Artykuł metodologiczny

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

DOI:

10.3791/52752

⸱

30 maja 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oprócz uznanych metod, takich jak Western blot, potrzebne są nowe metody, aby szybko i łatwo zmierzyć chorobowo związaną α-synucleinę (αSD) w eksperymentalnych modelach synucleinopatii. W tym badaniu wykorzystano linię myszy transgenicznych (M83), nadmiernie ekspresującą ludzką αS A53T i spontanicznie rozwijającą dramatyczny fenotyp kliniczny między ósmym a 22. miesiącem życia, charakteryzujący się objawami, w tym utratą masy ciała, prostracją i ciężkim upośledzeniem ruchowym. Do molekularnych analiz αSD (chorobowo związana αS) u tych myszy zaprojektowano test ELISA, aby specyficznie zmierzyć αSD u chorych myszy. Analiza ośrodkowego układu nerwowego w tym modelu myszym wykazała obecność αSD głównie w ogonowych regionach mózgu i rdzeniu kręgowym. Nie było różnic w dystrybucji αSD między różnymi warunkami eksperymentalnymi prowadzącymi do choroby klinicznej, tj. u nieszczepionych i normalnie starzejących się myszy transgenicznych oraz u myszy szczepionych ekstraktami z mózgu chorych myszy. Specyficzne wykrywanie immunoreaktywności αSD za pomocą przeciwciała przeciw fosforylowanemu Ser129 αS przez test ELISA w zasadzie korelowało z tym uzyskanym przez Western blot i immunohistochemikę. Nieoczekiwanie, podobne wyniki obserwowano z kilkoma innymi przeciwciałami przeciwko C-końcowej części αS. Propagacja αSD, sugerująca zaangażowanie "prionopodobnego" mechanizmu, może być więc łatwo monitorowana i zmierzyna w tym modelu myszym przy użyciu podejścia ELISA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie stosowanych metod wykrywania związanego z chorobą α-synucleiny (αSD) w eksperymentalnych modelach choroby Parkinsona (PD), takich jak immunohistochemia czy Western blot, jest czasochłonnych i nie są ilościowe. Ta neurodegeneracyjna choroba charakteryzuje się agregacją alfa-synucleiny głównie w postaci inkluzji zawierających skumulowaną formę zwykle rozpuszczalnego presynaptycznego białka αS1,2 (ciałka Lewego i neurofibrile Lewego). Normalnie tylko marginalnie fosforylowana, αS jest nadmiernie fosforylowana w pozycji serynowej 129 w tych inkluzjach3 i może być monitorowana przez przeciwciała skierowane specyficznie przeciw fosforylowanemu w pozycji Ser129 αS, zapewniając tym samym wiarygodny marker patologii.

Ostatnie badania sugerują, że mechanizm „podobny do prionów” mógłby być zaangażowany w propagację agregacji αS w obrębie układu nerwowego u chorego pacjenta4,5. Te badania opisywały przyspieszenie synucleinopatii poprzez inokulację ekstraktów mózgu zawierających αSD do transgenicznego modelu mysiego (M83) ekspresującego zmutowaną ludzką αS białka A53T, związaną z poważnym upośledzeniem ruchowym występującym wraz ze starzeniem się myszy6. W ten sam sposób, inokulacja domózgowa skumulowanego rekombinowanego αS w tym samym modelu myszym M83 potwierdziła przyspieszenie agregacji5. Indukcja osadów fosforylowanego αS została również opisana po inokulacji myszy dzikiego typu C57Bl/6 albo fibrylarnego rekombinowanego αS albo ekstraktów mózgu ludzkich pacjentów z chorobą ciałek Lewego (DLB)7,8. Sacino et al.9 niedawno zwrócili uwagę, że po wstrzyknięciu fibrylarnego ludzkiego αS, rozpowszechniona i progresywna formacja inkluzji αS w mózgu mogłaby zostać wywołana w myszach M83, ale nie w myszach transgennych E46K ani w myszach nietransgennych, w których indukowane inkluzje αS były przejściowe i głównie ograniczone do miejsca wstrzyknięcia. Ostatnie badania na małpach potwierdziły propagację agregatów αS po inokulację ekstraktów pochodzących z choroby Parkinsona w gatunkach bliżej spokrewnionych z ludźmi10.

Powiązanie między zmianami αS a chorobą Parkinsona sugeruje, że αSD jest potencjalnym biomarkerem choroby Parkinsona11. Niedawne badanie wykazało wykrycie oligomerycznych rozpuszczalnych agregatów α-synucleiny w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) i osoczu jako potencjalny biomarker choroby Parkinsona na podstawie konwencjonalnego systemu ELISA typu „sandwich” z wykorzystaniem tego samego przeciwciała do wychwytu i wykrycia αS12. Na podstawie tej samej metody, białka multimeryczne zostały rozpoznane w próbkach biologicznych, w tym mózgu, ponieważ istnieje wiele kopii epitopów obecnych w złożonych formach13. Niedawno patologiczne αS w CSF pacjentów z udowodnioną patologią ciałek Lewego zostały wykryte zarówno za pomocą zestawu ELISA z wysoce specyficznym przeciwciałem przeciwko αSD (5G4), jak i za pomocą testu immunoprecypitacyjnego14. Te metody mogą odróżnić pacjentów z PD/DLB od innych rodzajów demenc.

