Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

10.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52756

⸱

25 czerwca 2015

 ,  , 
1Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Ulm University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy proces korzystania z systemu TetON w celu osiągnięcia specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego.

Streszczenie

Danio pręgowany stał się bardzo ważnym organizmem modelowym do badania rozwoju kręgowców, fizjologii, chorób i regeneracji tkanek. Dokładne zrozumienie mechanizmów molekularnych i komórkowych wymaga narzędzi eksperymentalnych, które pozwalają na indukowalną, specyficzną tkankowo manipulację ekspresją genów lub szlakami sygnałowymi. Dlatego my i inni niedawno dostosowaliśmy system TetON do stosowania u danio pręgowanego. System TetON ułatwia czasowo i przestrzennie kontrolowaną ekspresję genów, a ostatnio użyliśmy tego narzędzia do zbadania specyficznych dla tkanek funkcji sygnalizacji Wnt/beta-kateniny podczas regeneracji płetwy ogonowej danio pręgowanego. W tym miejscu opisujemy przebieg pracy przy użyciu systemu TetON w celu uzyskania indukowalnej, specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego. Obejmuje to generowanie stabilnych transgenicznych linii TetActivator i TetResponder, indukcję transgenu oraz techniki weryfikacji ekspresji genów specyficznych dla tkanek w regeneracji płetwy. W związku z tym protokół ten służy jako plan do stworzenia funkcjonalnego systemu TetON u danio pręgowanego i jego późniejszego wykorzystania, w szczególności do badania regeneracji płetw.

Wprowadzenie

Danio pręgowany jest dobrze znanym modelowym organizmem kręgowców do badania wielu aspektów rozwoju, fizjologii, chorób i regeneracji. Wraz z rosnącym zastosowaniem danio pręgowanego jako modelu postembrionalnych procesów biologicznych, coraz ważniejsze stają się narzędzia eksperymentalne do indukowalnej, specyficznej tkankowo manipulacji ekspresją genów lub szlakami sygnałowymi. W szczególności badania nad regeneracją narządów i przydatków u dorosłych ryb danio pręgowanego ucierpiały z powodu braku narzędzi do analizy czasoprzestrzennych wymagań szlaków sygnałowych podczas tych procesów regeneracyjnych.

Obecnie, trzy różne systemy zostały użyte do osiągnięcia warunkowej, specyficznej tkankowo ekspresji genów w regenerujących się organach dorosłego danio pręgowanego: system Cre-lox, mozaikowa ekspresja transgenów indukowanych szokiem cieplnym za pomocą transgenezy somatycznej za pośrednictwem transpozonu, oraz system TetON1-3. TetON odnosi się do wariantu systemu aktywacji transkrypcji kontrolowanego tetracykliną, w którym ekspresja jest aktywowana w obecności antybiotyku tetracykliny lub pochodnej, np. doksycykliny. System Cre-lox, tak jak do tej pory był stosowany u dorosłych ryb, opiera się na kontrolowanej przez tamoksyfen rekombinazie Cre (CreERT2), której ekspresja jest ograniczona przestrzennie przez specyficzne tkankowo elementy regulatorowe. Usunięcie kasety STOP sterowane przez Cre ułatwia ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania, napędzanego przez promotor, który powinien być aktywny we wszystkich typach komórek1. Tworzenie transgenów somatycznych o ekspresji mozaikowej za pośrednictwem transpozonów zapewnia system indukowalnej ekspresji transgenów w poszczególnych liniach komórkowych. Wstrzyknięcie zarodków danio pręgowanego z transpozonem Tol2 przenoszącym gen będący przedmiotem zainteresowania pod kontrolą transkrypcyjną promotora szoku cieplnego powoduje, że chimeryczne osobniki zazwyczaj są nosicielami transgenu tylko w dyskretnych liniach komórkowych regenerującego się narządu2. Podczas gdy oba systemy pozwalają na warunkową ekspresję genów specyficznych dla tkanki, system Cre-lox nie jest odwracalny, a strategia wykorzystująca znakowanie klonalne oparte na transpozonach cierpi ze względu na swoją stochastyczną naturę. W związku z tym my i inni niedawno dostosowaliśmy transgeniczne systemy TetON do stosowania u danio pręgowanego, które ułatwiają czasowo i przestrzennie kontrolowaną ekspresję genów, która jest ponadto dostrajalna i odwracalna3-5.

