Artykuł metodologiczny

Skalowalna hodowla i produkcja iPSC na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy

34.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52755

⸱

14 maja 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1InvivoSciences, Inc., 2Gilson, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Opisane protokoły pozwalają laboratoriom na przeprowadzanie skalowalnych, przylegających hodowli komórek macierzystych z dużą wydajnością przy minimalnym nakładzie pracy, doświadczenia i inwestycji w sprzęt przy użyciu programowalnego robota do obsługi cieczy i 96-dołkowych płytek. iPSC pasażowane ponad 20 razy w tym systemie utrzymywały pluripotencję, prawidłowe kariotypy i różnicowały się w kardiomiocyty.

Streszczenie

Ciągły postęp w hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych wypełnia lukę między stanowiskiem a szpitalem do wykorzystania tych komórek w medycynie regeneracyjnej, odkrywaniu leków i testowaniu bezpieczeństwa. Aby móc produkować biofarmaceutyki i komórki komórkowe pochodzące z komórek macierzystych oraz komórki do inżynierii tkankowej i transplantacji, niezbędna jest opłacalna technologia produkcji komórek. Utrzymanie pluripotencji i stabilnej wydajności komórek w dalszych zastosowaniach (np. różnicowanie komórek) w czasie ma kluczowe znaczenie dla produkcji komórek na dużą skalę. Jednak może to być trudne do osiągnięcia, zwłaszcza jeśli komórki są hodowane ręcznie, gdzie operator może wprowadzić znaczną zmienność, a także być zbyt kosztownym w zwiększaniu. Aby umożliwić wysokowydajną produkcję komórek macierzystych na dużą skalę i wyeliminować wpływ operatora, opracowano nowatorskie protokoły hodowli komórek macierzystych przy użyciu stacjonarnego wielokanałowego robota do obsługi cieczy, które wymagają minimalnego zaangażowania techników lub doświadczenia. Dzięki tym protokołom ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) hodowano w warunkach wolnych od karmienia bezpośrednio z zamrożonego stada i utrzymywano na 96-dołkowych płytkach. W zależności od linii komórkowej i pożądanego tempa skalowania, operator może łatwo określić, kiedy przejść przez linię na podstawie serii obrazów pokazujących optymalne zagęszczenie kolonii do podziału. Następnie przygotowuje się niezbędne odczynniki do przeprowadzenia podziału kolonii na nowe płytki bez etapu wirowania. Po 20 pasażach (~3 miesiące) dwie linie iPSC utrzymywały stabilne kariotypy, wykazywały ekspresję markerów komórek macierzystych i różnicowały się w kardiomiocyty z wysoką wydajnością. System może przeprowadzać późniejsze wysokoprzepustowe badania przesiewowe nowych protokołów różnicowania lub manipulacji genetycznej przeznaczonych dla płytek 96-dołkowych. Technologia ta zmniejszy nakład pracy i obciążenia techniczne związane z produkcją dużej liczby identycznych komórek macierzystych do niezliczonych zastosowań.

Wprowadzenie

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) znacznie wzrosło od czasu ich wyprowadzenia w 2007 roku1 do testowania związków, medycyny regeneracyjnej i modelowania chorób 2-6. Zapotrzebowanie to wynika ze zdolności iPSC do wytwarzania dużej liczby komórek pluripotencjalnych, które można różnicować w komórki somatyczne w niezrównanej ilości. Wraz z poprawą technik ukierunkowanego różnicowania 7-10 i rozwojem modelowania ludzkich komórek lub tkanek oraz terapią komórkową wzrostem11-14, rośnie również zapotrzebowanie na masową produkcję wysokiej jakości iPSC. Powszechnie uważa się, że wśród innych dolegliwości, zawał mięśnia sercowego lub funkcjonalna wymiana komórek B będzie wymagała setek milionów do miliardów komórek somatycznych pochodzących z iPSC15-18. Co więcej, coraz bardziej złożone modelowanie tkanek 3D w celu odkrywania i terapii leków będzie wymagało dużej liczby komórek9,13,19. We wszystkich tych przykładach zdefiniowane, jednolite i powtarzalne iPSC muszą być dostępne i łatwe do wyprodukowania.

Aby produkować biofarmaceutyki pochodzące z komórek macierzystych oraz komórki do inżynierii tkankowej i transplantacji, niezbędna jest opłacalna technologia produkcji komórek. Skalowana produkcja iPSC skupiła się na hodowli zawiesiny20–25 lub zawiesinie z użyciem substratów mikronośnikowych26–28, częściowo dlatego, że techniki te są z powodzeniem stosowane w produkcji eukariotycznej na dużą skalę, bez iPSC. Kilka grup zademonstrowało systemy hodowli zawiesinowych, które dają pluripotencjalne komórki macierzyste20,21,23,24,29. Jednak podejścia te wykorzystują drogie i złożone systemy, które nie są łatwo dostępne dla naukowców opracowujących nowatorskie programy różnicowania, kierujących inżynierią tkankową i prowadzących badania na skalę laboratoryjną. Ponadto hodowle iPSC w zawiesinie i mikronośniku wymagają adaptacji i technik lub substancji chemicznych, które nie występują w tradycyjnych, przylegających kulturach iPSC, takich jak ciągłe stosowanie inhibitora kinazy Rho, środków przeciwpieniących i filtracji w celu regulacji agregacji. Naprężenia fizyczne w komórkach są bardziej rozpowszechnione w hodowli zawiesiny, wprowadzane przez mieszanie mechaniczne, a także podczas zderzenia mikronośników. Problemy te ograniczają przewidywalność i szybkość, z jaką nowo wygenerowane linie komórek macierzystych mogą być hodowane w zawiesinie. Inne firmy opracowały zrobotyzowane systemy obsługi płytek, które naśladują techniki hodowli płytek30,31, ale oprócz podstawowych wyzwań związanych z hodowlą komórek macierzystych platformy te wymagają znacznych inwestycji w sprzęt i wiedzę specjalistyczną.

Poniższa praca opisuje rozwój i praktykę skalowalnego systemu hodowli iPSC, który wykorzystuje samodzielny, standardowy 8-kanałowy robot do obsługi cieczy i 96-dołkowe płytki. Metoda ta została opracowana w celu połączenia hodowli iPSC na skalę laboratoryjną i produkcji iPSC na dużą skalę (np. 107 – 1,5 x 109 komórek tygodniowo na technika), umożliwiając osobom opracowującym nowe technologie iPSC łatwe zwiększenie skali produkcji bez dużych inwestycji w sprzęt lub pracę. Ta metoda jest stosunkowo niedroga w konfiguracji, wymaga niewielkiej lub żadnej hodowli komórek macierzystych, programowania lub doświadczenia inżynieryjnego, zajmuje niewiele miejsca na sprzęt bez potrzeby stosowania dedykowanego kaptura do hodowli komórkowych i wykorzystuje standardowy sprzęt do hodowli komórek, aby umożliwić zautomatyzowaną produkcję komórek o średniej i wysokiej przepustowości. Celem było opracowanie systemu zdolnego do skalowalnej hodowli komórek macierzystych, który mógłby być wykorzystany przez laboratoria nowe w hodowli komórek macierzystych, tych, dla których ręczna hodowla stanowi przeszkodę w rozwijaniu swoich pomysłów lub tych, którzy chcą ekonomicznego sposobu na produkcję dużej liczby komórek macierzystych. Przedstawiona tutaj platforma eliminuje wpływ techników na hodowlę komórek macierzystych i normalizuje procedury karmienia i pasażu, aby umożliwić stałą produkcję komórek macierzystych.

Protokół

Zrobotyzowany system obsługi cieczy, który dla następujących protokołów był pipetmaX Gilsona, ułatwia zautomatyzowaną, skalowalną hodowlę i produkcję komórek macierzystych, zachowując tradycyjne warunki hodowli przylegającej w formacie płytki 96-dołkowej. Podobnie jak tradycyjna hodowla płytek 6-dołkowych, iPSC są hodowane zgodnie z tym protokołem jako monowarstwa odrębnych kolonii, ale w formacie płytki 96-dołkowej. Każda studzienka może być izogeniczna lub odrębna, a każda konfiguracja może być hodowana równolegle, ponieważ robot może utrzymać każdą studzienkę w segregacji. Typowa procedura hodowli iPSC składa się z dwóch faz: programu karmienia, w którym kultury są podawane zgodnie z konfigurowalnym harmonogramem, oraz programu pasażowego, w którym użytkownik wybiera metodę dysocjacji i współczynnik podziału, kontrolując w ten sposób gęstość wysiewu i szybkość kamienia. Poniższe protokoły opisują, w jaki sposób rozpoczyna się nową hodowlę, w jaki sposób odbywa się karmienie i pasaż oraz programy uzupełniające, które ułatwiają hodowlę iPSC.

Uwaga: Proszę zapoznać się z Listą Materiałów, aby uzyskać szczegółowe zalecenia dotyczące materiału do powlekania matrycy i odczynników dysocjacyjnych zatwierdzonych dla następujących protokołów.

