Opisujemy tutaj prosty protokół izolacji mysich makrofagów otrzewnowych. Po tej procedurze następuje ekstrakcja RNA w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów Toll-podobnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja mysich makrofagów otrzewnowej w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów toll-podobnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podczas infekcji i stanów zapalnych, krążące monocyty opuszczają krwiobieg i migrują do tkanek, gdzie różnicują się w makrofagi. Makrofagi wyrażają powierzchniowe receptory Toll-podobne (TLR), które rozpoznają wzorce molekularne zachowane w procesie ewolucji w szerokim zakresie mikroorganizmów. TLR odgrywają kluczową rolę w aktywacji makrofagów, która jest zwykle związana ze zmianą ekspresji genów. Makrofagi mają kluczowe znaczenie w wielu chorobach i stały się atrakcyjnymi celami terapii. W poniższym protokole opisujemy procedurę izolacji mysich makrofagów otrzewnowej przy użyciu pożywki tioglikolanowej Brewera. Ten ostatni zwiększy migrację monocytów do otrzewnej, co w związku z tym zwiększy wydajność makrofagów 10-krotnie. Przeprowadzono kilka badań z wykorzystaniem makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego, śledziony lub otrzewnej. Wykazano jednak, że makrofagi otrzewnowe są bardziej dojrzałe po izolacji i są bardziej stabilne pod względem funkcjonalności i fenotypu. Tak więc makrofagi wyizolowane z mysiej jamy otrzewnowej stanowią ważną populację komórek, która może służyć w różnych badaniach immunologicznych i metabolicznych. Po wyizolowaniu makrofagi stymulowano różnymi ligandami TLR, a w konsekwencji oceniano ekspresję genów.
Wprowadzenie
System fagocytarny siateczkowo-śródbłonkowy składa się z komórek w różnych tkankach i organach, takich jak szpik kostny, krew, wątroba i śledziona. Makrofagi są szeroko rozmieszczone w organizmie, gdzie w szczególności uczestniczą we wrodzonych i adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych w celu kontroli i usuwania infekcji. Oprócz swojej roli w obronie gospodarza, makrofagi odgrywają również ważną rolę w gojeniu się ran i utrzymaniu homeostazy tkanek1,2. Co więcej, makrofagi są nie tylko ważne dla funkcjonowania układu odpornościowego, ale także aktywnie uczestniczą w homeostazie żelaza3. W organizmie około 80% żelaza jest obecne w hemoglobinie w erytrocytach, które po starzeniu się są fagocytozowane przez makrofagi4. Codziennie te makrofagi przetwarzają 25 mg żelaza pochodzącego z erytrocytów i zapewniają jego transport do osocza5. Ponadto podczas infekcji i stanu zapalnego makrofagi prozapalne sekwestrują żelazo w surowicy, aby zmniejszyć dostępność żelaza dla patogenów, zarówno na poziomie ogólnoustrojowym, jak i miejscowym6-8. Badania wykazały również, że makrofagi, a głównie hepatocyty, wytwarzają peptyd przeciwdrobnoustrojowy o nazwie hepcydyna, który jest uważany za główny regulator metabolizmu żelaza 9,10. Hepcydyna jest zwiększana głównie przez bodźce zapalne i jest częściowo odpowiedzialna za sekwestrację żelaza w makrofagach w przewlekłym zapaleniu11-13. Ponieważ ekspresja hepcydyny w makrofagach nie jest zbyt dobrze poznana, badaliśmy możliwą rolę receptorów Toll-podobnych (TLR) w tej regulacji. TLR znajdują się głównie na makrofagach i odgrywają kluczową rolę w ich aktywacji. Ponadto ekspresja hepcydyny indukowana przez LPS w wątrobie jest zależna od TLR413. Dlatego do przeprowadzenia naszego badania zastosowaliśmy metodę opartą na izolacji mysich makrofagów otrzewnowych.
