Artykuł metodologiczny

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52752

⸱

30 maja 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Streszczenie

Oprócz uznanych metod, takich jak Western blot, potrzebne są nowe metody, aby szybko i łatwo zmierzyć chorobowo związaną α-synucleinę (αSD) w eksperymentalnych modelach synucleinopatii. W tym badaniu wykorzystano linię myszy transgenicznych (M83), nadmiernie ekspresującą ludzką αS A53T i spontanicznie rozwijającą dramatyczny fenotyp kliniczny między ósmym a 22. miesiącem życia, charakteryzujący się objawami, w tym utratą masy ciała, prostracją i ciężkim upośledzeniem ruchowym. Do molekularnych analiz αSD (chorobowo związana αS) u tych myszy zaprojektowano test ELISA, aby specyficznie zmierzyć αSD u chorych myszy. Analiza ośrodkowego układu nerwowego w tym modelu myszym wykazała obecność αSD głównie w ogonowych regionach mózgu i rdzeniu kręgowym. Nie było różnic w dystrybucji αSD między różnymi warunkami eksperymentalnymi prowadzącymi do choroby klinicznej, tj. u nieszczepionych i normalnie starzejących się myszy transgenicznych oraz u myszy szczepionych ekstraktami z mózgu chorych myszy. Specyficzne wykrywanie immunoreaktywności αSD za pomocą przeciwciała przeciw fosforylowanemu Ser129 αS przez test ELISA w zasadzie korelowało z tym uzyskanym przez Western blot i immunohistochemikę. Nieoczekiwanie, podobne wyniki obserwowano z kilkoma innymi przeciwciałami przeciwko C-końcowej części αS. Propagacja αSD, sugerująca zaangażowanie "prionopodobnego" mechanizmu, może być więc łatwo monitorowana i zmierzyna w tym modelu myszym przy użyciu podejścia ELISA.

Wprowadzenie

Obecnie stosowanych metod wykrywania związanego z chorobą α-synucleiny (αSD) w eksperymentalnych modelach choroby Parkinsona (PD), takich jak immunohistochemia czy Western blot, jest czasochłonnych i nie są ilościowe. Ta neurodegeneracyjna choroba charakteryzuje się agregacją alfa-synucleiny głównie w postaci inkluzji zawierających skumulowaną formę zwykle rozpuszczalnego presynaptycznego białka αS1,2 (ciałka Lewego i neurofibrile Lewego). Normalnie tylko marginalnie fosforylowana, αS jest nadmiernie fosforylowana w pozycji serynowej 129 w tych inkluzjach3 i może być monitorowana przez przeciwciała skierowane specyficznie przeciw fosforylowanemu w pozycji Ser129 αS, zapewniając tym samym wiarygodny marker patologii.

Ostatnie badania sugerują, że mechanizm „podobny do prionów” mógłby być zaangażowany w propagację agregacji αS w obrębie układu nerwowego u chorego pacjenta4,5. Te badania opisywały przyspieszenie synucleinopatii poprzez inokulację ekstraktów mózgu zawierających αSD do transgenicznego modelu mysiego (M83) ekspresującego zmutowaną ludzką αS białka A53T, związaną z poważnym upośledzeniem ruchowym występującym wraz ze starzeniem się myszy6. W ten sam sposób, inokulacja domózgowa skumulowanego rekombinowanego αS w tym samym modelu myszym M83 potwierdziła przyspieszenie agregacji5. Indukcja osadów fosforylowanego αS została również opisana po inokulacji myszy dzikiego typu C57Bl/6 albo fibrylarnego rekombinowanego αS albo ekstraktów mózgu ludzkich pacjentów z chorobą ciałek Lewego (DLB)7,8. Sacino et al.9 niedawno zwrócili uwagę, że po wstrzyknięciu fibrylarnego ludzkiego αS, rozpowszechniona i progresywna formacja inkluzji αS w mózgu mogłaby zostać wywołana w myszach M83, ale nie w myszach transgennych E46K ani w myszach nietransgennych, w których indukowane inkluzje αS były przejściowe i głównie ograniczone do miejsca wstrzyknięcia. Ostatnie badania na małpach potwierdziły propagację agregatów αS po inokulację ekstraktów pochodzących z choroby Parkinsona w gatunkach bliżej spokrewnionych z ludźmi10.

Powiązanie między zmianami αS a chorobą Parkinsona sugeruje, że αSD jest potencjalnym biomarkerem choroby Parkinsona11. Niedawne badanie wykazało wykrycie oligomerycznych rozpuszczalnych agregatów α-synucleiny w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) i osoczu jako potencjalny biomarker choroby Parkinsona na podstawie konwencjonalnego systemu ELISA typu „sandwich” z wykorzystaniem tego samego przeciwciała do wychwytu i wykrycia αS12. Na podstawie tej samej metody, białka multimeryczne zostały rozpoznane w próbkach biologicznych, w tym mózgu, ponieważ istnieje wiele kopii epitopów obecnych w złożonych formach13. Niedawno patologiczne αS w CSF pacjentów z udowodnioną patologią ciałek Lewego zostały wykryte zarówno za pomocą zestawu ELISA z wysoce specyficznym przeciwciałem przeciwko αSD (5G4), jak i za pomocą testu immunoprecypitacyjnego14. Te metody mogą odróżnić pacjentów z PD/DLB od innych rodzajów demenc.

