następnie wykonaj końcowy obraz sygnału mKate2 w celu kontroli poziomów ekspresji. Używaj szybkości odświeżania 2/s podczas każdej serii.
  4. Do wizualnej kontroli danych należy użyć mapy w sztucznych kolorach, aby zwiększyć widoczność niewielkich zmian intensywności fluorescencji. Wykreślić dane fluorescencyjne jako ΔF/F, gdzie F jest średnią wartością bazową fluorescencji. Szczegółowy opis analizy danych dotyczących wapnia można znaleźć w literaturze20.

5. Równoległe AMI wielu robaków

  1. Umieść naczynie zawierające mikrokomory na mikroskopie, ustaw ostrość na próbce i włącz autofokus. Skonfiguruj protokół programowy tak, aby kamera rejestrowała serię 40 klatek obrazu w ciągu 20 sekund co pół godziny przez 24 godziny, co da 1920 klatek na robaka, rozsądną ilość danych. Skonfiguruj skanowanie w taki sposób, aby odwiedzało każdego robaka korzystającego ze stołu montażowego. Staraj się sfilmować około 30 robaków w jednym przebiegu.
  2. Obrazuj wiele robaków, pomniejszając je, tj. używając mniejszego powiększenia. Użyj mniejszego powiększenia, aby pokryć kilka mikrokomór chipem aparatu i sfilmuj jednocześnie kilka sąsiednich mikrokomór. Po zakończeniu akwizycji obrazu oddziel dane dla każdej komory z osobna, przycinając obszar zainteresowania obejmujący jedno zwierzę.
  3. Aby szybko ocenić dane dotyczące mobilności, użyj odejmowania ramek28-32.

6. Obrazowanie różnych etapów życia C. elegans

  1. Używaj mikrokomór agarozowych dla wszystkich etapów życia C. elegans od L1 do dorosłego osobnika, w tym dla dauerów. Należy stosować odpowiednie wymiary komory dla różnych etapów życia, które przedstawiono w tabeli 1.
.
Etap życiaWielkość komoryGłębokość studzienkiTypowy czas nagrywaniaPowiększenie
L1190 x 190 μm10 - 15 μmjajko - środek L2400-krotny
L2370 x 370 μm15 μmjajko - L3200-krotny
Larwa Dauera370 x 370 μm25 μm4 dni200-krotny
L3700 x 700 μm45 μmL2 - L4200-krotny
L4700 x 700 μm45 μmmłody L4 - młody dorosły100-krotny
Młody dorosły700 x 700 μm45 μm12 - 24 godz100-krotny

Tabela 1. Rozmiary komór dla różnych etapów życia. Pokazane są wymiary komory i powiększenia, które są przydatne dla różnych etapów zoptymalizowanych pod kątem układu kamery 8 x 8 mm.

Wyniki

Mikrokomory agarozowe można stosować na każdym etapie cyklu życiowego C. elegans. Jak widać na Rysunku 1A, możliwe jest obserwowanie rozwoju larwalnego oraz zachowania podczas snu w trakcie letargu L1. Przedstawiono komory o rozmiarach 190 x 190 µm i głębokości 10 µm. Jeśli wymagane są dłuższe ramy czasowe, można zastosować większe komory. Jak widać na Rysunku 1B, użycie komory o większych wymiarach (370 x 370 µm, głębokość 25 µm) pozwala na rozwój C. elegans od jaja do stadium dorosłego. Rysunek 1C przedstawia analizę długoterminowych zmian w zachowaniu z wykorzystaniem metody odejmowania klatek dla nicznia wyhodowanego w komorze od jaja do stadium dorosłego. Przedstawiono średnie intensywności po odjęciu klatek dla wybranych serii aktywności podczas stanu czuwania i letargu. Im niższa wartość średniej intensywności po odjęciu klatek, tym mniejsza ruchliwość nicznia. Pokazano wybrane ślady serii aktywności dla jednego stanu czuwania i jednego stanu letargu dla każdego stadium larwalnego. Obserwowany wzrost średniej intensywności podczas rozwoju wynika głównie ze zwiększonego kontrastu i rozmiaru zwierzęcia. Rysunek 1D pokazuje larwę w stadium dauer, czyli alternatywny etap życia, który następuje w niekorzystnych warunkach środowiskowych33. Rozmiar komory to 370 x 370 µm, głębokość 15 µm. Należy zauważyć, że larwa dauer została umieszczona w komorze bez pożywki bakteryjnej, która spowodowałaby wyjście ze stadium dauer. Rysunek 1E przedstawia dorosłego nicznia, który złożył już wiele jaj do komory. Wymiary komory zastosowane dla osobnika dorosłego wynosiły 700 x 700 µm, głębokość 45 µm. Na koniec Rysunek 1F przedstawia dorosłego hermafrodyta i samca kopulujących w komorze dla osobników dorosłych.