1. Przygotowanie 96-dołkowych płytek z powłoką żelową macierzy zewnątrzkomórkowej

  1. Wyjmij opakowanie z sześciu nowych płytek RT 96-dołkowych i umieść je na łożu robota do obsługi płynów w pozycjach 2, 3, 5, 7, 8, 9 (patrz rysunek 1A dla pozycji stołu).
  2. Umieścić wstępnie schłodzone 4-dołkowe koryto o temperaturze 4 °C w pozycji łóżka 6.
  3. Załaduj kolumnę 12 stojaka na końcówki w pozycji stołu 1 wstępnie schłodzonymi końcówkami do pipet o temperaturze 4 °C i 200 μl.
  4. Napełnić pierwszą (najbardziej wysuniętą na lewo) studzienkę w pozycji złoża 6 25 ml 4 °C DMEM/F12, zalewając podwielokrotność przy użyciu sterylnej techniki. Alternatywnie, użyj pipety, aby zakończyć transfer.
  5. Zdejmij 96-dołkowe pokrywki płytek i wsuń każdą z nich do specjalnie zaprojektowanego stojaka na pokrywę płytki (PLHR, patrz Rysunek 1A). Unikać kontaktu z wnętrzem pokrywek talerzy.
    Uwaga: Obchodzenie się z wnętrzem pokrywki talerza lub układanie pokrywek talerzy w miejscu, w którym wnętrze jednej pokrywki styka się z zewnętrzną stroną drugiej, jest doskonałą drogą do zanieczyszczenia.
  6. Korzystając z panelu dotykowego sterowania robotem, naciśnij następującą serię przycisków, aby rozpocząć proces wstępnego zwilżania studni:
    1. Dotknij "Uruchom protokół".
    2. Wybierz "żel do macierzy zewnątrzkomórkowej Prewet" i dotknij dalej.
    3. Decyzja użytkownika: Dotknij "uruchom test", aby użyć kreatora krok po kroku do wstępnego przetestowania wybranego programu.
      Uwaga: Robot nie działa, ale oprogramowanie testuje protokół pod kątem problemów z oprogramowaniem. Przy ustalonych protokołach dopuszczalne jest stukanie, "pomiń konfigurację".
    4. Dotknij "Uruchom protokół".
  7. Podczas procesu wstępnego zwilżania (krok 1.6) przejdź do kroku 1.8.
  8. Rozmrozić na lodzie jedną 4 mg porcji żelu macierzy zewnątrzkomórkowej o zredukowanym czynniku wzrostu (GFRM) zawartego w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przechowywanej w temperaturze -80 °C. Przechowywać porcję na lodzie do momentu przygotowania do użycia.
    Uwaga: GFRM zestali się, jeśli pozwoli mu się dotrzeć do RT i nie będzie użyteczny.
  9. Zawiesić podwielokrotność 4 mg GFRM w 24 ml 4 °C DMEM/F12 za pomocą szklanej pipety o pojemności 25 ml. Podczas przenoszenia DMEM/F12 należy zrobić przerwę na 2-3 sekundy, aby pipeta ostygła przed ponownym podwieszeniem podwielokrotności GFRM.
  10. Po zakończeniu procesu wstępnego zwilżania (krok 1.6) przejdź do kroku 1.11.
  11. Przenieść 24 ml mieszaniny DMEM/F12 GFRM do czwartego dołka koryta w pozycji łóżka 6.
  12. Korzystając z panelu dotykowego sterowania robotem, naciśnij następującą serię przycisków, aby rozpocząć proces powlekania żelem macierzy zewnątrzkomórkowej:
    1. Dotknij "Uruchom protokół".
    2. Wybierz "podwielokrotność żelu macierzy zewnątrzkomórkowej" i dotknij Dalej.
    3. Decyzja użytkownika: Dotknij "uruchom test", aby użyć kreatora krok po kroku do wstępnego przetestowania wybranego programu.
      Uwaga: Robot nie działa, ale oprogramowanie testuje protokół pod kątem problemów z oprogramowaniem. Przy ustalonych protokołach dopuszczalne jest stukanie, "pomiń konfigurację".
    4. Dotknij "Uruchom protokół".
  13. Po zakończeniu kroku 1.12 załóż pokrywy płytek.
  14. Przenieść 96-dołkowe płytki pokryte żelem macierzy zewnątrzkomórkowej do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i trzymać tam przez 24 godziny, po czym płytki będą gotowe do użycia lub przechowywania.
    Uwaga: W warunkach wyjątkowych nowo pokryte płytki żelowe macierzy zewnątrzkomórkowej można stosować po 15-30 minutach inkubacji, ale zaleca się inkubację O/N do 24 godzin.
  15. Powtarzaj kroki protokołu 1.1, 1.3, 1.5-1.6, 1.10 i 1.12-14, aż zostanie użyty cały DMEM/F12 z GFRM.

2. Przechowywanie 96-dołkowych płytek pokrytych żelem macierzy zewnątrzkomórkowej

  1. Usunąć 96-dołkowe płytki pokryte żelem macierzy zewnątrzkomórkowej z wilgotnego inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2
    2. .
  2. Opcjonalnie: Poczekaj, aż 96-dołkowe płytki pokryte żelem macierzy zewnątrzkomórkowej dojdą do RT przed przejściem do kroku 2.3.
    Uwaga: Ten opcjonalny krok zmniejszy gromadzenie się kondensatu, gdy płyty są umieszczone w temperaturze 4 °C.
  3. Umieść płytki na łożu robota do obsługi płynów w pozycjach 2, 3, 5, 7, 8, 9 (patrz Rysunek 1A dla pozycji stołu).
  4. Załadować kolumnę 12 stojaka na końcówki w pozycji stołu 1 końcówkami do pipet RT 200 μl.
  5. Umieść zbiornik z czterema korytami w pozycji łóżka 6.
  6. Napełnij 4 (skrajną prawą) część zbiornika środkiem RT DMEM/F12.
  7. Zdjąć pokrywki płytek 96-dołkowych i wsunąć każdą z nich do PLHR.
  8. Korzystając z panelu dotykowego sterowania robotem, naciśnij następującą kombinację przycisków:
    1. Dotknij "Uruchom protokół".
    2. Wybierz "podwielokrotność żelu macierzy zewnątrzkomórkowej" i dotknij Dalej.
    3. Decyzja użytkownika: Dotknij "uruchom test", aby użyć kreatora krok po kroku do wstępnego przetestowania wybranego programu.
      Uwaga: Robot nie działa, ale oprogramowanie testuje protokół pod kątem problemów z oprogramowaniem. Przy ustalonych protokołach dopuszczalne jest stukanie, "pomiń konfigurację".
    4. Dotknij "Uruchom protokół".
  9. Po zakończeniu załóż pokrywy płyt i wyjmij je z łoża maszyny.
  10. Owinąć wokół całej strony każdej 96-dołkowej płytki pokrytej żelem macierzy zewnątrzkomórkowej (w miejscu, w którym pokrywka styka się z płytką) paskiem folii parafinowej o wymiarach jeden cal na 6 cali. Pamiętaj, aby rozciągnąć folię parafinową, aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie.
  11. Opcjonalnie: Oznaczyć płytki datą zakończenia powlekania żelem do macierzy zewnątrzkomórkowej, numerem partii żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej, nazwą użytkownika i wszelkimi innymi informacjami.
  12. Przechowuj płytki w temperaturze 4 °C, gdzie będą dobre do użycia przez okres do dwóch tygodni.
    Uwaga: Talerze były z powodzeniem używane po upływie limitu dwóch tygodni, jednak nie jest to zalecane.

3. Wykonywanie gradientu gęstości wysiewu kolonii komórek macierzystych w formacie 96-dołkowej płytki z żywej lub zamrożonej hodowli: Jak rozpocząć lub przywrócić normalne odstępy między pasażami do linii komórek macierzystych