„Prionopodobna” propagacja agregacji αS była dalsze badana w transgennym modelu myszym M83 przy użyciu podejścia ELISA, które zostało zaprojektowane specjalnie do identyfikacji αSD15. W tym badaniu opisujemy szczegółowy protokół ELISA stosowany do ilościowego wykrywania αSD u chorych myszy (czy to zaszczepionych αSD od chorych myszy M83, czy nie) i zwłaszcza w regionach mózgu specyficznie docelowanych przez patologiczny proces w tym transgennym modelu myszym M834.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury i protokoły z udziałem zwierząt były zgodne z Dyrektywą WE 86/609/EWG i zatwierdzone przez ComEth, francuski komitet narodowy do spraw etyki w eksperymentach na zwierzętach (protokół 11-0043). Zwierzęta były przetrzymywane i pielęgnowane w zatwierdzonych ośrodkach eksperymentalnych ANSES’s w Lyonie (zatwierdzenie B 69387 0801).

1. Przygotowanie myszy

  1. Zabijajcie myszy za pomocą dootrzewnowej iniekcji śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodu.
  2. Wyjmijcie cały mózg z czaszki myszy i umieśćcie go na lodzie w 35 mm plastikowym naczyńku Petriego do czasu ekstrakcji.
  3. Wyjmijcie rdzeń kręgowy szyjny.
    UWAGA: Wyjmujcie αS albo z jednej z połówek mózgu po przekrojeniu wzdłużnym albo z przekrojonych mózgów myszy, dostępnych po przeprowadzonych eksperymentach wymienionych w Tabeli 1.
EksperymentMyszy
Inoculum (równoważnik mózgu)		Okres przeżycia
(d.p.i.)		Mediana/maksymalne przeżycie
(dni)		Wykrycie αSd przez ELISA
/WB/IHC
1Myszy niezaszczepione441 ± 166419/7368/8
2Myszy zaszczepione (0,2 mg)150 ± 52140/2419/9

Tabela 1. Lista eksperymentów przeprowadzonych na myszach M83. Zaszczepienia przeprowadzano w wieku 6 tygodni dla eksperymentu 2 w obszarze zwojów czworobocznych i kory mózgowej za pomocą 20 µl homogenatu mózgu chorej myszy (1% wt/vol w glukozie 5%), po znieczuleniu 6-tygodniowych homozygotycznych myszy M83 za pomocą inhalacji 3% izofluranu. d.p.i.: dni po inokulacji.

2. Ekstrakcja αS z połówek mózgu

  1. Przekroić mózg wzdłużnie, aby uzyskać dwie połówki. Waga każdej połówki w rurce do ribolizy zawierającej kulki do mielenia.
  2. Przygotować bufor High Salt (HS) zawierający 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% fosfataz i koktajl inhibitorów proteaz. Dodać bufor High Salt do połówek mózgu, aby uzyskać 20% (waga/objętość) homogenaty.
  3. Przygotować próbki z połówek mózgu za pomocą mechanicznego homogenizatora z prędkością 6,0 m/s przez 23 sekundy dwa razy. Po pierwszej 23-sekundowej homogenizacji, umieścić rurki z homogenatami na lodzie przez 2 minuty przed drugim 23-sekundowym cyklem.
  4. Centryfugować próbki przy 1.000 x g przez 5 minut, aby wyeliminować niezmielony fragment mózgu. Odzyskać surnatki, podzielić na 200 µl alikwoty i przechowywać je w temperaturze -80 °C do dalszej analizy ELISA.