Obrazowanie wapnia u ruchliwych nicieni jest możliwe dzięki zastosowaniu czujników wapnia GCaMP. Rysunki 2A,B przedstawiają obrazowanie wapnia w interneuronie sterującym AVA u larwy L127. Rysunki 2C,D pokazują aktywność wapniową dla tego samego typu neuronu u dorosłego osobnika.

Zwiększenie skali obrazowania długoterminowego jest możliwe dzięki skanowaniu i oddalaniu obrazu. Rysunek 3A przedstawia jakość obrazu podczas jednoczesnego obrazowania 30 nicieni na jednym układzie kamery przy użyciu kamery 5 megapikseli. Rysunek 3B przedstawia jakość obrazu podczas jednoczesnego obrazowania poziomu wapnia u 4 nicieni.

Mikroskopowe obrazy etapów życia C. elegans, wykres analizy mobilności, pokazujące rozwój larw, 200x-400x.
Rycina 1. Adaptacja AMI do wszystkich etapów życia C. elegans. (A) Larwa obrazowana od wczesnego stadium L1 do wczesnego stadium L2 w komorach o wymiarach 190 x 190 µm. (B) Rozwój od jaja do osobnika dorosłego w komorze o wymiarach 370 x 370 µm. (C) Mobilność nicienia oceniana za pomocą odejmowania klatek. Przedstawiono średnią intensywność wszystkich obrazów po odejmowaniu klatek dla jednego wybranego filmu typu burst dla każdego stadium larwalnego w odniesieniu do zachowania czuwania i letargu. (D) Larwa w stadium dauer przy braku pożywienia w komorze o wymiarach 370 x 370 µm. (E) Dorosły hermafrodyta z wieloma jajami złożonymi w komorze o wymiarach 700 x 700 µm. (F) Kojarzenie się samca i hermafrodyty wewnątrz komory o wymiarach 700 x 700 µm. YA oznacza młodego osobnika dorosłego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza porównawcza z mikroskopii fluorescencyjnej z wykresami intensywności sygnału AVA/AVE przy powiększeniu 400x, 100x.
Rysunek 2. Obrazowanie wapnia za pomocą AMI. (A) Obrazowanie wapnia z użyciem GCaMP3 w interneuronie dowodzącym AVA larw L1 przy użyciu promotora nmr-1. Przedstawiono dwa obrazy w sztucznych kolorach. Na lewym obrazie aktywność AVA jest niska i nicień nie wykonuje ruchu wstecznego. Na prawym obrazie aktywność AVA jest wysoka, a nicień porusza się do tyłu. (B) Przebiegi przejściowe wapnia w czasie dla nicienia w stadium L1. (C,D) Przebiegi przejściowe wapnia u zwierzęcia dorosłego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy C. elegans w matrycy mikrokomór, przedstawiający larwy L1 i L3, powiększenie 100x.
Rycina 3. Równoległe obrazowanie wielu nicieni poprzez zmniejszenie powiększenia. (A) Jednoczesne obrazowanie 30 nicieni L1 na klatkę przy użyciu komór o wymiarach 190 x 190 µm, powiększeniu 100X (z zastosowaniem obiektywu 10X) i matrycy kamery o wymiarach 16,6 x 14 mm. (B) Jednoczesne obrazowanie czterech nicieni L3 na klatkę przy użyciu komór o wymiarach 370 x 370 µm, powiększeniu 100X i wybranym obszarze zainteresowania (ROI) matrycy kamery o wymiarach 16,6 x 14 mm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Sprzęt

