Tutaj opisana jest metoda tworzenia syngenicznego mysiego modelu ortotopowego guza pęcherza moczowego w celu oceny skuteczności przeciwnowotworowej białka bakteryjnego HP-NAP.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena skuteczności białka H. pylori HP-NAP jako narzędzia terapeutycznego w leczeniu raka pęcherza moczowego w ortotopowym modelu myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rak pęcherza moczowego jest jednym z najczęstszych nowotworów złośliwych układu moczowo-płciowego. Dopęcherzowe wstrzyknięcie Bacillus Calmette-Guérin (BCG) jest złotym standardem leczenia nieinwazyjnego raka pęcherza moczowego o wysokim stopniu złośliwości (NMIBC). Ponieważ jednak skutki uboczne związane z leczeniem są istotne, potrzebne są nowsze modyfikatory odpowiedzi biologicznej o lepszym stosunku korzyści do skutków ubocznych.
Mikrośrodowisko guza może wpływać zarówno na rozwój guza, jak i na skuteczność terapii. W celu uzyskania dobrego modelu pożądane jest wszczepienie komórek nowotworowych w narządzie, z którego pochodzi nowotwór.
W tym protokole opisujemy metodę tworzenia guza w jamie pęcherza moczowego samic myszy i późniejszego dostarczania środków terapeutycznych; te ostatnie są zilustrowane przez nasze użycie białka aktywującego neutrofile Helicobacter pylori (HP-NAP). Wstępne oparzenie chemiczne błony śluzowej, a następnie wstrzyknięcie linii komórkowej raka urotelialnego myszy MB49 poprzez cewnikowanie cewki moczowej, umożliwia komórkom przyczepienie się do błony śluzowej pęcherza moczowego. Po pewnym czasie, wymaganym do początkowej proliferacji komórek, myszy są leczone HP-NAP, podawanym ponownie przez cewnikowanie. Aktywność przeciwnowotworową HP-NAP ocenia się, porównując objętość guza, rozległość martwicy i stopień unaczynienia między zwierzętami leczonymi nośnikiem i HP-NAP.
Wprowadzenie
Rak pęcherza moczowego jest jednym z najczęstszych nowotworów układu moczowo-płciowego, z prawie 75 000 nowych przypadków każdego roku w USA1. Wysokie wskaźniki nawrotów wymagają obserwacji przez całe życie, co sprawia, że rak pęcherza moczowego jest jednym z najdroższych nowotworów w leczeniu. Złotym standardem leczenia NMIBC o wysokim stopniu złośliwości jest resekcja przezcewkowa cewki moczowej, a następnie immunoterapia dopęcherzowa BCG. Chociaż dokładny mechanizm działania przeciwnowotworowego BCG pozostaje w pełni wyjaśniony, przyjmuje się, że aktywacja komórkowej odpowiedzi immunologicznej wzbogaconej w limfocyty T (Th)1 i cytotoksyczne limfocyty T (Tc)1 ma kluczowe znaczenie dla powodzenia terapii2.
Pomimo faktu, że BCG pozostaje leczeniem z wyboru dla NMIBC, duża część pacjentów nie reaguje na terapię; ponadto może powodować szereg skutków ubocznych: około 70% leczonych nowotworów powraca po pewnym czasie, a ~15% przechodzi do inwazyjnej formy choroby w mięśniach. Inne działania niepożądane związane z leczeniem BCG to dyzuria, zapalenie pęcherza moczowego i zakażenie nerek3-6.
Rozwój nowych strategii terapeutycznych musi uwzględniać wykorzystanie modeli przedklinicznych, po wstępnej ocenie in vitro; jest to szczególnie istotne w przypadku nowotworów, których mikrośrodowisko może znacząco wpływać na ich rozwój i reakcję na leczenie.