Linie komórkowe makrofagów są szeroko stosowane w badaniach makrofagów; niemniej jednak rozszerzona hodowla może spowodować utratę genów i obniżenie funkcji immunologicznych w tych liniach komórkowych. Dlatego kluczowa jest izolacja makrofagów z jamy otrzewnej.
Mysia jama otrzewnowa stanowi idealne miejsce do pobierania makrofagów13-15. Izolowane mysie makrofagi otrzewnowe są wygodne w kilku badaniach dotyczących ich funkcji immunologicznej. Jednak liczba makrofagów w otrzewnej jest niewystarczająca do szeroko zakrojonych badań i szacuje się ją na około 1 x 106 makrofagów na mysz. Tak więc, aby zwiększyć produkcję makrofagów, sterylny środek wywołujący, taki jak tioglikolan, wstrzyknięto do jamy otrzewnej przed pobraniem komórek. Po wstrzyknięciu tioglikolanu wydajność makrofagów na mysz wzrosła 10-krotnie. Pomimo wzrostu wydajności makrofagów, pożywka tioglikolanowa Brewera działa jako czynnik drażniący, który indukuje reakcję zapalną, powodując rekrutację makrofagów, które mogą, ale nie muszą, wpływać na ekspresję genów. W związku z tym w każdym eksperymencie musi zostać uwzględniona grupa kontrolna składająca się z makrofagów niepoddanych działaniu substancji. W naszych rękach ekspresja hepcydyny, która jest silnie stymulowana przez stan zapalny, nie została wykryta w makrofagach otrzewnowych wywołanych tioglikolanem. Co więcej, badania wykazały, że tioglikolan Brewera rekrutuje liczne makrofagi, ale ich nie aktywuje16. Z drugiej strony, tioglikolan Brewera wywołał makrofagi, wykazał wzrost enzymu lizosomalnego, ale spadek zabijania spożytych mikroorganizmów17. Jednak pojemność fagocytarna nie uległa zmianie w porównaniu z niewywołanymi makrofagami16.
Po wyhodowaniu w naczyniach, makrofagi otrzewnowe stają się przylegające, co pozwala na ich oddzielenie od innych typów komórek wyizolowanych z jamy otrzewnej. Następnie izolowane makrofagi poddano prowokacji różnymi agonistami receptorów TLR. Na koniec wyekstrahowano mRNA z hodowanych komórek, a ekspresję genów przeanalizowano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami po zatwierdzeniu przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Centre de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Izolacja, identyfikacja i hodowla mysich makrofagów otrzewnowej
- Przygotować 3,8% pożywkę tioglikolanową browaru. W tym celu zawiesić 38 g pożywki tioglikolanowej w 1 000 ml wody destylowanej. Doprowadź roztwór do wrzenia, aby całkowicie rozpuścić pożywkę. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min. Przechowywać do 3 miesięcy w ciemności, w temperaturze RT18.
UWAGA: Wyrzuć, jeśli pojawi się zmętnienie, które wskazuje na zanieczyszczenie bakteryjne. Roztwór można przechowywać do jednego roku w ciemności, jeśli jest on sterylny. - Za pomocą strzykawek o pojemności 1 ml dołączonych do igieł 23 G, wstrzyknąć 1 ml 3,8% pożywki tioglikolowej browarnianej do jamy otrzewnowej każdej myszy i odczekać 3 dni. Użyć nowej strzykawki i igły dla każdej myszy.
- Znieczulenie myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (100 mg / kg) i eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, sprawdzając częstość oddechów. Zwykle szybkie oddechy wskazują, że mysz nie jest głęboko znieczulona.
- Umyj brzuch każdej myszy 70% etanolem. Za pomocą nożyczek wykonaj boczne nacięcie wzdłuż dolnej linii środkowej otrzewnej.