  1. Jeśli zaczynasz od zamrożonej kultury, przejdź do kroku 3.2. Jeśli zaczynasz od hodowli żywych komórek macierzystych znajdujących się już na płytce, zacznij od kroku 3.5.
  2. Rozmrozić zamrożoną kulturę, obracając probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko mały kawałek lodu.
  3. Opcjonalnie: Rozcieńczyć rozmrożone komórki w 10 ml pożywki do wzrostu komórek macierzystych RT (SCGM), odwirować przez 2 minuty przy 300 x g, odessać pożywkę supernatantową i ponownie zawiesić osad komórek macierzystych w 7 ml świeżego SCGM zawierającego 10 μM Y27632.
    Uwaga: Ten krok eliminuje przenoszenie środków zamrażających.
  4. Przejdź do kroku 3.6.
  5. Jeśli zaczynasz od żywych, już posianych komórek macierzystych: pasażuj komórki w normalny sposób, stosując dysocjację enzymatyczną lub nieenzymatyczną. Spróbuj zebrać w sumie 1,5-3 miliony komórek; zwykle jeden dołek z sześciodołkowej płytki. Odwirować pobrane komórki przez 2 minuty przy 300 x g, odessać pożywkę sklarowaną nad osadem i ponownie zawiesić osad komórek macierzystych w 7 ml świeżego SCGM zawierającego 10 μM Y27632. Przejdź do kroku 3.6.
  6. Upewnij się, że komórki, pochodzące z zamrożonej lub żywej hodowli, są zawieszone w 7 ml RT SCGM z 10 μM Y27632.
  7. Załaduj kolumnę 12 stojaka na końcówki w pozycji pierwszej za pomocą końcówek do pipet RT 200 μl.
  8. Umieść zbiornik z czterema korytami w pozycji łóżka 2.
  9. Umieścić jedną nową 96-dołkową płytkę pokrytą żelem macierzy zewnątrzkomórkowej, wstępnie podgrzaną do temperatury 37 °C, w pozycji stołu 5 i zdjąć pokrywkę, umieszczając ją w PLHR.
  10. Przenieść 7 ml zawieszonych komórek do studzienki 3 zbiornika za pomocą pipety lub sterylnego nalewania.
    1. Korzystając z panelu dotykowego sterowania robotem, naciśnij następującą kombinację przycisków:
    2. Dotknij "Uruchom protokół".
    3. Wybierz "Gradient gęstości wysiewu" i dotknij Dalej.
    4. Decyzja użytkownika: Dotknij "uruchom test", aby użyć kreatora krok po kroku do wstępnego przetestowania wybranego programu.
      Uwaga: Robot nie działa, ale oprogramowanie testuje protokół pod kątem problemów z oprogramowaniem. Przy ustalonych protokołach dopuszczalne jest stukanie, "pomiń konfigurację".
  11. Dotknij "Uruchom protokół".
  12. Po zakończeniu serii rozcieńczania ponownie przykryć płytkę i umieścić w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do następnego karmienia.
  13. Opcjonalnie: Oznacz tabliczkę datą, informacjami o szczepie, nazwą użytkownika, typem nośnika i innymi istotnymi informacjami.
  14. W ciągu następnych kilku dni należy karmić 96-dołkową płytkę zgodnie z wymaganiami, korzystając z protokołu 4 poniżej.
    Uwaga: Typowa płytka z komórkami macierzystymi będzie wymagała pełnej wymiany pożywki raz na 24 godziny, a SCGM nie zawiera Y27632 do karmienia; tylko podczas początkowego siewu po przejściu. Przed karmieniem sprawdź płytkę pod kątem zanieczyszczenia i gęstości kolonii. Zobacz krok 3.16, aby uzyskać więcej informacji na temat monitorowania zagęszczenia kolonii.
  15. W ciągu następnych kilku dni kilka kolumn w pobliżu środka płytki (zwykle kolumny 5-8) zbliży się do idealnej gęstości do przejścia; aby określić tę gęstość, porównaj płytkę 96-dołkową z zakresem gęstości pokazanym na rysunku 3B, mając na uwadze następujące informacje:
    1. Pasaż, gdy przestrzeń między większością kolonii wynosi około 25% średnicy sąsiedniej kolonii.
      Uwaga: Uzasadnieniem dla określenia czasu do przejścia jest to, że kolejny cykl karmienia i wzrostu spowodowałby kontakt kolonii, którego należy unikać.
  16. Aby rozpocząć równomiernie rozcieńczoną płytkę i rozpocząć regularną hodowlę, wybierz kolumnę o idealnej gęstości i przejściu. Patrz Protokół 5 do przejścia.

4. Karmienie 96-dołkowych kolonii komórek macierzystych

Uwaga: Poniższy protokół opisuje karmienie jedną 96-dołkową płytką kolonii komórek macierzystych. Technikę można skalować w górę, aby pomieścić łącznie 6 płyt równolegle.

  1. Wyjąć 96-dołkową płytkę z kolonią komórek macierzystych z nawilżanego inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Sprawdź płytkę pod kątem zanieczyszczeń i gęstości komórek. Aby się pożywić, upewnij się, że gęstość kolonii jest poniżej idealnej gęstości przejścia. Rysunek 3B zawiera informacje na temat gęstości.
    Uwaga: Zanieczyszczenia mogą objawiać się mętnym podłożem i towarzyszyć im nieprzyjemny zapach. Małe, ewidentnie niezawierające iPSC agregaty mogą być również widoczne pod mikroskopem. Aby ocenić gęstość komórek, zobacz krok 3.16.1 powyżej.
  3. Umieść 96-dołkową płytkę z kolonią komórek macierzystych w pozycji łóżka 3 na nachylonej rampie o temperaturze 37 °C.
  4. Załadować kolumnę 12 stojaka na końcówki w pozycji stołu 1 końcówkami do pipet RT 200 μl.
  5. Umieść 4-dołkowe koryto w pozycji łóżka 2.
  6. Napełnij studzienkę 3 koryta w pozycji stołu 2 8 ml świeżego RT SCGM bez Y27632 przez sterylne nalewanie lub pipetowanie.
  7. Zdejmij pokrywkę 96-dołkowej płytki kolonii komórek macierzystych, umieszczając ją w PLHR.
  8. Korzystając z panelu dotykowego sterowania robotem, naciśnij następującą kombinację przycisków:
    1. Dotknij "Uruchom protokół".
    2. Wybierz "Colony Feed One Plate" i dotknij Dalej.
    3. Decyzja użytkownika: dotknij "uruchom test", aby użyć kreatora krok po kroku do wstępnego przetestowania wybranego programu.
      Należy pamiętać, że robot nie działa, ale oprogramowanie testuje protokół pod kątem problemów z oprogramowaniem. Przy ustalonych protokołach dopuszczalne jest stukanie, "pomiń konfigurację".
    4. Dotknij "Uruchom protokół".
  9. Po zakończeniu protokołu karmienia ponownie przykryj 96-dołkową płytkę kolonii komórek macierzystych i wróć do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do czasu, gdy wymagane będzie następne karmienie lub pasaż. Jest to zwykle wymagane po 24 godzinach.
    Uwaga: Zaleca się zapisywanie zdarzenia karmienia na pokrywie talerza z datą, typem nośnika, nazwą użytkownika i innymi istotnymi informacjami.

5. Przekazywanie 96-dołkowych kolonii komórek macierzystych na płytkach

  1. Po kilku cyklach karmienia 96-dołkowa płytka kolonii komórek macierzystych będzie gotowa do przejścia. Protokół ten opisuje przejście jednej kolumny na jedną 96-dołkową płytkę, reprezentującą stosunek podziału 1:12. Użytkownik może zdefiniować współczynnik podziału i wybrać dowolną liczbę studni lub kolumn do podziału, w tym wybrać studnie, które mogą nie sąsiadować ze sobą.
  2. Porównaj gęstość płytki kolonii komórek macierzystych w 96 dołkach z rysunkiem 3B, aby określić, czy należy pasować. Idealna gęstość pasażów występuje wtedy, gdy przestrzeń między większością kolonii wynosi około 25% średnicy sąsiedniej kolonii, w przeciwnym razie późniejsze karmienie spowodowałoby, że kolonie zrosłyby się ze sobą.
  3. Zbadaj 96-dołkową płytkę kolonii komórek macierzystych pod mikroskopem, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia.
  4. Umieść 96-dołkową płytkę z kolonią komórek macierzystych w pozycji łóżka 3 na nachylonej rampie o temperaturze 37 °C.
  5. Załaduj kolumny 8-12 do stojaka załadowczego końcówek w pozycji stołu 1 końcówkami do pipet RT 200 μl.
  6. Umieść 4-dołkowe koryto w pozycji łóżka 2.
  7. Pozostawić koryto 1 puste, wlać 8,5 ml SCGM + 10 μM Y27632 do studzienki 2, wlać 3,5 ml 30% odczynnika dysocjacji proteolitycznej i kolagenolitycznej (lub odczynnika dysocjacyjnego na bazie EDTA) do studzienki 3, umieścić 4,5 ml PBS w studzience 4,
    Uwaga: Wszystkie odczynniki mogą być w temperaturze RT lub 37 °C. Odczynnik do dysocjacji proteolitycznej i kolagenolitycznej RT w 30% rozcieńczony PBS zastosowano do opisanej tutaj hodowli iPSC pochodzącej z tkanki tłuszczowej i fibroblastów.
  8. Umieścić jedną nową, wstępnie ogrzaną 96-dołkową płytkę pokrytą żelem macierzy zewnątrzkomórkowej o temperaturze 37 °C w pozycji 5 łóżka.
  9. Zdejmij pokrywę płytki z 96-dołkową płytką z kolonią komórek macierzystych, a także nową pokrywę z 96-dołkową płytką i umieść je obie w PLHR.
  10. Korzystając z panelu dotykowego sterowania robotem, naciśnij następującą kombinację przycisków:
    1. Dotknij "Uruchom protokół".
    2. Wybierz "Colony Split 1:12 Kolumna 1" i dotknij Dalej.
    3. Decyzja użytkownika: Dotknij "uruchom test", aby użyć kreatora krok po kroku do wstępnego przetestowania wybranego programu.
      Uwaga: Robot nie działa, ale oprogramowanie testuje protokół pod kątem problemów z oprogramowaniem. Przy ustalonych protokołach dopuszczalne jest stukanie, "pomiń konfigurację".
    4. Dotknij "Uruchom protokół".
  11. Po zakończeniu protokołu przejścia ponownie zakryj obie płyty.
  12. Opcjonalnie: Oznacz nową tabliczkę wymaganymi informacjami (np. datą, linią komórkową, numerem przejścia, typem nośnika, nazwą użytkownika itp.).
  13. Umieścić obie płytki z powrotem w inkubatorze z wilgotnością 37 °C, 5% CO2 do momentu, gdy wymagane jest następne karmienie lub pasaż. Uwaga: Następne karmienie następuje zazwyczaj po 24 godzinach
    Uwaga: Komórki i kolonie powinny przyczepić się do płytki w ciągu 2-3 godzin od rozszczepienia i wyglądać na bardzo rozłożone. Wynika to z obecności inhibitora kinazy Rho, a komórki ulegną kondensacji i będą wykazywać charakterystyczną morfologię komórek macierzystych (tj. kolonie wypełnione kostką brukową ze stosunkiem małej objętości komórek do dużego jądra) po pierwszym karmieniu wolnym od inhibitora kinazy Rho.