System TetON używany tutaj składa się z transgenicznej linii sterującej (TetActivator), w której indukowany doksycykliną (DOX) aktywator transkrypcji (ulepszony odwrotny transaktywator tetracykliny, irtTA, w skrócie TetA) jest pod kontrolą specyficznych dla tkanek genomowych sekwencji regulatorowych. Po drugie, wymaga transgenicznej linii odpowiedzi (TetResponder), która zawiera gen będący przedmiotem zainteresowania pod kontrolą transkrypcyjną operatora tetracykliny (element odpowiedzi Tet; TetRE) (rysunek 1A). W związku z tym zastosowanie specyficznych kombinacji linii TetActivator i TetResponder pozwala na warunkową specyficzną tkankowo manipulację ekspresją genów.

Ostatnio wykorzystaliśmy system TetON do zbadania specyficznych dla tkanek funkcji sygnalizacji Wnt/beta-kateniny w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej zebry3. W przedstawionym tutaj protokole opisano przebieg pracy związany z konfiguracją i użytkowaniem systemu TetON u danio pręgowanego, w szczególności w badaniach nad regeneracją płetw. Zawiera on szczegółowe instrukcje, jak generować stabilne transgeniczne linie TetActivator i TetResponder oraz protokół indukcji transgenów u zarodków i dorosłych danio pręgowanego. Ponadto opisano techniki weryfikacji specyficznej tkankowo ekspresji genów w regeneracji płetwy, w tym protokół przygotowania kriosekcji dorosłych płetw grybo. Dodatkowo omawiamy zagadnienia dotyczące projektowania transgenu TetActivator, wyboru metody transgenezy i wykrywania ekspresji TetResponder. W związku z tym ogólnym celem tego protokołu jest posłużenie jako plan stworzenia funkcjonalnego systemu TetON u danio pręgowanego w celu osiągnięcia warunkowej ekspresji genów specyficznej dla tkanki, którą można zastosować do dowolnej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.

Stworzyliśmy wektor TetActivator, który pozwala na generowanie stabilnych linii TetActivator za pośrednictwem I-SceI lub Tol2 przy użyciu krótkich genomowych sekwencji regulatorowych (fragmenty wzmacniacza; Baza danych plazmidów laboratorium Weidingera nr 1247; Rysunek 1B). Ten konstrukt zawiera kasetę TetActivator składającą się ze zmutowanego wariantu M2 odwróconej domeny represora Tet połączonej z pochodną domeny transaktywacyjnej wirusa opryszczki pospolitej VP16 3F [irtTAM2(3F)]. Ekspresja TetActivatora (TetA) może być łatwo monitorowana, ponieważ ulega on jednoczesnej ekspresji z fluoroforem AmCyan z tej samej otwartej ramki odczytu; peptyd p2a pośredniczy w pomijaniu rybosomów, co powinno skutkować wytwarzaniem TetA i AmCyan jako oddzielnych białek w stosunku 1:15,6. Konstrukt zawiera również poylinker 5' kasety TetActivator, aby ułatwić wprowadzanie interesujących sekwencji regulatorowych genomu przy użyciu konwencjonalnych metod klonowania.

Dodatkowo, stworzyliśmy konstrukcję składającą się z wyżej opisanej kasety TetActivator oraz kasety selekcyjnej Kanamycyny (baza danych plazmidów Weidinger lab nr 1180; Figura 1C), który można rekombinować w sztuczny chromosom bakteryjny (BAC) zawierający duży region genomu (zwykle do kodonu start genu, którego wzorzec ekspresji ma być naśladowany przez transgen). Oba konstrukty są dostępne w laboratorium Weidinger na życzenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Generowanie transgenicznych linii dla ryb TetActivator