W ciągu ostatniej dekady zajęliśmy się wieloma aspektami immunomodulującej aktywności HP-NAP, białka wytwarzanego przez bakterię Helicobacter pylori, początkowo zidentyfikowanego jako zdolne do promowania adhezji śródbłonka komórek polimorfojądrowych (PMN)7. Strukturalnie HP-NAP należy do rodziny8 białek chroniących DNA w warunkach głodu (Dps) i składa się z 12 identycznych podjednostek ułożonych w otoczce dodekamerycznej.
Wykazaliśmy, że HP-NAP jest agonistą receptora Toll-podobnego (TLR)2, o silnym działaniu immunomodulującym, odpowiedzialnym za różnicowanie limfocytów T w kierunku fenotypu Th1, zarówno in vitro, jak i in vivo9-10. Dzięki tej aktywności HP-NAP jest w stanie przekierować odpowiedź immunologiczną Th2 na bardziej korzystną odpowiedź Th1 w mysim modelu astmy alergicznej11.
Aby ocenić potencjał przeciwnowotworowy HP-NAP zależny od Th1, skorzystaliśmy z mysiego modelu raka pęcherza moczowego, opracowanego kilka lat temu przez O'Donnela i współpracowników12, do oceny wpływu podawania BCG.
Za pomocą tego protokołu wykazujemy, że HP-NAP ma silny potencjał przeciwnowotworowy przeciwko rakowi pęcherza moczowego i że skuteczność podawania HP-NAP jest równoległa do znaczącej akumulacji, w obrębie guza i regionalnych węzłów chłonnych, zarówno limfocytów Th1, jak i Tc1 wytwarzających Interferon (IFN)-γ13. Guzy wyizolowane od myszy leczonych HP-NAP wykazywały większą martwicę i mniejsze unaczynienie niż nieleczony odpowiednik.
Niniejszy raport zawiera protokół krok po kroku, szczegółowo opisujący przygotowanie zwierząt, cewnikowanie cewki moczowej, chemiczne spalanie wymagane do przyłączenia komórek do błony śluzowej pęcherza moczowego oraz wstrzyknięcie komórek nowotworowych. Opisano również miejscowe podawanie HP-NAP, które można uznać za prototyp wszelkich środków terapeutycznych opracowanych w leczeniu raka pęcherza moczowego. Dowody uzyskane poprzez porównanie guzów wyizolowanych od zwierząt z grupy kontrolnej i zwierząt leczonych HP-NAP podkreślają nie tylko fakt, że HP-NAP może być dobrym kandydatem do immunoterapii raka pęcherza moczowego, ale także ogólną skuteczność zestawu doświadczalnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące obchodzenia się ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (D.M. 204/2011-B).
1. Zwierzęta
- Hoduj samice myszy C57BL6/J do 8 tygodnia życia w indywidualnie wentylowanych klatkach z filtrami mikroizolacyjnymi.
Uwaga: Preferowane są kobiety, ponieważ anatomiczna budowa ich zewnętrznego aparatu moczowo-płciowego sprawia, że cewnikowanie jest łatwiejsze niż u mężczyzn.
2. Hodowla komórkowa
- Utrzymuj mysią linię komórkową raka urotelialnego MB49 w pożywce RPMI 1,640 uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie surowicą bydlęcą płodu i 50 μg/ml gentamycyny w temperaturze 37 °C w nawilżonym 5% CO2 .
- Hoduj komórki MB49 w kolbach T-75 do 80% konfluencji. Trypsynizować i ponownie zawiesić w 0,5 × 105 - 0,5 × 106 komórek na 150 μl PBS przed implantacją u myszy.
3. Implant guza dopęcherzowego
- Myszy należy znieczulić za pomocą mieszanki środków znieczulających zoletil i ksylor (odpowiednio 33 mg/kg i 20 mg/kg), wstrzykiwanych dootrzewnowo.
- Ułóż zwierzęta w pozycji leżącej na plecach i przymocuj tylne nogi do podkładki za pomocą taśmy klejącej. Łapy muszą być wystarczająco oddzielone, aby ujście cewki moczowej było dobrze widoczne i łatwo dostępne do wprowadzenia cewnika.
