Artykuł metodologiczny

Hybrydowe obrazowanie μCT-FMT i analiza obrazu

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52770

⸱

4 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, 2Institute for Biomedical Engineering - Biointerface Laboratory, RWTH Aachen University, 3Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół obrazowania hybrydowego, łączący tomografię za pośrednictwem fluorescencji (FMT) z mikrotomografią komputerową (μCT). Po fuzji i rekonstrukcji przeprowadzamy interaktywną segmentację narządów w celu wyodrębnienia ilościowych pomiarów rozkładu fluorescencji.

Streszczenie

Tomografia za pośrednictwem fluorescencji (FMT) umożliwia długotrwałe i ilościowe określenie rozkładu fluorescencji in vivo i może być używana do oceny biodystrybucji nowych sond oraz do oceny postępu choroby za pomocą ustalonych sond molekularnych lub genów reporterowych. Połączenie z metodą anatomiczną, np. mikrotomografią komputerową (μCT), jest korzystne dla analizy obrazu i rekonstrukcji fluorescencyjnej. Opisujemy protokół multimodalnego obrazowania μCT-FMT, w tym etapy przetwarzania obrazu niezbędne do ekstrakcji pomiarów ilościowych. Po przygotowaniu myszy i wykonaniu obrazowania, rejestrowane są multimodalne zestawy danych. Następnie wykonywana jest ulepszona rekonstrukcja fluorescencyjna, która uwzględnia kształt myszy. W przypadku analizy ilościowej segmentacje narządów są generowane na podstawie danych anatomicznych za pomocą naszego interaktywnego narzędzia do segmentacji. Na koniec krzywe biodystrybucji są generowane przy użyciu funkcji przetwarzania wsadowego. Pokazujemy możliwość zastosowania metody, oceniając biodystrybucję dobrze znanej sondy, która wiąże się z kośćmi i stawami.

Wprowadzenie

Tomografia za pośrednictwem fluorescencji, zwana również fluorescencyjną tomografią molekularną (FMT), jest obiecującą techniką ilościowej oceny rozkładu fluorescencji w tkankach rozproszonych, takich jak znieczulone myszy lub nawet tkanki ludzkiego ciała, np. piersi lub stawy palców. W przeciwieństwie do nieinwazyjnych technik mikroskopowych, które pozwalają na obrazowanie powierzchownych celów w rozdzielczości subkomórkowej1, FMT pozwala na trójwymiarową rekonstrukcję źródeł fluorescencyjnych na głębokości kilku centymetrów, choć w niższejrozdzielczości2. Dostępnych jest wiele celowanych sond fluorescencyjnych do obrazowania angiogenezy, apoptozy, stanu zapalnego i innych 2-5. Niektóre sondy są aktywowane, np. przez specyficzne rozszczepienie enzymów, co prowadzi do niegaszenia fluorochromów. Co więcej, geny reporterowe wyrażające białka fluorescencyjne mogą być obrazowane, np. w celu śledzenia migracji komórek nowotworowych6.

FMT czerpie duże korzyści z połączenia z anatomiczną metodą, np. μCT2,7 lub MRI8. Chociaż na rynku dostępne są samodzielne urządzenia FMT9, obrazy fluorescencyjne są trudne do interpretacji bez anatomicznych informacji referencyjnych. Ostatnio udało nam się wykazać, że połączone dane z obrazu anatomicznego umożliwiają bardziej wiarygodną analizę10. Dane anatomiczne mogą być również wykorzystane do dostarczenia wcześniejszej wiedzy, takiej jak zewnętrzny kształt myszy, co jest ważne dla dokładnego modelowania optycznego i rekonstrukcji fluorescencyjnej11. Ponadto mapy rozpraszania i absorpcji optycznej można oszacować za pomocą segmentacji typów tkanek i przypisując współczynniki specyficzne dla klasy12,13. W przypadku światła bliskiej podczerwieni hemoglobina jest głównym absorberem u myszy, oprócz melaniny i futra14. Ponieważ względna objętość krwi zmienia się regionalnie o rzędy wielkości, mapa absorpcji jest szczególnie ważna dla ilościowej rekonstrukcji fluorescencji13.

Jedną z zalet korzystania z nieinwazyjnych urządzeń do obrazowania jest to, że myszy mogą być obrazowane wzdłużnie, tj. w wielu punktach czasowych. Jest to ważne dla oceny dynamicznego zachowania sond, tj. ich docelowej akumulacji, biodystrybucji i wydalania10,15 lub oceny progresji choroby16. Podczas obrazowania kilku myszy w wielu punktach czasowych powstaje duża ilość zestawów danych obrazu. Aby umożliwić porównywalność, należy je uzyskiwać w sposób systematyczny, tj. za pomocą dobrze zdefiniowanego i udokumentowanego protokołu. Duża liczba skanów stanowi wyzwanie dla analizy obrazu, która jest niezbędna do wyodrębnienia pomiarów ilościowych z danych obrazu.

Celem naszego badania jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu obrazowania μCT-FMT, który wykorzystaliśmy i zoptymalizowaliśmy w kilku badaniach10,13,15,17,18. Opisujemy, w jaki sposób zestawy danych są generowane, przetwarzane, wizualizowane i analizowane. Wykazano to za pomocą uznanej sondy molekularnej OsteoSense, która wiąże się z hydroksyapatytem19 i może być używana do obrazowania chorób kości i przebudowy2. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez rządową komisję rewizyjną ds. opieki nad zwierzętami.