  1. Generowanie konstruktu TetActivator
    1. Klonuj interesujące sekwencje regulacyjne przed kasetą TetActivator w wektorze #1247 przy użyciu standardowych technik. Alternatywnie, użyj technik rekombinacji do wygenerowania BAC, w którym kaseta TetActivator (wektor #1180) jest wprowadzana do pierwszego eksonu docelowego genu, a odwrócone powtórzenia Tol2 są wprowadzane do szkieletu BAC (szczegółowy protokół rekombinacji patrz7,8).
    2. Przygotuj wolne od toksyn preparaty plazmidowego DNA lub BAC DNA, korzystając z dostępnych na rynku zestawów.
  2. Generowanie transgenicznych żyłek do ryb TetActivator
    1. Wykonać mikroiniekcję konstruktu TetActivator zgodnie ze standardowymi procedurami9.
      1. Wstrzyknąć 25-50 pg plazmidowego DNA lub do 250 pg DNA BAC do zarodków w stadium jednokomórkowym wraz z kodowaniem RNA z czapeczką dla transpozazy tol2 dla transgenezy za pośrednictwem transpozonu lub z białkiem I-SceI do transgenezy za pośrednictwem I-SceI.
        UWAGA: Rozważania na temat wyboru metody transgenezy można znaleźć w sekcji dyskusji.
        UWAGA: Najlepiej wstrzykiwać do cytoplazmy, a nie do żółtka, ponieważ skuteczność transgenezy może się zmniejszyć, gdy DNA nie jest dostarczane do cytoplazmy.
    2. Podnieś wstrzyknięte zarodki G0 do dorosłości. Opcjonalnie należy przeprowadzić badania przesiewowe zarodków G0 pod kątem fluorescencji AmCyan i preferencyjnie hodować zarodki wykazujące pożądany wzór ekspresji. Może to zwiększyć szybkość transmisji w linii zarodkowej, w szczególności w przypadku transgenezy za pośrednictwem Tol2.
    3. Ocenić pomyślną integrację linii zarodkowej poprzez krzyżowanie pojedynczych ryb G0 z rybami typu dzikiego i pojawienie się fluorescencji AmCyan w oczekiwanym wzorcu ekspresji w zarodkach lub larwach F1 za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego (przykład pokazano na rysunku 1D).
    4. Wyhoduj fluorescencyjnie dodatnie zarodki F1 do dorosłości i połącz je z rybami typu dzikiego, aby uzyskać stabilne transgeniczne ryby F2.
    5. Podnieś i scharakteryzuj co najmniej 3 różne podlinie pochodzące od różnych ryb założycielskich G0, ponieważ poszczególne linie mogą różnić się poziomem ekspresji, wzorcem ekspresji, zdolnością do indukowania linii TetResponder, nieszczelnością i podatnością na wyciszenie.
      UWAGA: Wiele transgenów, które ulegają silnej ekspresji w zarodkach, jest częściowo lub całkowicie wyciszonych u larw w późnym stadium rozwoju lub u dorosłych ryb. Tak więc, jeśli linie mają być używane u dorosłych ryb, scharakteryzuj kilka niezależnych linii pod kątem ich ekspresji i funkcji TetActivator w wieku dorosłym.
      UWAGA: Wygenerowano panel linii TetActivator do specyficznej tkankowo ekspresji TetActivator zarówno w zarodkach, jak i dorosłych rybach, które są wymienione w Tabeli 1. Linie te są dostępne w laboratorium Weidinger na życzenie.

2. Generacja transgenicznych linii rybnych TetResponder

UWAGA: Wygenerowano konstrukcję TetResponder pozwalającą na generowanie stabilnych linii TetResponder za pośrednictwem I-SceI lub Tol2, która jest dostępna w laboratorium Weidinger na żądanie (baza plazmidów laboratorium Weidinger nr 1444; Rysunek 1E). Ten konstrukt zawiera operator tetracykliny, po którym następuje region polilinkera ułatwiający wstawienie sekwencji kodujących (CDS) interesującego genu i pochodnej YFP sekwencji kodującej YPet. W związku z tym konstrukt jest przeznaczony do ekspresji za pośrednictwem TetA C-końcowej fuzji białka będącego przedmiotem zainteresowania z YPet. Jeśli trzeba uniknąć ekspresji znakowanego białka fuzyjnego, peptyd p2a lub t2a może zostać wprowadzony z genem zainteresowania CDS, co ułatwia koekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania i YPet jako oddzielnych polipeptydów6,10.