- Uwaga: Do cewnikowania odpowiedni jest pediatryczny cewnik żylny 24 G dla myszy w wieku od 8 do 10 tygodni. Wybór cewnika jest bardzo ważny, aby uniknąć wycieku płynu między ścianą cewki moczowej a cewnikiem. W przypadku większych lub starszych myszy należy używać cewników o większym otworze.
- Za pomocą małego szczypiec ściśnij jedną krawędź zewnętrznej części cewki moczowej i przekręć ją bardzo delikatnie w kierunku "końca głowy" myszy. Działanie to odsłania ujście cewki moczowej.
- Wyjmij wewnętrzną igłę cewnika i włóż ją do cewki moczowej pod kątem 45°, lekko zorientowaną w kierunku "końca ogona" myszy. Nie wciskaj cewnika na siłę; W przypadku oporu wystarczy bardzo delikatnie przekręcić cewnik, aż wsunie się do cewki moczowej. Gdy około 0,5-0,8 cm cewnika znajdzie się w cewce moczowej, ostrożnie umieść cewnik równolegle do ogona myszy i włóż go całkowicie.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, której igłę należy wprowadzić do cewnika, należy umyć pęcherz moczowy z zalegającego moczu, wstrzykując 200-300 μl jałowego PBS i odessać cały płyn z pęcherza.
- Uwaga: Podczas wstrzykiwania PBS pęcherz moczowy wypełni się i będzie widoczny obrzęk między tylnymi nogami myszy; potwierdza to, że cewnikowanie jest prawidłowe. Większość cewników ma objętość martwą, którą należy wziąć pod uwagę przy obliczaniu objętości wstrzyknięcia.
- Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć 200 μl 0,1 N HCl. Napełnić pęcherz w celu spalenia całej jego ściany. Po 10 sekundach usunąć cały kwas i natychmiast zneutralizować, wstrzykując 200 μl 0,1 N NaOH za pomocą sterylnej strzykawki. W przypadku wstrzyknięcia największej liczby komórek (0,5 × 106) etap zakwaszania nie jest wymagany.
- Odessać cały pozostały płyn i natychmiast przepłukać jamę 300 μl sterylnego PBS.
- Opróżnij pęcherz moczowy przez aspirację i wstrzyknij 150 μl PBS zawierającego komórki MB49 (zakres 0,5 × 105 - 0,5 × 106) do pęcherza. Pozostawić strzykawkę zmontowaną do cewnika, aby uniknąć wycieku komórek. Lepiej jest zabezpieczyć strzykawkę, mocując ją do podkładki za pomocą taśmy klejącej.
- Po 1 godzinie delikatnie wyjmij cewnik z cewki moczowej i umieść myszy w klatce, pod żarówką, aż się obudzą: zwykle następuje to między 1 a 2 godziną po zakończeniu leczenia.
4. Dopęcherzowe dostarczanie HP-NAP
- Uwaga: Co najmniej 3 dni po wkropleniu komórek można rozpocząć kurację.
- Cewnikować zgodnie z opisem w krokach od 3.1 do 3.4. Na tym etapie nie jest konieczne spalanie ściany pęcherza HCl.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml umyj pęcherz moczowy z resztek moczu, wstrzykując 200-300 μl sterylnego PBS i odessać cały płyn z pęcherza.
- Wstrzyknąć 50 μg HP-NAP na 150 μl PBS do pęcherza moczowego. Pozostawić strzykawkę podłączoną do cewnika, aby uniknąć wycieku roztworu białka. Zabezpieczyć strzykawkę, przymocowując ją do podkładki za pomocą taśmy klejącej.
- Po 1 godzinie delikatnie wyjmij cewnik z cewki moczowej i umieść myszy w klatce, pod żarówką, aż się obudzą.