6. Pozyskiwanie 96-dołkowych komórek macierzystych do produkcji

Uwaga: Kolonie komórek macierzystych mogą być zbierane do wykorzystania w dowolnym momencie hodowli. Zwykle dzieje się tak, gdy komórki są gotowe do przejścia (patrz protokół 5). Protokół ten opisuje, jak pobrać jedenaście kolumn z 96-dołkowej płytki kolonii komórek macierzystych.

  1. Zbadaj 96-dołkową płytkę kolonii komórek macierzystych pod mikroskopem, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia.
  2. Umieść 96-dołkową płytkę z kolonią komórek macierzystych w pozycji łóżka 3 na nachylonej rampie o temperaturze 37 °C.
  3. Załaduj kolumny 11 i 12 do stojaka załadowczego końcówek w pozycji łoża 1 za pomocą końcówek do pipet RT 200 μl.
  4. Umieść 4-dołkowe koryto w pozycji łóżka 2.
  5. Pozostawić koryto 1 puste, umieścić 8,5 ml SCGM w studzience 2, wlać 3,5 ml 30% odczynnika dysocjacji proteolitycznej i kolagenolitycznej (lub odczynnika dysocjacyjnego na bazie EDTA) do studzienki 3, umieścić 4,5 ml PBS w studzience 4,
    Uwaga: Wszystkie odczynniki mogą być w temperaturze RT lub 37 °C.
  6. Zdjąć pokrywkę 96-dołkowej płytki z kolonią komórek macierzystych i umieścić w PLHR.
  7. Korzystając z panelu dotykowego sterowania robotem, naciśnij następującą kombinację przycisków:
    1. Dotknij "Uruchom protokół".
    2. Wybierz "Colony Harvest Columns 2-12" i dotknij dalej.
    3. Decyzja użytkownika: Dotknij "uruchom test", aby użyć kreatora krok po kroku do wstępnego przetestowania wybranego programu.
      Uwaga: Robot nie działa, ale oprogramowanie testuje protokół pod kątem problemów z oprogramowaniem. Przy ustalonych protokołach dopuszczalne jest stukanie, "pomiń konfigurację".
    4. Stuknij "Uruchom protokół".
      Uwaga: Po zakończeniu procedury pobierania komórki znajdą się w dołku 2 i będą gotowe do pobrania.

Wyniki

Opracowanie zrobotyzowanej platformy do hodowli komórek macierzystych w płytkach wielodołkowych.

Popyt na iPSC rośnie ze względu na ich użyteczność w opracowywaniu leków i medycynie regeneracyjnej. Jednak skalowalna produkcja koncentrowała się na hodowli w zawiesinie32 z wykorzystaniem stosunkowo złożonego sprzętu, co wyklucza wielu badaczy i odbiega od ugruntowanych metod hodowli adherentnych. Zamiast drastycznie zmieniać sprawdzone metody hodowli komórek macierzystych na płytkach, takie jak przejście na hodowlę w zawiesinie czy stosowanie mikronośników, skupiliśmy się na miniaturyzacji i automatyzacji naszych istniejących technik hodowli adherentnych iPSC. Pierwszym celem była automatyzacja dokarmiania i pasażowania w celu ujednolicenia całego procesu hodowli. Wymagana była również platforma zdolna do szybkiego zwiększenia skali przy użyciu istniejącej technologii. Aby osiągnąć te cele, opracowano metodę hodowli komórek macierzystych na płytce 96-dołkowej z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu dozowania cieczy (Ryc. 1). Protokoły dokarmiania i pasażowania opracowane tutaj z użyciem robota do obsługi cieczy nie wymagają etapu wirowania ani ciągłego monitorowania przez technika. Protokoły te opracowano z wykorzystaniem dwóch linii iPSC bez użycia komórek karmicieli; jednej pochodzącej z fibroblastów, a drugiej z komórek tłuszczowych33.

Komputerowy system dozowania cieczy (Rycina 1A) składa się z płaskiego stołu przesuwającego się w przód i w tył. Stół posiada dziewięć ponumerowanych wgłębień o wymiarach około 5 x 3,3 cala z klipsami mocującymi, które pozwalają na umieszczenie standardowych płytek do hodowli komórkowych, zbiorników na ciecze oraz innego specjalistycznego sprzętu. Głowica pipetująca porusza się w lewo i w prawo (prostopadle do ruchu stołu) oraz w górę i w dół. Wspólnie ze stołem, głowica pipetująca może być zaprogramowana do pobierania lub dozowania pożywki w dowolnym miejscu na stole po pobraniu końcówek pipet z wymiennego statywu. W razie potrzeby każda z 96 studni może być obsługiwana oddzielnie, aby wyeliminować kontaminację krzyżową. W obecnej konfiguracji każda końcówka głowicy pipetującej może przenieść od 0 do 200 µl pożywki, jednak w zależności od rozmiaru końcówek możliwe są inne zakresy objętości.

Podczas pasażowania komórek macierzystych w standardowych płytkach, dysocjacja enzymatyczna lub chemiczna zazwyczaj wymaga inkubacji w 37 °C. Wstępne testy potwierdziły, że dysocjacja z użyciem odczynnika proteolitycznego i kolagenolitycznego lub odczynnika na bazie EDTA przebiegała efektywniej w 37 °C niż w RT, zarówno pod kątem czasu dysocjacji, jak i homogeniczności wielkości kolonii uzyskanych dla naszych dwóch linii iPSC w płytkach 96-dołkowych (dane nie pokazano). Aby zautomatyzować proces rozdzielania i uniknąć przenoszenia płytek do inkubatora i z powrotem, zbudowano nachylone rampy z kontrolą temperatury, które przyjmują i powtarzalnie pozycjonują standardowe płytki hodowlane (Ryc. 1A). Po podgrzaniu ramp do 37 °C dysocjacja iPSC z płytek 96-dołkowych przy użyciu odczynnika proteolitycznego i kolagenolitycznego lub EDTA była porównywalna do płytek umieszczonych w inkubatorze w 37 °C (dane nie pokazano). Nachylone rampy wykorzystano również po to, aby końcówki pipet mogły pobrać całą zawartość dołka (objętość resztkowa poniżej 5 uL) poprzez dotarcie do najniższego punktu dołka, podczas gdy aspiracja z płaskiej płytki pozostawiała objętość resztkową około 10-15 µl, co prowadziło do utraty komórek. Nachylona rampa umożliwiła także przemywanie (tryturację) dołków poprzez wtryskiwanie medium u góry nachylonego dołka i jego zbieranie u dołu.

Robotyka w hodowli komórek macierzystych w formacie płytek 96-dołkowych; dokarmianie i pasażowanie.

Hodowla iPSC przy użyciu robotycznego systemu dozowania cieczy składa się z dwóch faz: pasażowania i dokarmiania. Gdy kolonia jest gotowa do pasażowania, zostaje ona rozdzielona w określonym stosunku w celu zaszczepienia nowej płytki, która jest następnie dokarmiana w regularnych odstępach czasu, aż ponownie będzie gotowa do pasażowania (Rysunek 1B). Hodowle mrożone lub prowadzone w formacie innym niż 96-dołkowy można rozpocząć w formacie 96-dołkowym i niezwłocznie wprowadzić w cykl pasażowania/dokarmiania. Komórki, które nie są wykorzystywane do utrzymania kolonii (co stanowi większość zawartości płytki), są zbierane do innych zastosowań i reprezentują komponent produkcyjny tego systemu.

Karmienie iPSC hodowanych w płytkach 96-dołkowych polega na usunięciu części lub całości pożywki po określonym czasie hodowli i przelaniu jej do zbiornika na odpady. Następnie do tej samej płytki dozuje się świeżą pożywkę. Robot może wykorzystywać nowe końcówki i korytka z pożywką, aby odseparować każdy dołek w celu pełnej personalizacji procesu karmienia, w tym mieszania pożywki kondycjonowanej ze świeżą pożywką.

Typowe pasażowanie komórek macierzystych wymaga metody dysocjacji i często etapu wirowania. Protokoły opisane w niniejszej pracy mają na celu normalizację dysocjacji i wyeliminowanie wirowania. Protokół pasażowania rozpoczyna się w momencie, gdy robot dozuje odczyn dysocjujący do płytek 96-dołkowych umieszczonych na nachylonych rampach w temperaturze 37 °C. Po upływie ustalonego czasu zdysocjowane komórki są zbierane poprzez czynność płukania, nad którą użytkownik sprawuje kontrolę w zakresie pozycji, liczby powtórzeń, objętości oraz szybkości tryturacji. Czas działania enzymu, szybkość tryturacji oraz liczba powtórzeń tryturacji były wystarczające, aby zróżnicować wielkość i homogeniczność zdysocjowanych kolonii (Rysunek 2), jednak każdy z tych parametrów można dostosować do wymagań danej linii komórkowej. Taka kontrola eliminuje zmienność wprowadzaną przez techników pipetujących z różną prędkością, w różnych pozycjach i z różną liczbą powtórzeń. Po zebraniu zdysocjowanych komórek i zgromadzeniu ich w zbiorniku ze świeżą pożywką, są one przenoszone na nową płytkę. Aby uniknąć wirowania oraz problemów z wysiewaniem wynikających z degradacji podłoża lub śmierci komórek spowodowanej działaniem enzymu, odczyn dysocjujący rozcieńczono do minimalnego poziomu akceptowalnej dysocjacji, która zapewniała niezawodny wysiew. Technika ta była skuteczna w przypadku proteolitycznego i kolagenolitycznego odczynu dysocjującego w pożywce mTeSR134, która charakteryzuje się stosunkowo wysoką zawartością białka, a także w pożywkach o niskiej zawartości białka, takich jak Essential-8 35; obie są kompatybilne z tym systemem (dane dla E8 nie zostały przedstawione).