  1. Generowanie konstrukcji TetResponder
    1. Sklonuj CDS interesującego genu 3' operatora tetracykliny i 5' YPet CDS zgodnie ze standardowymi procedurami. Upewnij się, że kodon stop został usunięty z interesującego genu CDS.
    2. Przygotuj wolne od toksyn preparaty plazmidowego DNA, korzystając z dostępnych na rynku zestawów.
  2. Generowanie transgenicznych żyłek do ryb TetResponder
    1. Wykonać mikroiniekcję konstruktu TetResponder zgodnie ze standardowymi procedurami9.
      1. Wstrzyknąć 25-50 pg plazmidowego DNA do cytoplazmy zarodków w stadium jednokomórkowym wraz z kodowaniem RNA z czapeczką dla transpozazy tol2 do transgenezy za pośrednictwem transpozonu lub z enzymem I-SceI do transgenezy wspomaganej meganukleazą.
        UWAGA: Rozważania na temat wyboru metody transgenezy można znaleźć w sekcji dyskusji.
        UWAGA: Najlepiej wstrzykiwać do cytoplazmy, a nie do żółtka, ponieważ skuteczność transgenezy może się zmniejszyć, gdy DNA nie jest dostarczane do cytoplazmy.
    2. Podnieś wstrzyknięte zarodki G0 do dorosłości.
    3. Oceń pomyślną integrację linii zarodkowej i indukowalność transgenu poprzez kojarzenie poszczególnych ryb G0 z wcześniej ustaloną linią TetActivator, a następnie leczenie doksycykliną zarodków F1 lub larw F1.
      UWAGA: Zazwyczaj używamy linii TetActivator napędzanej przez promotor ubikwityny (ubikwityna:irtTAM2(3F)-p2a-AmCyanulm2, w skrócie ubikwityna:TetA AmCyan3) do badań przesiewowych pod kątem funkcjonalnych nosicieli TetResponder, ponieważ ta linia napędza dość wszechobecną ekspresję w zarodkach i dorosłych rybach, a zatem dobrze nadaje się do oceny indukowalności TetResponder we wszystkich interesujących tkankach. Linia ta jest dostępna w laboratorium Weidinger na życzenie.
    4. Zebrać zarodki z każdego lęgu na oddzielnej 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej pożywkę dla zarodków E3 (patrz tabela materiałów) i inkubować szalki w temperaturze 28,5 °C.
    5. Umieść ryby G0, które oddały zarodki, w osobnych ponumerowanych zbiornikach (pudełkach hodowlanych; patrz tabela materiałów) do czasu przesiewu zarodków. Pozwala to na odzyskanie ryb G0, które wykazują transgen w linii zarodkowej.
    6. Jeśli oczekuje się, że tylko połowa zarodków będzie nosicielami transgenu TetActivator (w przypadku gdy heterozygotyczny nosiciel TetActivator został skrzyżowany z rybą założycielską TetResponder), należy wybrać zarodki zawierające transgen TetActivator na podstawie pojawienia się fluorescencji AmCyan na odpowiednim etapie rozwoju.
    7. Indukować aktywność transkrypcyjną TetActivator poprzez traktowanie zarodków Doksycykliną (DOX) zgodnie z opisem w punkcie 2.3.
    8. Badanie przesiewowe zarodków F1 pod kątem pojawienia się fluorescencji YPet. Preferowane linie (ryby G0), które wytwarzają jednorodną ekspresję YPet, czyli zarodki w lęgu powinny wykazywać niewielką mozaikowość w oczekiwanej domenie ekspresji i niewielką zmienność między poszczególnymi zarodkami. Zobacz groty strzałek na rys. 1F i rys. 1G, aby zapoznać się z reprezentatywnymi przykładami.
    9. Ryba Mate G0 przenosząca indukowalny transgen TetResponder zidentyfikowany w kroku 2.2.8 z rybami typu dzikiego i wychowuje wszystkie zarodki F1 do dorosłości.
    10. Zidentyfikować dorosłe ryby transgeniczne F1 za pomocą genotypowania opartego na PCR (patrz punkt lub przez skrzyżowanie poszczególnych ryb F1 z linią TetActivator, a następnie leczenie DOX zarodków F2 i pojawienie się fluorescencji YPet (patrz sekcja 2.5).