5. Eksplantaty guza i analiza histologiczna
- Pod koniec zabiegu należy złożyć zwierzęta w ofierze, ułożyć je w pozycji leżącej na plecach i przymocować tylne nogi do podkładki za pomocą taśmy klejącej.
- Za pomocą skalpela chirurgicznego wykonaj pionowe nacięcie o długości około 1,52 cm przez skórę i otrzewną, zaczynając tuż nad zewnętrznymi narządami płciowymi do "końca głowy" myszy. Aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia pęcherza, należy zwrócić szczególną uwagę na głębokość cięcia.
- Pęcherz moczowy zostanie umieszczony pośrodku lewej strony cięcia, a guz będzie widoczny jako ciemnoróżowa/fioletowa masa. Po jego wycięciu umieść cały pęcherz moczowy w klatce histologicznej i utrwal w 10% buforowanej formalinie przed zatopieniem w parafinie.
- Do analizy histologicznej i immunologicznej histochemicznej należy przygotować seryjne odcinki pęcherza moczowego (o grubości 46 μm) za pomocą standardowego mikrotomu.
- Wybarwić skrawki hematoksyliną/eozyną i przystąpić do obliczania wielkości guza (D x d2) i określania procentu martwicy na pole przekroju poprzecznego za pomocą komputerowego analizatora obrazu.
- W celu zliczenia naczyń należy przystąpić do barwienia skrawków pod kątem markera śródbłonka CD31/PECAM, stosując standardową technikę immunoperoksydazy. Skanuj skrawki przy niskiej mocy (4×), aby zidentyfikować obszar o największej gęstości naczyniowej. W tym regionie policz pojedyncze mikronaczynia w pięciu oddzielnych losowych polach o dużej mocy (20×).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia technikę kaniulacji; mysz zostaje poddana kaniulacji i podano jej 0,5 × 106 komórek MB49. Leczenie za pomocą HP-NAP rozpoczyna się 3 dni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, aby umożliwić im przytwierdzenie do ścianki pęcherza i proliferację. Wszystkie zwierzęta należące do grupy kontrolnej rozwijają nowotwór; niektóre z nich mogą obumrzeć przed końcem 13-dniowego okresu z powodu niedrożności cewki moczowej.
Po pierwszej iniekcji HP-NAP zwie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Większość postępów w terapii nowotworów wymaga testów na modelach zwierzęcych przed rozpoczęciem badań klinicznych. Możliwość badania biologii nowotworów in vivo, z wykorzystaniem modeli zwierzęcych, stanowi kluczowe narzędzie dla badaczy zajmujących się patogenezą nowotworów, umożliwiając ocenę różnych podejść terapeutycznych. Modele ortotopowe pozostają złotym standardem14-15, zarówno ze względu na ogromną liczbę linii komórkowych dostępnych do stworzenia modelu guza, jak i dlatego, że naśladują śro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań, projekty Prin i Progetti di Ricerca di Ateneo, grant nr CPDA137871, Fondazione Cariplo, grant nr 2011-0485 dla MdB, oraz przez Finanziamento Giovani Studiosi, Uniwersytet w Padwie, dla Gaia Codolo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiały | |||
| C57BL/6J samice myszy | Harlan Włochy (Udine, Włochy) | ||
| Komórki | uzyskane od prof. O'Donnela, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, do rozcieńczenia w wodzie apirogennej |
| Kolba | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Strzykawka 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Mediolan, Włochy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, Francja) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Cewnik | Terumo (Rzym, Włochy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Odczynniki (Mediolan, Włochy) | 403871 | Płynny |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pensylwania, USA) | 10095011 | Proszek |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, Anglia) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Niemcy) | RM2235 | |
| Preparaty mikroskopowe | VWR International (Radnor, Pensylwania, USA) | 631-0108 | |
| Analizator obrazu | Zeiss (Jena, Niemcy) | Cyres System |
Bibliografia
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L. Complications of bacillus Calmette-Guerin immunotherapy. Urol Clin North Am. 19, 565-572 (1992).
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