Kontrola gęstości wysiewu komórek macierzystych po pasażowaniu jest kluczowa dla rutynowej i skutecznej hodowli komórek macierzystych. Zbyt niski lub zbyt wysoki wysiew może prowadzić do różnicowania ektopowego i utraty pluripotencji, a także powodować nieregularne odstępy między pasażami. Typowa hodowla komórek macierzystych opiera się na podziale proporcjonalnym, w którym jedna studnia płytki 6-dołkowej służy do wysiania całej nowej płytki 6-dołkowej (podział 1:6). Dzięki robotowi do obsługi cieczy proporcję tę można dostosować do potrzeb użytkownika (np. 1:6, 1:9, 1:12 itp.), co ma największy wpływ na interwał pasażowania. Robot może zebrać mniej niż jedną kolumnę, jedną pełną kolumnę (8 studni) lub więcej niż jedną kolumnę, w zależności od potrzeb użytkownika, które powinny zostać określone empirycznie. iPSC pochodzące z tkanki tłuszczowej oraz fibroblastów utrzymywały regularny trzydniowy harmonogram dokarmiania z pasażowaniem w czwartym dniu przy podziale 1:12. W tym przypadku zebrano jedną kolumnę i wykorzystano ją do wysiania jednej nowej płytki 96-dołkowej, tworząc podział 1:12 w każdym cyklu (Rycina 3A). Pozostałe 11 studni było następnie dostępnych do dalszych zastosowań. Aby zebrać komórki z tych 11 studni produkcyjnych, powtórzono protokół pasażowania, z wyjątkiem tego, że komórki osadzono w rynience w celu ich zebrania. Alternatywnie, komórki można pozostawić na płytce i wykorzystać bezpośrednio.

Aby zapewnić spójną gęstość wysiewu z pasażu na pasaż bez konieczności liczenia komórek oraz utrzymać rutynowy harmonogram pasażowania, nasze protokoły przewidują rozdzielanie tej samej, określonej liczby kolumn, gdy kolonie osiągną gęstość idealną do pasażowania. Aby pomóc użytkownikom w identyfikacji właściwej gęstości, przygotowano serię obrazów przedstawiających różne poziomy zagęszczenia, z zaznaczoną idealną gęstością pasażowania (Rysunek 3B). W celu ustalenia momentu pasażowania technik analizuje płytkę i porównuje ją ze skalą obrazów gęstości. Idealna gęstość do pasażowania została określona na podstawie hodowli iPSC pochodzących z tkanki tłuszczowej oraz fibroblastów i stwierdzono, że jest ona osiągana, gdy przestrzeń między większością kolonii stanowi około 25% średnicy sąsiedniej kolonii. Ważne jest, aby kolonie były rozmieszczone homogenicznie. Taki stopień rozdzielenia kolonii koreluje z maksymalną pożądaną gęstością, ponieważ jeden dodatkowy cykl karmienia doprowadziłby do stykania się kolonii, co jest sygnałem do różnicowania ektopowego.

Konieczny protokół opracowany w niniejszej pracy opisuje sposób rozpoczynania hodowli w formacie 96-dołkowym oraz sposób resetowania hodowli po wystąpieniu problemów z gęstością. Przy rozpoczynaniu nowej hodowli optymalna gęstość wysiewu oraz liczba cykli dokarmiania przed pasażowaniem nie są znane. Aby zapewnić użyteczną gęstość po wysiewie, robot rozdziela istniejące lub rozmrożone komórki na płytce 96-dołkowej w serii rozcieńczeń (Rycina 4A). Przykładowe wyniki takiego gradientu przedstawiono na Ryciniach 4B-E. Po kilku cyklach dokarmiania niektóre kolumny osiągają idealną gęstość do podziału, w którym momencie technik wykorzystuje robota do wysiewu na płytkę o jednolitym rozcieńczeniu, aby rozpocząć regularną hodowlę. Protokołu gradientu gęstości użyto również w celu przywrócenia regularnych odstępów między pasażami oraz homogeniczności kolonii na płytce o nieregularnym wzroście. Jeśli pasaż zostanie opóźniony lub pominięty, gęstość i rozmiar kolonii stają się zbyt duże, natomiast jeśli pasaż zostanie wykonany zbyt wcześnie, gęstość kolonii jest zbyt niska, a poszczególne kolonie mogą stać się zbyt duże, nie rozkładając się równomiernie w dołku. Protokół gradientu gęstości rozwiązuje te problemy i pozwala użytkownikowi na restart poprzez wybór zestawu dołków o optymalnej gęstości wysiewu.

Dwie linie iPSC zachowały pluripotencję po 3 miesiącach hodowli robotycznej.

Utrzymanie pluripotencji komórek macierzystych może być niekorzystnie wpływać przez warunki hodowli36,37. Aby ocenić, czy linie iPSC pochodzące z tkanki tłuszczowej i fibroblastów (odpowiednio a-iPSC i f-iPSC) zachowują pluripotencję podczas zrobotyzowanej hodowli w płytkach 96-dołkowych przez dłuższy czas, obie linie hodowano za pomocą robota do obsłużki cieczy zgodnie z powyższym opisem przez 3 miesiące, a następnie zbadano markery pluripotencji. W tym okresie obie linie były pasażowane z użyciem proteolitycznego i kolagenolitycznego odczynnika dysocjującego ponad 20 razy bez wirowania. Utrwalone płytki 96-dołkowe z liniami a-iPSC i f-iPSC barwione pod kątem Oct4 i Nanog wykazywały akumulację tych markerów w jądrach, podczas gdy Ssea-4 obserwowano na powierzchni komórek (Figure 5A-L). Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami dotyczącymi pluripotencjalnych iPSC38–41. Przeciwbarwienie DAPI nie ujawniło żadnych dodatkowych komórek, które nie byłyby jednocześnie pozytywne pod kątem trzech markerów pluripotencji. Aberracje chromosomowe są powszechnie obserwowane podczas hodowli komórek macierzystych42,43, lecz mogą nie wpływać na rozkład markerów pluripotencji, takich jak te przedstawione na Figure 5A-L. Analiza kariotypu wykazała, że obie zrobotyzowane linie iPSC posiadały 46 normalnych chromosomów, co sugeruje, że zrobotyzowana metoda hodowli nie wprowadziła niestabilności chromosomowej ponad to, co może wystąpić w warunkach normalnych (Figure 5M-N).

Aby zbadać uznane markery ekspresji genów komórek macierzystych1,41,44,45 w liniach iPSC hodowanych robotycznie, całkowite RNA zebrano równolegle do barwienia i analizy kariotypu. Obie linie iPSC w płytkach 96-dołkowych wykazywały podobną ekspresję markerów pluripotencji NANOG, POU5F1 oraz REX1, podczas gdy kardiomiocyty zróżnicowane z każdej z linii ich nie wykazywały, podobnie jak oddzielna linia ludzkich fibroblastów skóry (HDFs) (Rysunek 6). Kardiomiocyty pochodzące z obu linii były dodatnie pod kątem MYL7, natomiast HDFs i komórki macierzyste nie wykazywały ekspresji MYL7. Obie linie iPSC zróżnicowano w kardiomiocyty przy użyciu małej cząsteczki, zgodnie z niedawno opisaną techniką manipulacji szlakiem Wnt46. Po zabarwieniu kardiomiocyty z obu linii były dodatnie pod kątem cTnT z wyraźnym tworzeniem się sarkomerów (Rysunek 7). Różnicowanie w kardiomiocyty w formacie 96-dołkowym zakończyło się sukcesem w ponad 80% dołków (dane nie pokazane). Razem dane te sugerują, że 3 miesiące i ponad 20 pasaży hodowli robotycznej doprowadziły do uzyskania komórek z prawidłowym kariotypem, wykazujących program transkrypcyjny spójny z pluripotencją, które były również zdolne do różnicowania w kardiomiocyty.