Protokół

Protokół zawiera szczegółowy opis następujących kroków: Na początku fantomy lub myszy i multimodalne łóżko myszy są przygotowywane do obrazowania. Następnie w tomografii komputerowej μCT wykonywany jest skan całego ciała. Następnie łóżko myszy jest przenoszone do FMT, gdzie pobierane są dwa skany (do góry i do góry nogami). Można to powtórzyć dla wielu myszy w wielu punktach czasowych. Po zakończeniu akwizycji danych należy je wyeksportować i posortować, aby umożliwić automatyczną segmentację (wymagającą licencji na oprogramowanie Definiens), a także fuzję obrazów i rekonstrukcję fluorescencyjną (wymagającą licencji na oprogramowanie Imalytics Preclinicic). Na koniec pokazano, w jaki sposób wizualizowane są multimodalne zestawy danych i jak interaktywnie segmentowane są narządy w celu ilościowego określenia biodystrybucji sond fluorescencyjnych.

1. Przygotowanie Phantom

UWAGA: Fantomy są przydatne do testowania systemu obrazowania, ale także do określania współczynnika kalibracji dla nowej sondy.

  1. Przygotować roztwór składający się z 200 ml wody, 2 % agarozy, 1,8 g proszku TiO2 i 50 μl błękitu trypanowego. Po ugotowaniu napełnij roztwór prostokątną formą o długości około 8 cm, szerokości 3 cm i wysokości 1,5 cm.
  2. Przygotuj kilka inkluzji fluorescencyjnych w fantomie za pomocą końcówek pipet, zawierających mieszaninę fluorescencji i środka kontrastowego μCT. Aby utworzyć inkluzje, odetnij końcówki pipet i uszczelnij je zapalniczką.
  3. Po zestaleniu się roztworu włóż inkluzje do fantomu. Odetnij niektóre części fantomu, aby uzyskać nieregularny kształt i dopasować go do multimodalnego uchwytu na mysz.
  4. Aby określić współczynnik kalibracji dla nowej sondy, wymagane są pewne skany fantomowe. W tym celu używany jest domyślny fantom FMT w połączeniu ze znanymi ilościami sondy. W celu zwiększenia dokładności należy dodać 4 % emulsji lipidowej do roztworu, aby otrzymać taki sam współczynnik rozpraszania wewnątrz inkluzji, jak w pozostałej części fantomu. Należy również dodać niewielką ilość (2%) środka kontrastowego μCT, aby ułatwić analizę obrazu.

2. Przygotowanie myszy

UWAGA: Obrazowanie μCT-FMT wymaga specjalnego przygotowania, w tym znieczulenia i depilacji.

  1. Umieść mysz na żywności wolnej od chlorofilu na 7 dni przed obrazowaniem. Spowoduje to zmniejszenie sygnału tła i jest szczególnie ważne dla kanałów FMT poniżej 750 nm.
  2. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzane są w znieczuleniu. Aby rozpocząć znieczulenie, umieść mysz w komorze wypełnionej 2% izofluranem w powietrzu (przepływ 5 l/min) do momentu, aż mysz zaśnie. Potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez delikatne szczypanie palców u nóg lub skóry oraz sprawdzenie rozluźnienia tonusa mięśniowego (np. mięśnia żuchwy). Aby podtrzymać znieczulenie, należy kontynuować aplikację izofluranu za pomocą rurki umieszczonej na nosie myszy (2% izofluranu w powietrzu, natężenie przepływu 1 l/min). Aby zapobiec wysuszeniu oczu, należy stosować maść weterynaryjną u znieczulonych myszy.
  3. Aby wstrzyknąć środek kontrastowy, przymocuj znieczuloną mysz do poduszki grzewczej za pomocą taśmy. Umieścić cewnik (igłę strzykawki przymocowaną do rurki) do żyły ogonowej i wstrzyknąć fluorescencyjny środek kontrastowy (np. 2 nmol, o maksymalnej objętości wstrzyknięcia 5 ml/kg masy ciała, tj. 150 μl dla myszy o masie 30 g).
  4. W przypadku skanowania owłosionej myszy obszar skanowania musi być wcześniej wydepilowany. W tym celu użyj golarki lub kremu do depilacji. U niektórych szczepów myszy mogą pojawić się wysypki po kremie do depilacji. Dlatego monitoruj myszy pod kątem zmian skórnych i w razie potrzeby skontaktuj się z personelem weterynaryjnym w celu uzyskania opieki. Przetestuj również tolerancję na niewielkiej liczbie zwierząt podczas korzystania z nowych szczepów myszy.
  5. Utrzymuj mysz w znieczuleniu podczas obrazowania μCT i FMT (2% izofluranu w powietrzu, natężenie przepływu 1 l/min).

3. Przygotowanie łóżka dla myszy

UWAGA: Do skanowania μCT-FMT użyj multimodalnego łóżka myszy, które pasuje zarówno do μCT, jak i FMT.

  1. Przed obrazowaniem wyczyść łóżko myszy mokrymi chusteczkami. Nie używaj etanolu, ponieważ może to uszkodzić szkło akrylowe. Upewnij się, że markery są wolne od wody, ponieważ może to zakłócić automatyczne wykrywanie znaczników.
  2. Odkręć multimodalnego łoża myszy i zdejmij górną część.
  3. Przymocuj rurkę z gazem znieczulającym do łóżka myszy i przymocuj ją taśmą.
  4. Umieść znieczuloną mysz w łóżku myszy i włóż nos do rurki gazowej. Upewnij się, że główka myszy znajduje się na przednim wskaźniku łoża myszy (Rysunek 1).
  5. Upewnij się, że mysz znajduje się na środku łoża myszy, aby optymalnie wykorzystać pole widzenia FMT.
  6. Zamknij łoże myszy i dokręć, aż mysz zostanie mocno przytrzymana. Upewnij się, że mysz może oddychać stabilnie, dzięki wizualnemu monitorowaniu ruchów oddechowych klatki piersiowej.

4. Obrazowanie μCT

UWAGA: Skanowanie całego ciała jest wykonywane za pomocą μCT. Wygenerowane dane anatomiczne są niezbędne do fuzji obrazu, do lepszej rekonstrukcji fluorescencyjnej oraz do analizy obrazu.