    11. Ustal i scharakteryzuj co najmniej 3 różne podlinie TetResponder pochodzące od różnych ryb założycielskich G0, ponieważ indukowalność może się różnić w poszczególnych liniach. W szczególności osiągalne poziomy ekspresji i to, czy osoba odpowiadająca może być aktywowana we wszystkich typach komórek, mogą się różnić. Ponadto podatność na wyciszenie będzie się różnić w zależności od linii. Wreszcie, w niektórych przypadkach preferowane może być wybranie linii, które pośredniczą tylko w umiarkowanych poziomach ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania, w szczególności jeśli oczekuje się, że nieszczelna ekspresja wytwarzana w połączeniu z linią TetActivator przy braku doksycykliny spowoduje wady rozwojowe lub toksyczność><. UWAGA: Linie TetResponder, które są silnie indukowane w zarodkach, mogą być częściowo lub całkowicie wyciszone u larw w późnym stadium lub u dorosłych ryb. Tak więc, jeśli linie mają być stosowane u dorosłych ryb, należy scharakteryzować kilka niezależnych linii pod kątem indukowalności u dorosłych. Jeśli indukcja genu będącego przedmiotem zainteresowania jest zgodna z dalszym rozwojem, okazało się, że przydatne jest tworzenie podwójnie transgenicznych zarodków (TetActivator x TetResponder), indukowanie ekspresji GOI w zarodkach oraz selekcja i hodowla tylko tych osobników, które wykazują najsilniejszą i najmniej mozaikową indukcję.
    12. W celu utrzymania i rozmnażania ustalonych linii TetResponder, genotyp dorosłych ryb, jak opisano w punkcie 2.5).
  3. Leczenie zarodków doksycykliną
    1. Przygotuj 2,000x Doxycyklin (DOX) akcje. Rozpuść DOX w 50% EtOH, aby osiągnąć stężenie 50 mg/ml (97 mM). Zapasy DOX należy przechowywać w sposób chroniony przed światłem w temperaturze -20 °C.
    2. Zdekantować większość pożywki E3 z zarodków i zastąpić ją pożywką zarodkową E3 zawierającą DOX w końcowym stężeniu 25 μg/ml DOX (2,5 μl 2 000 x DOX na 50 ml E3). Dechorionacja nie jest wymagana.
    3. Przywrócić zarodki do temperatury 28,5 °C przez co najmniej 6 godzin przed oceną ekspresji oznakowanego genu będącego przedmiotem zainteresowania na podstawie pojawienia się fluorescencji YPet.
    4. Ocenić nieszczelność kombinacji TetActivator/TetResponder, traktując zarodki wyłącznie rozpuszczalnikiem EtOH.
      UWAGA: Hybrydyzacja in situ (ISH) lub RT-PCR w celu wykrycia mRNA TetResponder może być stosowana jako bardziej czułe miary nieszczelności niż fluorescencja znakowanego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Stopień nieszczelności będzie zależał od konkretnej kombinacji linii TetActivator/TetResponder, a także może się różnić w zależności od tkanek i etapów rozwoju.
  4. Znieczulenie dorosłego danio pręgowanego
    1. Przygotować szalkę Petriego o średnicy 10 cm lub małą zlewkę wypełnioną wodą z systemu rybnego zawierającą 1 mg/ml trikainy (metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu, MS-222).
    2. Przenieść rybę do pojemnika zawierającego środek znieczulający i poczekać, aż osiągnie 4 poziom znieczulenia, na co wskazuje całkowita utrata równowagi (ryba leży na boku), brak ruchów i brak reakcji na dotyk11.
    3. Ostrożnie przenieść rybę za pomocą pęsety lub łyżki na szklane szkiełko, pokrywkę plastikowej szalki Petriego lub szalkę Petriego pokrytą agarozą i wykonać amputację płetwy lub obrazowanie (patrz punkt 3.2).
    4. Umieść ryby z powrotem w pojemniku zawierającym dużą objętość świeżej wody w systemie rybnym i monitoruj go. Jeśli ruchy skrzeli nie zostaną wznowione w ciągu 3 minut, wspomagaj, wdmuchując wodę na skrzela za pomocą plastikowej pipety transferowej.
  5. Genotypowanie ryb TetResponder oparte na PCR
    1. Wykonać częściową amputację płetwy ogonowej12. Umieść ryby w osobnych, ponumerowanych zbiornikach (skrzynkach hodowlanych; patrz tabela materiałów). Pozwala to na odtworzenie ryb transgenicznych po udanym genotypowaniu.
    2. Przenieść tkanki płetw do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki PCR wstępnie wypełnionej 20 μl wody wolnej od DNaz w celu wyizolowania genomowego DNA13.
      1. Dodać 120 μl 1 M NaOH do każdej studzienki i inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 95°C za pomocą termocyklera.
      2. Schłodzić próbki do temperatury 4°C, dodać 14 μl 1 M Tris-HCl (pH 8,0) do każdego dołka i krótko zawirować próbki. Odwiruj próbki przez 5 minut przy 16 000 x g, aby osadzać resztki komórek. Przechowywać genomowe DNA w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebne.
    3. Zaprojektuj startery, aby specyficznie amplifikować fragment transgenu TetResponder. Użyj 2 μl wyizolowanego DNA w standardowej reakcji PCR i przeanalizuj produkt PCR na żelu agarozowym.