Automatyczny system dozowania cieczy z głowicą pipetującą, płytki 96-dołkowe; schemat procesu hodowli komórkowej.
Rycina 1. Przegląd robotycznego sprzętu do hodowli komórek macierzystych i typowy schemat hodowli iPSC. (A) Robotyczny system dozowania cieczy przedstawiony z typowym układem platformy dla hodowli komórek macierzystych w płytkach 96-dołkowych. Nowe sterylne końcówki do pipet (Tips), wyjmowany pojemnik na zużyte końcówki (Waste), wielodołkowa autoklawowalna korytka do przechowywania wymaganych odczynników ciekłych (Liquids), płytki 96-dołkowe umieszczone i podparte na kontrolowanej temperaturowo, nachylonej rampie (96-well plates), 8-kanałowa robotyczna głowica pipetująca poruszająca się w kierunkach lewo/prawo oraz góra/dół (Pipet head). Stojak do przykrywek płytek (PLHR). Numery pozycji na platformie przedstawiono w poniższej tabeli. (B) Robotyczna hodowla iPSC składa się z dwóch faz: dokarmiania (Feeding) i pasażowania (Passage). Cykl produkcji komórek rozpoczyna się, gdy płytka z koloniami jest gotowa do pasażowania. Użytkownik wybiera pożądany stosunek pasażowania, a robot wysiewa nową grupę płytek 96-dołkowych, które są następnie dokarmiane w regularnych odstępach czasu, aż będą ponownie gotowe do pasażowania. Gdy płytki są gotowe do pasażowania, większość zawartości każdej płytki nie jest wykorzystywana do wysiewu kolejnych płytek z koloniami i pozostaje dostępna do innych zastosowań, co stanowi fazę produkcyjną systemu. Zamrożone lub istniejące linie komórkowe mogą zostać wprowadzone w dowolnym momencie i utrzymywane w cyklu dokarmiania/pasażowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza trawienia enzymatycznego; wpływ czasu, szybkości i liczby powtórzeń; obrazy mikroskopowe, proces enzymatyczny.
Rysunek 2. Parametry zrobotyzowanego dozowania cieczy mogą być wykorzystane do kontroli charakterystyki dysocjacji kolonii iPSC. Każdy reprezentatywny obraz przedstawia iPSC pochodzące z fibroblastów po dysocjacji w wyniku wskazanego zabiegu, wciąż zawieszone w studzience płytki 96-dołkowej. (Górny rząd, A-C) Czas trawienia enzymatycznego, bez tryturacji. iPSC pochodzące z fibroblastów hodowane na płytkach 96-dołkowych poddano działaniu odczynnika do dysocjacji proteolitycznej i kolagenolitycznej przez zwiększający się czas; nie przeprowadzano zrobotyzowanej tryturacji. (Środkowy rząd, D-F) Szybkość tryturacji, 3 minuty trawienia enzymatycznego. Komórki poddano trzymięciutkiemu działaniu odczynnika do dysocjacji proteolitycznej i kolagenolitycznej, a następnie naniesiono 175 µl pożywki wzrostowej i w każdej studzience wykonano jednokrotne pipetowanie w górę i w dół z wskazaną szybkością. µl/sec = mikrolitry na sekundę. (Dolny rząd, G-I) Powtórzenia tryturacji, 3 minuty trawienia enzymatycznego, 160 µl/sec. Komórki poddano działaniu odczynnika do dysocjacji proteolitycznej i kolagenolitycznej przez 3 minuty, naniesiono 175 µl pożywki wzrostowej, a następnie wykonano tryturację z szybkością 160 µl/sec przez wskazaną liczbę powtórzeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu pasażowania kultur komórkowych z oceną gęstości w różnych odstępach czasu.
Rycina 3. Typowy schemat utrzymywania kolonii iPSC z tkanki tłuszczowej i fibroblastów oraz seria obrazów gęstości kolonii w celu określenia momentu pasażowania dla zachowania regularnego cyklu dokarmiania/pasażowania. (A) Zaczynając od gotowej do pasażowania kolonii iPSC z tkanki tłuszczowej lub fibroblastów w płytce 96-dołkowej, jedna kolumna komórek została spasażowana przez robota bez wirowania i rozcieńczona w 12 nowych kolumnach, które były następnie dokarmiane w określonych odstępach czasu, aż płytka była ponownie gotowa do pasażowania. W celu produkcji komórek, kolumny niewykorzystane do utrzymania kolonii były pasażowane i zbierane do dalszego użycia. Dowolna liczba kolumn może zostać spasażowana w celu kontrolowania tempa ekspansji. (B) Aby określić moment pasażowania, użytkownikom udostępniono serię obrazów gęstości wykonanych co 24 hr. W górnej czerwonej ramce (w ciągu 72 hr po początkowym wysiewie) kolonia nie jest wystarczająco gęsta do pasażowania i należy ją dokarmić. Gdy gęstość odpowiada tej pokazanej w zielonej ramce (w ~96 hr), kolonia ma idealną gęstość do pasażowania. Do 120 hr kolonia jest zbyt gęsta do pasażowania i należy unikać takiego scenariusza. Ten ostatni problem można rozwiązać poprzez zastosowanie gradientu gęstości wysiewu, jednak rutynowa hodowla przy takiej gęstości jest zdecydowanie odradzana. Biały pasek odpowiada 200 µM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza gęstości komórek z użyciem robota do obsługi cieczy; obrazy mikroskopowe przy różnych poziomach wysiewu.
Rycina 4. Robotyczny system hodowli w płytkach 96-dołkowych umożliwia użytkownikom rozpoczynanie hodowli z zamrożonych lub aktywnych linii komórkowych oraz przeprowadzanie wysiewu w gradiencie. (A) Użytkownik przygotowuje zawiesinę komórek z zamrożonego banku komórek lub po zbiorze z hodowli aktywnej i umieszcza ją w robocie. System robotyczny wykonuje następnie protokół rozcieńczeń seryjnych w celu rozdzielenia początkowej zawiesiny komórek w płytce 96-dołkowej, tworząc gradient gęstości rozłożony kolumnami. (B-E) Przykłady gęstości komórek z czterech z dwunastu kolumn z punktu A, 48 h po wykonaniu protokołu wysiewu w gradiencie gęstości. Białe linie odpowiadają 225 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Immunobarwienie iPSC pochodzących z tkanki tłuszczowej i fibroblastów; markery DAPI, Oct4, Nanog, Ssea4; analiza kariotypu.
Rycina 5. Pluripotencja jest utrzymywana dla linii iPSC pochodzących z tkanki tłuszczowej i fibroblastów podczas robotycznej hodowli w płytkach 96-dołkowych przez 22 (tkanka tłuszczowa) lub 23 (fibroblasty) pasaża (~3 miesiące). (A-L) Linie komórkowe iPSC pochodzące z tkanki tłuszczowej i fibroblastów były robotycznie karmione i pasażowane zgodnie z opisem w tekście, bez wirowania, w płytkach 96-dołkowych przez 22 lub 23 pasaża, a następnie utrwalone i barwione na markery pluripotencji Oct4, Nanog lub Ssea4 z przeciwbarwieniem DAPI. Biały pasek odpowiada 100 µm. (M-N) Równoległe hodowle do tych opisanych w punkcie A poddano analizie kariotypu, która wykazała prawidłowy zestaw 46 chromosomów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki elektroforezy żelu RT-PCR; wykryto prążki ekspresji NANOG, POU5F1, REX1, MYL7, GAPDH.
Rycina 6. iPSC pochodzące z tkanki tłuszczowej (96-A) i fibroblastów (96-F), hodowane przez ponad 20 pasaży w robotycznym formacie 96-dołkowym, zachowały ekspresję genów pluripotencji i zróżnicowały się w kardiomiocyty. Całkowity mRNA wyekstrahowano z obu linii iPSC hodowanych robotycznie, a także z kardiomiocytów zróżnicowanych z obu linii (CM-A = kardiomiocyty pochodzące z iPSC z tkanki tłuszczowej, CM-F = kardiomiocyty pochodzące z iPSC z fibroblastów, pobrane 14 dni po indukcji różnicowania) i wykorzystano do RT-PCR w celu badania markerów pluripotencji NANOG, POU5F1, REX1, markera kardiomiocytów MYL7 oraz kontroli załadunku GAPDH. Pobrano również ludzkie fibroblasty skórne (HDF), które posłużyły jako kontrola niebędąca iPSC ani kardiomiocytem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Różnicowanie kardiomiocytów, mikroskopia iPSC pochodzących z fibroblastów/tkanki tłuszczowej; barwienie DAPI, cTnT, F-aktyny.
Rysunek 7. iPSC pochodzące z fibroblastów i tkanki tłuszczowej zachowały zdolność do różnicowania się w kardiomiocyty po długoterminowej robotycznej hodowli w płytkach 96-dołkowych. (A-H) iPSC z tkanki tłuszczowej i fibroblastów, hodowane w robotycznym formacie 96-dołkowym przez ponad 20 pasażów, zostały poddane różnicowaniu w kardiomiocyty. 14 dni po indukcji różnicowania kardiomiocyty związane z płytką 96-dołkową zostały zdysocjowane i ponowne wysiane z niską gęstością na szkiełka przedmiotowe w celu immunobarwienia troponiny T (czerwony), F-aktyny (zielony) i jąder komórkowych (niebieski). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat procesu skalowania hodowli komórkowej; przebieg pasażowania; metoda ekspansji na płytkach wielodołkowych.
Rycina 8. Skalowanie hodowli komórek macierzystych na płytkach 96-dołkowych. Skalowanie produkcji komórek macierzystych zależy od liczby płytek wykorzystanych do zasiewu kolejnej grupy płytek. Użytkownik może utrzymać jeden poziom produkcji, pasażując taką samą liczbę płytek przy każdym podziale, lub zwiększyć produkcję poprzez zasiew większej liczby płytek. Na przykład w Cyklu 0 jedna płytka 96-dołkowa jest pasażowana na dwanaście nowych płytek (Cykl 1), co daje 12-krotną ekspansję. Tempo to można utrzymać, jeśli jedna z dwunastu płytek zostanie pasażowana na nowy zestaw dwunastu płytek (z Cyklu 1 do 2), lub zwiększyć poprzez pasażowanie wielu płytek (z Cyklu 2 do 3). Podczas pasażowania wszystkie płytki niewykorzystane do utrzymania kolonii są dostępne do dalszych zastosowań. Zatem rutynowe pasażowanie 12 płytek może przynieść do 144 płytek w dwóch pasażach: 12 do utrzymania kolonii i 132 do innych zastosowań. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Czas obsługi ręcznej i robotycznej, wykres liniowy porównujący godziny przetwarzania płytek 6-dołkowych i 96-dołkowych.
Rysunek 9. Wydajność hodowli w płytkach 96-dołkowych do produkcji komórek znacznie przewyższa hodowlę ręczną. Jak zauważono na Rysunku 8, jedną płytkę można pasażować w celu zasiania dwunastu płytek, które następnie można pasażować na 144 płytki. Takie tempo ekspansji można osiągnąć w dwóch cyklach pasażowania. Technik potrzebuje około 3,5 minuty na nakarmienie jednej płytki 6-dołkowej, podczas gdy na jedną płytkę 96-dołkową poświęca około 30 sec, aby zbadać ją pod mikroskopem i umieścić w robocie. Jeśli technik obsługuje 144 płytki, spędzi około 1,2 hr na manipulowaniu płytkami podczas karmienia za pomocą robota, podczas gdy hodowla ręczna wymagałaby 8 hr dedykowanego czasu na karmienie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W niniejszym badaniu opracowaliśmy metodę hodowli robotycznej do produkcji iPSC, która miniaturyzuje i automatyzuje podawanie i pasaż w formacie 96-dołkowej płytki, umożliwiając jednocześnie efektywne skalowanie. Robot do obsługi cieczy został wykorzystany do rutynowego karmienia kolonii iPSC i przechodzenia przez nie w regularnych odstępach czasu poprzez dysocjację enzymatyczną. Robot został również zaprogramowany do wytwarzania płytek pokrytych żelem macierzy zewnątrzkomórkowej i wykonywania gradientu gęstości wysiewu. Gdy fibroblasty i iPSC pochodzące z tkanki tłuszczowej były hodowane w tym systemie przez ponad 20 pasaży, około 3 miesięcy, pluripotencja została utrzymana, podobnie jak stabilne kariotypy. Obie linie komórkowe były zdolne do różnicowania się w kardiomiocyty. Opisany tutaj zbiór protokołów umożliwia użytkownikom z bardzo małym doświadczeniem w hodowli komórek macierzystych lub ograniczonym dostępem do specjalistycznego sprzętu do hodowli komórek macierzystych hodowlę komórek macierzystych i osiągnięcie wysokiej produkcji komórek lub obsługi wieloliniowej przy minimalnym nakładzie pracy i kosztów.