Ostrość mikroskopu zazwyczaj zmienia się podczas długotrwałej akwizycji obrazu. W przypadku mikroskopów złożonych systemy utrzymywania ostrości można nabyć u głównych producentów mikroskopów. W przypadku, gdy mikroskop złożony z kontrolą ostrości jest zbyt drogi, prostą alternatywą byłoby użycie mikroskopu stereoskopowego. Mikroskopy złożone umożliwiają stosowanie obiektywów o dużej aperturze numerycznej (NA) i mogą być łatwo zautomatyzowane. Dobrze nadają się obiektywy olejowe 40X. Soczewki zanurzone w wodzie nie są idealne ze względu na parowanie podczas długotrwałego obrazowania. Różnicowy kontrast interferencyjny (DIC) generuje ładny kontrast, który pomaga śledzić zmiany morfologiczne i behawioralne, ale można również zastosować proste obrazowanie w jasnym polu. Do obrazowania DIC lub jasnego pola użyj światła czerwonego, umieszczając filtr światła czerwonego w ścieżce oświetlenia dialogicznego mikroskopu. Do skanowania kilku mikrokomór niezbędny jest zautomatyzowany etap. Najlepszą wydajność osiąga się, gdy używany jest stolik z nieliniowym przyspieszaniem i zwalnianiem, który można ustawić na niską prędkość skanowania, aby zapobiec przeszkadzaniu zwierzętom podczas skanowania. Nie zaobserwowaliśmy reakcji behawioralnych ani wzrostu stężenia wapnia w neuronach mechanowrażliwych (ALM i PLM) podczas skanowania, co sugeruje, że powolne skanowanie rzeczywiście nie aktywuje systemu mechanowrażliwego robaka (dane nie pokazane). Można stosować komercyjne systemy LED. Kilka firm oferuje gotowe do użycia rozwiązania, które obejmują diody LED o różnych długościach fal. Dioda LED powinna mieć możliwość zewnętrznego wyzwalania diody LED sygnałem TTL. Do obrazowania wapnia poruszających się zwierząt potrzebna jest bardzo czuła kamera. Kamery EMCCD są najbardziej czułymi kamerami na rynku. Aparat musi mieć wyjście TTL podczas ekspozycji (nazywane również wyjściem "ognia"). Grzałka pokrywy jest wymagana, aby zapobiec kondensacji pary wodnej na pokrywie w przypadku korzystania z odwróconego mikroskopu. Pod mikroskopem pionowym naczynie zostanie umieszczone tak, aby pokrywka znajdowała się na dole, dzięki czemu zapobiega się kondensacji pary wodnej i nie jest wymagane podgrzewanie pokrywki. Pokrywka powinna szczelnie zamykać naczynie, aby zapobiec parowaniu wody podczas długotrwałego obrazowania.

Pieczątki PDMS

Powierzchnia stempla PDMS, która zawiera strukturę do formowania agarozy, jest odwrócona od szkiełka podstawowego, które podtrzymuje stempel PDMS. Listę firm, które oferują niestandardowe chipy mikroprzepływowe, można znaleźć na Wikipedii (http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies).