  1. Umieść łoże myszy wraz z myszą w μCT. Upewnij się, że mysz jest umieszczona w taki sposób, aby wchodziła "ogonem do przodu" w μCT. Jest to ważne dla zautomatyzowanej fuzji.
  2. Aby podtrzymać znieczulenie, gdy pokrywa μCT jest zamknięta, należy ponownie podłączyć rurki, aby skierować gaz przez obudowę μCT. Najpierw odłącz długą rurkę od łoża myszy i przymocuj ją do złącza na zewnątrz μCT. Następnie podłącz pozostały wolny koniec do złącza wewnątrz μCT.
  3. Wbij łoże myszy do μCT. Upewnij się, że rurka gazowa nie jest luźna i nie może zostać złapana przez obracającą się suwnicę. W razie potrzeby przymocuj go taśmą. Włóż rurkę do wycięcia w uchwycie łoża myszy.
  4. Zamknij μCT i uzyskaj topogram. Wybierz co najmniej dwa skany podrzędne, aby pokryć znaczną część myszy i jej łoża, co jest ważne dla fuzji i rekonstrukcji.
  5. Wybierz protokół skanowania μCT o nazwie HQD-6565-360-90, który rejestruje 720 projekcji o rozdzielczości 1032 x 1012 pikseli podczas jednego pełnego obrotu, co wymaga czasu skanowania wynoszącego 90 s na podskanowanie. Lampy pracują pod napięciem 65 kV i prądem 1,0 mA. Alternatywnie, aby zmniejszyć dawkę promieniowania i czas skanowania, wybierz protokół skanowania SQD-6565-360-29, który uzyskuje 720 projekcji o rozdzielczości 516 x 506 pikseli z czasem skanowania 29 s na podskan.
  6. Rozpocznij skanowanie μCT. Niebieski pasek wskazuje postęp. Skany cząstkowe zostaną pobrane później. Hipotermia i utrata płynów nie stanowią problemu ze względu na krótki czas skanowania, wynoszący zaledwie kilka minut. Nie otwieraj pokrywy μCT podczas skanowania, ponieważ spowoduje to automatyczne przerwanie skanowania w celu ochrony użytkownika przed promieniowaniem.
  7. Po zakończeniu skanowania otwórz pokrywę, ponownie podłącz rurkę znieczulającą i odłącz łoże myszy od uchwytu, aby przetransportować je do FMT.

5. Obrazowanie FMT

UWAGA: Bezpośrednio po skanowaniu μCT, mysz jest skanowana w FMT w dwóch konfiguracjach (góra i do góry nogami), które są używane razem dla lepszej rekonstrukcji fluorescencji.

  1. Włączyć dopływ gazu znieczulającego (2% izofluranu w powietrzu, przepływ 1 l/min) dla FMT przed umieszczeniem łóżka myszy w FMT. Korzystając z oprogramowania sterującego FMT, utwórz grupę badawczą z odpowiednią liczbą badanych (np. myszy). Wybierz sondy, które będą używane do obrazowania (użyj OsteoSense dla nowych sond, które nie są wymienione).
  2. Przenieś multimodalne łóżko myszy z myszą do FMT. Długa, elastyczna rurka gazu anestezjologicznego utrzymuje przepływ gazu. Przed włożeniem łoża myszy do FMT ostrożnie wyjmij rurkę, ponieważ nie jest ona potrzebna wewnątrz FMT. Unikaj przekręcania łoża myszy.
  3. Umieść łóżko myszy w FMT z czerwonym wskaźnikiem skierowanym do przodu ("głową do przodu"). Jest to ważne, aby fuzja obrazu była zgodna z μCT.
  4. Zamknij FMT.
  5. Wybierz odpowiednią grupę badawczą i temat. Wybierz żądany kanał FMT (dla OsteoSense 750EX użyj kanału 750 nm).
  6. Dodaj opis, np. "w górę" lub "w dół" i uzyskaj skan przeglądowy, naciskając "Przechwyć". W ten sposób rejestrowany jest obraz odbicia całego pola widzenia. Upewnij się, że nie masz zaznaczonej opcji "Tylko obrazy odbijające", ponieważ w przeciwnym razie nie jest możliwe późniejsze uzyskanie skanów 3D.
  7. Dostosuj parametry obrazowania dla skanowania 3D. Powiększ pole widzenia, aby objąć jak największą część myszy. Zazwyczaj jednak głowa i ogon nie do końca mieszczą się w polu widzenia. Kliknij "Zaawansowane" i sprawdź ustawienia obrazowania. Ustaw gęstość próbkowania na 3 mm, czułość na normalną i oświetlenie min/maksimum odpowiednio na 5000 i 50000.
  8. Kliknij "dodaj do kolejki rekonstrukcji", a następnie kliknij "Skanuj", aby rozpocząć skanowanie FMT. Zajmie to około 5 do 15 minut, w zależności od rozmiaru i grubości myszy, ponieważ w przypadku grubszych obiektów wymagane są dłuższe czasy naświetlania. Urządzenie zawiera podgrzewaną komorę obrazowania, aby uniknąć hipotermii.
  9. Po skanowaniu odwróć łoże myszy wraz z myszą do góry nogami i wykonaj kolejne skanowanie. Dostarcza to dodatkowych danych do rekonstrukcji fluorescencji.
  10. Po zakończeniu tomografii komputerowej μCT i skanów FMT i wybudzeniu myszy ze znieczulenia nie należy pozostawiać jej bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, np. do chodzenia lub utrzymania pozycji leżącej mostka.

6. Fuzja i rekonstrukcja obrazu

UWAGA: Po zakończeniu skanowania μCT-FMT, np. na końcu badania, uzyskane dane muszą zostać posortowane, aby umożliwić automatyczną fuzję obrazu i rekonstrukcję fluorescencji.