Opisane tutaj protokoły robotyczne zapewniają metodę ekonomicznego zwiększania skali produkcji i obsługi iPSC. Jedną z zalet jest skalowalna hodowla komórek macierzystych w ustalonym formacie opartym na płytce, którą zademonstrowano tutaj, a wcześniej44,47–49 w celu utrzymania pluripotencji. Podczas gdy inne formaty skalowalnej hodowli komórek macierzystych dają komórki pluripotencjalne20,23,29 , ta metoda oparta na płytkach zasadniczo nie wymaga zmian w formacie hodowli, takich jak adaptacja do zawiesiny, stosowanie przeciwpieniących substancji chemicznych lub długotrwałe stosowanie inhibitora kinazy Rho20. Ta metoda oparta na płytkach może zatem szybko i przewidywalnie dostosować się do nowych linii, ponieważ warunki hodowli są podobne. Wraz ze wzrostem wykorzystania iPSC do modelowania chorób4,6,19,50, stale generowane są nowe linie iPSC. Opisane tutaj techniki najlepiej nadają się do hodowli nowych linii w średnim i dużym wolumenie oraz przepustowości, ponieważ bariera przejścia na format jest niska. Dotyczy to również pracy i sprzętu niezbędnego do utrzymania kolonii. Wreszcie, ponieważ format i obsługa są podobne do środowiska używanego do wyprowadzania i weryfikowania linii iPSC, wydajność hodowli, taka jak ukierunkowane różnicowanie, będzie prawdopodobnie bardziej przewidywalna.

Rysunek 8 ilustruje jedną ze strategii zwiększania skali produkcji komórek macierzystych na płytkach 96-dołkowych. Jedna płytka (cykl 0) służy do automatycznego wysiewu 12 nowych płytek, co daje 12-krotne zwiększenie (cykl 0 do 1). Po kilku dniach karmienia jedna z dwunastu płytek jest pasażowana, aby wysiać kolejny zestaw dwunastu płytek (cykl 1 do cyklu 2). Pozostałe jedenaście płyt jest teraz dostępnych do innych zastosowań i stanowi komponent produkcyjny systemu. W tym tempie przejście jednej płytki zapewni 11 płytek w każdym cyklu lub co 3-4 dni. Metodologia ta może być bardziej skalowana, gdy przechodzi wiele płyt, jak pokazano w przejściu z cyklu 2 do cyklu 3. W cyklu 3 zawsze używa się dwóch szalek do utrzymania kolonii i wysiewu 24 nowych płytek. Pozostałe 22 płytki są następnie dostępne do użycia po każdym cyklu przejścia. W dowolnym momencie cyklu konserwacji użytkownik może wysiać więcej talerzy, aby zwiększyć produkcję. Jednym z przykładów może być przejście przez każdą kolumnę przez dwa cykle wzrostu. Pierwszy fragment przekształca jedną płytkę w dwanaście płytek, a każda z dwunastu płytek jest używana do zasiewu 144 płytek. W tym przypadku użytkownik zaczyna od jednej płytki i po dwóch przejściach, czyli około 1,5-2 tygodniach hodowli, ma 144 płytki. Na przykład linie iPSC fibroblastów i tkanki tłuszczowej dają około 25-75 milionów komórek na 96-dołkową płytkę, gdy są gotowe do przejścia. 144 płytki mogą zatem reprezentować około 4-7 x 109 komórek.

Jakie jest obciążenie pracą przy zrobotyzowanym przenoszeniu 144 płytek 96-dołkowych? Jednym z celów tej pracy była skalowalna produkcja komórek macierzystych, która zmniejszyła nakład pracy w porównaniu z tradycyjną (tj. 6-dołkową) hodowlą komórek macierzystych. Robot osiąga to, zmniejszając potrzebę fizycznej obsługi każdej płytki podczas podawania i przejścia. Podczas gdy produkcja płytek 96-dołkowych skaluje się liniowo, tak jak w przypadku tradycyjnych płytek 6-dołkowych, czas spędzany przez technika na pracy z płytkami jest znacznie krótszy przy użyciu hodowli robotycznej. Z tej różnicy wynika wydajność produkcji kultury robotycznej (rysunek 9). Okazało się, że technicy mogą wyjąć 6-dołkową płytkę z inkubatora, sprawdzić ją pod mikroskopem, a następnie zassać i podać płytkę w ciągu około 3,5 minuty. Dla porównania, technicy spędzają około 30 sekund na wyjmowaniu 96-dołkowej płytki z inkubatora i sprawdzaniu jej pod mikroskopem pod kątem gęstości i zanieczyszczeń przed umieszczeniem jej na robocie. Dzięki rozszerzonemu protokołowi karmienia, podobnemu do opisanego powyżej, można załadować i podawać sześć 96-dołkowych płytek, co zajmuje około 21 minut, czyli 3,5 minuty na płytkę. Całkowity czas, jaki upłynął do podania płytki, jest porównywalny między metodami zrobotyzowanymi i ręcznymi, ale do ręcznego podawania 6 płytek potrzebny jest technik przez wszystkie 21 minut, podczas gdy technik poświęca tylko 3 minuty na obsługę sześciu płytek dla robota (30-sekundowa kontrola na płytkę). Jak pokazano na rysunku 9 , czas, jaki technik poświęca na obsługę 144 płyt za pomocą robota, wynosi około 1,2 godziny, w przeciwieństwie do 8 godzin ręcznie, a robot nigdy nie popełni błędu podczas obsługi płytek lub przenoszenia płynów.