- Za pomocą kleszczy odciągnij skórę brzucha, aby odsłonić przezroczystą skórę otrzewnej. Za pomocą strzykawek o pojemności 5 ml dołączonych do igieł 20 G, wstrzyknąć 5 ml zimnego DPBS do jamy otrzewnowej każdej myszy.
- Wykonaj delikatny masaż jamy otrzewnej, a następnie ostrożnie odessaj płyn, nie nakłuwając żadnego narządu. Wyjąć igłę i rozlać płyn otrzewnowy do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
- Wirować przez 10 minut przy 400 x g w wirówce z chłodzeniem. Komórki muszą pozostać zimne podczas całego zabiegu. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w pożywce RPMI 1640.
- Za pomocą hemocytometru policz komórki i dostosuj gęstość komórek do 1 x 106 komórek/ml.
- Scharakteryzować fenotyp izolowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu 1 x 106 komórek na mysz i antyciała przeciwko F4/80 (antygen powierzchniowy wyrażany na makrofagach).
2. Leczenie komórkami
- Bezpośrednio, po izolacji, dodaj 1 x 106 komórek do każdej studzienki. Pozostaw mysie makrofagi otrzewnowe, aby przylegały do płytek 6-dołkowych, hodując je przez 1 do 2 godzin w temperaturze 37 °C. Usuń nieprzylegające komórki, delikatnie przemywając 3 razy ciepłym PBS.
- Następnie hodować komórki w 900 μl DMEM bez surowicy przez 24 godziny w obecności następujących ligandów TLR: (Pam3CSK4-TLR1/2 (0,5 mg/ml); Poli(I:C)-TLR3 (10 mg/ml); LPS-TLR4 (100 ng/ml); Wiciowiec-TLR5 (100 ng/ml); FSL1-TLR6/2 (100 ng/ml); ssRNA40-TLR7 (1 μg/ml); ODN1826-TLR9 (1 μM).
UWAGA: Przygotuj dla każdego liganda 10x roztwór podstawowy. Dodać 100 μl tego ostatniego do każdej studzienki, wykonując w ten sposób 10-krotne rozcieńczenie.
3. Izolacja RNA
- Usunąć wszystkie pożywki i komórki lizy bezpośrednio z płytek sześciodołkowych, dodając 1 ml trizolu do każdej studzienki i przepuszczając lizat komórkowy kilka razy przez pipetę. Inkubować homogenizowane próbki przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych.
- Przenieść lizat do 1,5 ml probówek wirówkowych wolnych od RNaz i DNaz. Dodać 0,2 ml chloroformu na 1 ml TRIzolu. Potrząsaj energicznie probówkami ręcznie przez 15 sekund i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 5 do 10 minut. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Obserwuj, jak mieszanina rozdziela się na dolną fazę czerwoną (fenol-chloroform), interfazę i bezbarwną górną fazę wodną. RNA pozostaje wyłącznie w fazie wodnej.
- Ostrożnie przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki, nie naruszając interfazy. Wytrącić z niego RNA, mieszając z 0,5 ml alkoholu izopropylowego. Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut i odwirowywać przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. RNA wytrąca się, tworząc białą osadkę z boku i na dole probówki.
- Usunąć supernatant. Przemyć osad RNA raz 1 ml 75% etanolu. Mieszać próbki przez wirowanie i odwirowywać przy 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Krótko wysuszyć RNA (suszyć na powietrzu przez 10 minut). Rozpuścić RNA w 0,1 ml DEPC (woda wolna od RNAzy) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 55 °C.
- Określ ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru. W tym celu należy rozcieńczyć próbki 100 razy w wodzie DEPC i odczytać je przy długości fali 260 nm. Stężenie RNA będzie wtedy wynosić: OD260 x 40 ng/ul x współczynnik rozcieńczenia.