Napełnianie nicieni ich komorami

Jest to najbardziej krytyczny krok w protokole i należy wziąć pod uwagę następujące punkty: A) Wilgotność agarozy ma kluczowe znaczenie dla przenoszenia robaków i obrazowania. Jeśli agaroza jest zbyt wilgotna, tzn . na powierzchni kilku mikrokomór znajduje się płyn, nie będzie możliwe rozprowadzenie pokarmu bakteryjnego i robaków w kontrolowany sposób, ponieważ płyn spowoduje odpływ bakterii. Jeśli agaroza jest zbyt sucha, bakterie i robaki mogą nie zejść łatwo z kilofa, co oznacza, że do upuszczenia robaków i bakterii należy użyć zwiększonej siły, co łatwo powoduje uszkodzenie agarozy. Podczas wypełniania dużej ilości robaków agaroza może wyschnąć. W najgorszym przypadku agaroza będzie w końcu tak sucha, że komory się zawalą. Jeśli agaroza jest zbyt sucha, można ją ponownie nawodnić, umieszczając małą kroplę (około 2 μl) S-Basal po stronie chipa, gdzie nie ma robaków. Następnie zanurz platynowy drutyk w płynie, a nawet wciągnij część płynu do obszaru, w którym komory są wypełnione robakami. B) Ilość pokarmu ma kluczowe znaczenie dla udanego długoterminowego obrazowania. Jeśli nie ma wystarczającej ilości jedzenia, robaki mogą go zabraknąć. Jeśli jest nadmiar jedzenia, jama komory nie będzie zachowywać się jak ciecz, ale raczej jak ciało stałe i pozwoli robakom uciec z komory, odpychając bakterie. Staraj się uzyskać zawiesinę bakteryjną, która wypełni całą komorę. Robaki są w stałym kontakcie fizycznym z powierzchnią agaru i szkła na większości swojej długości podczas eksperymentu, a zachowanie pełzania wydaje się być podobne do ruchu na talerzu i niepodobne do miotania się w płynie. C) Mechaniczne uszkodzenie agarozy może zrujnować eksperyment. Dobry wybór to podstawa. Nie powinien mieć ostrych rogów. Miękka rzęsa przymocowana do końcówki pipety może być używana do przenoszenia bakterii lub robaków do komór zamiast używania platynowego szpikulca. W większości przypadków jednak przyczyną uszkodzeń jest przesuszona agaroza. Kilof lub rzęsa powinny w idealnym przypadku ledwo dotykać samej agarozy, a film wodny na powierzchni agarozy powinien ściągać robaki i bakterie. Podczas uszczelniania komór ponownie niezbędna jest wilgotność agarozy. Na powierzchni agarozy nie powinno znajdować się żaden wolny płyn, ponieważ może to zmyć bakterie i robaki podczas uszczelniania. Duże pęcherzyki można usunąć, delikatnie podnosząc róg płyty agarowej. Małe pęcherzyki, które są mniejsze niż komora, często zostają uwięzione w komorach. Te bąbelki nie stanowią problemu i znikną po wchłonięciu. Po złożeniu naczynia sprawdź ponownie, czy agaroza nie jest zbyt sucha lub zbyt mokra. Komory powinny być ładnie uszczelnione i nie powinno być przepływu cieczy między komorami. Jeśli agaroza jest zbyt mokra, komory nie uszczelnią się prawidłowo. Robaki mogą uciec lub ich pokarm zostanie zmyty. Jeśli próbka jest zbyt wilgotna, po prostu otwórz pokrywkę i pozwól agarozie wyschnąć przez minutę lub dwie. Jeśli agaroza jest zbyt sucha, komory mogą się zapaść, a robaki uciekną.