Opisane tutaj metody hodowli iPSC z 96 dołkami stanowią łatwą platformę do wykonywania złożonych zadań przesiewowych. Ponieważ każda studzienka jest genetycznie identyczna i obsiana tą samą gęstością z tej samej początkowej puli, zmienne mogą być rozprowadzane po płycie i utrzymywane przez robota za pomocą dostępnych na rynku zbiorników w celu segregacji warunków. Byłoby to przydatne w eksperymentach, takich jak opracowywanie pożywek do wzrostu komórek macierzystych34,35,47, testowanie warunków substratu lub hodowli oraz badania toksyczności z wykorzystaniem komórek macierzystych51. Ponieważ każda linia komórek macierzystych jest wyjątkowa pod względem optymalnej wielkości kolonii i wymagań dotyczących pasażu, można użyć tego systemu do modulacji gęstości wysiewu, częstotliwości karmienia i obsługi pasażu poprzez manipulowanie zebranymi kolumnami, mieszaniem mechanicznym podczas pasażu i częstotliwością karmienia. Iteracja przez te zmienne pozwoli użytkownikowi szybko znaleźć zestaw warunków odpowiednich dla hodowli nowej linii lub opracować nowe techniki hodowli. Zrobotyzowany system jest również w stanie utrzymać 96 równoległych, ale niezależnych kolonii komórek macierzystych. Gdy iPSC pochodzą z komórek somatycznych lub są klonowane po manipulacji genetycznej, wiele równoległych klonów jest poddawanych badaniom przesiewowym w celu uzyskania potencjalnych linii iPSC. Gdy pojedyncze komórki zostaną wysiane na 96-dołkowe płytki, system ten może zasilać i przechodzić przez 96-dołkowe płytki, utrzymując każdą kolonię w separacji. Umożliwia to bardzo wysoką przepustowość przy wyborze potencjalnych klonów i eliminuje trudności w fizycznym hodowaniu 96 równoległych linii. Metoda ta pozwala również na zwiększenie skali produkcji każdego klonu, dzięki czemu materiał jest łatwo dostępny do analizy równoległej. Wreszcie, przewidujemy integrację tych technik hodowli z robotycznym systemem transportu płytek, który dostarcza płytki do i z inkubatora, umożliwiając w pełni zautomatyzowaną hodowlę. Można to osiągnąć za pomocą bardziej złożonej robotyki, która pozwala na większą rozbudowę, ponieważ opisane tutaj podstawowe protokoły można przenieść do innych systemów opartych na płytach.

Pierwszymi krytycznymi krokami, które należy uwzględnić w protokołach, są kroki, które zapobiegają zanieczyszczeniu i sprawdzają je pod kątem zanieczyszczenia, takie jak kroki 1.5 i 4.2. Zanieczyszczenia, jak omówiono powyżej, można skutecznie uniknąć, jeśli zastosuje się dobrą sterylną technikę i zdrowy rozsądek. Niezależnie od formatu hodowli komórek macierzystych, konieczne jest, aby operator sprawdził, czy nie ma zanieczyszczenia, a wykonanie tego w tym protokole na wskazanych etapach znacznie zmniejszy ryzyko zanieczyszczenia. Właściwa aplikacja żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej jest drugim niezbędnym krokiem do ogólnego sukcesu tego protokołu. Bez odpowiedniego pokrycia 96-dołkowych płytek komórki macierzyste nie będą rosły. Jednym z częstych problemów jest niekompletne pokrycie studni. Doświadczenie pokazuje, że pęcherzyki powietrza, przyciąganie elektrostatyczne i działanie kapilarne utrudniają pełne pokrycie studni. Etap wstępnego zwilżania (1.6) został opracowany w celu znacznej poprawy powłoki dna studni i nie należy go pomijać. Ten etap wstępnego zwilżania wydaje się zmniejszać pozorną hydrofobowość plastikowej płytki 96-dołkowej, tak że po nałożeniu powłoki żelowej macierzy zewnątrzkomórkowej jest ona równomiernie rozprowadzana na dnie i bokach studzienki. Zaleca się również delikatne stukanie 96-dołkowymi płytkami w czystą dłoń po pokryciu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu żelu macierzy zewnątrzkomórkowej. Parametry dysocjacji są również ważne dla optymalizacji. Przedłużona inkubacja z odczynnikiem dysocjacyjnym na bazie enzymu lub EDTA spowoduje powstanie pojedynczych komórek, które mogą, ale nie muszą, być celem podczas przejścia. Dlatego operator powinien zwrócić szczególną uwagę na to, jak czas dysocjacji, siła rozcierania i powtórzenia płukania wpływają na morfologię i zdrowie kolonii oraz odpowiednio dostosować.

Zrozumienie ograniczeń opisanych tutaj technik ma kluczowe znaczenie dla udanej operacji. Podobnie jak w każdym innym środowisku hodowli komórkowych, stosowanie płytek 96-dołkowych wiąże się ze stosunkowo wysokim ryzykiem zanieczyszczenia. Jak opisano powyżej, technik obsługuje każdą płytkę podczas podawania i pasażu; Na przykład podczas otwierania pokrywy, kładzenia płytki na łożu robota i sprawdzania płytki pod mikroskopem. Dlatego, jak wspomniano po kroku 1.5, konieczne jest, aby nie dotykać wnętrza pokrywy płyty ani nie wystawiać tej części na kontakt z potencjalnie zanieczyszczoną powierzchnią, taką jak nachylone bloki grzewcze lub pionowe kołki na łóżku. Podczas opracowywania protokołu odkryto to ograniczenie, które było impulsem do opracowania stojaka do przechowywania pokrywek płytek w celu utrzymania sterylności. Podobnie, zbiorniki korytowe, końcówki pipet i inne materiały na łożu robota do obsługi cieczy są potencjalnymi źródłami zanieczyszczeń, ponieważ są otwarte na środowisko i obsługiwane przez technika. Dlatego należy stosować dobrą technikę sterylną, taką jak ograniczenie ruchów nad odsłoniętymi materiałami hodowlanymi lub otwartymi płynami. Innym ograniczeniem jest to, że gdy protokół jest skalowany, wizualne sprawdzanie każdego dołka ze >100 96-dołkowymi płytkami jest kłopotliwe. Można sobie z tym poradzić, dokonując wizualnej kontroli całej płyty pod kątem oznak zanieczyszczenia, takich jak mętne media, w celu zidentyfikowania podejrzanych studni. W celu zwiększenia skali działalności w przyszłości zostanie wykorzystany zautomatyzowany mikroskop oraz wskaźnik wzrostu komórek i potencjalnego zanieczyszczenia.

Podsumowując, opisana tutaj wysokoprzepustowa platforma oparta na 96 dołkach oferuje powtarzalną, bardzo wierną metodę hodowli i produkcji komórek macierzystych w formacie płytki. Metoda ta zmniejsza wymagane doświadczenie, niezbędny sprzęt i czas pracy poświęcony hodowli komórek macierzystych przy jednoczesnym zachowaniu korzyści płynących z tradycyjnej hodowli adherentnej.

Oświadczenia

Autorzy MKC, MJG, EEB, NJD i RO są lub byli w czasie prac rozwojowych pracowników InvivoSciences, INC, którzy opracowali i opracowali opisane tutaj protokoły robotyczne. TW jest CSO dla InvivoSciences INC. SH jest pracownikiem Gilson INC.

Podziękowania

Ta praca została częściowo wsparta przez granty NIH, R44 GM087784 i R01 HL109505. Autorzy dziękują zespołowi technicznemu i OEM w Gilson, INC za rozszerzone wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 96-dołkoweCorning359696-dołkowe; Objętość studni: 360  μ l; Obszar wzrostu komórek: 0,32  cm2; Indywidualnie pakowane
koryto SeahorseSeahorseBio201308-100Zbiornik 4 Przezroczysta część Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson KońcówkiGilsonF16702310 stojaków Gilson 96 końcówek Końcówki D200
DMEM/F12Life Technologies12500062proszek DMEM/F12.  Zawiesić w 1 l oczyszczonej wody klasy do hodowli komórkowych i sterylnym filtrze.
Czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu MatrigelCorning354230Określany w tekście jako "żel do macierzy zewnątrzkomórkowej". Matrigel GFR, 10  ml
mTeSR1StemCell Technologies5857mTeSR1 Kompletny zestaw do konserwacji hES.
E8 MediaStemCell Technologies5940TeSR-E8 Zestaw do konserwacji hESC/hiPSC
Y27632AdooQ BioScienceA11001-50Inhinitor skalny Y-27632 2HCI
AccutaseInnowacyjne technologie komórkoweACCUTAZAW tekście określany jako "odczynnik dysocjacji proteolitycznej i kolagenolitycznej". Accutase 500  ml sterylny roztwór komórek
PBSFisherSH30256FSPBS w/o Ca Mg 500  ml, 6/pk
Gilson PIPETMAXGilsonPIPETMAXhttp://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

Bibliografia

  1. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  2. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
  3. Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
  4. Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34 (6), 755-764 (2013).
  5. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3 (4), 369-381 (2008).
  6. Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  7. Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
  8. Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-17 (2013).
  9. Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
  10. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111 (3), 344-358 (2012).
  11. Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
  12. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
  13. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4 (130), 130ra47(2012).
  14. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
  15. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
  16. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
  17. Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
  18. Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
  19. Soldner, F., Jaenisch, R. iPSC Disease Modeling. Science. 338, 1155-1156 (2012).
  20. Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5 (1), 51-64 (2010).
  21. Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11 (3), 1103-1116 (2013).
  22. Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8 (3), 388-402 (2012).
  23. Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6 (5), 572-579 (2011).
  24. Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18 (10), (2012).
  25. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16 (2), (2010).
  26. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
  27. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
  28. Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
  29. Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6 (5), (2011).
  30. Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102(2013).
  31. Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77 (100), 246-257 (2013).
  32. Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
  33. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
  34. Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
  35. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  36. Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
  37. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
  38. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451 (7175), 141-146 (2008).
  39. Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113 (5), (2003).
  40. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3 (1), 3-11 (2009).
  41. Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  42. Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (4), 521-531 (2010).
  43. Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30 (1), 22-27 (2012).
  44. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  45. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  46. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  48. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105 (12), 4598-4603 (2005).
  49. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  50. Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
  51. Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. , (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pluripotencjalne kom rki macierzysterozdzielanie koloniiwarunki bezkom rkowe feeder freeanaliza kariotypur nicowanie w kardiomiocytymarkery kom rek macierzystychwysokoprzepustowe przesiewanie
Skalowalna hodowla i produkcja iPSC na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.