3. Specyficzna tkankowo indukcja ekspresji transgenu u dorosłego regenerującego się płetwy ogonowej danio pręgowanego

  1. Założenie TetActivatora; Podwójna transgeniczna ryba TetResponder
    1. Nośniki TetActivator należy łączyć z nośnikami TetResponder.
    2. Selekcjonować zarodki będące nosicielami transgenu TetActivator w fazie rozwoju, gdy aktywne są elementy regulatorowe napędzające kasetę TetActivator. Transgeniczne zarodki można łatwo zidentyfikować na podstawie fluorescencji AmCyan za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego.
      UWAGA: Ryby transgeniczne transgeniczne TetActivator można alternatywnie zidentyfikować w wieku dorosłym poprzez obrazowanie znieczulonych ryb, np. po amputacji płetwy ogonowej i pojawieniu się fluorescencji AmCyan w regeneracji.
    3. Wychowuj wybrane zarodki do dorosłości.
    4. Zidentyfikuj podwójnie transgeniczne dorosłe ryby (ryby, które są nosicielami TetResponder oprócz TetActivator) za pomocą genotypowania opartego na PCR lub (najlepiej) za pomocą ich zdolności do indukowania ekspresji TetResponder w tkance będącej przedmiotem zainteresowania. Protokół indukcji i detekcji TetResponder w regenerującej się płetwie ogonowej opisano w punktach 2.3 i 4.
      UWAGA: Jeśli przejściowa ekspresja TetResponder jest zgodna z dalszym rozwojem embrionalnym lub larwalnym, przydatna jest identyfikacja podwójnie transgenicznych zarodków zawierających transgeny TetActivator i TetResponder po leczeniu DOX podczas rozwoju embrionalnego, jak opisano powyżej (sekcja 2.3, Figura 1H). Podwójnie dodatnie zarodki będą wykazywać fluorescencję AmCyan i YPet. Wychowuj pozytywne zarodki do dorosłości.
  2. Amputacja płetw ogonowych danio pręgowanego i indukcja ekspresji transgenu w płetwie regenerującej
    1. Wykonać częściową amputację płetwy ogonowej u znieczulonych ryb (patrz punkt 2.4)12. Ryby należy traktować natychmiast za pomocą DOX lub zwrócić je do systemu utrzymania ryb.
    2. Przygotować pudełko hodowlane (Rysunek 2A; patrz tabela materiałów) wypełnione 1 litrem wody z systemu rybnego zawierającej 25 μg/ml DOX (dodać 500 μl 2,000x 50 mg/ml bulionu do 1 l wody z systemu rybnego).
      UWAGA: Indukcja ekspresji transgenu bezpośrednio po amputacji pozwala na ocenę wpływu na wczesne zdarzenia podczas regeneracji, podczas gdy indukcja po 3 dniach od amputacji (3 dpa) powinna być stosowana do oceny ekspresji lub funkcji transgenu podczas wzrostu regeneracyjnego.
    3. Przenieś do 10 wcześniej amputowanych, podwójnie transgenicznych ryb do pudełka hodowlanego i zamknij pudełko pokrywą tak, aby ryby nie mogły uciec (ryc. 2A).
    4. Umieść budki hodowlane w ciemności, aby zmniejszyć stres. Zazwyczaj umieszczamy pudełka w inkubatorze powietrza o temperaturze 28,5 °C, aby zapewnić stałą ciemność i temperaturę.
    5. Traktowanie ryb podwójnie transgenicznych w kontroli ujemnej wyłącznie EtOH (250 μl na 1 l wody w systemie rybnym).
      UWAGA: Pojedyncza ryba transgeniczna lub typu dzikiego potraktowana DOX może być stosowana jako dodatkowa kontrola ujemna, chociaż nigdy nie zaobserwowaliśmy niekorzystnego wpływu zastosowanych tutaj dawek DOX na regenerację płetw.
    6. Znieczulić ryby zgodnie z opisem w sekcji 2.4 i przenieść ryby za pomocą pęsety lub łyżki na zwilżoną szalkę Petriego pokrytą agarozą. Ostrożnie rozłóż płetwę ogonową za pomocą pęsety.
    7. Badanie przesiewowe ryb pod kątem pojawienia się YPet w procesie regeneracji za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego (ryc. 2B).
      UWAGA: Zazwyczaj fluorescencję sterowaną przez TetResponder można wyraźnie zaobserwować po 6 godzinach leczenia DOX. Zalecamy jednak scharakteryzowanie dynamiki wyrażenia TetResponder dla każdego wygenerowanego wiersza.
    8. Zwróć ryby do systemu obsadzania ryb, aby zakończyć indukcję transgenu TetResponder lub kontynuować leczenie.
      UWAGA: W przypadku zabiegów >24 godziny (zabiegi długotrwałe) konieczna jest codzienna wymiana wody i dokładne czyszczenie boksów hodowlanych.
    9. Podczas długotrwałych zabiegów należy karmić ryby co 2-3 dni, przenosząc je do czystego pojemnika ze świeżą wodą z systemu rybnego przed powrotem do boksów hodowlanych po karmieniu.