  1. Aby posortować skany do dalszego przetwarzania, utwórz folder dla badania. Dla każdego skanowania μCT-FMT utwórz jeden podfolder, którego nazwa zawiera identyfikator myszy i punkt czasowy, np. M01_02h.
  2. Dla każdego skanowania μCT-FMT wyeksportuj skany FMT (w górę i w dół) jako pliki .fmt i zapisz je w podfolderze pod nazwami plików kończącymi się na "_up.fmt" lub "_down.fmt". Każdy plik .fmt zawiera pozyskane dane surowe, tj. obrazy wzbudzenia i emisji uzyskane przez kamerę, metadane, takie jak czasy naświetlania, oraz rekonstrukcję fluorescencyjną wygenerowaną przez FMT.
  3. Korzystając z oprogramowania μCT, utwórz rekonstrukcję za pomocą izotropowego woksela o rozmiarze 35 μm. Wybierz gładkie jądro rekonstrukcji (T10). Dostosuj pole widzenia tak, aby całe łoże myszy wraz ze znacznikami było zakryte. Wybierz MIFX/RAW jako format wyjściowy i rozpocznij rekonstrukcję. Po zakończeniu rekonstrukcji przenieś pliki rekonstrukcji μCT do podfolderu skanu μCT-FMT.
  4. Eksportuj dane μCT i FMT dla wszystkich skanów. Upewnij się, że każdy podfolder zawiera dwa pliki .fmt (góra i dół) oraz rekonstrukcję μCT w formacie MIFX/RAW. Aby sprawdzić kompletność, wybierz Menu->CT-FMT->Sprawdź kompletność za pomocą oprogramowania przedklinicznego Imalytics. Może pojawić się lista błędów, takich jak brakujące pliki .fmt lub rekonstrukcje μCT. Napraw błędy i sprawdzaj kompletność, aż wszystkie błędy zostaną rozwiązane.
  5. Korzystając z Menu->CT-FMT->Settings, sprawdź nazwę serwera oprogramowania Definiens i dostosuj w razie potrzeby. Wartość domyślna to http://localhost:8184, przy założeniu, że oprogramowanie Definiens jest zainstalowane na tym samym komputerze. W kolejnym kroku wymagane jest oprogramowanie Definiens, aby przeprowadzić automatyczną segmentację łoża myszy i markerów.
  6. Kliknij Menu->CT-FMT->Fuse group w oprogramowaniu Imalytics Preclinical aby przeprowadzić automatyczną fuzję μCT-FMT dla całego badania. Zajmuje to kilka minut na skan μCT-FMT i powoduje, że folder z sufiksem "Pakiet" jest równoległy do folderu badania. Zawiera on mniejszy podzbiór plików (dane μCT i rekonstrukcja FMT dostarczona przez dostawcę), które są istotne dla dalszej analizy.
  7. Kliknij Menu->CT-FMT->Rekonstruuj grupę (FMT) w oprogramowaniu przedklinicznym Imalytics, aby przeprowadzić rekonstrukcję fluorescencji, w tym generowanie map absorpcji i rozpraszania13. Mimo że przetwarzanie jest akcelerowane przez GPU20, każda rekonstrukcja wymaga od 1 do 4 godzin, w zależności od rozmiaru myszy. Wyniki zostaną zapisane w folderze pakietu. Uwaga: Aby umożliwić większą przepływność, obecnie wykonujemy te rekonstrukcje w klastrze z procesorem GPU z 56 procesorami GPU.

7. Analiza obrazu

UWAGA: Aby wyodrębnić pomiary ilościowe z danych obrazu, wymagana jest segmentacja zmian chorobowych i narządów.

  1. Po połączeniu i zrekonstruowaniu wszystkich zestawów danych utwórz segmentację dla każdego skanu μCT-FMT za pomocą oprogramowania Imalytics Preclinical .
  2. Wczytaj plik μCT jako podkładanie, a plik fluorescencyjny jako nakładkę. Naciśnij "3D", aby włączyć renderowanie woluminu i sprawdzić zestaw danych.
  3. Aby podzielić płuca na segmenty, kliknij Menu->Classes->Dodaj klasę i utwórz klasę o nazwie "tmp". Można to również zrobić za pomocą menu kontekstowego. Utworzenie nowej klasy automatycznie ustawia ją jako klasę wyjściową dla kolejnych operacji segmentacji.
    1. Wykonaj operację progowania, aby podzielić wszystkie obszary o niskiej intensywności w zestawie danych μCT (kliknij Menu->Segmentacja->Thresholding->Poniżej i wprowadź 600). Teraz klasa tmp zawiera powietrze na zewnątrz myszy, ale także tkankę płucną.
    2. Utwórz klasę "Płuco". Wykonaj operację "Wypełnij obszar" (kliknij prawym przyciskiem myszy na płuco i wybierz Menu->Wypełnij region->Wypełnij region bez ograniczeń), aby oddzielić płuco od powietrza zewnętrznego.
    3. Usuń klasę tmp, ponieważ nie jest już potrzebna.
  4. Aby podzielić wypukłe obszary, np. pęcherz moczowy, użyj trybu bazgrołów. Najpierw utwórz klasę "Pęcherz".
    1. Naciśnij F1, aby usunąć wszystkie bazgroły.
    2. Za pomocą myszy komputerowej narysuj bazgroły, aby wyznaczyć granice pęcherza.
    3. Naciśnij F3, aby wypełnić obszar zamknięty w bazgrołach tymczasową maską, która jest wyświetlana jako czerwona nakładka. Iteracyjnie dodawaj więcej bazgrołów (w dowolnej orientacji krojenia) i naciskaj F3, aż zostanie osiągnięta wystarczająca dokładność. Zazwyczaj wystarczą bazgroły w 10 plasterkach.
    4. Naciśnij F4, aby zapisać tymczasową maskę jako "Pęcherz".
    5. Postępuj w ten sposób, aby podzielić inne wypukłe obszary, takie jak serce i nerki. Wiele regionów, np. żołądek lub wątroba, można przybliżyć za pomocą kilku wypukłych obszarów.
  5. Aby podzielić kręgosłup na segmenty, najpierw utwórz klasę "Bone".
    1. Wybierz ContextMenu->Thresholding->Above, aby wykonać operację progowania w celu sklasyfikowania wszystkich jasnych wokseli (np. powyżej 1,600) jako "Kość".
    2. Operacja wypełnienia obszaru nie pozwoliłaby na segmentację kręgosłupa, ponieważ jest on połączony z wieloma innymi częściami szkieletu, np. żebrami. Wykonaj kilka operacji cięcia, iteracyjnie rysując bazgroły i naciskając F2, aby oddzielić kręgosłup od czaszki, żeber i kości krzyżowej.
    3. Na koniec utwórz klasę "Kręgosłup" i wykonaj operację wypełniania regionu, aby uzyskać grzbiet (kliknij prawym przyciskiem myszy na grzbiecie i wybierz ContextMenu->Fill Region->Fill region unlimited).
  6. Zapisz segmentację jako plik w podfolderze skanowania μCT-FMT. Użyj spójnej nazwy, np. organs.seg, aby włączyć przetwarzanie wsadowe.
  7. Wybierz Menu->Statystyka->Statystyki klas (nakładka), aby wygenerować arkusz kalkulacyjny, który zawiera średnią intensywność fluorescencji, objętość i całkowitą ilość (iloczyn średniej i objętości) dla każdej klasy.
  8. Aby wygenerować pojedynczy arkusz kalkulacyjny zawierający wartości dla wszystkich regionów wszystkich skanów μCT-FMT, kliknij Menu->Batch->Set batch settings, a następnie kliknij Menu->Batch->Batch statistics. Pozwala to uniknąć wysiłku związanego z tworzeniem i scalaniem wielu plików arkuszy kalkulacyjnych, tj. po jednym dla każdego skanu μCT-FMT.