3. Ekstrakcja αS z przekrojonych regionów mózgu

  1. Przekrój cały mózg na lodzie w 35 mm plastikowym naczyńku Petriego za pomocą lupy o niskiej mocy (8x powiększenie) przy użyciu dwóch kleszczy, których końce są trzymane razem, z wyjątkiem przecinania hipokampu. Nie przekraczaj 10 minut, aby zachować integralność mózgu. Umieść mózg prawidłową stroną do góry i pobierz następujące regiony mózgu w tej kolejności:
    1. Oddzielić jedną z dwóch cebulek węchowych za pomocą kleszczy umieszczonych tuż za cebulką. Odłączyć ją od mózgu ruchem w dół. Powtórzyć tę operację dla drugiej cebulki.
    2. Delikatnie włożyć kleszcze między dwie korty i przesunąć je do przodu, aby ułatwić oddzielenie dwóch korty. Utrzymując mózg w miejscu za pomocą jednych kleszczy, użyj drugich, aby oddzielić korę od hipokampu.
    3. Umieść kleszcze 2 mm poniżej kory. Utrzymaj delikatne naciśnięcie kleszczami, aż górna część hipokampu będzie widoczna. Oddzielić pierwszą część kory i powtórzyć z drugą częścią. Użyj kleszczy, aby oddzielić dwie korty, zaczynając od hipokampu i przesuwając się w kierunku przedniej części mózgu.
    4. Umieść otwarte kleszcze wokół jednego z hipokampów. Zamknij kleszcze u dołu hipokampu, a następnie delikatnie je usuń, odzyskuj jak najwięcej. Powtórz procedurę dla drugiego hipokampu.
    5. Umieść otwarte kleszcze poniżej jednego z zwojów czworobocznych i delikatnie oddzielić go od mózgu. Użyj kleszczy, aby usunąć wszelkie pozostałe korty ze zwoju czworobocznego. Powtórz tę procedurę dla drugiego zwoja czworobocznego.
    6. Użyj kleszczy, aby delikatnie wcisnąć kontur móżdżku o 2 mm, aby ułatwić oddzielenie móż

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu zastosowano testy ELISA, które specyficznie identyfikowały związane z chorobą αS (αSD) w homogenatach mózgu przygotowanych w buforze z wysoką zawartością soli od chorych myszy M83. Zastosowanie przeciwciała specyficznie rozpoznającego pSer129 αS (p = 0,0074) pozwoliło testowi ELISA na łatwe odróżnienie starych, chorych myszy (> 8 miesięcy) od młodych (2-5 miesięcy), zdrowych myszy M83 (Rysunek 1). Kilka innych przeciwciał wykazało podobnie wysokie sygnały (> 0,6 OD) tylko ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że wykorzystanie ELISA pozwalało na specyficzne wykrywanie αSD bezpośrednio z homogenatów mózgu myszy w trakcie choroby w modelu myszy transgenicznych M83. Rzeczywiście, ten ELISA mógł łatwo odróżnić chore myszy M83 od zdrowych myszy M83, używając wyłącznie homogenatów całego mózgu w buforze z wysokim stężeniem soli.

Najskryteczniejszymi krokami dla uzyskania pomyślnych wyników przy użyciu tego ELISA są: poprawne wycięcie różnych obszarów mózgu myszy poprzez rozwinięcie ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcą podziękować Damienowi Gaillard za inokulacje i nadzór nad eksperymentami na zwierzętach. Ta praca została wsparta przez ANSES (Francuska Agencja ds. Bezpieczeństwa Żywności, Środowiska i Bezpieczeństwa oraz Higieny Pracy) oraz grantem Fundacji France Parkinson.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LB509Abcamab27766Antibody detekcyjny 1/2,000
AS11Produced at AnsesAntibody detekcyjny 1/1,000
4D6Abcamab1903Antibody detekcyjny 1/2,000
PSer129Abcamab59264Antibody detekcyjny 1/3,000
PSer129 EP1536YAbcamab51253Antibody detekcyjny 1/1,000
syn514Abcamab24717Antibody detekcyjny 1/500
clone 42BD Biosciences610787Antibody powlekający i detekcyjny (1/2,000)
8A5Provided by Dr. AndersonAntibody detekcyjny 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibodyMilliporeAB5038PAntibody powlekający
Anti-mouse IgG HRP conjugateSouthern Biotech1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugateSouthern Biotech4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugateDianova115-035-164
HS bufferAdjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSAdjust at pH 7.5
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815Roztwór macierzysty 100 mM, toksyczny
1% phosphatase cocktailPierce78428
1% protease inhibitor cocktailRoche04 693 132 00150x skoncentrowany
Microplate MaxiSorpTMThermo Scientific442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602.86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking bufferPierceE6423H10x skoncentrowany
TMBSigmaT0440Używany do ELISA
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302Używany do mapowania epitopów
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120Przechowywać na lodzie na tym etapie
Grinding tubesBiorad355-1197
Plate washerTecanColumbus Pro
Plate readerBioradModel 680
Low power magnifier VWR630-1062Powiększenie 8X
Forceps Dumont#7WPI14097Do etapów sekcji
Transfer pipette 1ml SamsoSamso043231
1.5 ml tubesDutscher033290

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).
  2. Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
  3. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
  4. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
  5. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
  7. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  8. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).
  9. Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
  10. Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
  11. Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
  12. El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
  13. Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
  14. Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
  15. Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29(2014).
  16. Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
  17. Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
  18. Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
  19. Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11(2001).
  20. Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
  21. Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
  22. Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225(2011).
  23. Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
  24. Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie alfa synukleinymetoda ELISAalfa synukleina zwi zana z chorobprzygotowanie homogenatu m zgupor wnanie z Western blotprzeciwcia o anty fosfo Ser129analiza rdzenia kr gowegor dm zgowiepie m zgupropagacja prionopodobna

Powiązane artykuły