Skalowanie w górę przez pomniejszenie

W przypadku obrazowania fluorescencyjnego pomniejszenie jest ograniczone przez małą ilość światła uzyskiwanego przy mniejszych powiększeniach. Ponadto kamery EMCCD są zoptymalizowane pod kątem czułości i często mają stosunkowo niską rozdzielczość. Jednak czterokrotne zwiększenie obrazowania jest jak najbardziej możliwe. Na przykład cztery komory o wymiarach 190 μm x 190 μm mogą zmieścić się w jednej klatce przy użyciu powiększenia 140X (uzyskanego przy użyciu obiektywu 20X i mocowania kamery 0,7X) i kamery 512 x 512 pikseli, 8 x 8 mm. Kamera o wysokiej rozdzielczości z dużym chipem (taka jak kamery sCMOS, układ 16,6 mm x 14 mm, 2560 x 2560 pikseli = 5,5 megapiksela) optymalizuje skalowanie DIC i obrazowanie w jasnym polu. Na przykład przy 100-krotnym powiększeniu na każdej klatce tej kamery może zmieścić się do 30 robaków L1 w komorach 190 μm x 190 μm (patrz rysunek 3). Zasadniczo można również łączyć pomniejszanie i skanowanie, aby uzyskać jeszcze większą liczbę zwierząt. Większość neuronów dość dobrze utrzymuje ostrość, więc wystarczy zobrazować tylko jedną płaszczyznę ogniskową. Jeśli okaże się, że neurony poruszają się poza ogniskiem, w każdym punkcie czasowym można wykonać skan z za pomocą napędu piezoelektrycznego.

Adaptacja do różnych zachowań

Ten protokół daje dobre wyobrażenie o zachowaniu w długich skalach czasowych. Oczywiście czas wybuchów musi być dostosowany do różnych zachowań i etapów życia.

Ograniczenia techniki

Na czas trwania obrazowania wpływa kilka czynników. Najważniejsza jest ilość jedzenia. Po spożyciu pokarmu larwy przestają się rozwijać. Tak więc w małych komorach (190 x 190 μm) robaki rozwijają się do stadium L3, a następnie zatrzymują się. Jeśli wymagany jest dłuższy czas obrazowania, należy zastosować większe komory. Maksymalny czas trwania obrazowania długoterminowego mieści się w zakresie 2,5 - 3 dni. Jeśli wymagane jest dłuższe obrazowanie, robaki muszą zostać odzyskane i umieszczone w nowych komorach. Podczas obrazowania dorosłych robaków kolejnym ograniczeniem jest potomstwo tych robaków. Dorosłe robaki składają jaja, z których wylęgają się larwy. Larwy te będą również przebywać w komorze, spożywać pokarm i mogą zakłócać analizę obrazu. Jeśli problemem jest potomstwo, rozwiązaniem jest użycie bezpłodnych dorosłych osobników lub wielokrotne umieszczanie robaków w świeżych komorach. Aby odzyskać robaki, płyta agarozowa zawierająca komorę jest odcinana skalpelem, jest ściągana ze szkiełka nakrywkowego i umieszczana na płytce NGM, z której można odzyskać robaki. Kolejnym ograniczeniem jest ograniczenie robaków do stosunkowo małych obszarów. Może to stanowić problem, jeśli trzeba przeanalizować ruch na duże odległości. Podczas gdy zwierzęta w komorach mogą być stymulowane mechanicznie i optogenetycznie21,27,34,35, szczelny charakter komory utrudni stosowanie rozpuszczalnych lub lotnych stymulantów. Biologicznie ważne gazy, takie jak tlen lub dwutlenek węgla, mogą swobodnie dyfundować w agarze . Duży zbiornik powietrza w czaszy powinien utrzymywać stałe stężenia gazów w komorach przez czas potrzebny na eksperymenty. Należy jednak pamiętać, że miejscowe stężenie tlenu w komorze może bardziej przypominać warunki panujące w kulturze płynnej niż hodowlę na płytce.