8. Kalibracja sondy

  1. Aby obliczyć współczynnik kalibracji dla sondy, wymagane są wielokrotne skany fantomowe μCT-FMT z różnymi znanymi wartościami sondy (patrz krok 1.4), np. przy 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol i 0 pmol.
  2. Zeskanuj fantomy zgodnie z opisem w sekcjach 4 i 5. Również w przypadku skanów fantomowych wymagane są skany w górę i w dół w FMT.
  3. Wyeksportuj dane i wykonaj fuzję i rekonstrukcję zgodnie z opisem w sekcji 6.
  4. Segmentuj inkluzję za pomocą danych μCT dla każdego skanu według progów (powyżej 1 200) i wypełniania regionów.
  5. Wygeneruj arkusz kalkulacyjny z zmierzonymi ilościami fluorescencji i wykreśl je w funkcji znanych ilości. Obliczanie nachylenia pasowania regresji liniowej. Jest to współczynnik kalibracji sondy.

Wyniki

Zastosowaliśmy opisany protokół w celu oceny biodystrybucji ukierunkowanej sondy OsteoSense, która wiąże się z hydroksyapatytem. 3 myszy (myszy z podwójnym znokautowaniem C57BL/6 Apoe-/- Ahsg-/-, w wieku 10 tygodni) obrazowano przed oraz 15 min, 2 h, 4 h, 6 h i 24 h po dożylnym wstrzyknięciu 2 nmol OsteoSense. Nasze oprogramowanie automatycznie wykryło markery wbudowane w multimodalny podłoże dla myszy (Rycina 1, Rycina 2A,B), co umożliwiło fuzję anatomicznych danych µCT z rekonstrukcją fluorescencji wykonaną przez FMT (Rycina 2C,D). Ponieważ OsteoSense jest sondą o niskiej masie cząsteczkowej, oczekiwane jest szybkie wydalanie nerkowe, a tym samym wysoki sygnał w pęcherzu moczowym. Fuzja rekonstrukcji fluorescencji z FMT ujawniła problemy, takie jak błędnie umiejscowiony sygnał poza pęcherzem (Rycina 2C,D). Problemy te występują, ponieważ FMT nie zna rzeczywistego kształtu myszy i przyjmuje kształt bloku. Nasza rekonstrukcja określa dokładny kształt na podstawie danych µCT i generuje mapy rozpraszania oraz absorpcji13, aby umożliwić dokładniejszą rekonstrukcję fluorescencji z lepszą lokalizacją sygnału, co jest szczególnie widoczne w przypadku pęcherza (Rycina 2E,F).

Aby przypisać zrekonstruowaną fluorescencję do odpowiednich obszarów, interaktywnie wysegmentowaliśmy kilka organów przy użyciu naszego oprogramowania (Rycina 3). Dla każdego z 18 skanów wysegmentowano 7 obszarów na podstawie danych µCT, t.j. serce, płuca, wątrobę, nerki, kręgosłup, jelito i pęcherz moczowy. Następnie oprogramowanie zostało wykorzystane do obliczenia średniego stężenia fluorescencji dla każdego ze 126 obszarów. Na szczęście oprogramowanie oferuje tryb wsadowy, który oblicza wszystkie wartości i zapisuje je w jednym arkuszu kalkulacyjnym.

Aby zwizualizować rozkład fluorescencji, dla każdego punktu czasowego wygenerowano rendery 3D, stosując porównywalne ustawienia okna (Rysunek 4A-F). Na podstawie ilościowych wartości dla poszczególnych organów obliczono biodystrybucję, wyciągając średnią z wartości organów dla trzech myszy (Rysunek 4G). Skanowania wstępne, wykonane przed wstrzyknięciem, wykazały pomijalny sygnał tła. 15 min po wstrzyknięciu najsilniejszy sygnał pojawił się w pęcherzu moczowym ze względu na szybką wydalanie nerkowe. W kolejnych punktach czasowych pozostała sonda zgromadziła się w kościach i stawach.