4. Charakterystyka ekspresji TetResponder w regeneracji płetw

UWAGA: Zazwyczaj weryfikujemy ekspresję genów specyficznych tkankowo w regenerującej się płetwie ogonowej, używając obrazowania fluorescencyjnego kriosekcji przy 3 dpa. W tym momencie uformowały się różne przedziały tkankowe regeneracji i można je wyraźnie zidentyfikować na skrawkach tkanki, a kriosekcja jest prostsza niż na późniejszych etapach regeneracji. Rysunek 2C przedstawia domeny tkankowe, które można rozróżnić w procesie regeneracji, i wymienia kilka markerów molekularnych dla tych domen. Poniższy protokół opisuje przygotowanie kriosekcji podłużnych lub poprzecznych do bezpośredniego obrazowania lub barwienia immunologicznego.

  1. Kriosekcja dorosłych płetw ogonowych
    1. Ryby, którym amputowano płetwy ogonowe z 2 dpa do 3 dpa za pomocą DOX zgodnie z opisem w sekcji 3.2
    2. Znieczulić ryby, jak opisano w sekcji 2.4
    3. Za pomocą łyżki lub pęsety delikatnie przenieś rybę na pokrywkę plastikowej szalki Petriego.
    4. Ponownie amputuj płetwę, zregeneruj się na około 4-5 segmentach kostnych proksymalnie do początkowej płaszczyzny amputacji za pomocą skalpela i zwróć rybę do świeżej wody z systemu rybnego.
    5. Ostrożnie przenieś regenerate na małą szalkę Petriego (np. 35 mm) zawierającą 4% (w/v) paraformaldehydu (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; patrz tabela materiałów) za pomocą cienkiej pęsety. Nie dotykaj regenerowanej części, a jedynie kikuta tkanki.
    6. Ułożyć chusteczkę płasko na dnie płytki Petriego i ustabilizować O/N w temperaturze 4 °C.
    7. Wash regeneruje się dwukrotnie w 1x PBS zawierającym 0,1% Tween (PBT) w celu usunięcia PFA i inkubuje regeneruje o/n w temperaturze 4 °C w 0,5 M EDTA-PBS (pH 7,5) w celu odwapnienia macierzy kostnej.
    8. Inkubacja regeneruje się w temperaturze pokojowej w 10% sacharozy-PBS, 20% sacharozy-PBS, 30% sacharozy-PBS i 30% sacharozy-PBS: pożywka do zamrażania tkanek w stosunku 1:1 (TFM; patrz tabela materiałów) przez 30 minut każdy. Następnie inkubować żebra w temperaturze 4 °C przez >2 godzinę w pożywce do zamrażania tkanek.
    9. Umieść krioformy na szkiełku mikroskopowym i wypełnij je pożywką do zamrażania tkanek. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza.
    10. Transfer regeneruje się do krioform i odpowiednio orientuje tkankę, aby uzyskać podłużne lub poprzeczne odcinki regeneracji płetw (ryc. 2D). Upewnij się, że regeneracja jest prosta, co ułatwia cięcie.
    11. Przenieś krioformy wraz ze szkiełkiem mikroskopowym na metalowy stojak umieszczony na podłożu z suchego lodu, aby rozpocząć proces zamrażania (rysunek 2D).
    12. Gdy podłoże do zamrażania tkanek stanie się twarde, umieść kriomald na stole i pozostaw na kilka minut w temperaturze pokojowej, tak aby podłoże do zamrażania tkanek rozmroziło się na granicy faz tworzywo sztuczne i podłoże.
    13. Użyj długopisu lub podobnego narzędzia, aby wypchnąć zamrożony blok z krioformy. Przechowywać kriobloki w pudełku w temperaturze -80 °C do czasu przecięcia tkanek.
    14. Przygotować kriosekcje o grubości 10-14 μm za pomocą kriomikrotomu i zebrać skrawki na szkiełkach mikroskopowych adhezyjnych (patrz tabela materiałów). Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
  2. Charakterystyka ekspresji TetResponder na przekrojach płetw na podstawie fluorescencji YPet
    1. Traktuj skrawki żeber przez 30 minut 100% MeOH schłodzonym do -20 °C, aby poprawić przyczepność do szkiełka mikroskopowego, a następnie wykonaj dwa płukania w temperaturze RT w PBT i 1 płukanie w PBS, każde po 5 minut.
    2. Wizualizuj jądra, inkubując sekcje przez 10 minut w 4', 6-diamidino-2-fenylonolodolu (Dapi) w PBS (1:5 000), a następnie dwa płukania po 10 minut w PBS.
    3. Zamontuj sekcje w 75% Glycerol-PBS lub dostępnych na rynku mocowaniach zapobiegających blaknięciu i przykryj prowadnicą pokrywy.
    4. Obraz fluorescencji YPet i AmCyan pod konfokalnym lub szerokokątnym mikroskopem fluorescencyjnym (ryc. 1E).