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod

Urządzenia mikroprzepływowe są bardzo zaawansowane w badaniach behawioralnych i rozwojowych u C. elegans. Często struktury mikroprzepływowe są zbudowane z PDMS12. W tym miejscu opisujemy protokół generowania mikroprzepływowych komór hodowlanych wykonanych z agarozy. Mocną stroną tej techniki jest połączenie wysokiej jakości obrazowania, korelacji zachowania z pomiarami fizjologicznymi, długotrwałego obrazowania i dość wysokiej przepustowości. Wysoką jakość obrazu uzyskuje się dzięki obrazowaniu przez szklane szkiełko nakrywkowe przy użyciu obiektywów o wysokiej NA. W rezultacie można wykonywać obrazowanie fluorescencyjne, takie jak obrazowanie wapnia i obrazowanie konfokalne struktur subkomórkowych. Ponieważ zwierzęta nie są unieruchomione, jak w innych systemach, pozwala to na korelację zachowania z pomiarami fizjologicznymi. Ponieważ zwierzęta mają dużo pożywienia, nadal się rozwijają, umożliwiając długotrwałe obrazowanie. System ten może obrazować wiele robaków w jednym przebiegu, ponieważ zwierzęta są ograniczone do zdefiniowanych komór. W ten sposób tę metodę można łatwo skalowaćw górę 9,27,34-36.

Przyszłe zastosowania

Do tej pory system ten był używany głównie do badania zachowań związanych ze snem larw C. elegans L1. Jednak adaptacja do wszystkich etapów umożliwi badanie szerokiego zakresu zachowań również u osób dorosłych i dorosłych. Za pomocą tej techniki można badać szeroki wachlarz zachowań, od krycia po składanie jaj.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Towarzystwo Maxa Plancka i stypendium Göttingen Graduate School Junior Group dla H.B. sfinansowały tę pracę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wysoka temperatura topnienia agarozyFisher BioreagentsBP(E)164-1000
Top Vision niska temperatura topnienia agarozaSystem LED Thermo ScientificR0801
CoolLEDpE-2
Mikroskop złożonyNikonTiE
StereomikroskopLeicaM5
EMCCDaparat AndoriXon 897jest teraz sprzedawany jako iXon Ultra 897
Kamera sCMOSAndorNeo
Środek do czyszczenia plazmowegoHarrickPDC-23G2
Podgrzewacz pokrywyMPI warsztatzamówienie
Plastikowa miskaFalcon08-757-100A
Stopień Z do mikroskopuWcześniejszyNano Scan Z
X-Y dla mikroskopPriorProscan III
PDMS pieczęćAbbott Laboratoriesna zamówienie
Filtr światła czerwonegoChromaET660/50m
35 mm szalka PetriegoFalconFalcon Jednorazowe szalki Petriego, sterylne, Corning
Dwustronna taśma klejącaSellotape/Henkeldwustronna 25 mm x 33 malternatywnie można użyć zaawansowanej dwustronnej taśmy klejącej firmy Rubance Adhesives.
na stopień

Bibliografia

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2012).
  3. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10, 877-879 (2013).
  4. Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094(2012).
  5. Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. Tracking movement behavior of multiple worms on food. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).
  6. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in. C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).
  7. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3, e2208(2008).
  8. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).
  9. Bringmann, H. Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae. Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).
  10. Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).
  11. Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. Non-microfluidic methods for imaging live. C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).
  12. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , 1-19 (2013).
  13. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).
  14. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  15. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  16. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of. C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  17. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  18. Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).
  19. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  20. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  21. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).
  22. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
  23. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).
  24. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
  25. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, e198(2008).
  26. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).
  27. Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in. C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).
  28. Singh, K., et al. C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence. Current Biology. 21, 825-834 (2011).
  29. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
  30. Iwanir, S., et al. The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron. Sleep. 36, 385-395 (2013).
  31. Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans. Methods. , (2014).
  32. Nagy, S., et al. A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling. eLife. 2, e00782(2013).
  33. Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).
  34. Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 21, R983-R984 (2011).
  35. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1, 12-14 (2012).
  36. Schwarz, J., Bringmann, H. Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 8, e75853(2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

C elegansobrazowanie d ugoterminowekamera EMCCDaktywno neuronalnamonitorowanie zachowaniakomory mikroprzep ywowerezerwuar po ywkiskanowanie stolika
Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.