Układ tomograficzny z lampami μCT i markerami; wskaźnik FMT i wyniki obrazowania myszy.
Rycina 1. Multimodalny podłoże dla myszy. (A) Multimodalne podłoże dla myszy składa się z dwóch płyt z pleksiglasu, które ciasno unieruchamiają mysz. Stopień dociśnięcia reguluje się za pomocą dwóch śrub. Podłoże zawiera markery (puste otwory) służące do fuzji obrazów. Gaz anestetyczny jest podawany za pomocą elastycznej rurki przymocowanej taśmą. (B) Podłoże dla myszy jest przymocowane do metalowego uchwytu i umieszczone w centrum obrotowego gantry µCT. (C) Należy unikać powstania szczeliny między podłożem a metalowym uchwytem, ponieważ w przeciwnym razie markery mogą zostać błędnie przypisane, co doprowadzi do nieprawidłowej fuzji. Rurka z gazem anestetycznym powinna być podłączona do złącza rurki. (D) Podłoże dla myszy należy wsunąć do FMT przodem do przodu, aby umożliwić poprawną automatyczną fuzję. (E) Markery są widoczne dla kamery FMT, która jest wykorzystywana do automatycznego wykrywania markerów i fuzji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Segmentacja, fuzja i rekonstrukcja równowagi statycznej; schemat analizy obrazowania z markerami.
Rycina 2. Fuzja i rekonstrukcja obrazu. (A, B) Markery oraz zewnętrzny kształt myszy są określane przez zautomatyzowany algorytm segmentacji. (C, D) 15 min po wstrzyknięciu OsteoSense znaczna ilość sondy została już wydalona do pęcherza moczowego. Po fuzji rekonstrukcji dostarczonej przez producenta z danymi µCT widoczne stają się problemy. Większość sygnału pojawia się wokół pęcherza, a nie w jego wnętrzu, a część sygnału pojawia się nawet w powietrzu. Dzieje się tak, ponieważ FMT zakłada blokowy kształt myszy. (E, F) Nasza ulepszona rekonstrukcja fluorescencji, wykorzystująca kształt myszy wyprowadzony z danych µCT, skutkuje lepszą lokalizacją fluorescencji wewnątrz pęcherza. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza tomografii komputerowej anatomicznej; wizualizacja segmentowanych organów; badanie danych obrazowania radiologicznego.
Rycina 3. Interaktywna segmentacja organów. (A) W celu ilościowego określenia rozkładu fluorescencji segmentowanych jest kilka organów: serce (czerwony), płuco (różowy), wątroba (brązowy), żołądek (beżowy), kręgosłup (fioletowy), nerki (żółty), jelito (zielony) i pęcherz moczowy (złoty). (B) Płuco, które silnie kontrastuje z otaczającą tkanką, jest segmentowane przy użyciu progowania i wypełniania obszarów. (C) Organy o okrągłym kształcie, takie jak pęcherz moczowy, nerki i serce, są segmentowane za pomocą „scribbles” (notatek graficznych). (D) Organy o bardziej złożonym kształcie, np. wątroba i żołądek, są segmentowane przyrostowo za pomocą scribbles. Aby wysegmentować kręgosłup, zastosowano wysoki próg, aby wyodrębnić wszystkie kości. Następnie wycina się niektóre kości, np. żebra, aż pozostanie sam kręgosłup. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Biodistribution analysis, urine excretion, bladder, timed imaging, and concentration graph.
Rycina 4. Biodystrybucja. W celu oceny biodystrybucji myszy poddaje się skanowaniu w kilku punktach czasowych (A-F). (ASkan wstępny, wykonany przed iniekcją, wykazuje niewielki sygnał tła w kanale 750 nm.B15 min po wstrzyknięciu znaczna ilość sondy znajduje się już w pęcherzu moczowym.C) W punkcie czasowym 2 h mysz oddała mocz, co skutkowało wystąpieniem fluorescencji poza organizmem zwierzęcia. W późniejszych punktach czasowych (D-F), sygnał pojawia się głównie w kościach i stawach, t. j.., w obrębie kręgosłupa i kolan. (G) Przedstawiono ilościowe stężenie fluorescencji dla wybranych organów.

Dyskusja

Opisujemy i stosujemy protokół do multimodalnego obrazowania μCT-FMT. Korzystamy z dostępnych na rynku i powszechnie stosowanych aparatów FMT i μCT3,11,15–17,21. Podczas gdy protokół wymaga określonego FMT, μCT może zostać zastąpiony innym μCT o podobnej funkcjonalności i porównywalnych parametrach skanowania, np. pole widzenia powinno być wystarczająco duże, aby pokryć łoże myszy wraz ze znacznikami.

FMT został wykorzystany do analizy biodystrybucji bez łączenia go z μCT lub MRI21, jednak dane anatomiczne są korzystne dla zwiększenia odtwarzalności, ponieważ segmentacja może być oparta na granicach narządów, które są widoczne w danych μCT10. Chociaż zintegrowane urządzenia μCT-FMT zostały opracowane2,7, nie są one jeszcze dostępne na rynku. Co więcej, zastosowanie dwóch oddzielnych urządzeń pozwala na rurociągowanie, tj. następna mysz może być obrazowana w μCT, podczas gdy pierwsza mysz nadal znajduje się w FMT, w celu zwiększenia przepustowości.