„Prionopodobna” propagacja agregacji αS była dalsze badana w transgennym modelu myszym M83 przy użyciu podejścia ELISA, które zostało zaprojektowane specjalnie do identyfikacji αSD15. W tym badaniu opisujemy szczegółowy protokół ELISA stosowany do ilościowego wykrywania αSD u chorych myszy (czy to zaszczepionych αSD od chorych myszy M83, czy nie) i zwłaszcza w regionach mózgu specyficznie docelowanych przez patologiczny proces w tym transgennym modelu myszym M834.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury i protokoły z udziałem zwierząt były zgodne z Dyrektywą WE 86/609/EWG i zatwierdzone przez ComEth, francuski komitet narodowy do spraw etyki w eksperymentach na zwierzętach (protokół 11-0043). Zwierzęta były przetrzymywane i pielęgnowane w zatwierdzonych ośrodkach eksperymentalnych ANSES’s w Lyonie (zatwierdzenie B 69387 0801).

1. Przygotowanie myszy

  1. Zabijajcie myszy za pomocą dootrzewnowej iniekcji śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodu.
  2. Wyjmijcie cały mózg z czaszki myszy i umieśćcie go na lodzie w 35 mm plastikowym naczyńku Petriego do czasu ekstrakcji.
  3. Wyjmijcie rdzeń kręgowy szyjny.
    UWAGA: Wyjmujcie αS albo z jednej z połówek mózgu po przekrojeniu wzdłużnym albo z przekrojonych mózgów myszy, dostępnych po przeprowadzonych eksperymentach wymienionych w Tabeli 1.
EksperymentMyszy
Inoculum (równoważnik mózgu)		Okres przeżycia
(d.p.i.)		Mediana/maksymalne przeżycie
(dni)		Wykrycie αSd przez ELISA
/WB/IHC
1Myszy niezaszczepione441 ± 166419/7368/8
2Myszy zaszczepione (0,2 mg)150 ± 52140/2419/9

Tabela 1. Lista eksperymentów przeprowadzonych na myszach M83. Zaszczepienia przeprowadzano w wieku 6 tygodni dla eksperymentu 2 w obszarze zwojów czworobocznych i kory mózgowej za pomocą 20 µl homogenatu mózgu chorej myszy (1% wt/vol w glukozie 5%), po znieczuleniu 6-tygodniowych homozygotycznych myszy M83 za pomocą inhalacji 3% izofluranu. d.p.i.: dni po inokulacji.

2. Ekstrakcja αS z połówek mózgu

  1. Przekroić mózg wzdłużnie, aby uzyskać dwie połówki. Waga każdej połówki w rurce do ribolizy zawierającej kulki do mielenia.
  2. Przygotować bufor High Salt (HS) zawierający 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% fosfataz i koktajl inhibitorów proteaz. Dodać bufor High Salt do połówek mózgu, aby uzyskać 20% (waga/objętość) homogenaty.
  3. Przygotować próbki z połówek mózgu za pomocą mechanicznego homogenizatora z prędkością 6,0 m/s przez 23 sekundy dwa razy. Po pierwszej 23-sekundowej homogenizacji, umieścić rurki z homogenatami na lodzie przez 2 minuty przed drugim 23-sekundowym cyklem.
  4. Centryfugować próbki przy 1.000 x g przez 5 minut, aby wyeliminować niezmielony fragment mózgu. Odzyskać surnatki, podzielić na 200 µl alikwoty i przechowywać je w temperaturze -80 °C do dalszej analizy ELISA.