- Wyrównaj stężenia RNA i zsyntetyzuj cDNA zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA RT-PCR. Zgodnie z instrukcjami producenta, zmierz poziomy mRNA genów za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (45 cykli) w systemie wykrywania DNA w czasie rzeczywistym. Normalizuj poziomy ekspresji genów za pomocą dwóch genów porządkowych, na przykład β-aktyny i GAPDH.
UWAGA: Znormalizuj stężenie RNA do 500 μg/ml i użyj 0,5 μg do syntezy cDNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W pierwszej kolejności przeprowadzono charakterystykę wyizolowanych makrofagów otrzewnej mysiej za pomocą cytometrii przepływowej. W tym celu zastosowano przeciwciała (F4/80), które specyficznie rozpoznają markery ekspresjonowane wyłącznie przez makrofagi. Charakterystyka ta jest niezbędna do określenia procentowej zawartości wyizolowanych makrofagów oraz ich odróżnienia od pozostałych komórek uzyskanych podczas procesu izolacji. Jak pokazano na (Rysunku 1), odsetek komórek wykazujących ekspresję antygen...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Makrofagi mają kluczowe znaczenie dla przetrwania i stanowią kuszący cel do manipulowania gospodarzem w celach immunologicznych. Odkrycie TLR i innych cząsteczek rozpoznających sprawiło, że makrofagi znalazły się w centrum debaty immunologicznej. Makrofagi reagują na różne bodźce, w tym cytokiny, cząsteczki wzorca molekularnego związane z uszkodzeniem (DAMP)20 i cząsteczki związane z grupami patogenów (PAMP)21. Te różne reakcje na bodźce reprezentują przebieg aktywacji makrofagów i są zwykle związan...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC, grant nr 298515-2011). AL jest laureatem stypendium doktoranckiego od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), a MS był wspierany przez grant z Canadian Institutes of Health Research (CIHR, Nr dotacji MOP123246).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 myszy | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Tioglikolan | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% etanol | |||
| 10% pentobarbital sodu (Stosowany do znieczulenia myszy (80 mg / kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS), umieszczona na lodzie i posłuży do zbioru makrofagów | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Suplement z penicyliną, streptomycyną, L-glutaminą i 10% płodową surowicą cielęcą). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| Strzykawki 1 i 5 ml | BD USA (NJ) | ||
| Płytki 6-dołkowe | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Lipoproteina bakteryjna Pam3CSK4 (0,5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Poliionozyna– Kwas policytydylowy (Poli(I:C)) (10 mg / ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL- | |
| LPS z Escherichia coli 055:B5 (100 ng / ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Oczyszczona flagelina z Salmonella typhimurium (100 ng / ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoproteina syntetyczna FSL1 (100 ng / ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA pochodzące z długiego końcowego powtórzenia ssRNA40 HIV-1 (1 μ g / ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Typ B CpG oligonukleotyd ODN1826 (1 μ M) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Kanada) | 15596-026 | |
| Igły 20 G i 23 G | BD USA (NJ) | ||
| Kleszcze | |||
| nożycowe | |||
| 50 ml stożkowe probówki umieszczone na lodzie | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Bufor do lizy czerwonych krwinek | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| z chłodzeniem | |||
| Hemocytometr | |||
| F4/80 | przeciwciało BIO-RAD (CA, USA) | ||
| Przeciwciała CD16/CD32 | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Cytometr | przepływowyLicznik Coulter Epics Elite, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1,5 ml Probówki Eppendorf | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Kanada) | UN1888 | |
| Alkohol izopropylowy | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% etanol (w wodzie uzdatnionej DEPC) | Commercial Alchohols (QC, Kanada) | 17394 | |
| 0,01% woda uzdatniona pirowęglanem dietylu (DEPC) (odstawić na noc i autoklawować) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| System Omniscript RT-PCR | Qiagen, (Mississauga, ON, Kanada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Kanada) | ||
| Zestawy QuantiTect SYBR Green I PCR | Qiagen, (Mississauga, ON, Kanada) | 204141 |
Bibliografia
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C. Storage iron regulation. Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