Aby zmniejszyć nakład pracy ręcznej, przeprowadzamy automatyczne wykrywanie i łączenie znaczników. Co więcej, kształt myszy jest automatycznie segmentowany, a ta informacja znacznie poprawia rekonstrukcję fluorescencji11,13,22. Do ilościowej rekonstrukcji fluorescencji potrzebne są mapy absorpcji i rozpraszania13,23. Mapę rozpraszania wyprowadzamy poprzez automatyczną segmentację danych μCT i przypisanie znanych współczynników rozpraszania kilku typów tkanek (płuca, kości, skóra, tłuszcz i pozostała tkanka miękka)24. Następnie rekonstruujemy mapę absorpcji na podstawie surowych danych optycznych, co jest szczególnie ważne dla dobrze ukrwionych narządów, takich jak serce i wątroba13,20.

Skanowanie kilku myszy w wielu punktach czasowych szybko powoduje powstanie dużej liczby zestawów danych do analizy. W przypadku badań biodystrybucji należy podzielić kilka narządów na segmenty dla każdego skanu μCT-FMT. Niestety, segmentacji nie można ponownie wykorzystać, ponieważ mysz jest wielokrotnie umieszczana na nowo w łóżku myszy. Korzystamy z narzędzia do segmentacji interaktywnej, opracowanego w naszym instytucie, jednak odpowiednie mogą być również inne narzędzia25. Generujemy segmentacje wokselowe, ponieważ lepiej pasują one do złożonych organów niż proste kształty, takie jak elipsy i sześciany26. Zautomatyzowana segmentacja całego zwierzęcia byłaby przydatna w celu dalszego zmniejszenia obciążenia pracą ręczną27, ale nadal potrzebne byłoby interaktywne narzędzie do segmentacji w celu skorygowania błędów segmentacji. Co więcej, zautomatyzowane narzędzia do segmentacji z trudem przewidują szczególne przypadki, takie jak patologie. Ponieważ korzystamy z natywnych skanów μCT, niektóre narządy, takie jak śledziona, są bardzo trudne do segmentacji nawet ręcznie. Środki kontrastowe pomogłyby, ale występują problemy z tolerancją i trudno jest utrzymać stały rozkład środka kontrastowego w całym obrazowaniu podłużnym.

Nasze badanie fantomowe pokazuje, że lokalizacja sygnału ulega poprawie, gdy wykorzystuje się informacje o kształcie do rekonstrukcji fluorescencji. In vivo podobna poprawa jest widoczna we wczesnym punkcie czasowym (15 minut po wstrzyknięciu), kiedy duża ilość sondy znajduje się już w pęcherzu moczowym. Sonda wiążąca hydroksyapatyt gromadzi się w kościach i stawach. Niezwykłe jest to, jak szybko to następuje, tzn. sygnał jest już wyraźnie widoczny na kręgosłupie 15 minut po wstrzyknięciu. Jest to prawdopodobnie spowodowane niską masą cząsteczkową sondy, która umożliwia szybkie wynaczynienie i dyfuzję do regionów docelowych. Sonda wiąże się kowalencyjnie z docelowym hydroksyapatytem, a niezwiązana sonda jest wydamiana. W późniejszych punktach czasowych, między 6 godziną a 24 godziną po wstrzyknięciu, intensywność sygnału w kręgosłupie pozostaje stosunkowo stabilna, prawdopodobnie dlatego, że prawie żadne światło nie dociera głęboko do myszy, aby wybielić fluorescencję. W naszym badaniu użyliśmy kanału 750 nm, który skutkuje niską fluorescencją tła, co jest widoczne w skanach uzyskanych przed wstrzyknięciem. Na niższych falach można spodziewać się większej ilości sygnału tła28.

Podsumowując, opisujemy multimodalny protokół obrazowania dla dostępnych na rynku urządzeń FMT i μCT. Pokazujemy, że połączenie zapewnia korzyści dla rekonstrukcji fluorescencyjnej. Pokazujemy, w jaki sposób krzywe biodystrybucji są wyodrębniane z dużej ilości danych obrazowych za pomocą interaktywnej segmentacji narządów i przetwarzania wsadowego. Wierzymy, że ten ustandaryzowany przepływ pracy może być pomocny w opracowywaniu leków i innych badaniach obrazowych przy użyciu sond znakowanych fluorescencyjnie.

Oświadczenia

Felix Gremse jest założycielem i właścicielem Gremse-IT, start-upu, który oferuje oprogramowanie i usługi do analizy obrazów medycznych we współpracy z firmą Philips i Wydziałem Eksperymentalnego Obrazowania Molekularnego Uniwersytetu RWTH w Akwizgranie.

Podziękowania

Dziękujemy Markowi Weilerowi za przeprowadzenie eksperymentów fantomowych. Prace te były wspierane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN Starting Grant 309495: NeoNaNo), niemiecki kraj związkowy Nadrenia Północna-Westfalia (NRW; High-Tech.NRW/EU-ZIEL 2-Programm (EFRE); ForSaTum), niemieckie Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) (programy finansowania Virtual Liver (0315743), LungSys (0315415C), LungSys2(0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), Uniwersytet RWTH w Akwizgranie (I3TM Seed Fund) oraz Philips Research (Akwizgran, Niemcy).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FMT (Fluorescencyjna tomografia molekularna) FMT2500 LXPerkinElmerFMT2000 Urządzenie do fluorescencyjnej tomografii molekularnej
i mikro; CT (mikrotomografia komputerowa) Tomoscope DuoCT Imaging GmbHTomoscope DuoUrządzenie do mikrotomografii komputerowej
Multimodalne łóżko myszyCT Imaging GmbHKonstruktor eksperymentalnyCzęściowo przezroczysty uchwyt na zwierzęta
IsoFlo (izofluran, USP)Abbott05260-05Izofluran Znieczulenie wziewne
System znieczulenia małych zwierzątAparat Harvarda726419Kompletny system stołowy Isoflurane
Pokarm dla myszy bez chlorofiluSsniffE15051żywność o niskiej zawartości chlorofilu / niskiej fluorescencji
OsteoSense 750EXPerkinElmerNEV10053EXZwierzęcy środek kontrastowy FMT
Portex Rurka polietylenowa o drobnym otworzeSmith medical800/100/120Rurka do cewnika iniekcyjnego
Sterican 30gBBraun4656300Igła podskórna do cewnika
ImeronAltana pharmaINLA F.1/0203/3.5337.69CT środek kontrastowy do inkluzji fantomowych
AgarozaSigma90-12-36-6Agaroza do produkcji fantomów
TiO2ApplichemA1900,1000Tlenek tytanu jako środek rozpraszający fantomowe
Błękit trypanowyFluka93595Trypan niebieski do regulacji światła fantomowego propagacja
Cy7Lumiprobe15020Fluorochrom do inkluzji fantomowych
Lipovenoes 20%Fresenius Kabi3094740Emulsja lipidowa, środek rozpraszający do środków kontrastowych FMT
Definiens Developer XD ServerDefiniens AGServer XDPlatforma programowa do automatycznej segmentacji
Imalytics PreclinicalExMI/Gremse-ITWersja 2.0.1Oprogramowanie do fuzji, rekonstrukcji i analizy obrazu
NVIDIA Geforce TitanAsusGTXTITAN6GD5Wysokiej klasy komputerowa karta graficzna, 6GB Memory