3. Ekstrakcja αS z przekrojonych regionów mózgu

  1. Przekrój cały mózg na lodzie w 35 mm plastikowym naczyńku Petriego za pomocą lupy o niskiej mocy (8x powiększenie) przy użyciu dwóch kleszczy, których końce są trzymane razem, z wyjątkiem przecinania hipokampu. Nie przekraczaj 10 minut, aby zachować integralność mózgu. Umieść mózg prawidłową stroną do góry i pobierz następujące regiony mózgu w tej kolejności:
    1. Oddzielić jedną z dwóch cebulek węchowych za pomocą kleszczy umieszczonych tuż za cebulką. Odłączyć ją od mózgu ruchem w dół. Powtórzyć tę operację dla drugiej cebulki.
    2. Delikatnie włożyć kleszcze między dwie korty i przesunąć je do przodu, aby ułatwić oddzielenie dwóch korty. Utrzymując mózg w miejscu za pomocą jednych kleszczy, użyj drugich, aby oddzielić korę od hipokampu.
    3. Umieść kleszcze 2 mm poniżej kory. Utrzymaj delikatne naciśnięcie kleszczami, aż górna część hipokampu będzie widoczna. Oddzielić pierwszą część kory i powtórzyć z drugą częścią. Użyj kleszczy, aby oddzielić dwie korty, zaczynając od hipokampu i przesuwając się w kierunku przedniej części mózgu.
    4. Umieść otwarte kleszcze wokół jednego z hipokampów. Zamknij kleszcze u dołu hipokampu, a następnie delikatnie je usuń, odzyskuj jak najwięcej. Powtórz procedurę dla drugiego hipokampu.
    5. Umieść otwarte kleszcze poniżej jednego z zwojów czworobocznych i delikatnie oddzielić go od mózgu. Użyj kleszczy, aby usunąć wszelkie pozostałe korty ze zwoju czworobocznego. Powtórz tę procedurę dla drugiego zwoja czworobocznego.
    6. Użyj kleszczy, aby delikatnie wcisnąć kontur móżdżku o 2 mm, aby ułatwić oddzielenie móż

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu zastosowano testy ELISA, które specyficznie identyfikowały związane z chorobą αS (αSD) w homogenatach mózgu przygotowanych w buforze z wysoką zawartością soli od chorych myszy M83. Zastosowanie przeciwciała specyficznie rozpoznającego pSer129 αS (p = 0,0074) pozwoliło testowi ELISA na łatwe odróżnienie starych, chorych myszy (> 8 miesięcy) od młodych (2-5 miesięcy), zdrowych myszy M83 (Rysunek 1). Kilka innych przeciwciał wykazało podobnie wysokie sygnały (> 0,6 OD) tylko ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykazano, że wykorzystanie ELISA pozwalało na specyficzne wykrywanie αSD bezpośrednio z homogenatów mózgu myszy w trakcie choroby w modelu myszy transgenicznych M83. Rzeczywiście, ten ELISA mógł łatwo odróżnić chore myszy M83 od zdrowych myszy M83, używając wyłącznie homogenatów całego mózgu w buforze z wysokim stężeniem soli.

Najskryteczniejszymi krokami dla uzyskania pomyślnych wyników przy użyciu tego ELISA są: poprawne wycięcie różnych obszarów mózgu myszy poprzez rozwinięcie ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcą podziękować Damienowi Gaillard za inokulacje i nadzór nad eksperymentami na zwierzętach. Ta praca została wsparta przez ANSES (Francuska Agencja ds. Bezpieczeństwa Żywności, Środowiska i Bezpieczeństwa oraz Higieny Pracy) oraz grantem Fundacji France Parkinson.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
LB509Abcamab27766Antibody detekcyjny 1/2,000
AS11Produced at AnsesAntibody detekcyjny 1/1,000
4D6Abcamab1903Antibody detekcyjny 1/2,000
PSer129Abcamab59264Antibody detekcyjny 1/3,000
PSer129 EP1536YAbcamab51253Antibody detekcyjny 1/1,000
syn514Abcamab24717Antibody detekcyjny 1/500
clone 42BD Biosciences610787Antibody powlekający i detekcyjny (1/2,000)
8A5Provided by Dr. AndersonAntibody detekcyjny 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibodyMilliporeAB5038PAntibody powlekający
Anti-mouse IgG HRP conjugateSouthern Biotech1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugateSouthern Biotech4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugateDianova115-035-164
HS bufferAdjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSAdjust at pH 7.5
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815Roztwór macierzysty 100 mM, toksyczny
1% phosphatase cocktailPierce78428
1% protease inhibitor cocktailRoche04 693 132 00150x skoncentrowany
Microplate MaxiSorpTMThermo Scientific442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602.86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking bufferPierceE6423H10x skoncentrowany
TMBSigmaT0440Używany do ELISA
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302Używany do mapowania epitopów
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120Przechowywać na lodzie na tym etapie
Grinding tubesBiorad355-1197
Plate washerTecanColumbus Pro
Plate readerBioradModel 680
Low power magnifier VWR630-1062Powiększenie 8X
Forceps Dumont#7WPI14097Do etapów sekcji
Transfer pipette 1ml SamsoSamso043231
1.5 ml tubesDutscher033290

Bibliografia

  1. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).
  2. Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
  3. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
  4. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
  5. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
  7. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  8. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).
  9. Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
  10. Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
  11. Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
  12. El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
  13. Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
  14. Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
  15. Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29(2014).
  16. Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
  17. Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
  18. Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
  19. Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11(2001).
  20. Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
  21. Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
  22. Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225(2011).
  23. Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
  24. Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie alfa synukleinymetoda ELISAalfa synukleina zwi zana z chorobprzygotowanie homogenatu m zgupor wnanie z Western blotprzeciwcia o anty fosfo Ser129analiza rdzenia kr gowegor dm zgowiepie m zgupropagacja prionopodobna

Powiązane artykuły