      UWAGA: Aby ułatwić jednoznaczną identyfikację typów komórek wykazujących ekspresję YPet, można przeprowadzić immunofluorescencję lub immunohistochemię z przeciwciałami przeciwko antygenom specyficznym dla typu komórki wraz z przeciwciałami anty-GFP (które reagują z YPet, ale nie z AmCyan). Alternatywnie, aby ułatwić wykrycie słabej ekspresji YPet, hybrydyzację RNA in situ z YPet RNA można przeprowadzić na całych płetwach lub sekcjach parafinowych żeber.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby stworzyć funkcjonalny system TetON do tkankowo specyficznej, indukowalnej ekspresji genów, należy wygenerować transgeniczne linie TetActivator i TetResponder (Rysunek 1A). Osiąga się to poprzez mikroiniekcję konstruktów TetActivator (Rysunek 1B-C) lub TetResponder (Rysunek 1E) do wczesnych embrionów zebrafish oraz późniejszą integrację z linią zarodkową. Funkcjonalne konstrukty TetActivator można wygenerować albo poprzez klonowanie krótkich sekwencji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dorosły danio pręgowany ma niesamowitą zdolność do skutecznej regeneracji wielu narządów wewnętrznych i przydatków. Dokładne zrozumienie mechanizmów molekularnych i komórkowych wymaga specyficznej tkankowo analizy funkcji genów i szlaków sygnałowych. W tym celu system TetON stanowi skuteczne narzędzie do czasowo kontrolowanej ekspresji genów u embrionalnych i dorosłych ryb danio pręgowanych. Konstrukcje i metodologia systemu TetON opisane w tym manuskrypcie zostały z powodzeniem wykorzystane w niedawnym badaniu naszego l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Christie Haase, Doris Weber i Brigitte Korte za pomoc techniczną. Prace w laboratorium Weidinger są wspierane przez granty Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223/3-1, WE 4223/4-1 oraz Deutsche Gesellschaft für Kardiologie za pośrednictwem Oskar-Lapp-Stipendium i Klaus-Georg-und-Sigrid-Hengstberger-Forschungsstipendium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pudełka hodowlaneAqua SchwarzAquaBox 1
Złożony mikroskop fluorescencyjnynp. Leica, Zeissróżni się w zależności od producentaaby obrazować fluorescencyjne skrawki tkanek
Mikroskop konfokalny, np. Leica, Zeissróżni się w zależności od producentaaby obrazować fluorescencyjne skrawki tkanek
Kriostatnp. Leica, Thermo-Scientificróżni się w zależności od producentdo kriosekcji
4', 6-diamidino-2-fenylonolol (Dapi)Sigma-AldrichD9542użyj 1/5,000 w PBS
do wizualizacji jąder
DoksycyklinaSigma-AldrichD9891przygotuj zapasy w 50% EtOH w stężeniu 50 mg/ml (97 mM)
do indukcji TetResponder
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-AldrichP61484% (w/v) paraformaldehyd w PBS, pH 7,5
do utrwalania
1x sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5
1x sól fizjologiczna z buforem fosforanowym + Tween 20 (PBT)1x PBS z 0,1% Tween 20
szkiełka mikroskopowe adhezyjne Superfrost Ultra PlusThermo Scientific 1014356190do pobierania skrawków tkanek
Stereomikroskop fluorescencyjnynp. Leica, Zeissróżni się od producentado genotypowania opartego na fluorescencji
Termocykler, np. Biorad, Applied Biosystemsróżni się od producentado genotypowania opartego na PCR
Pożywka do zamrażania tkanek (TFM)Triangel Biomedical SciencesTFM-Cdo osadzania tkanek próbki
Trikainy (L-etylo-m-amino-benzoesanosulfonian metanu/MS-222)Sigma-AldrichE10521do znieczulenia
stosować w dawce 1 mg/ml w pożywce dla zarodków E3
, , , , ,

Bibliografia

  1. Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
  2. Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317(2014).
  3. Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
  4. Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
  5. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  6. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
  7. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  8. Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
  9. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  10. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556(2011).
  11. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
  12. Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
  13. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610(2007).
  14. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  15. Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
  16. Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tkankowo specyficzna ekspresja gen windukcja doksycyklinlinie transgenicznemikroskopia fluorescencyjnaregeneracja p etwy ogonowejszlak sygna owy Wnt beta kateninymikroskopia konfokalnaintegracja z lini zarodkow

Powiązane artykuły