Bibliografia

  1. Hoffman, R. M., Yang, M. Subcellular imaging in the live mouse. Nature Protocols. 1 (2), 775-782 (2006).
  2. Ale, A., Ermolayev, V., Herzog, E., Cohrs, C., Angelis, M. H., Ntziachristos, V. FMT-XCT: in vivo animal studies with hybrid fluorescence molecular tomography-X-ray computed tomography. Nature Methods. 9 (9), 615-620 (2012).
  3. Eaton, V. L., Vasquez, K. O., Goings, G. E., Hunter, Z. N., Peterson, J. D., Miller, S. D. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. Journal of Neuroinflammation. 10 (138), (2013).
  4. Lederle, W., Arns, S., et al. Failure of annexin-based apoptosis imaging in the assessment of antiangiogenic therapy effects. EJNMMI Research. 1 (26), (2011).
  5. Ntziachristos, V., Tung, C. -H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nature Medicine. 8 (7), (2002).
  6. Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nature Reviews Cancer. 5 (10), 796-806 (2005).
  7. Schulz, R. B., Ale, A., et al. Hybrid system for simultaneous fluorescence and x-ray computed tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29 (2), 465-473 (2010).
  8. Stuker, F., Baltes, C., et al. Hybrid small animal imaging system combining magnetic resonance imaging with fluorescence tomography using single photon avalanche diode detectors. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (6), 1265-1273 (2011).
  9. Leblond, F., Davis, S. C., Valdés, P. A., Pogue, B. W. Preclinical Whole-body Fluorescence Imaging: Review of Instruments, Methods and Applications. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 98 (1), 77-94 (2010).
  10. Kunjachan, S., Gremse, F., et al. Noninvasive optical imaging of nanomedicine biodistribution. ACS Nano. 7 (1), 252-262 (2013).
  11. Radrich, K., Ale, A., Ermolayev, V., Ntziachristos, V. Improving limited-projection-angle fluorescence molecular tomography using a co-registered x-ray computed tomography scan. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126011(2012).
  12. Freyer, M., Ale, A., Schulz, R. B., Zientkowska, M., Ntziachristos, V., Englmeier, K. -H. Fast automatic segmentation of anatomical structures in x-ray computed tomography images to improve fluorescence molecular tomography reconstruction. Journal of Biomedical Optics. 15 (3), 036006(2010).
  13. Gremse, F., Theek, B., et al. Absorption Reconstruction Improves Biodistribution Assessment of Fluorescent Nanoprobes Using Hybrid Fluorescence-mediated Tomography. Theranostics. 4 (10), 960-971 (2014).
  14. Cheong, W. -F., Prahl, S. A., Welch, A. J. A review of the optical properties of biological tissues. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).
  15. Doleschel, D., Mundigl, O., et al. Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).
  16. Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts. Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).
  17. Kunjachan, S., Pola, R., et al. Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines. Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).
  18. Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1. Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).
  19. Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
  20. Gremse, F., Höfter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging. SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).
  21. Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. Quantitative Whole Body Biodistribution of Fluorescent-Labeled Agents by Non-Invasive Tomographic Imaging. PLoS ONE. 6 (6), e20594(2011).
  22. Theek, B., Gremse, F., et al. Characterizing EPR-mediated passive drug targeting using contrast-enhanced functional ultrasound imaging. Journal of Controlled Release. 182 (1), 83-89 (2014).
  23. Hyde, D., Schulz, R., Brooks, D., Miller, E., Ntziachristos, V. Performance dependence of hybrid x-ray computed tomography/fluorescence molecular tomography on the optical forward problem. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).
  24. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37(2013).
  25. Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: a free software tool for multimodality medical image analysis. Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).
  26. Gremse, F., Schulz, V. Qualitative and Quantitative Data Analysis. Small Animal Imaging. , 363-378 (2011).
  27. Baiker, M., Milles, J., et al. Atlas-based whole-body segmentation of mice from low-contrast Micro-CT data. Medical Image Analysis. 14 (6), 723-737 (2010).
  28. Sevick-Muraca, E. M., Rasmussen, J. C. Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine. Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303(2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tomografia fluorescencyjnamikrotomografia komputerowahybrydowy protok obrazowaniarekonstrukcja fluorescencjisegmentacja organ wanaliza biodystrybucjirejestracja po o enia myszyinteraktywne narz dzie segmentacjifunkcja przetwarzania wsadowegoilo ciowy pomiar fluorescencji
Hybrydowe obrazowanie μCT-FMT i analiza obrazu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.